CN116196347B - 一种葛根中五种活性成分的绿色提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种葛根中五种活性成分的绿色提取方法。本发明通过一系列的实验，研究其提取3‑羟基葛根素，葛根素，大豆苷，大豆苷元，3‑甲氧基葛根素等活性成分的最适宜条件，达到良好的提取效果，因葛根具有抗氧化活性，用DPPH自由基清除法测定其抗氧化活性，用抑制率表示抗氧化活性，抑制率越高，抗氧化活性越强，通过研究葛根，为进一步研究其他中药材的抗氧化活性打下坚实的基础。

Description

一种葛根中五种活性成分的绿色提取方法
技术领域
本发明涉及分离提纯技术领域，具体涉及一种葛根中五种活性成分的绿色提取方法。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
葛根别名野葛，甘葛等，在中国有许多产地如河南，山东，四川。葛根提取物被应用于医疗卫生保健行业。葛根总黄酮提取液可以增加女性雌激素含量，治疗痛经。葛根还具有治疗头痛发热，心痛等的症状，葛根中含有人类所需要的必要元素如钙，铁，锌等。异黄酮类化合物是葛根中的主要生物活性成分，其中葛根素含量最高。因此对葛根中的异黄酮类活性成分的提取研究显得尤为重要。而目前尚无一种有效的方法对葛根中多种异黄酮类活性成分进行分离提纯。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种葛根中五种活性成分的绿色提取方法。目前工业污染日益严重，研究新型绿色溶剂，减少环境污染，这一重要任务日益紧迫，本发明主要目的是研究离子液体提取葛根中5种活性成分，深入研究离子液体对提取效率的影响，提取葛根中的大豆苷元，大豆苷，3-甲氧基葛根素，葛根素，3-羟基葛根素，测算出总黄酮含量，得出最适宜提取条件。促进社会医疗事业大发展，为研究其他中药材提供方向。
本发明以葛根为研究对象，葛根中含有3-羟基葛根素，葛根素，大豆苷，大豆苷元，3-甲氧基葛根素等活性成分，采用超声辅助离子液体提取活性成分，用于达成一定的药物治疗作用，提高其在工业中的实际应用。
离子液体作为提取剂，探索液固比，提取时间及提取温度对五种有效成分提取率的影响。提取温度范围为为30、40、60、70℃，提取时间为；研究3-羟基葛根素，葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元有效成分的提取率。
通过一系列的实验，研究其提取3-羟基葛根素，葛根素，大豆苷，大豆苷元，3-甲氧基葛根素等活性成分的最适宜条件，达到良好的提取效果，因葛根具有抗氧化活性，用DPPH自由基清除法测定其抗氧化活性，用抑制率表示抗氧化活性，抑制率越高，抗氧化活性越强，通过研究葛根，为进一步研究其他中药材的抗氧化活性打下坚实的基础。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一种绿色溶剂提取葛根5种异黄酮类活性成分的方法，包括如下步骤：
(1)将野生葛根进行粉碎，而后过筛，得到葛根样品；
(2)称取葛根样品于容器中，加入离子液体，然后加入去离子水，超声，摇匀静置后，进行离心，取上层清液，加入甲醇，混匀，过滤得到样品溶液，进行HPLC检测。
进一步的，步骤(1)具体步骤为：将野生葛根放入粉碎机进行粉碎，而后用不同规格的筛子过筛，得到不同颗粒度的样品，如小于24目，24-50目，50-70目，大于70目，将样片存放于样品袋于干燥阴暗的环境储存。
进一步的，所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑碘盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-丙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丙基-3-甲基咪唑醋酸盐中的一种；优选的，为1-丁基-3-甲基咪唑碘盐。
进一步的，准确称取葛根样品于容器中，加入离子液体，然后加入去离子水，将其放入数控超声波清洗器中超声，摇匀静置后，进行离心，取上层清液0.1mL，加入3.9mL 60％的甲醇，混匀，移用1mL，经0.45μm有机膜过滤得到样品溶液，进行HPLC检测。
进一步的，用离子液体提取的葛根样品提取液进行HPLC分析，分析条件如下：采用GL Sciences InertSustain C18 column(5μm，250mm×4.6mm)；用乙腈作为B泵，0.1％甲酸A泵作为流动相。
进一步的，洗脱程序为梯度洗脱方式，具体为：
0min：85％A,15％B；
16min:70％A,30％B；
30min：100％B,0％A；
31min：85％B,15％A；
40min：85％A,15％B。
进一步的，检测波长为λ＝260nm；流速为0.5mL/min；进样量为2.0μL。比较保留时间、峰面积、分离效果，并考察其重现性。
进一步的，提取温度为30、40、50、60℃，优选为40℃。
进一步的，提取时间为5-30min，优选为30min。
进一步的，葛根样品的用量为100g±0.5g；离子液体用量为100g。
进一步的，水量为1.0-5.0kg，优选为4.0kg。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种绿色溶剂提取葛根5种异黄酮类活性成分的方法；本发明研究了提取3-羟基葛根素，葛根素，大豆苷，大豆苷元，3-甲氧基葛根素等活性成分的最适宜条件，达到良好的提取效果，因葛根具有抗氧化活性，用DPPH自由基清除法测定其抗氧化活性，用抑制率表示抗氧化活性，抑制率越高，抗氧化活性越强，通过研究葛根，为进一步研究其他中药材的抗氧化活性打下坚实的基础。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为3-羟基葛根素标准曲线图；
图2为葛根素标准曲线图；
图3为3-甲氧基葛根素标准曲线图；
图4为大豆苷标准曲线图；
图5为大豆苷元标准曲线图；
图6为葛根中五种有效成分提取高效液相色谱图；
图7为温度对3-羟基葛根素提取率的影响；
图8为温度对葛根素提取率的影响；
图9为温度对3-甲氧基葛根素提取率的影响；
图10为温度对大豆苷提取率的影响；
图11为温度对大豆苷元提取率的影响；
图12为时间对3-羟基葛根素提取率的影响；
图13为时间对葛根素提取率的影响；
图14为时间对3-甲氧基葛根素提取率的影响；
图15为时间对大豆苷提取率的影响；
图16为时间对大豆苷元提取率的影响；
图17为水量对3-羟基葛根素提取率的影响；
图18为水量对葛根素提取率的影响；
图19为水量对3-甲氧基葛根素提取率的影响；
图20为水量对大豆苷提取率的影响；
图21为水量对大豆苷元提取率的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
材料与试剂
野葛根：济南中鲁医院；
甲醇：北京百灵威科技有限公司；
乙腈：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
甲酸：天津市光复精细化工研究所；
去离子水：山东省分析测试中心
葛根素标准品：上海源叶生物科技有限公司；
3-甲氧基葛根素标准品：上海源叶生物科技有限公司；
大豆苷标准品：上海源叶生物科技有限公司；
大豆苷元标准品：上海源叶生物科技有限公司；
3-羟基葛根素标准品：上海源叶生物科技有限公司；
IL-1:1-丁基-3-甲基咪唑氯盐；中科院兰州物理研究所监制；
IL-2:1-乙基-3-甲基咪唑溴盐；中科院兰州物理研究所监制；
IL-3:1-丁基-3-甲基咪唑碘盐；中科院兰州物理研究所监制；
IL-4:1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐；中科院兰州物理研究所监制；
IL-5:1-丙基-3-甲基咪唑溴盐；中科院兰州物理研究所监制；
IL-6:1-丙基-3-甲基咪唑醋酸盐；中科院兰州物理研究所监制。
实验仪器
BPG-9156A型精密鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；XS205型电子天平：METTLER TOLEDO；集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市英峪高科仪器厂；SPD-20A型液相色谱仪(紫外)：安捷伦1260；KQ-600KDE型数控超声清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司。
实施例1有效成分的标准曲线的绘制
称取3-羟基葛根素1.32mg于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，M＝0.132mg/mL；称取葛根素2.02mg于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，M＝0.202mg/mL；称取3-甲氧基葛根素2.14mg于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，M＝0.214mg/mL；称取大豆苷1.28mg于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，M＝0.128mg/mL；称取大豆苷元1.24mg于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，M＝0.124mg/mL；
取M＝0.132mg/mL的3-羟基葛根素0.5mL用60％的甲醇定容至10mL得到M＝6.6ug/mL；
取M＝0.202mg/mL葛根素2.5mL用60％的甲醇定容至10mL得到M＝5.5ug/mL；
取M＝0.214mg/mLl3-甲氧基葛根素1mL，用60％的甲醇定容至10mL得到M＝21.4ug/mL；
取M＝0.128mg/mL大豆苷0.5mL用60％的甲醇定容至10mL得到M＝6.4ug/mL；
取M＝0.124mg/mL大豆苷元0.5mL用60％的甲醇定容至10mL得到M＝6.2ug/mL取稀释后的3-羟基基葛根素、葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷0.2mL和40μL的稀释后的大豆苷元和160μL的60％的甲醇。
而后3-羟基基葛根素、葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元进行HPLC检测，以标准品浓度为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，分别得到3-羟基基葛根素、葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的曲线方程，如图1-5。
实施例2离子液体对葛根中五种有效成分提取效率的影响
准确称取100g(±0.5g)的葛根样品，于1L玻璃容器中，在提取时间30min，药材颗粒度大于70目，分别加入不同的离子液体提取溶剂(100g)，加水量3kg条件下，经HPLC检测，色谱图见图6，结果见下表。由表格得出IL-3提取效果最好。
表1不同离子液体的提取效率
实施例3温度对葛根中五种黄酮有效成分提取效率的影响
准确称取100g(±0.5g)的葛根样品于容器中，在提取时间10min，药材颗粒度大于70目，加入100g离子液体，加水量3kg条件下，选择提取温度分别为：30、40、50、60℃进行提取，结果如图7-11。葛根素，3-甲氧基葛根素，大豆苷含量随着温度的升高，先增加后降低，在40℃，提取含量最高，超过40℃后，随着温度升高，转化为其他物质。对于大豆苷元，随着温度升高，提取含量逐渐降低，即提取效率逐渐下降，对于3-羟基葛根素，温度越高，提取效率越高，综合考虑五种成分的含量，确定最佳提取温度40℃。
实施例4时间对葛根中五种黄酮有效成分提取效率的影响
准确称取100g(±0.5g)的葛根样品于容器中，在提取温度30℃，药材颗粒度大于70目，加入100g IL-3，加水量3kg条件下，选择提取时间分别为：5、15、20、30min进行提取，如图12-16所示，随着提取时间的延长，3-羟基葛根素，葛根素，3-甲氧基葛根素，大豆苷的含量不断增高，即其提取效率增强，大豆苷元随着时间的延长，其提取含量逐渐降低，提取率下降综合考虑最佳提取时间30min。
实施例5水量对葛根中五种黄酮有效成分提取效率的影响
准确称取100g(±0.5g)的葛根样品于容器，在提取温度30℃，提取所耗用时间10min，加入100g IL-3，药材颗粒度大于70目条件下，加水量分别为：1.0、3.0、4.0、5.0kg进行提取，经HPLC检测。从图17-21中可以看出大豆苷，葛根素随着加水量的增多，提取率呈先增加后减少的趋势，在加入水量4mL时，大豆苷，葛根素提取含量最高，提取率最佳。超过4mL以后提取量逐渐减少的原因是大豆苷、葛根素是脂溶性物质，加水量增多，导致提取液定容时60％甲醇的用量减少，脂溶性的有效成分没有溶解完全；3-羟基葛根素提取率是随着加水量的增多呈现增加趋势，即3-羟基葛根素的提取量也是随着加水量的增多而增加，因此，综合考虑选取料加水量4.0mL。
实施例6葛根提取物抗氧化活性
为了测定葛根的抗氧化能力，本实验采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除法。方法：称取DPPH自由基0.0132g用无水乙醇定容于250mL容量瓶中，放入冰箱保存备用，取葛根提取液40μL于4mL容器，加入DPPH 4mL，用恒温水浴锅在37摄氏度恒温反应20min，用紫外分光光度计在510nm处检验其吸光度。空白用DPPH 4mL和40μL的去离子水。
抑制率(％)＝[1-(AX-A0')/A0]*100
表2葛根提取物抗氧化活性
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种绿色溶剂提取葛根5种异黄酮类活性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将野生葛根进行粉碎，而后过筛，得到葛根样品；
(2)称取葛根样品于容器中，加入离子液体，然后加入去离子水，超声，摇匀静置后，进行离心，取上层清液，加入甲醇，混匀，过滤得到样品溶液，进行HPLC检测；
所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑碘盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-丙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丙基-3-甲基咪唑醋酸盐中的一种；
所述异黄酮类活性成分为3-羟基葛根素，葛根素，大豆苷，大豆苷元，3-甲氧基葛根素。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)具体步骤为：将野生葛根放入粉碎机进行粉碎，而后用不同规格的筛子过筛，得到不同颗粒度的样品，将样片存放于样品袋于干燥阴暗的环境储存。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑碘盐。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，准确称取的葛根样品于容器中，加入离子液体，然后加入去离子水，将其放入数控超声波清洗器中超声，摇匀静置后，进行离心，取上层清液0.1mL，加入3.9mL 60％的甲醇，混匀，移用1mL，经0.45μm有机膜过滤得到样品溶液，进行HPLC检测。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，用离子液体提取的葛根样品提取液进行HPLC分析，分析条件如下：采用GL Sciences InertSustain C18 column(5μm，250mm×4.6mm)；用乙腈作为B泵，0.1％甲酸A泵作为流动相。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，洗脱程序为梯度洗脱方式，具体为：
0min：85％A，15％B；
16min:70％A,30％B；
30min：100％B,0％A；
31min：85％B,15％A；
40min：85％A,15％B。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，检测波长为λ＝260nm；流速为0.5mL/min；进样量为2.0μL。
8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，提取温度为30、40、50、60℃。
9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，提取温度为40℃。
10.根据权利要求4所述方法，其特征在于，提取时间为5-30min。
11.根据权利要求4所述方法，其特征在于，提取时间为30min。
12.根据权利要求4所述方法，其特征在于，葛根样品的用量为100g±0.5g；离子液体用量为100g；
水量为1.0-5.0kg。
13.根据权利要求4所述方法，其特征在于，水量为4.0kg。
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