CN115745829B - 白鲜酰碱a及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
白鲜酰碱A及其制备方法和应用，它涉及一种化合物及其制备方法和该化合物的用途。本发明的目的是为了提供一种具有体外抗肿瘤活性的物质。白鲜酰碱A化学名为N‑(2‑羟基‑2‑(4‑羟基苯基)乙基)‑N‑甲基甲酰胺，分子式为C10H13NO3，分子量为195.0895。制备方法：一、将白鲜皮粉碎用95％乙醇提取；二、回收乙醇的浸膏用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取；三、乙酸乙酯萃取物经反复硅胶柱色谱，高效液相色谱分离，即得到单体化合物。本发明白鲜酰碱A具有抗人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞作用，其IC50值为57.6(μg/ml)及最低有效浓度6.25(μg/ml)。本发明属于有机物的提取领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物及其制备方法和该化合物的用途。
背景技术
肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。世界癌症报告估计，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。因此，可抑制肿瘤细胞的物质对挽救无数患者的生命具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种具有体外抗肿瘤活性的物质。
白鲜酰碱A的分子式为C10H13NO3，分子量为195.0895，分子结构式为：
白鲜酰碱A的制备方法如下：
一、将白鲜皮100公斤粉碎，每次15-20公斤置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95％的乙醇进行提取，提取温度为90℃，提取时间1小时每次，提取三次，合并提取液，得到乙醇提取液；
二、乙醇提取液进行浓缩至无乙醇，然后用等体积的水进行分散，再依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到萃取物；
三、将萃取物采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为(100∶0)-(0∶100)的混合液洗脱，将洗脱物a采用ODS液相色谱柱以甲醇与水体积比为(0∶100)-(90∶10)的甲醇和水的混合液为流动相进行洗脱，洗脱物b采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为(100∶0)-(0∶100)的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，再取洗脱物c经硅胶柱色谱以乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物为流动相进行洗脱，洗脱物d进行高效液相色谱分离，制备得白鲜酰碱A；
高效液相色谱分离色谱条件：色谱柱：C18，10μm，250×10.0mm；检测波长210nm、254nm；流动相甲醇与水体积比为10:90；进样量100μL；流速3mL/min；出峰时间为8.540min；
步骤三所述乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的体积比为15:8:4:1；
或者步骤三所述乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的体积比为6:4:4:1。
步骤一中索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，-0.8MPa负压浓缩，提取温度设定90℃。
所述白鲜酰碱A用于制备抗肿瘤的注射剂、冻干粉针、输液剂或口服制剂。
白鲜皮(Dictamnus dasycapus)，别名：白藓皮、八股牛、山牡丹、羊鲜草，芸香科多年生草本植物白鲜和狭叶白鲜的根皮，是常用的中药材及民间用药。春、秋二季采挖根部，除去泥沙及粗皮，剥取根皮，切片，干燥；生用；具有清热燥湿，祛风解毒之功效；在皮肤病的治疗中极其常用，主治：风热湿毒所致的风疹；湿疹；疥癣；黄疸；湿热痹。
本发明白鲜酰碱A提取自白鲜皮，化学名为：N-(2-羟基-2-(4-羟基苯基)乙基)-N-甲基甲酰胺(N-[2-Hydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-ethyl]-N-methyl-formamide)。
白鲜酰碱A为淡黄色油状物，薄层色谱经碘化铋钾显色检识为碱性；紫外254nm处有暗斑、紫外365nm处无荧光；用10％H2SO4溶液显色后的斑点为粉紫色。比旋光度为[α]25 D+62.5(c＝0.1,MeOH)；UV谱中白鲜酰碱A在277nm有一个最大吸收峰。HR-ESI-MS给出分子离子峰:[M+H]+为196.0968，提示分子式为C10H13NO3。
本发明方法获得的白鲜酰碱A的纯度高达98.6％以上。
本发明白鲜酰碱A具有体外抗肿瘤活性，本发明白鲜酰碱A具有抗人乳腺癌MDA-MB-231细胞作用，对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的IC50值为57.6(μg/ml)及最低有效浓度6.25(μg/ml)。可将本发明的白鲜酰碱A制成注射剂、冻干粉针、输液剂或口服制剂(包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液和缓控释制剂)等类型的抗肿瘤药物。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式白鲜酰碱A的分子式为C10H13NO3，分子量为195.0895，分子结构式为：
具体实施方式二：具体实施方式一所述白鲜酰碱A的制备方法如下：
一、将白鲜皮100公斤粉碎，每次15-20公斤置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95％的乙醇进行提取，提取温度为90℃，提取时间1小时每次，提取三次，合并提取液，得到乙醇提取液；
二、乙醇提取液进行浓缩至无乙醇，然后用等体积的水进行分散，再依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到萃取物；
三、将萃取物采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为(100∶0)-(0∶100)的混合液洗脱，将洗脱物a采用ODS液相色谱柱以甲醇与水体积比为(0∶100)-(90∶10)的甲醇和水的混合液为流动相进行洗脱，洗脱物b采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为(100∶0)-(0∶100)的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，再取洗脱物c经硅胶柱色谱以乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物为流动相进行洗脱，洗脱物d进行高效液相色谱分离，制备得白鲜酰碱A；
高效液相色谱分离色谱条件：色谱柱：C18，10μm，250×10.0mm；检测波长210nm、254nm；流动相甲醇与水体积比为10:90；进样量100μL；流速3mL/min；出峰时间为8.540min；
步骤三所述乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的体积比为15:8:4:1；
或者步骤三所述乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的体积比为6:4:4:1。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤三中乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为100∶5的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，将洗脱物a采用ODS液相色谱柱以甲醇与水体积比为10∶90的甲醇和水的混合液为流动相进行洗脱，洗脱物b采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为100∶10的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，再取洗脱物c经硅胶柱色谱以乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物为流动相进行洗脱，洗脱物d进行高效液相色谱分离，制备得白鲜酰碱A。其他与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤一中索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，-0.8MPa负压浓缩，提取温度设定90℃。其他与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：具体实施方式一至四所述白鲜酰碱A用于制备抗肿瘤的注射剂、冻干粉针、输液剂或口服制剂。
采用下述实验验证本发明效果：
实验一：
白鲜酰碱A的制备方法如下：
一、将100kg白鲜皮粉碎，每次15-20公斤置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95％的乙醇进行提取，提取温度为90℃，提取时间1小时每次，提取三次，合并提取液，得到乙醇提取液；
二、乙醇提取液进行浓缩至无乙醇后用等体积的水进行分散，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，对乙酸乙酯萃取物进行分离。()；
三、乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为100∶5的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，将洗脱物a采用ODS液相色谱柱以甲醇与水体积比为10:90的甲醇和水的混合液为流动相进行洗脱，洗脱物b采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为100∶10的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，洗脱物c经硅胶柱色谱以乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物(15:8:4:1)为流动相进行洗脱，洗脱物d进行高效液相色谱分离，制备得白鲜酰碱A1.5mg；
高效液相色谱分离色谱条件：色谱柱：C18，10μm，250×10.0mm；检测波长210nm、254nm；流动相甲醇与水体积比为10:90；进样量100μL；流速3mL/min；出峰时间为8.540min；
步骤三所述乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的体积比为15:8:4:1。
步骤三所述ODS柱色谱法采用反相硅胶。
本实验采用美国沃特世Waters 2545高效液相色谱仪，检测器为Waters2489紫外检测器。硅胶柱色谱法色谱柱的填料正相默克柱硅胶。
白鲜酰碱A的分子式为C10H13NO3，分子量为195.0895，分子结构式为：
本实验用100kg白鲜皮粉碎、提取，最终获得白鲜酰碱A为1.5mg，纯度高达98.6％以上。
白鲜酰碱A的核磁共振数据如表1所示。
表1
本实验制备的白鲜酰碱A为淡黄色油状物，薄层色谱经碘化铋钾显色检识为碱性；紫外254nm处有暗斑、紫外365nm处无荧光；用10％H2SO4溶液显色后的斑点为粉紫色。比旋光度为[α]25 D+62.5(c＝0.1,MeOH)；UV谱中白鲜酰碱A在277nm有一个最大吸收峰。HR-ESI-MS给出分子离子峰:[M+H]+为196.0968，提示分子式为C10H13NO3。
将处于对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于96孔板中(接种密度为7000个/孔)，37℃培养24h，弃掉原培养基，向孔板中分别加入含有不同浓度白鲜酰碱A的培养基(空白对照组、浓度组：6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)，继续37℃孵育。24h后每孔加入浓度为5mg/mL的MTT(二苯基四氮唑溴盐)20μL，37℃孵育4h。孵育结束后弃去上清，每孔加入150μL的DMSO(二甲基亚砜)震摇10min充分溶解孔板中的紫色结晶物，使用酶标仪于570nm下检测吸光度值，并计算IC50值为57.6(μg/ml)及最低有效浓度6.25(μg/ml)。
实验二：
白鲜酰碱A的制备方法如下：
一、将100kg白鲜皮粉碎，置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95％的乙醇进行提取，提取温度为90℃，提取时间1小时/次，提取三次，合并提取液，得到乙醇提取液；
二、乙醇提取液进行浓缩至无乙醇后用等体积的水进行分散，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，对得到乙酸乙酯萃取物进行分离；
三、乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为100∶5的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，将洗脱物a采用ODS柱色谱法，以甲醇与水体积比为10:90的甲醇和水的混合液为流动相进行洗脱，洗脱物b采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为100∶10的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，洗脱物c经硅胶柱色谱以乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物为流动相进行洗脱，洗脱物d进行高效液相色谱分离，制备得白鲜酰碱A1.5mg；
高效液相色谱分离色谱条件：色谱柱：C18，10μm，250×10.0mm；检测波长210nm、254nm；流动相甲醇与水体积比为10:90；进样量100μL；流速3mL/min；出峰时间为8.540min；
步骤三所述乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的体积比为6:4:4:1。
本实验采用美国沃特世Waters 2545高效液相色谱仪，检测器为Waters2489紫外检测器。硅胶柱色谱法色谱柱的填料为正相默克硅胶。
ODS柱色谱法采用反相硅胶。
白鲜酰碱A的分子式为C10H13NO3，分子量为195.0895，分子结构式为：
本实验制备的白鲜酰碱A为淡黄色油状物，薄层色谱经碘化铋钾显色检识为碱性；紫外254nm处有暗斑、紫外365nm处无荧光；用10％H2SO4溶液显色后的斑点为粉紫色。比旋光度为[α]25 D+62.5(c＝0.1,MeOH)；UV谱中白鲜酰碱A在277nm有一个最大吸收峰。HR-ESI-MS给出分子离子峰:[M+H]+为196.0968，提示分子式为C10H13NO3。
本实验用100kg白鲜皮粉碎、提取，最终获得白鲜酰碱A为1.5mg，纯度高达98.6％以上。
Claims (5)
1.白鲜酰碱A，其特征在于所述白鲜酰碱A的分子式为C10H13NO3，分子量为195.0895，分子结构式为：
2.权利要求1所述白鲜酰碱A的制备方法，其特征在于所述白鲜酰碱A的制备方法如下：
一、将白鲜皮100公斤粉碎，每次15-20公斤置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中用体积浓度为95%的乙醇进行提取，提取温度为90℃，提取时间1小时每次，提取三次，合并提取液，得到乙醇提取液；
二、乙醇提取液进行浓缩至无乙醇，然后用等体积的水进行分散，再依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到萃取物；
三、将乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为（100∶0）-（0∶100）的混合液洗脱，将洗脱物a采用ODS液相色谱柱以甲醇与水体积比为（0∶100）-（90∶10）的甲醇和水的混合液为流动相进行洗脱，洗脱物b采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为（100∶0）-（0∶100）的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，再取洗脱物c经硅胶柱色谱以乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物为流动相进行洗脱，洗脱物d进行高效液相色谱分离，制备得白鲜酰碱A；
高效液相色谱分离色谱条件：色谱柱：C18，10 μm，250×10.0 mm；检测波长210nm、254nm；流动相甲醇与水体积比为10:90；进样量100μL；流速3mL/min；出峰时间为8.540min；
步骤三所述乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的体积比为15:8:4:1；
或者步骤三所述乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的体积比为6:4:4:1。
3.根据权利要求2所述白鲜酰碱A的制备方法，其特征在于步骤三中乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为100∶5的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，将洗脱物a采用ODS液相色谱柱以甲醇与水体积比为10∶90的甲醇和水的混合液为流动相进行洗脱，洗脱物b采用硅胶柱色谱法，用二氯甲烷与甲醇体积比为100∶10的二氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，再取洗脱物c经硅胶柱色谱以乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和水的混合物为流动相进行洗脱，洗脱物d进行高效液相色谱分离，制备得白鲜酰碱A。
4.根据权利要求2所述白鲜酰碱A的制备方法，其特征在于步骤一中索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，-0.8MPa负压浓缩，提取温度设定90℃。
5.权利要求1所述的白鲜酰碱A的应用，其特征在于所述白鲜酰碱A用于制备抗肿瘤的注射剂、冻干粉针、输液剂或口服制剂。
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