CN111172074A - 一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌Probio-M8及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌Probio‑M8及应用。本申请以APP/PS1小鼠为实验对象，通过与野生型小鼠配对繁殖生产的小鼠中选择7只基因型为APP/PS1的小鼠，随机分为两组后，一组灌胃乳双歧杆菌Probio‑M8，另一组灌胃生理盐水，测定小鼠脑中Aβ斑块数量的变化情况，实验结果证明，乳双歧杆菌Probio‑M8具有缓解改善阿尔茨海默症状的作用。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌及应用。
背景技术
随着我国人均期望寿命的提高和老龄化社会的步步逼近，一种古老但又严重威胁老年人健康乃至社会发展的疾病--阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，又称老年性痴呆，一种中枢神经系统变性病，开始大面积地出现在我国老年人群中。临床上主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。和其它老年性疾病不同，阿尔茨海默病至今发病原因不明，尚无有效的治疗药物，但它对患者及其家庭的严重危害却使任何一种老年性疾病瞠乎其后。特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。目前认为AD是由遗传因素、环境因素和代谢因素等多种因素共同作用所引起的一种病理过程。
双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物。双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能，目前双歧杆菌已成为人体健康的重要指标之一。近年来双歧杆菌在食品、保健以及医疗方面的功效及前景已被更多的人重视。由于益生菌菌株益生效果各异，目前缺乏高效、安全、无毒副作用且有效缓解阿尔茨海默症的益生菌。
发明内容
本申请的目的之一在于提供一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌；
本申请的目的之二在于提供乳双歧杆菌Probio-M8在缓解改善阿尔茨海默症状的应用；
进一步地，所述乳双歧杆菌Probio-M8在发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
本申请的目的之三在于提供乳双歧杆菌Probio-M8在改善因阿尔茨海默病而引起的重要病理特征的应用，所述重要病理特征包括Aβ斑块沉积、Aβ斑块斑块数量多和Aβ斑块面积大。
本申请的乳双歧杆菌Probio-M8是通过以下技术方案实现的：
步骤1：将一株新分离的菌种接入到MRS液体培养基，于37℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力，对菌液进行倍比稀释，得到10-1-10-7稀释梯度，分别吸取200μL 10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液，均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h。
步骤2：挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h。
步骤3：待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检，保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析，经过分析后命名为乳双歧杆菌Probio-M8。
本申请提供一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌Probio-M8，所述乳双歧杆菌Probio-M8(Bifidobacterium lactis Probio-M8)是2017年从84份中国健康妇女母乳中分离所得的364株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌，该菌株保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.18610；分类命名为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)；保藏时间：2019年09月20日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。
本申请提供一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌Probio-M8。本申请以APP/PS1小鼠为实验对象，通过与野生型小鼠配对繁殖生产的小鼠中选择7只基因型为APP/PS1的小鼠，随机分为两组后，一组灌胃乳双歧杆菌Probio-M8，另一组灌胃生理盐水，测定小鼠脑中Aβ斑块数量的变化情况，证明乳双歧杆菌Probio-M8具有缓解改善阿尔茨海默症状的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为灌胃生理盐水组的小鼠大脑切片Aβ染色图；
图2为灌胃乳双歧杆菌Probio-M8小鼠大脑切片Aβ染色图。
具体实施方式
本申请提供一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌Probio-M8，所述乳双歧杆菌Probio-M8(Bifidobacterium lactis Probio-M8)是2017年从84份中国健康妇女母乳中分离所得的364株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌，该菌株保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.18610；分类命名为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)；保藏时间：2019年09月20日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。
本申请的乳双歧杆菌Probio-M8是通过以下技术方案实现的：
于2017年从84份中国健康妇女母乳中分离所得364株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的乳双歧杆菌Probio-M8。
分离纯化的步骤如下：
步骤1、将一株新分离的菌种接入到MRS液体培养基，于37℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力，对菌液进行倍比稀释，得到10-1-10-7稀释梯度，分别吸取200μL 10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液，均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h。
步骤2、挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h。
步骤3、待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检，保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析，经过分析后命名为乳双歧杆菌Probio-M8。
具体地，乳双歧杆菌Probio-M8的研究设计，包括：
A.以乳双歧杆菌Probio-M8(Bifidobacterium lactis Probio-M8)为研究对象，选择APP/PS1的转基因1只2月龄雄性小鼠与野生型的3只同龄雌性小鼠自发配对繁殖生产；
B.待30天后18只胎鼠出生，给所有胎鼠进行基因型鉴定，获得APP/PS1小鼠及野生型小鼠数量；
C.正常饲养小鼠至其4月龄后，选择7只基因型为APP/PS1的小鼠随机分为两组，一组灌胃乳双歧杆菌Probio-M8(4只)，另一组灌胃生理盐水(3只)，灌胃时间共持续45天；
D.45天后处死小鼠，取出小鼠脑组织，于4％多聚甲醛中4℃固定24h后，取出小鼠大脑组织梯度浸泡于10％、20％、30％蔗糖-PBS溶液中脱水，每个梯度均在4℃下脱水24h。用OCT包埋剂将脱水后的脑组织包埋后，冻存于-80℃冰箱中；
E.通过冷冻切片及免疫荧光染色方法，用蔡司Axio Imager.Z2-荧光显微镜可扫描整张脑片，根据拍出照片统计出现的Aβ数量及大小。
进一步地，为保证小鼠摄入足够的活菌，每日配制的乳双歧杆菌Probio-M8是由益生菌冻干粉溶解于生理盐水中，控制乳双歧杆菌Probio-M8浓度为1.0×109CFU/mL，灌胃体积为0.1mL/10g小鼠体重，同时对照组摄入0.1mL生理盐水/10g小鼠体重。
进一步地，处死小鼠使用2％戊巴比妥钠按照0.026mL/10g小鼠体重进行麻醉，小鼠完全麻醉后用眼科剪剪开胸腔皮肤，暴露出心脏，找到小鼠右心耳，用剪刀剪开，使其血液流出，用镊子稍微固定稳住心脏，将吸满生理盐水的10mL一次性注射器迅速插入左心尖，缓慢匀速灌注生理盐水。
进一步地，冷冻切片及免疫荧光染色方法是准备15张载玻片，从小鼠嗅球部位开始沿冠状面连续切片，尽量不丢弃脑片，按15张载玻片顺序贴片，每张载玻片贴10-15张脑片，保证一张载玻片上有大部分脑区的脑片，将贴片后的切片保存于-80℃冰箱中。
进一步地，免疫荧光染色可按如下步骤进行：
步骤a：染色时从冰箱中选出切片，复温15min，使用0.01M PBST漂洗5min×3；
步骤b：用含5％山羊血清-PBST于湿盒内封闭30min；
步骤c：将Aβ抗体以1:1000比例稀释，每张载玻片滴加250μL稀释后抗体，放置于湿盒中4℃过夜(孵育一抗)，第二天从冰箱中拿出湿盒，用PBST漂洗载玻片5min×4，配制稀释比例为1:500的荧光二抗，每张载玻片滴加250μL荧光二抗，避光室温孵育1h(孵育二抗)；
步骤d：用PBS洗净载玻片上二抗5min×4，将DAPI 1:1000稀释后滴加于载玻片上5min；
步骤e：用PBS清洗一次，5min，甘油封片；
步骤f：使用荧光显微镜镜检，观察拍照。
进一步地，小鼠的饲养及操作流程均严格按照美国NIH机构及暨南大学实验动物中心的规定执行。所使用的生理盐水为市面可购买到的无菌生理盐水。以下实施例使用的原始APP/PS1双转基因雄性小鼠购自南京大学-南京生物医药研究院(SCXK2015-0001)小鼠饲养于暨南大学实验动物中心SPF级动物房，每笼小鼠数量小于6只，饲养条件为：恒温(20±2℃)恒湿(40-60％)，小鼠可自由饮食和饮水，光照条件为12h白天/黑夜。
实验例：乳双歧杆菌Probio-M8在小鼠临床疗效观察试验中的应用分析
实验方法：以乳双歧杆菌Probio-M8(Bifidobacterium lactis Probio-M8)为研究对象，选择APP/PS1的转基因1只2月龄雄性小鼠与野生型的3只同龄雌性小鼠自发配对繁殖生产。待30天后18只胎鼠出生，给所有胎鼠进行基因型鉴定，获得APP/PS1小鼠及野生型小鼠数量。正常饲养小鼠至其4月龄后，选择7只基因型为APP/PS1的小鼠随机分为两组，一组灌胃乳双歧杆菌Probio-M8(4只)、另一组灌胃生理盐水(3只)，灌胃时间共持续45天。45天后处死小鼠，取出小鼠脑组织，于4％多聚甲醛中4℃固定24h后，取出小鼠大脑组织梯度浸泡于10％、20％、30％蔗糖-PBS溶液中脱水，每梯度均在4℃下脱水24h。用OCT包埋剂将脱水后的脑组织包埋后，冻存于-80℃冰箱中。通过冷冻切片及免疫荧光染色方法，用蔡司Axio Imager.Z2-荧光显微镜可扫描整张脑片，根据拍出照片统计出现的Aβ数量及大小。
实验结果参见图1和图2。两组数据对比分析得出，持续灌胃45天乳双歧杆菌Probio-M8的小鼠脑中Aβ斑块数量相比灌胃生理盐水组(对照组)有显著减少，其中面积较大的Aβ斑块数量也有所下降。证明了通过口服乳双歧杆菌Probio-M8干预4月龄APP/PS1小鼠可减少阿尔兹海默病特殊病理特征-Aβ斑块数量及面积。反映出乳双歧杆菌Probio-M8具有缓解改善阿尔茨海默症状的作用。
本申请提供一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌Probio-M8。本申请以APP/PS1小鼠为实验对象，通过与野生型小鼠配对繁殖生产的小鼠中选择7只基因型为APP/PS1的小鼠，随机分为两组后，一组灌胃乳双歧杆菌Probio-M8，另一组灌胃生理盐水，测定小鼠脑中Aβ斑块数量的变化情况，证明乳双歧杆菌Probio-M8具有缓解改善阿尔茨海默症状的作用。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (4)
1.一株具有缓解改善阿尔茨海默症状的乳双歧杆菌Probio-M8，其特征在于，所述乳双歧杆菌Probio-M8(Bifidobacterium lactis Probio-M8)是从84份中国健康妇女母乳中分离所得的364株乳酸菌和双歧杆菌中筛选出的一株具有潜在益生特性的益生菌，该菌株保藏于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.18610。
2.权利要求1所述的乳双歧杆菌Probio-M8在缓解改善阿尔茨海默症状的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乳双歧杆菌Probio-M8在发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
4.权利要求1所述的乳双歧杆菌Probio-M8在改善因阿尔茨海默病而引起的重要病理特征的应用，所述重要病理特征包括Aβ斑块沉积、Aβ斑块斑块数量多和Aβ斑块面积大。
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