CN108570418A - 一种烟曲霉菌琼脂珠及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟曲霉菌琼脂珠及其制作方法。首先制备烟曲霉菌孢子悬液，然后将烟曲霉菌孢子悬液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基混合，将混合物加入至含有矿物油的容器中，搅拌、离心，使其珠粒化，再加入无菌磷酸盐缓冲液洗涤，离心除油。筛选直径小于280μm的珠粒，调整琼脂珠内的孢子浓度至5×10⁶CFU/ml，即得。将本发明制备的含有烟曲霉菌的琼脂珠应用于试验动物，与对照组相比，未见任何异常的临床症状，采食量及增重差异不显著。该产品不仅达到烟曲霉菌在肺内定植目的，而且应用方便，未见不良的临床表现；可用于家禽烟曲霉菌肺内定植模型的建立，为进一步研究家禽的曲霉菌病及其与机体的相互作用提供前提。

Description

一种烟曲霉菌琼脂珠及其制作方法

技术领域

本发明涉及动物实验产品技术领域，具体涉及一种烟曲霉菌琼脂珠及其制作方法。

背景技术

烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)属于曲霉菌属，是霉菌中最常见的条件性致病菌，属于畜禽及人肠道正常真菌属之一，而且还以孢子的形式广泛分布于空气中，其粒径约为2-3μm，可随呼吸进入呼吸道深部以及肺泡。

在畜禽养殖中，由于饲养管理疏忽，饲料和垫料容易发霉产生霉菌，其中烟曲霉菌最为常见，其产生的孢子分散到空气中可以被动物吸入，正常动物吸入孢子后一般不会引起呼吸系统的感染，但是对于免疫低下的个体，可能会引起以肺和气囊感染为特征的曲霉菌病，家禽中以雏鸡和鹅最为易感。

为阐明烟曲霉菌的发病机制，寻找敏感的诊断方法及有效的治疗药物，迫切需要可靠的实验动物模型。但目前的研究资料大部分集中于该菌自然病例的报道，或是通过人工干预直接感染动物导致发病的报道，人工干预的方法包括腹腔注射、气囊注射和气管外注射等。然而实际生产中大部分动物个体虽然吸入该菌孢子但并不发病，这可能与烟曲霉菌在呼吸道内能否定植有关，也可能源于定植后局部对病原的清除能力。因而，建立烟曲霉菌在禽肺内的定植而非感染模型，监测该菌的脏器定植时间，不仅可以确定烟曲霉菌在禽肺内的定植能力，而且还可以为深入的免疫学研究、开发有效的治疗药物提供前期工作。

但对于烟曲霉菌究竟是否可以通过呼吸定植在肺中，定植时间多长，如何模仿自然状态建立烟曲霉菌的定植而非感染模型目前尚未见到报道，再加之呼吸道对异物的排斥性，因此，研究开发一种能够使烟曲霉菌在畜禽肺内有效定植的产品、建立定植模型一直是该领域的技术难点所在。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供烟曲霉菌琼脂珠及其制作方法。采用本发明制备的烟曲霉菌琼脂珠可以使烟曲霉菌定植在家禽呼吸道，模拟自然发生状态，为研究机体与烟曲霉菌活菌丝的相互作用提供了基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种烟曲霉菌琼脂珠的制作方法，包括如下步骤：

(1)制备烟曲霉菌孢子悬液；

(2)将步骤(1)制备的烟曲霉菌孢子悬液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基混合，将混合后的混合物加入至含有矿物油的容器中，搅拌，离心，使其珠粒化，倒掉上清后，加入无菌磷酸盐缓冲液，离心，洗涤除油，筛选直径小于280μm的珠粒，调整琼脂珠内的孢子浓度至5×10⁶CFU/ml，即得。

优选的，步骤(1)中，烟曲霉菌孢子悬液的制备方法为：将烟曲霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，37℃培养4天；用含有0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液冲洗培养基，并收集孢子悬液，10000rpm，离心3min，去上清，再用含有0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液重悬，最后用8层无菌纱布过滤；在显微镜下用血细胞计数板计数，调整浓缩孢子悬液浓度为1.0×10⁹CFU/ml。

优选的，步骤(2)中，烟曲霉菌孢子悬液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基按体积比1：(0.5-1.5)混合；更为优选的，烟曲霉菌孢子悬液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基按体积比1：1混合。

优选的，步骤(2)中，将混合后的混合物迅速加入至含有矿物油的烧瓶中，先室温搅拌6min，然后碎冰上搅拌10min；再移至离心管中，4℃，9000rpm离心20min，使其珠粒化。

优选的，步骤(2)中，加入无菌磷酸盐缓冲液，室温下，400rpm离心10min。

优选的，步骤(2)中，利用平板计数法CFU以定量琼脂珠粒内的分生孢子数，浓度高时加入适量琼脂进行稀释，直至调整至琼脂珠内的孢子浓度为5×10⁶CFU/ml。

本发明的第二方面，提供由上述方法制备得到的烟曲霉菌琼脂珠。

本发明的第三方面，提供上述烟曲霉菌琼脂珠在建立烟曲霉菌定植动物模型中的应用。

本发明的第四方面，提供一种烟曲霉菌定植动物模型的构建方法，步骤如下：

将上述制备的含有烟曲霉菌分生孢子的琼脂珠导入到试验动物的气管内，并注入空气，随试验动物吸气，使琼脂珠进入试验动物的肺部。

术语说明：

家禽：本文中的“家禽”包括鸡、鸭、鹅等。

本发明的有益效果：

(1)本发明制备的烟曲霉菌琼脂珠为胶冻状，颗粒直径大小为小于280μm，可以在4℃条件下保存6个月，在适当的条件下能生长繁殖；而且操作简单，制作成本低。

(2)将本发明制备的含有烟曲霉菌的琼脂珠应用于试验动物，未见任何异常的临床症状、与对照组相比，采食量及增重差异不显著，该产品不仅达到烟曲霉菌在肺内的定植目的，而且应用方便，未见不良的临床表现；可用于家禽的烟曲霉菌定植，为进一步研究烟曲霉菌与机体的相互作用提供前提。

(3)本发明还提供了一种烟曲霉菌定植肺的动物模型的构建方法，将上述的琼脂珠采用气管内注射即构建得到动物模型，模型构建方法简单，可重复性好，成功率高，安全性强，该方法构建的动物模型可以模拟自然发生状态，使吸入的孢子在肺内发芽生长，可以使烟曲霉菌长期定植在呼吸道内。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：烟曲霉菌琼脂珠接种3dpi PDA培养结果；

图2：烟曲霉菌琼脂珠接种10dpi PDA培养结果；

图3：烟曲霉菌琼脂珠接种24dpi PDA培养结果；

图4：烟曲霉菌琼脂珠接种29dpi PDA培养结果；

图5：肺组织培养物镜下形态；

图6：肺组织GMS染色。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中对于烟曲霉菌究竟是否可以通过呼吸定植在肺中，定植时间多长，如何模仿自然状态建立烟曲霉菌的定植而非感染模型尚未有相关报道，再加之呼吸道对异物的排斥性，因此，如何构建烟曲霉菌肺部定植动物模型一直是本领域的技术难点所在。基于此，本发明提出了一种烟曲霉菌琼脂珠及其制作方法，并将其用于烟曲霉菌肺部定植动物模型的构建，取得了非常好的效果。

在本发明的一种实施方案中，给出了一种烟曲霉菌琼脂珠的制作方法，包括如下步骤：

(1)制备烟曲霉菌孢子悬液：将烟曲霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)进行培养，收集孢子悬液，并将孢子悬液浓缩至一定浓度。

(2)制备烟曲霉菌琼脂珠：将步骤(1)制备的烟曲霉菌孢子悬液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基混合，将混合后的混合物加入至含有矿物油的容器中，搅拌，离心，使其珠粒化，倒掉上清后，加入无菌磷酸盐缓冲液，离心，洗涤，筛选直径小于280μm的珠粒，调整琼脂珠内的孢子浓度至5×10⁶CFU/ml，即得。

上述实施方案中制备的烟曲霉菌琼脂珠在动物呼吸道内的相容性较好，能够减轻呼吸道对异物的排斥性，方便模拟自然发生状态，使烟曲霉菌琼脂珠内的孢子在肺内发芽生长，使烟曲霉菌长期定植在呼吸道内。

基于本发明制备的烟曲霉菌琼脂珠的性能，在本发明的另一种实施方案中提供了烟曲霉菌定植肺的动物模型的构建方法，将上述的烟曲霉菌琼脂珠采用气管内注射，随实验动物的吸气，烟曲霉菌琼脂珠进入肺内，即完成动物模型的构建。

采用本发明实施方案构建的动物模型对实验动物基本不会造成物理伤害，建模后的实验动物未出现异常的临床症状，与空白对照组相比，采食量及增重差异不显著，达到了烟曲霉菌在肺内定植的目的。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：

(1)烟曲霉菌孢子悬液的制备

用金属接种环挑取烟曲霉菌(菌株号为CCCCMIDA1，购自中国医学科学院皮肤科和病理学研究所)接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，37℃培养4天。用含有0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液冲洗培养基，并收集孢子悬液，10000rpm，离心3min，去上清，再用含有0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液重悬，最后用8层无菌纱布过滤。在显微镜下用血细胞计数板计数，调整浓缩孢子悬液浓度为1.0×10⁹CFU/ml。

(2)烟曲霉菌琼脂珠的制备

配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基100ml，121℃，15min，高压灭菌。取52℃(选取52℃主要考虑两方面的因素，一是温度低于50℃培养基易凝固，二是温度高于55℃会影响烟曲霉活性，综合平衡培养基的状态和烟曲霉菌的活性，本发明优选为52℃)的马铃薯葡萄糖琼脂培养基20ml与20ml浓缩的烟曲霉菌孢子悬液混合，然后将混合物迅速加入含有40ml的52℃矿物油的烧瓶中，快速放到磁力搅拌器上，放入无菌磁转子，室温条件下搅拌6min，然后碎冰上搅拌10min。将该混合物分装至无菌的50ml离心管中，4℃，9000rpm离心20min，使其珠粒化，倒掉上清后，加入20ml无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，在室温下，400rpm离心10min，将珠子洗涤四次。通过金属分级筛，使珠粒通过金属网，选择直径小于280μm的珠粒，利用平板计数法计数CFU以定量琼脂珠粒内的分生孢子数，浓度高时，可加入适量的琼脂稀释，直至调整琼脂珠内的孢子浓度为5×10⁶CFU/ml时，无菌检测后作为接种物，置灭菌容器内4℃冷藏保存。

琼脂珠内的孢子浓度对烟曲霉菌在肺中定植效果有非常重要的影响，所以需要对琼脂珠内的孢子浓度进行调整，若孢子浓度过高容易造成感染；若孢子浓度过低则很快被机体清除，造成定植不成功。本发明对琼脂珠内的孢子浓度进行了优化，结果发现，琼脂珠内的孢子浓度为5×10⁶CFU/ml时，能够不感染发病而且还能在肺中成功定植。

另外，对于琼脂珠内的孢子浓度的定量是珠粒化成型后定量，稀释时加入的琼脂是离心珠粒化后的，除了没有添加烟曲霉菌孢子，其他过程都一样，所以不影响琼脂珠的形态。

实施例2：烟曲霉菌定植雏鸡呼吸道模型的构建

1.试验动物：

SPF鸡60只，9日龄，购自济南斯帕法斯家禽有限公司，饲养在山东农业大学动物科技学院动物房，常规饲料饲养，自由饮水，当SPF雏鸡饲养到14日龄时，开始进行烟曲霉琼脂珠(实施例1制备)接种，途径为气管内注射，剂量为300μl。

2.构建方法：

将14日龄雏鸡抱定，站立位并使其口腔张开，在光照充足的情况下充分显示其口咽、喉的位置。操作者采用1ml注射器吸取300μl烟曲霉菌琼脂珠(实施例1制备)，并使用8号弯型饲喂针，当雏鸡呼吸喉口开放时，迅速将饲喂针通过喉口插入气管、插入深度为3cm左右，缓慢地将300μl烟曲霉菌琼脂珠注射到气管内，并注入100μl空气，轻微左右摇晃，随着雏鸡吸气，烟曲霉菌琼脂珠进入肺部，然后待雏鸡恢复30-40s后可直接放回。空白组不做任何处理。

3.试验结果：

(1)试验动物的一般情况

雏鸡接种烟曲霉琼脂珠后，开始呼吸困难，30-40s左右恢复正常。与对照组相比，未见任何异常的临床症状、采食量及增重差异不显著。

(2)肺部真菌培养

雏鸡在烟曲霉菌定植后第1，3，10，17，24，29，31天处死，收集肺放置在无菌离心管内。取新鲜肺组织用灭菌剪刀剪碎放置新的无菌离心管，组织研磨后取100μl上清于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，用涂布器涂抹均匀，37℃培养4天。

实验结果显示：直到接种后第29天，试验组烟曲霉菌培养为阳性，空白组为阴性，第31天两组均为阴性。其中部分实验结果如图1-4所示。

(3)肺组织培养物中烟曲霉菌检测

使用细针轻轻刮一下培养物蘸在盛有一滴生理盐水的载玻片上，轻轻涂布均匀，盖上盖玻片，去掉气泡，酒精灯固定。在显微镜下，先低倍观察，找到目标再换高倍镜观察，确定培养物为烟曲霉菌，结果如图5所示。

(4)肺组织切片中菌丝观察

雏鸡在烟曲霉菌定植后第1，3，10，17，24，29，31天处死，收集肺放置在4％甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，GMS染色，观察肺组织中的菌丝，部分结果如图6(图6为第29天的染色结果)所示。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种烟曲霉菌琼脂珠的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备烟曲霉菌孢子悬液；

(2)将步骤(1)制备的烟曲霉菌孢子悬液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基混合，将混合物加入至含有矿物油的容器中，搅拌，离心，使其珠粒化，倒掉上清后，加入无菌磷酸盐缓冲液，离心，洗涤除油，筛选直径小于280μm的珠粒，即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，烟曲霉菌孢子悬液的制备方法为：将烟曲霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，37℃培养4天；用含有0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液冲洗培养基，并收集孢子悬液，10000rpm，离心3min，去上清，再用含有0.1％吐温80的磷酸盐缓冲液重悬，过滤；调整浓缩孢子悬液浓度为1.0×10⁹/ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，烟曲霉菌孢子悬液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基按体积比1：(0.5-1.5)混合。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，烟曲霉菌孢子悬液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基按体积比1：1混合。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将混合后的混合物迅速加入至含有矿物油的烧瓶中，先室温搅拌6min，然后碎冰上搅拌10min；再移至离心管中，4℃，9000rpm离心20min，使其珠粒化。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加入无菌磷酸盐缓冲液，室温下，400rpm离心10min，除油。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，利用平板计数法CFU以定量琼脂珠粒内的分生孢子数，浓度高时加入适量琼脂进行稀释，直至调整至琼脂珠内的孢子浓度为5×10⁶/ml。

8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制作得到的烟曲霉菌琼脂珠。

9.权利要求8所述的烟曲霉菌琼脂珠在建立烟曲霉菌定植动物模型中的应用。

10.一种烟曲霉菌定植动物模型的构建方法，其特征在于，步骤如下：

将权利要求8所述的烟曲霉菌琼脂珠导入到试验动物的气管内，并注入空气，随试验动物吸气，促使琼脂珠进入试验动物的肺部。