CN108562685A - 一种黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物质量检测方法，包括以下步骤：（1）薄层色谱鉴别：对黄精、桑叶和玉竹分别进行薄层色谱鉴别；（2）多糖含量测定：采用苯酚‑硫酸法或蒽酮‑硫酸法鉴定组合物中的多糖含量；（3）5‑羟甲基糠醛含量测定：采用HPLC检测组合物中5‑羟甲基糠醛含量；（4）其他测试：水分含量测试、灰分含量测试和浸出物含量测试。本发明检测方法中对于配方中的关键成分的重要指标设计针对性检测分析，确定组合物中具有相应功效作用的天然药物化学成分的含量得到验证，保证药物组合物的应用效果更好的达到设计预期。

Description

一种黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药质量检测方法，特别是一种黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物的质量检测方法，属于中药技术领域。

背景技术

社会快速发展，人们饮食习惯不竭改变，由于饮食不合理不健康导致的糖尿病发病率逐年增长，现已逐步发展并成为了第三大危害人类身体健康的慢性疾病。现有技术中对于糖尿病的治疗大多采用胰岛素或化学合成药物进行降糖，属于外源性因素降糖，对于身体机能的正常运行具有一定干扰作用，长期食用的安全性不尽人意。

传统中医理论认为人体生病都是因为身体正常的机能被外因扰乱，而这些外因通常是伴随饮食过程进入人体。所以，传统医学理念中坚信药食同源，药品和食品密不可分，食疗机制是扶正固本促进人体功能的正常化，具有顺应自然的特点。另外，饮食治疗由于其可接受程度高、易于坚持等特点，在降血糖辅助治疗中有一定优势。

在中药领域，2015版中国药典收载的黄精来源于百合科植物滇黄精Polygonatumkingianum Coll.etHemsl.、黄精Polygonatum sibiricumRed.或多花黄精PolygonatumcyrtonemaHu a的枯燥根茎。按各自的形状不同，习惯上也叫做“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。中药玉竹来源于百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(MilL)Druce的枯燥根茎。黄精和玉竹都是既可以作药用也可以食用的两味常见中药。中药桑叶来源于桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶，善于散风热而泄肺热，常用语清热宣肺。

黄精、玉竹、桑叶均为药食同源之品，近年来的研究发现，黄精、桑叶和玉竹三者均有降血糖的功效。这些天然药物含有的生物碱类、黄酮类、多糖类天然产物化学成分，其中多种成分具有降血糖功效作用，这使得配方的整体质量研究变得更加复杂。

发明人在之前的研究报道中提出了黄精、桑叶和玉竹三者共同组方制成辅助治疗糖尿病的方案，三者组方经过科学研究确定了辅助降血糖的作用，但是目前尚无这三种中药材组方后的质量标准报道。如何确保组方标准检验方法可靠易行是该配方正式向市场推广之前的难题所在，特别是配方中多种中药材原料中所含有的天然药物化学成分不同，可能存在相互影响，使得检验分析方法的确定更加困难。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中缺少关于黄精、桑叶和玉竹配伍的中药组合物质量检测方法，不利于控制三者组方的质量稳定性和可靠性的不足，提供一种黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物质量检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供一种技术方案：

一种黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物质量检测方法，包括以下步骤：

(1)薄层色谱鉴别：对黄精、桑叶和玉竹分别进行薄层色谱鉴别。

(2)多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法鉴定组合物中的多糖含量。

(3)5-羟甲基糠醛含量测定：采用HPLC检测组合物中5-羟甲基糠醛含量。

(4)其他测试：水分含量测试、灰分含量测试和浸出物含量测试。

本发明黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物质量检测方法，首先针对组合物中各种原料的来源、药材的真伪性进行鉴别，严格防止市场上可能存在的假冒伪劣原料成分进入药物组合物当中。然后，再结合配伍药物发挥降血糖功效的主要成分多糖进行重点含量测定，已知黄精、玉竹中多糖类成分，桑叶中生物碱、黄铜和多糖等，均具有降血糖作用，而其中多糖是三者降血糖作用的关键组分，因而对于多糖成分的含量进行检测是确保组合物辅助降血糖功效作用有效、可靠的关键检测技术点之一。通过检测分析药物组合物中多糖含量能够有效的保障组合物的最终治疗功效可靠性。

再然后，对于炮制过程中炮制程度的重点指标5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量进行测定，确定药物组合物达到适宜炮制程度，具有更好的食疗功效作用。

最后，对于药物组合物中的水分、灰分和浸出物含量进行测定，从大方向检验确定药物组合物的整体质量品质表现，避免污染、杂质成分的影响破坏，提升药物组合物配伍应用以后的一致性。

通过本发明的检测方法可以针对性的检验确定黄精、桑叶和玉竹配伍组合物的品质表现的重要指标，能够很好的控制三者配伍的药物组合物的质量。对于发明人前期药效学实验确定的黄精、桑叶和玉竹配伍组合物的品质控制提供了可靠的保障，使之转化为具体的产品以后依然能够有效的发挥配方所具有的较好的辅助降糖效果。

进一步，步骤1，薄层鉴别包括：黄精的薄层鉴别、桑叶的薄层鉴别和玉竹的薄层鉴别中的至少一种。

优选地，步骤1，薄层色谱鉴别至少包括黄精的薄层色谱鉴别。

进一步，步骤1，桑叶的薄层鉴别方法如下：

(101A)桑叶供试品溶液制备：精密称量桑叶，加入石油醚，水浴锅回流加热，抽滤，将药渣挥干；然后加入乙醇超声提取，滤过，保留滤液，将滤液蒸发干，得残渣，加水加热溶解，滤过，滤液蒸干；最后加入了甲醇将残渣溶解，得到桑叶供试品溶液。

(101B)黄精、桑叶和玉竹供试品溶液：称取黄精、桑叶和玉竹组合物，用石油醚加热回流提取，弃去石油醚液，挥干药渣；药渣加入乙醇超声提取，过滤，保留滤液，蒸干滤液得残渣；加水溶解残渣，再滤过，蒸干滤液，最后加甲醇使残渣溶解，完成黄精、桑叶和玉竹配伍的供试品溶液的制备。

(101C)阴性供试品溶液的制备：精密称取黄精和玉竹，按照101B步骤制备得到阴性供试品溶液的制备。

(101D)对照药材的制备：取桑叶对照药材，按照101B步骤制备得到对照药材溶液。

(105E)TLC色谱鉴别：采用硅胶板，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，进行展开，展开完成后晾干，喷以3-6wt.％香草醛硫酸溶液，加热至斑点呈色清晰，最后置于紫外光灯下检视。优选紫外灯的紫外光线波长为365nm。优选地，使用5％香草醛硫酸溶液。

对比101A-101D的各个供试品和对照药材，确定其中主要显色点，排除干扰检测结果的显色点，供试品和对照药材中没有的显色点不得出现。

桑叶的薄层色谱鉴别过程包括对于供试品的制备、对照品、阴性供试品等不同情况下的检测，对比分析不同的显色结果可以确定黄精、桑叶和玉竹配伍组合物的薄层色谱特征显色点，记录重点显色点，准确排除干扰项影响，实现精确的黄精、桑叶和玉竹配伍组合物鉴别。

进一步，优选步骤101A，精密称量桑叶2g，随后加入(馏程60～90℃)石油醚30mL，水浴锅上回流加热30分钟，抽滤之后弃去石油醚液。药渣挥干，加入乙醇30mL，超声20分钟，滤过，保留滤液，将滤液蒸发干，留下的残渣加热水10mL，在60℃水浴上边溶解边搅拌，滤过，滤液蒸干，最后加入了甲醇1mL将残渣溶解，完成了桑叶供试品溶液的制备。

进一步，优选步骤101B，电子天平精密称取黄精4g、桑叶2g、玉竹2g，量取石油醚(馏程60～90℃)120mL加入，加热回流30分钟，丢弃过滤的石油醚液，药渣挥干，接着加入乙醇120mL，超声20分钟，过滤，蒸干滤液，加热水40mL到残渣中，在60℃水浴上搅拌溶解残渣，抽滤，蒸干滤液，用甲醇1mL溶解残渣，完成黄精、桑叶和玉竹配伍的供试品溶液制备。

进一步，步骤105E，硅胶板为硅胶和0.7CMC-Na按照1：3重量比例混合制成的硅胶板。经过发明人反复研究尝试，确定采用上述配合比例的硅胶和羧甲基纤维素钠作为薄层色谱的硅胶板展开效果好，关键显色点的区分度高，有利于鉴别结果的准确率提升。羧甲基纤维素钠取代比例为0.7，故称0.7CMC-Na。

进一步，步骤1，黄精的薄层鉴别方法如下：

(102A)黄精供试溶液制备：称取黄精，打粉，加入乙醇，回流提取，过滤，将滤液蒸干，加水溶解残渣，用正丁醇振摇提取，蒸发干燥，加入甲醇使残渣溶解，完成供试品溶液的制备。

(102B)黄精、桑叶和玉竹供试品溶液：称取黄精、桑叶和玉竹组合物，用石油醚加热回流提取，弃去石油醚液，挥干药渣；药渣加入乙醇超声提取，过滤，保留滤液，蒸干滤液得残渣；加水溶解残渣，再滤过，蒸干滤液，最后加甲醇使残渣溶解，完成黄精、桑叶和玉竹配伍的供试品溶液的制备。优选地，加水溶解残渣过程中，使用的是热水，例如60-90℃的热水。

(102C)阴性供试品溶液制备：精密称取桑叶和玉竹，按照步骤101B方法制备阴性供试品溶液。

(102D)对照药材的制备：精密称取黄精对照药材，按照步骤101B方法制备对照药材溶液。

(102E)TLC色谱鉴别：采用重量比例为硅胶：0.7CMC-Na＝1：3的原料制成硅胶板，用石油醚-乙酸乙酯-甲酸＝4.8-5.2：1.9-2.1：0.1的混合溶液作为展开剂进行展开。展开完成后，喷3-6％香草醛硫酸溶液显色，在101-107℃加热至斑点呈色清晰，最后置于紫外光灯下检视。

优选地，紫外灯的紫外光线波长为365nm。

优选地，使用5％香草醛硫酸溶液。

优选地，所述石油醚是馏程60～90℃的石油醚。

进一步，步骤102E，用毛细管吸取各供试品和对照药材溶液各10μl，将其点于同一硅胶G薄层板上，将石油醚-乙酸乙酯-甲酸＝5:2:0.1的混合溶液作为展开剂，薄层板至于展开缸中先饱和10min，饱和之后将薄层板展开，展开到约8cm，取出，薄层板晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点呈色清晰，最后置于紫外光灯下检视。

进一步，步骤1，玉竹薄层鉴别方法如下：采用步骤102C相同的方法准备供试品，供试品包括玉竹供试品、黄精桑叶和玉竹的组合物供试品、阴性供试品、对照药材样品。按照步骤102E相同的方式进行TLC色谱鉴别，确定鉴别供试品组合物中玉竹的含量情况。

进一步，步骤2，采用苯酚-硫酸法测定组合物中的多糖含量。多糖是黄精桑叶玉竹配方的都有的有效成分，多糖具有降糖功效，因此将多糖的含量作为一个质量控制的对象。

相比之下，蒽酮-硫酸法能够测定所有碳水化合物的含量，而苯酚-硫酸法测定的范围比较确定，包括单糖、多聚糖以及甲基化后的糖，因此蒽酮-硫酸法测定的多糖含量通常情况下要比苯酚-硫酸法偏高。苯酚-硫酸法显色稳定时间相对于其他方法较长，而且样品中的蛋白质也几乎不影响显色结果，苯酚-硫酸法具有高灵敏度、简便的操作等优势，因此黄精多糖含量测定采用苯酚-硫酸法测定。

进一步，步骤2，多糖测试方法为：

(201)对照品溶液的制备：取葡萄糖对照品，干燥至恒重，精密称取，加水，超声溶解，摇匀，配制得到葡萄糖对照品溶液。

(202)供试品溶液的制备：取清蒸黄精，干燥至恒重，精密称取，加入乙醇，水加热回流提取，趁热滤过，并用乙醇洗涤残渣2～3次，合并乙醇提取液和乙醇洗涤液得到第一提取液；将残渣及滤纸放于烧瓶中，加水，置沸水浴锅中加热回流，趁热滤过，用水洗涤残渣及烧瓶2～4次，合并水提取滤液与水洗液，得到第二提取液；将第一提取液和第二提取液合并，摇匀，定容，得到供试品。

(203)苯酚的配制：称取苯酚，精密量取蒸馏水溶解苯酚，得苯酚溶液，避光密封保存于冰箱中。优选地，苯酚溶液临取用的时候再加蒸馏水稀释成3-6％的苯酚溶液，如5％的苯酚溶液。

(204)显色及测定：分别精密量取葡萄糖对照品溶液和供试品溶液置于试管中，调整浓度，摇匀；将试管放于冷水中，精密量取苯酚溶液，混合均匀，并迅速加入硫酸，振摇均匀，放置于35-45℃水浴20-40min，取出，冰水浴冷却，备用；以相应的试剂为空白对照，于紫外分光光度计上扫描光谱图。

(205)标准曲线的绘制：精密量取对照品溶液配制成梯度浓度对照品溶液，按照步骤204中对照品相同的苯酚-硫酸法显色，然后用紫外-可见分光光度法测定波长480-490nm处吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(206)结合步骤204的测试结果和步骤205绘制标准曲线，计算确定供试品中的多糖含量。

进一步，步骤205，精密量取对照品溶液0mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL分别置10mL具塞刻度试管中，然后进行显色，紫外-可见分光光度法测试。

进一步，步骤3，采用HPLC检测组合物中5-羟甲基糠醛含量。黄精在此配方中是君药，5-HMF是黄精特有成分，选择多糖和5-HMF的含量作为测定指标，可以更好的确定黄精、桑叶和玉竹组合物的整体品质表现。

5-羟甲基糠醛(5-HydroxyMethylFurfural)，5-HMF是一种糖的热降解的产物，在含糖的中药炮制的过程中，都有可能生成，并且和炮制时间和温度有紧密的联系，它的含量能够作为炮制程度的指标，现如今已成为中药炮制研究原理的活性研究成分。黄精含有多糖、单糖等糖类成分，在炮制的过程中，黄精多糖发生美拉德反应，然后会生成典型的多糖反应产物5-HMF。同时多糖自身也会发生脱水、水解反应生成5-HMF。5-HMF具有抗氧化、抗心肌缺血、神经保护性和改变血液流变性。

优选地，步骤3，HPLC的参数设定为：依利特ODS-B色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈和1wt％磷酸水混合液(两者体积比＝5：95)；流速：1.0mL/min；检测波长：284nm；柱温：30℃；进样量为10μL。

5-羟甲基糠醛含量测定过程中，选用的流动相是已经和1wt％磷酸水溶液的混合液作为流动相，针对于黄精炮制以后5-HMF含量以及黄精、桑叶和玉竹中多糖、萜类、生物碱等成分的含量以及流动相中分离特性，选用上述混合溶液作为流动相。乙腈具有较强的极性，可以调整5-羟甲基糠醛在流动相中的流动速率，而1％磷酸水溶液适宜的pH值控制5-羟甲基糠醛的游离形态，控制液相色谱出峰的峰形，更有利于提高检测结果的准确度。

多糖是配方中黄精、桑叶和玉竹共有的降血糖有效成分。5-HMF是一种可用于指示炮制程度的物质，是中药炮制后含有的重要活性成分，药理研究表明5-HMF具有抗心肌缺血、抗氧化、改变血液流变性和神经保护性。本发明检测方法重点关注这两项指标做为控制中药组合物的品质关键所在，有效确保本发明中药组合物的品质达到最优。

进一步，步骤3，HPLC检测过程中，样品准备过程如下，精密称定黄精、桑叶和玉竹的药物组合物，第一次加入甲醇，第一次超声提取，抽滤；滤渣加甲醇溶解，接着继续第二次超声提取，滤过，合并滤液，定容，作为供试品。

优选地，精密称定黄精、桑叶和玉竹的药物组合物0.1-0.5克。

优选地，第一次加入8-12mL甲醇，滤渣加8-12mL甲醇溶解。

优选地，第一次超声提取10-40min，第二次超声提取10-40min。

优选地，合并滤液以后定容到25mL，作为供试品溶液。

进一步，步骤3，HPLC检测过程中，对照品是将5-HMF用甲醇溶解制备得到的对照品溶液。

进一步，步骤3，HPLC检测过程中，还包括制备阴性供试品溶液，以桑叶和玉竹的混合物作为样品，按照样品准备过程相同的方法，制得阴性供试品溶液。

进一步，步骤4，水分含量测试采用烘干法进行测定。水分含量表征黄精、桑叶和玉竹药物组合物的整体品质表现，通过检测组合物中水分含量，可以从整体上把握药物组合物的品质以及作为配方使用的稳定性。

进一步，步骤4，水分含量测试方法如下：

精密称定供试品，然后先将扁形称量瓶干燥至恒重，准确称定，记录称量瓶重量。再将称好的供试品加入称量瓶，烘干，放入干燥器中冷却，再准确称量；继续干燥，冷却，精密称重；重复干燥、冷却、称重步骤，直至连续称量重量差≤3mg为止；跟据供试品减少重量计算样品含水量。

优选地，烘干过程是在100-105℃的烘箱条件下烘3-8小时，特别优选5小时。

进一步，步骤4，灰分含量测试：将样品置于坩埚中灼烧至样品完全炭化，转移到干燥器中冷却，准确称定，得到灰分含量。

进一步，步骤4，灰分含量测试方法如下：

取样品，破碎，过2号筛，放置于炽灼至恒重的坩埚中，称定样品和坩埚的总重量，缓慢炽热，注意样品不能燃烧；等到完全炭化后，将其放冷直到和室温一样，再次炽灼，使样品彻底灰化，用钳子将灰化的样品放置到干燥器内冷却；放冷至室温后，将样品准确称定，再次炽灼至恒重，根据剩余残渣的重量，最后计算供试品中的总灰分的含量。

本发明灰分含量测试过程中，炽灼炭化分成多个阶段，逐渐炭化，避免燃烧导致灰分中低气化点物质挥发损失，精确检测灰分含量结果。

优选地，炽灼温度为500-600℃。

进一步，步骤4，浸出物含量测试方法如下：精密称取供试品，置锥形瓶加水，塞紧，称定重量，静置；连接回流冷凝管，微沸回流1-2小时。放冷后，称定重量，用水补足减失重量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密量取滤液，水浴蒸干，102-108℃干燥1-3小时，在干燥器中冷却，精密称定重量，计算供试品中水溶性浸出物含量。

将供试品充分微沸冷凝回流，促使供试品中水溶性浸出物完全转移到溶液当中。

优选地，水溶性浸出物含量应≥40％。

本发明黄精、桑叶和玉竹配伍中药组合物的质量检测方法，提供一种全新的检验分析标准，对于本发明之前提出的黄精、桑叶和玉竹配伍制成中药组合物的配方具有高度针对性，特别是对于中药组合物配伍实现降血糖的重点天然药物化学成分进行检测分析，确保中药组合物的产品能够按照配方设计实现相应的功能效果作用。而且，检测标准方法包括了多个层面，既包括了中药材原料的基础鉴别，也包括了黄精、桑叶和玉竹降血糖的主要天然化学成分的含量测定，以及药物组合物整体品质保障的鉴定测试，科学准确，能够保证药物组合物的最终品质。

本发明提供的新技术方案主要能够实现以下技术效果：

1.本发明检测方法对黄精、桑叶、玉竹的配伍进行初步的质量标准检测控制，为后期的配方深度开发，产品研究检验提供科学依据。

2.本发明检测方法对于配方中的各种原料成分具有针对性的检测分析，既包括了中药材原料成分的鉴别确定，又包括了炮制程度的研究分析确定，以及药物组合物的整体品质检测分析。无论是从单一药材的细节特性，还是药物组合物的整体特性检测验证分析都具有精确检测分析控制的效果。

3.本发明检测方法中对于配方中的关键成分的重要指标设计针对性检测分析，确定组合物中具有相应功效作用的天然药物化学成分的含量得到验证，保证药物组合物的应用效果更好的达到设计预期。

4.本发明检测方法对于各种原料采用薄层色谱鉴别，确保中药组合物的各种原料成分达到预期，满足设计要求，具有良好的中药功效品质作用。

附图说明：

图1是桑叶薄层色谱图。

图2是黄精薄层色谱图。

图3是黄精薄层色谱图。

图4是葡萄对照品与供试品波长扫面图。

图5是葡萄对照品标准曲线。

图6是阴性样品(A)高效液相色谱图。

图7是对照品(B)高效液相色谱图。

图8是样品(C)高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

<实施例1>

对黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物进行质量检测，包括(1)薄层色谱鉴别：对黄精、桑叶和玉竹分别进行薄层色谱鉴别；(2)多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法鉴定组合物中的多糖含量；(3)5-羟甲基糠醛含量测定：采用HPLC检测组合物中5-羟甲基糠醛含量；(4)其他测试：水分含量测试、灰分含量测试和浸出物含量测试。

其中桑叶的薄层鉴别方法如下：

1.供试溶液的制备

(1)桑叶供试品溶液的制备：精密称量桑叶2g，随后加石油醚(60～90℃)30mL，水浴锅上回流加热30分钟，抽滤之后不要石油醚液。药渣挥干，加入乙醇30mL，超声20分钟，滤过，保留滤液，将滤液蒸发干，留下的残渣加热水10mL，在60℃水浴上边溶解边搅拌，滤过，滤液蒸干，最后加入了甲醇1mL将残渣溶解，完成了桑叶供试品溶液的制备。

(2)黄精桑叶玉竹供试品溶液：电子天平精密称取黄精4g，桑叶2g，玉竹2g，量取石油醚(馏程60～90℃)120mL加入，回流加热30分钟，丢弃过滤的石油醚液，药渣挥干，接着加入乙醇120mL，超声20分钟，过滤，蒸干滤液，加热水40mL到残渣中，在60℃水浴上搅拌溶解残渣，抽滤，蒸干滤液，用甲醇1mL溶解残渣，完成黄精、桑叶和玉竹配伍的供试品溶液制备。

2.阴性供试品溶液的制备

称取黄精4g，玉竹2g，按黄精桑叶玉竹供试品溶液的制备方法，完成阴性供试品溶液的制备。

3.对照药材的制备

另取桑叶对照药材2g，按黄精桑叶玉竹供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。

4.TLC色谱条件

薄层板：自制硅胶板(硅胶：0.7CMC-Na为1：3)

展开剂系统：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上层溶液为展开剂

薄层色谱法鉴别：吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，置于加入了展开剂的展开缸内饱和10分钟，饱和完后展开到约8cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

结果如图1所示，桑叶薄层色谱图，图中编号1的展开图谱为20170301黄精、桑叶玉 竹配伍，编号2的展开图谱为20170601黄精、桑叶玉竹配伍，编号3的展开图谱为20170901黄 精、桑叶玉竹配伍，编号4的展开图谱为桑叶对照药材，编号5的展开图谱为桑叶，编号6的展 开图谱为桑叶阴性样品。

通过薄层色谱鉴别桑叶，对比单独的桑叶供试品、阴性供试品以及对照药材，确定黄精、桑叶和玉竹配伍组成的药物组合物在薄层色谱鉴别过程中合格的组合物TLC图谱结果。比较分析桑叶对照药材、阴性供试品等结果，薄层色谱TLC结果显示，纯桑叶展开图谱和桑叶对照药材展开图谱一致，而黄精、桑叶和玉竹配伍组合物的展开图谱包括桑叶对照药材的展开图谱中主要显色点。

<实施例2>

取实施例1相同的黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物进行质量检测，进行同样的薄层色谱鉴别、多糖含量、5-羟甲基糠醛含量、水分、灰分、浸出物含量等测试项目。

其中，黄精的薄层鉴别过程如下：

1.供试溶液的制备

(1)黄精供试溶液的制备

称取五蒸黄精粉末1g，量取70％乙醇20mL加入，回流加热1小时，过滤，将滤液蒸干，加水10mL溶解残渣，用40mL正丁醇振摇分2次提取，每次20mL，正丁醇液合并，蒸发干燥，加入甲醇1mL使残渣溶解，完成供试品溶液的制备。

(2)黄精桑叶玉竹供试品溶液

称取五蒸黄精粉末1g，桑叶0.5g，玉竹0.5g，并量取石油醚(60～90℃)120mL加入，回流加热30min后，弃去石油醚液，挥干药渣，精密量取乙醇120mL加入，超声了20min后，过滤，蒸干滤出的滤液，加热水40mL溶解残渣，在定温到60℃的水浴锅上搅拌溶解残渣，再滤过，蒸干滤液，最后加甲醇1mL使残渣溶解，完成黄精、桑叶和玉竹配伍的供试品溶液的制备。

2.阴性供试品溶液的制备

精密称取桑叶0.5g和玉竹0.5g，依照黄精桑叶玉竹供试品溶液的制备办法，完成阴性供试品溶液的制备。

3.对照药材的制备

另外再取黄精对照药材1g，同上方法制成对照药材溶液。

4.TLC色谱条件

薄层板：自制硅胶板(硅胶：0.7CMC-Na为1：3)

展开剂系统：石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5:2:0.1)

薄层色谱法鉴别：用毛细管吸取上述两种溶液各10μl，将其点于同一硅胶G薄层板上，将石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5:2:0.1)作为展开剂，薄层板至于展开缸中先饱和10min，饱和之后将薄层板展开，展开到约8cm，取出，薄层板晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点呈色清晰，最后置于紫外光灯(365nm)下检视。

结果如图2所示，黄精薄层色谱图。图中，编号1为20170301黄精、桑叶玉竹配伍，编 号2为20170601黄精、桑叶玉竹配伍，编号3为20170901黄精、桑叶玉竹配伍，编号4为黄精对 照药材，编号5为缺少黄精、玉竹阴性样品，编号6为黄精。

色谱图显示阴性样品，在对照药材相同位置上有多个相同斑点，说明阴性样品有干扰，因黄精和玉竹是同科属植物，所以猜测阴性干扰来自于玉竹。黄精的TLC薄层色谱鉴别应当注意玉竹的干扰影响，将黄精供试品、黄精和桑叶和玉竹的供试品、阴性供试品、对照药材等进行全面的比较分析，排除不良干扰影响项目，从整体分析TLC薄层色谱鉴别的图谱结果，确定黄精、桑叶和玉竹的药物组合物的整体品质表现，特别是重点影响的干扰显色点的排查。

<实施例3>

取实施例1相同的黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物进行质量检测，进行同样的薄层色谱鉴别、多糖含量、5-羟甲基糠醛含量、水分、灰分、浸出物含量等测试项目。

其中，薄层鉴别过程如下：

1.供试品样品第一部分

按照实施例1-2相同的准备多个黄精桑叶和玉竹配伍供试品溶液、黄精对照药材供试品、黄精供试品。

2.缺黄精和玉竹的阴性对照

称取桑叶0.5g，按照实施例1中桑叶供试品溶液的制备方法，制备阴性对照溶液。

3.TLC色谱

按照实施例2相同的TLC色谱检测条件和方法，进行上法、点样、饱和、展开、显色。

结果如图3所示，黄精薄层色谱图，其中编号1为20170301黄精、桑叶玉竹配伍，编 号2为20170601黄精、桑叶玉竹配伍，编号3为20170901黄精、桑叶玉竹配伍，编号4为缺少黄 精、玉竹阴性样品，编号5为黄精对照药材，编号6为黄精。

由检测结果可以看出缺少黄精、玉竹的阴性样品显色展开显色结果显色点较少，而黄精对照药材、20170301、20170601、20170901的黄精和桑叶和玉竹配伍的组合物显色点和黄精显色点高度一致，TLC薄层色谱鉴别过程中黄精被重点显色，结果较为突出，实现对于黄精的重点鉴别。

实施例1-3对于黄精、桑叶和玉竹药物组合物的配方进行TLC薄层色谱鉴别分析，分别采用紫外灯检视显色或香草醛硫酸溶液进行显色后紫外灯光下检视，通过采用不同的显色方式，实现更具有针对性的显色。可以更好的鉴别药物组合物中黄精成分是否准确含有。最好是可以将两种TLC薄层色谱鉴别方法同步实施，组合检视分析结果，确定检视结果可靠性。

<实施例4>

多糖的含量测定

1.对照品溶液的制备

精密称定，在105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品17.50mg，将对照品放于100mL容量瓶中，加入适量水，置超声机超声溶解后，并加水稀释至刻度，摇匀溶液，即制得0.1750mg/mL的对照品(每1mL中含无水葡萄糖0.1754mg)。

2.供试品溶液的制备

称取经炮制后70℃干燥至恒重五蒸黄精细粉约0.25g，加80％乙醇150mL到圆底烧瓶中，用水浴锅回流加热1小时，趁热滤过，并用80％热乙醇洗涤残渣3次，10mL每次，脂溶性成分除去之后，将残渣及滤纸放于烧瓶中，加水150mL，置沸水浴锅中加热回流1h，趁热滤过，用热水洗涤残渣及烧瓶4次，每次10mL，合并滤液与洗液，放冷，将合并液放至250mL容量瓶中，加水至刻度，并且摇匀，精密量1mL定容之后的供试品，置10mL具塞干燥试管中，同对照品溶液显色备用。

3.苯酚的配置

称取80g苯酚，精密量取20mL的蒸馏水溶解苯酚，即为80％的苯酚溶液，避光密封保存于冰箱中。取密封避光保存的80％苯酚溶液，于室温之中，再精密量取80％苯酚溶液3.125mL于100mL的容量瓶中定容，即完成5％的苯酚溶液的配置，现用现配[6]。

4.测定波长的选择

分别精密量取无水葡萄糖的对照品溶液和供试品溶液各1mL，分别置于10mL刻度试管中，加水1mL至2.0mL，并且摇匀之后，将试管放于冷水中，用移液管精密量取5％苯酚溶液1mL，混合均匀，并迅速加入硫酸7.0mL，振摇均匀，放置于40℃水浴中计时30min后，取出，置于冰水浴中5min后，取出备用。以相应的试剂为空白对照，于紫外分光光度计上扫描光谱图，结果如图4，结果葡萄糖对照品(图中谱图曲线2)与样品(图中谱图曲线1)均在487nm处有最大吸收。

5.标准曲线的绘制

精密量取，对照品溶液0mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL分别置10mL具塞刻度试管中，按照对照品同样的方法显色。照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，结果如表1所示。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果如图5所示，线性方程为y＝52.386x+0.1162(R2＝0.9996)

表1标准曲线的制备

6.样品含量测定

选取三个不同批次的黄精桑叶玉竹的配方，按照标准曲线绘制相同的方法完成多糖含量测定，每个样品平行测三次，取平均值，结果如下表所示。

表2多糖的含量(n＝3)

批号	多糖含量(％)	平均含量(％)
			20170301	7.34
20170601	7.56	7.36
			20170901	7.18

测试结果表明，黄精、桑叶和玉竹的配方组合物中多糖的含量在7.18-7.34之间，黄精降血糖功效的主要成分是多糖，因此根据研究结果可以确定黄精、桑叶和玉竹组合物中多糖的含量应当控制在7-8％之间，以确保配方组合物的品质优良。

<对比例1>

多糖的含量测定

准备供试品多糖检测溶液：采用和实施例4相似的处理方法，只是将80％乙醇溶液替换为30％乙醇溶液。得到供试品溶液备用。

按照实施例4相同的方法准备对照品溶液、苯酚溶液等，并按照相同的检测方法进行检测分析。结果显示，当改用低浓度的乙醇进行样品预处理以后，杂质含量增多，对于脂溶性杂质去除率不佳，而且相同批次的黄精样品测试的多糖含量仅为6.42％，明显低于实施例4测试结果，表明样品预处理过程中多糖的损失增加了。所以，多糖含量测试过程中不宜采用浓度太低的乙醇溶液，对于杂质的去除以及多糖的充分提取不利。

<实施例5>

5-羟甲基糠醛含量测定

1.对照品溶液的配置

5-HMF对照品低温时为块状，常温时为液体，称取5-HMF对照品时，为精密称定，采用减重法称量。并用甲醇溶解，制备成对照品20.96μg/mL溶液。注意避光低温保存。

2.供试品溶液的制备

精密称定五蒸五晒黄精0.2g，桑叶0.1g，玉竹0.1g，将其放置于150mL具塞锥形瓶中，精密量取甲醇10mL加入，用超声提取20min，抽滤。加甲醇10mL溶解滤渣，接着继续超声提取10min，滤过，合并滤液，将滤液定容到25mL量瓶中，即完成供试品的制备。

3.阴性供试品溶液的制备

精密称定桑叶0.1g，玉竹0.1g，按照上述方法供试品溶液的制备方法制备，得阴性供试品溶液。

4.色谱条件

依利特ODS-B色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：乙腈：1％磷酸水(5：95)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：284nm；

柱温：30℃；

进样量为10μL。

5.专属性考察

在上述色谱条件下，分别5-HMF对照品、供试品溶液、阴性对照溶液进样检测，检测结果如图6-8所示，分别为阴性样品(A)、对照品(B)、样品(C)高效液相色谱图。综合色谱图图6-8的结果可以确定5-HMF色谱峰出峰位置，同时试验结果表明，阴性供试品溶液在5-HMF色谱峰相应位置无色谱峰出现，表明黄精阴性样品无干扰。

具体而言，图6阴性样品A无5-HMF的色谱峰出现，表明阴性样品无干扰影响检测的成分。图7对照品B出峰位置显示峰形尖而锐利，无前沿峰也没有拖尾，表明色谱条件对于分离5-HMF的效果优秀，适宜用于相应的5-HMF分离检测分析。图8中样品C色谱峰出峰位置和对照品B出峰位置一致，可以用于用于精确检测分析。

6.样品含量测定

按照HPLC色谱检测分析方法依次对20170301、20170601、20170901样品进行制样及检测分析，并用5-HMF对照品参比，以外标法检测确定各个样品中5羟甲基糠醛的含量，结果如下表所示。

表3样品5-HMF含量测定结果(n＝3)

<对比例2>

5-羟甲基糠醛含量测定

供试品溶液准备：称取和实施例5相同的黄精、桑叶、玉竹混合物原料，分别按照以下方法制备供试品。(1)采用乙醇代替甲醇进行提取，制备得到供试品A。(2)加入10mL甲醇以后，强力搅拌30分钟，抽滤，再次加入10mL甲醇，强力搅拌20分钟，过滤，合并滤液，加甲醇定容至25mL，得到供试品B。(3)加入10mL乙腈以后，强力搅拌30分钟，抽滤，再次加入10mL乙腈，强力搅拌20分钟，过滤，合并滤液，加乙腈定容至25mL，得到供试品C。

然后，按照实施例5的相同的方式准备对照品溶液、阴性供试品溶液，并在相同的色谱条件下进行HPLC检测分析，结果色谱分析结果显示

按照HPLC色谱检测分析结果显示，供试品A中5-HMF的提取率极低，检测分析结果仅0.063％，和实施例5分析结果相差极大；且杂质峰较多，峰形不佳。供试品B测试结果为0.194％，提取率较高，但是和超声提取方式相比，没有达到充分提取。供试品C的结果为0.14，杂质峰较多，主要是因为乙腈对于目标化合物5-HMF的选择性不佳。

<实施例6>

水分含量测定

采用烘干法测定水分，具体测定过程如下：

先将扁形称量瓶干燥至恒重，准确称定，记录称量瓶重量。精密称取黄精、桑叶和玉竹复方(三者重量比2:1:1)供试品共2g，加入称量瓶中，在100-105℃的烘箱条件下烘5小时，再将其放入干燥器中30min，使其冷却之后，再准确称量，然后在上述的温度条件下继续干燥1小时后，冷却，精密称重，之后每次烘30min，连续称量后，应该称到其重量差≤3mg为止，最后依据供试品减少的重量，计算样品的含水量。每一个样品测定3个平行试样，取平均值，结果见下表。

表4样品水分含量测定结果(n＝3)

<实施例7>

灰分含量测定

取过二号筛的样品2g(其中黄精1g，桑叶0.5g，玉竹0.5g)放置于炽灼至恒重的坩埚中，称定样品和坩埚的总重量(准确至0.01g)，缓慢炽热，注意样品不能燃烧，然后到完全炭化时，将其放冷直到和室温一样，再在500-600℃的条件下将其炽灼，使样品彻底灰化，用钳子将灰化的样品放置到干燥器内冷却，放冷至室温后，将样品准确的称定，再在500-600℃的条件下炽灼至恒重，根据剩余残渣的重量，最后计算供试品中的总灰分的含量(％)。

表5样品灰分测定结果(n＝3)

<实施例8>

浸出物含量测定

测试参照2015年版中国药典第四部通则2201浸出物测定法项下水溶性浸出物测定法(热浸法)测定样品，结果如下表所示，最终药物组合物中水溶性浸出物限量需≥40％。

表6样品浸出物测定结果(n＝3)

小结：上述实施例1-8分别对黄精、桑叶和玉竹的组合物进行多项重要技术特征进行测定，包括：(1)建立了薄层色谱法，鉴别配方中的桑叶、黄精，层析图显示分离效果佳，斑点清晰。(2)建立了UV法测定配方中多糖含量以及HPLC测定配方中5-HMF含量。配方中多糖含量不得少于7％，5-HMF含量不得少于0.24％。(3)对配方的水分和灰分进行了检查，并且测定了水溶性浸出物的含量。水分不得高于13％，灰分不得超过5％，水溶性浸出物不得少于40％。

Claims (10)

1.一种黄精、桑叶和玉竹配伍药物组合物质量检测方法，包括以下步骤：

（1）薄层色谱鉴别：对黄精、桑叶和玉竹分别进行薄层色谱鉴别；

（2）多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法鉴定组合物中的多糖含量；

（3）5-羟甲基糠醛含量测定：采用HPLC检测组合物中5-羟甲基糠醛含量；

（4）其他测试：水分含量测试、灰分含量测试和浸出物含量测试。

2.如权利要求1所述质量检测方法，其特征在于，步骤1，薄层鉴别包括：黄精的薄层鉴别、桑叶的薄层鉴别和玉竹的薄层鉴别中的至少一种。

3.如权利要求1所述质量检测方法，其特征在于，步骤1，薄层色谱鉴别至少包括黄精的薄层色谱鉴别。

4.如权利要求1所述质量检测方法，其特征在于，步骤1，桑叶的薄层鉴别方法如下：

（101A）桑叶供试品溶液制备：精密称量桑叶，加入石油醚，水浴锅回流加热，抽滤，将药渣挥干；然后加入乙醇超声提取，滤过，保留滤液，将滤液蒸发干，得残渣，加水加热溶解，滤过，滤液蒸干；最后加入了甲醇将残渣溶解，得到桑叶供试品溶液；

（101B）黄精、桑叶和玉竹供试品溶液：称取黄精、桑叶和玉竹组合物，用石油醚加热回流提取，弃去石油醚液，挥干药渣；药渣加入乙醇超声提取，过滤，保留滤液，蒸干滤液得残渣；加水溶解残渣，再滤过，蒸干滤液，最后加甲醇使残渣溶解，完成黄精、桑叶和玉竹配伍的供试品溶液的制备；

（101C）阴性供试品溶液的制备：精密称取黄精和玉竹，按照101B步骤制备得到阴性供试品溶液的制备；

（101D）对照药材的制备：取桑叶对照药材，按照101B步骤制备得到对照药材溶液；

（105E）TLC色谱鉴别：采用硅胶板，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，进行展开，展开完成后晾干，喷以3-6wt.%香草醛硫酸溶液，加热至斑点呈色清晰，最后置于紫外光灯下检视。

5.如权利要求4所述质量检测方法，其特征在于，对比101A-101D的各个供试品和对照药材，确定其中主要显色点，排除干扰检测结果的显色点，供试品和对照药材中没有的显色点不得出现。

6.如权利要求4所述质量检测方法，其特征在于，优选步骤101A，精密称量桑叶2g，随后加入石油醚30mL，水浴锅上回流加热30分钟，抽滤之后弃去石油醚液；药渣挥干，加入乙醇30mL，超声20分钟，滤过，保留滤液，将滤液蒸发干，留下的残渣加热水10mL，在60℃水浴上边溶解边搅拌，滤过，滤液蒸干，最后加入了甲醇1mL将残渣溶解，完成了桑叶供试品溶液的制备。

7.如权利要求1所述质量检测方法，其特征在于，步骤1，黄精的薄层鉴别方法如下：

（102A）黄精供试溶液制备：称取黄精，打粉，加入乙醇，回流提取，过滤，将滤液蒸干，加水溶解残渣，用正丁醇振摇提取，蒸发干燥，加入甲醇使残渣溶解，完成供试品溶液的制备；

（102B）黄精、桑叶和玉竹供试品溶液：称取黄精、桑叶和玉竹组合物，用石油醚加热回流提取，弃去石油醚液，挥干药渣；药渣加入乙醇超声提取，过滤，保留滤液，蒸干滤液得残渣；加水溶解残渣，再滤过，蒸干滤液，最后加甲醇使残渣溶解，完成黄精、桑叶和玉竹配伍的供试品溶液的制备；

（102C）阴性供试品溶液制备：精密称取桑叶和玉竹，按照步骤101B方法制备阴性供试品溶液；

（102D）对照药材的制备：精密称取黄精对照药材，按照步骤101B方法制备对照药材溶液；

（102E）TLC色谱鉴别：采用重量比例为硅胶：0.7CMC-Na=1：3的原料制成硅胶板，用石油醚-乙酸乙酯-甲酸=4.8-5.2：1.9-2.1：0.1的混合溶液作为展开剂进行展开；展开完成后，喷3-6%香草醛硫酸溶液显色，在101-107℃加热至斑点呈色清晰，最后置于紫外光灯下检视。

8.如权利要求1所述质量检测方法，其特征在于，步骤2，采用苯酚-硫酸法测定组合物中的多糖含量。

9.如权利要求8所述质量检测方法，其特征在于，步骤2，多糖测试方法为：

（201）对照品溶液的制备：取葡萄糖对照品，干燥至恒重，精密称取，加水，超声溶解，摇匀，配制得到葡萄糖对照品溶液；

（202）供试品溶液的制备：取清蒸黄精，干燥至恒重，精密称取，加入乙醇，水加热回流提取，趁热滤过，并用乙醇洗涤残渣2~3次，合并乙醇提取液和乙醇洗涤液得到第一提取液；将残渣及滤纸放于烧瓶中，加水，置沸水浴锅中加热回流，趁热滤过，用水洗涤残渣及烧瓶2~4次，合并水提取滤液与水洗液，得到第二提取液；将第一提取液和第二提取液合并，摇匀，定容，得到供试品；

（203）苯酚的配制：称取苯酚，精密量取蒸馏水溶解苯酚，得苯酚溶液，避光密封保存于冰箱中；

（204）显色及测定：分别精密量取葡萄糖对照品溶液和供试品溶液置于试管中，调整浓度，摇匀；将试管放于冷水中，精密量取苯酚溶液，混合均匀，并迅速加入硫酸，振摇均匀，放置于35-45℃水浴20-40min，取出，冰水浴冷却，备用；以相应的试剂为空白对照，于紫外分光光度计上扫描光谱图；

（205）标准曲线的绘制：精密量取对照品溶液配制成梯度浓度对照品溶液，按照步骤204中对照品相同的苯酚-硫酸法显色，然后用紫外-可见分光光度法测定波长480-490nm处吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

（206）结合步骤204的测试结果和步骤205绘制标准曲线，计算确定供试品中的多糖含量。

10.如权利要求8所述质量检测方法，其特征在于，步骤3，采用HPLC检测组合物中5-羟甲基糠醛含量。