CN108473483A - 用于医药应用的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗和/或预防流感的化合物。所述化合物包含第一结构域和第二结构域，其中第一结构域包含至少一个与流感病毒表面结合的锚定基团，和第二结构域包含至少一个阴离子基团。所述第一结构域和第二结构域共价连接。本发明还提供所述化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。

Description

用于医药应用的化合物
提交数据
本申请与2015年11月20日提交的澳大利亚专利申请号2015904895有关，并要求其优先权，其全部内容以引用的形式并入本文。
技术领域
本申请涉及用于医药用途，特别是用于治疗或预防病毒感染的化合物。本申请还涉及制备该化合物的方法。
背景技术
流感是一种呼吸道感染，每年约有5％至25％的美国人口患有呼吸道感染，其中约20万人住院治疗，25,000人死亡。流感感染继续对人类健康构成持续威胁，并对健康服务造成负担。最近，来自禽源的高致病性H5N1病毒和H7N9病毒的出现以及它们获得人类可传播性的可能性增加了与流感感染相关的风险。尽管疫苗仍然是预防的基石，但需要花费大量时间开发针对任何新病毒株频繁突变的有效疫苗。抗流感药物如病毒神经氨酸酶(neuraminidase)抑制剂(NA抑制剂)，包括扎那米韦(瑞乐沙(Relenza))和奥司他韦(特敏福(Tamiflu))，和衍生自金刚烷的M2离子通道阻断剂，包括金刚烷胺和金刚烷乙胺，是可用的并且已经销售超过20年，但其效果受到作用机制的限制。它们的有效性可以通过病毒突变和后续耐药性的发展进一步受到损害。
例如，M2离子通道阻断剂目前不推荐使用，因为几乎所有的流行季节A病毒(circulating season A virus)(包括H1Nipcim09)在M2基因中携带S31N点突变，这赋予对金刚烷胺和金刚烷乙胺的耐受性。这导致严重依赖于替代NA抑制剂，如扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦。
NA抑制剂影响病毒生命周期中甲型流感(Influenza A)病毒的装配和出芽。对于从细胞释放的子代病毒粒子，神经氨酸酶(NA)必须从宿主糖蛋白上切割唾液酸基团，这对于病毒传播和再感染是必需的。因此，用特异性抑制剂(NA抑制剂)阻断神经氨酸酶的功能是治疗流感的一种方式。然而，由于这种抑制发生在病毒生命周期的后期(即病毒进入、复制、装配和出芽到细胞表面之后)，因此已经对细胞进行了大量损伤。而且，只有细胞表面出芽的病毒才受到影响。不受抑制的病毒子代可能会感染新细胞。这导致疾病严重程度的进展。为了降低疾病的严重程度，用NA抑制剂药物治疗的最佳治疗窗是在疾病进展的早期。然而，由于给定活性剂的治疗功效通常由作用机制决定，因此认为NA抑制剂药物相对温和且临床获益有限。
需要治疗流感的新方法。
甲型流感病毒的生命周期包括几个阶段：
(a)甲型流感病毒具有脂质双层包膜，其中有八个RNA基因组片段，其中每一片段与三聚体病毒RNA聚合酶(PB1、PB2、PA)相关并覆有多种核蛋白(NP)以形成vRNP。脂质包膜的外层加有HA、NA和少量M2的多个拷贝，而M1分子保持vRNP附着于内层。
(b)病毒表面糖蛋白HA与宿主细胞表面唾液酸受体结合，并且病毒在内吞囊泡中被转运到细胞中。核内体中的低pH触发HA蛋白的构象变化，导致病毒和内吞体膜的融合。低pH值也会触发质子通过M2离子通道流入病毒，从而使vRNP与M1基质蛋白分离。当M1分子被分离时，释放到细胞质中的vRNP通过识别核蛋白上的核定位序列(NLS)被运输到细胞核中。
(c)在细胞核中，病毒聚合酶启动的病毒mRNA合成，其中5'加帽的RNA片段从宿主前体mRNA切割。PB2亚基结合宿主前体mRNA的5'帽端(cap)，并且PA亚基中的核酸内切酶结构域将帽端下游的前体mRNA的10至13个核苷酸切割。随后从加帽的RNA片段的切割的3'末端开始病毒mRNA转录。这种“帽抢夺(cap snatching)”发生在新生的前体mRNA上。
(d)病毒mRNA被运输到细胞质以翻译成病毒蛋白。表面蛋白HA、M2和NA在内质网(ER)中加工，在高尔基体中被糖基化并转运至细胞膜。
(e)甲型流感病毒的NS1蛋白通过抑制宿主前体mRNA的3'末端加工来抑制宿主mRNA的产生，从而阻断包括干扰素-βmRNA在内的宿主mRNA的产生，从而起到关键作用。与宿主前体mRNA不同，病毒mRNA不需要宿主细胞机制的3'末端加工。因此，病毒mRNA被运输到细胞质，而宿主mRNA合成主要被阻断。
(f)病毒聚合酶不仅负责加帽RNA引发的mRNA合成，而且还负责如下的vRNA的非引发复制：
(-)vRNA→(+)cRNA→(-)vRNA。
核蛋白分子是这两个复制步骤所需的，并在RNA合成期间沉积在cRNA和vRNA上。随后将所得的vRNP运输至细胞质，由与vRNP结合的M1-NS2复合物介导；NS2与从细胞核输出vRNP的人CRM1蛋白相互作用。
(g)vRNP到达细胞膜以被合并入正在出芽的新病毒中。新病毒中的HA和NA蛋白含有末端唾液酸，这些末端唾液酸会导致病毒聚集在一起并粘附在细胞表面。新形成的病毒的NA切割这些唾液酸残基，从而从宿主细胞释放病毒。
在流感病毒生命周期的步骤(a)和(b)期间，病毒表面糖蛋白血凝素(HA)与宿主细胞上的唾液酸受体结合，然后受体介导的病毒内吞进入细胞。核内体中的低pH触发HA蛋白的构象改变，导致病毒和内膜的融合。同时，低pH也会通过M2离子通道触发质子流入病毒，从而将病毒基因物质释放到细胞核中以启动细胞中的病毒感染过程。
人们认识到病毒在细胞外环境中暴露于低pH可使病毒失活。低pH值鼻内凝胶喷雾剂已显示出在体外抑制流感病毒并保护雪貂免受流感感染。但是，在这些研究中，酸的有效浓度约为0.15M(约pH 3.5)。此外，还需要与病毒接触以产生杀病毒(viracidal)作用。另外，喷雾剂仅在病毒感染的早期阶段表现出功效。尽管通过施用pH 3.5的缓冲鼻喷雾剂可以达到接近3.5的pH值，但是该鼻递送存在局限性，由于粘膜纤毛的清除，在鼻中提供了相对较短的产品停留时间。经鼻施用溶液在人体内的正常停留时间约为12至15分钟。
此外，在治疗病毒感染的情况下，酸性缓冲液需要被深入递送至空气中。这种缓冲液的酸性可能会引起人体的刺激和不耐受。因此，酸性鼻内喷雾剂不适合作为治疗流感病毒感染的治疗剂，因为它们基本上是有限的和非特异性的。
聚阴离子化合物作为抗HIV剂提供了有吸引力的特征。聚阴离子的抗病毒活性谱延伸至各种包膜病毒，包括正粘病毒和副粘病毒(流感病毒)。已经显示这种聚阴离子以0.1至1μg/mL的浓度抑制细胞培养物中的病毒复制。有利的是，这种化合物即使在高达10,000倍的浓度下也不具有细胞毒性。然而，这些物质存在许多药代动力学和毒理学缺陷，这些缺陷似乎损害了它们的临床实用性，例如在血流中它们可能在到达其作用位点之前被各种血浆蛋白保留。另外，一些硫酸化多糖以不希望的抗凝血活性而臭名昭著。
需要有效对抗流感的新型抗病毒试剂。特别地，需要展现出以下一种或多种的新型抗病毒剂：i)对抗流感病毒的高效力，ii)控制感染的快速作用，iii)广谱抗病毒活性(包括甲型流感、乙型流感(influenza B)、禽流感)，iv)对抗耐药株的功效，v)耐药性倾向低，vi)延长的功效期，vii)高选择性，viii)改善的治疗窗口，ix)低毒性，x)更少的副作用和/或xi)适合于治疗和预防应用。
发明内容
本发明提供治疗和/或预防流感感染的化合物和方法。
本发明的化合物，也被称为“表面工程化合物”，被认为是改变病毒表面，将表面转化成微酸性/阴离子环境，以选择性干扰病毒的生命周期，包括步骤如上所述的(a)和(b)。
这被认为是通过本发明的化合物实现的，所述化合物将与流感病毒结合的基团和酸性或阴离子基团组合起来，所述酸性或阴离子基团干扰血凝素与细胞的结合。这提供了一个优点，因为本发明的化合物用于防止细胞感染并在细胞外发挥其作用。这避免了分子侵入细胞的需要，这将导致较低的毒性和/或较少的副作用。
在一个方面，本发明提供一种化合物，其包含第一结构域和第二结构域，
所述第一结构域包含至少一个与流感病毒表面结合的锚定基团(anchoringgroup)；和
所述第二结构域包含至少一个阴离子基团；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中所述第一结构域和第二结构域共价连接。
在另一个方面，本发明提供化合物，其中所述第一结构域和第二结构域通过至少一个二价连接子共价连接。
在其他方面，本发明的化合物可以进一步包含多价骨架基团(backbone group)。
在另一个方面，本发明提供式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中：
A在各出现处(at each occurrence)为锚定基团；
B为多价骨架基团；
C在各出现处为阴离子基团；
L1和L2在各出现处为二价连接子；
n为1至4的整数；和
p为1至3的整数。
在其他方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。在另一方面，本发明提供本发明化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体在制备用于治疗或预防流感病毒感染的药物中的用途。
在其他方面，本发明提供治疗或预防流感病毒感染的方法，其包括向需要其的人施用治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。
在一些方面，所述流感病毒感染为甲型流感、乙型流感、禽流感、或流感的耐药株。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应被视为对该现有技术形成公共常识的一部分的确认或任何形式的暗示。
本文引用的所有文献各自通过引用整体并入本文。
附图说明
图1：在MDCK细胞感染之前用测试化合物预处理病毒(A/悉尼/250/99或A/悉尼/5/97)的可变条件总结。
图2：在MDCK细胞感染之前用测试化合物预处理病毒(A/悉尼/250/99)，A)MD348，B)MD345和C)扎那米韦(对照)。
图3：在MDCK细胞感染之前用测试化合物预处理病毒(A/悉尼/5/97)，A)MD348，B)MD345和C)扎那米韦(对照)。
图4：在MDCK细胞感染之前，经过不同时间段和条件下，用MD345(测试化合物)和扎那米韦(对照)预处理病毒(A/悉尼/250/99)。
图5：MD314-1和MD021-7对A/悉尼/5/97(H3N2)的抗病毒活性的比较。
图6：MD314-1和MD021-7对A/密西西比/03/01(H1N1)野生型的抗病毒活性的比较。
图7：MD021-7和MD051-3对A/密西西比/03/01(H1N1)野生型的抗病毒活性的比较。
图8：MD021-7和MD051-3对A/密西西比/03/01(H1N1)H274Y(奥司他韦耐受)的抗病毒活性的比较。
图9：MD314-1和MD021-7对A/密西西比/03/01(H1N1)H274Y(奥司他韦耐受)的抗病毒活性的比较。
图10：用于评估小鼠肺和鼻甲中病毒清除率的处理时间、感染和器官收获的总结。
图11：小鼠中用于评估MD021、扎那米韦和PBS的病毒清除率的肺病毒滴度比较。
图12：小鼠中用于评估感染后第1、3、5和7天时MD021、扎那米韦和PBS的病毒清除率的肺病毒滴度比较。
图13：表示为PBS对照组平均百分比的病毒滴度比较。
图14：小鼠中用于评估MD021、扎那米韦和PBS的病毒清除率的体重减轻比较。
图15：体外A/加利福尼亚/7/09(pan H1N1)的中和。
具体实施方式
如上所述，本发明化合物被认为改变病毒表面，将表面转化成微酸性/阴离子环境以选择性干扰病毒生命周期中的步骤。
相信本发明化合物的酸性/阴离子基团将病毒表面转化成微酸性/阴离子环境，其使病毒活性降低或失活。此外，相信这些化合物在细胞外发挥作用，因此可能与副作用发生率降低、毒性降低和/或耐受性倾向降低有关。更特别地，相信本发明化合物在病毒生命周期的多个靶点的细胞外起作用，包括但不限于：
·酸性/阴离子基团在病毒表面产生较低的pH值，这会触发血凝素(HA)蛋白的过早构象变化，这可能随后减少或延缓病毒与细胞的融合。这对于上述病毒生命周期步骤(b)是特异的。
·另外，相信在病毒表面形成低pH环境会通过M2离子通道引发质子流入病毒，这可能会导致遗传物质释放到细胞外。这对于上述病毒生命周期步骤(b)是特异的。
·相信本发明化合物的锚定基团(anchor group)可以交联NA/HA并聚集病毒颗粒以降低病毒的移动性和感染性。这对于上述病毒生命周期步骤(a)和(b)是特异的。
·相信锚定基团抑制神经氨酸酶(NA)的功能以减少或阻止新病毒从细胞膜释放。这对于上述病毒生命周期步骤(g)是特异的。
相信病毒生命周期步骤(a)和(b)的破坏可通过降低病毒感染性(包括病毒侵入细胞，正常细胞核功能的病毒破坏和/或病毒复制)来降低感染的潜在严重性。因此，认为本发明化合物的施用可以比目前可用的NA抑制剂药物更有效地治疗病毒感染和/或更快使患者恢复。进一步，相信本发明化合物可以预防性地用于预防流感感染。
因此，在一个方面，本发明提供一种化合物，其包含第一结构域和第二结构域，
所述第一结构域包含至少一个与流感病毒表面结合的锚定基团；和
所述第二结构域包含至少一个阴离子基团；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中所述第一结构域和第二结构域共价连接。
在一些方面，所述第一结构域和第二结构域通过至少一个二价连接子共价连接。在其他方面，本发明化合物可以进一步包含多价骨架基团。
在另一方面，本发明提供式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其中：
A在各出现处为锚定基团；
B为多价骨架基团；
C在各出现处为阴离子基团；
L1和L2在各出现处为二价连接子；
n为1至4的整数；和
p为1至4的整数。
如本文所使用，“本发明化合物”或“式(I)化合物”意指化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，或其生理学功能衍生物。
如本文所使用，术语“锚定基团(anchoring group)”指与流感病毒表面结合的任何合适的基团。在一些实施方案中，所述锚定基团为与神经氨酸酶结合的基团，例如神经氨酸酶抑制剂或其衍生物。合适的基团的实例包括但不限于唾液酸或其衍生物，包括神经氨酸的N-或O-取代的衍生物，如扎那米韦或拉尼米韦、奥司他韦、帕拉米韦、2,3-二氟唾液酸(DFSA)及其衍生物。在其他实施方案中，所述锚定基团包含特异性结合神经氨酸酶的抗体结合结构域。包含特异性结合神经氨酸酶的抗体结合结构域的合适的锚定基团的实例包括抗体(Ab)或抗体的抗原结合片段，单链抗体片段(scFV)或单结构域抗体(dAb)。
如本文所使用，术语“骨架基团”是指任何合适的多价基团，其上连接有一个或多个锚定基团和一个或多个酸性或阴离子基团。在一些方面，所述骨架基团可以为三价基团。在其他方面，所述骨架基团可以为四价基团。合适的骨架基团的实例包括但不限于任选取代的丙烷-1,2,3-三羧酸酯，任选取代的环己烷-1,3,5-三羧酸酯，和任选取代的苯-1,2,4,5-四羧酸酯。
术语“酸性或阴离子基团”和“酸性/阴离子基团”是指具有酸性和/或阴离子性质的任何合适的官能团，其起到干扰血凝素与细胞的结合的作用。具体而言，术语“阴离子”描述官能团或材料的净负电荷。应该理解，给定的负电荷材料可以具有一个或多个与其相关的带正电的反离子，反之亦然。在溶液中，带负电荷的材料可能已经与与其相关的一个或多个带正电荷的反离子解离。如本文所使用，术语“阴离子”用于描述该材料或官能团的性质，而不是具有一种或多种反离子的整个复合物，所述一种或多种反离子通常使该复合物呈中性。应该理解，某些官能团在不同的pH值下带负电、中性或带正电荷。材料是否是阴离子将根据这些电荷的总和来确定。例如，在本发明的范围内，酸性或阴离子基团可以包括一个或多个下列官能团：羧酸、磺酸、磷酸和次膦酸及其电子等排体(isostere)或生物电子等排体(bioisostere)。合适的酸性或阴离子基团的实例包括具有酸性和/或阴离子性质的羧酸、氨基酸、二肽、三肽或多肽或其衍生物，例如天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸或衍生自天冬氨酸、半胱氨酸和/或谷氨酸的肽。
术语“唾液酸”在本领域中是很好理解的，并且是指9-碳单糖，尤其是来自神经氨酸的那些。合适的基团的实例包括但不限于衍生自N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的N-和/或O-取代的任选取代的单糖。
术语“神经氨酸酶抑制剂”在本领域中是很好理解的，并且是指一类阻断神经氨酸酶的化合物。在一些实施方案中，锚定基团可以是神经氨酸酶抑制剂或其衍生物。合适的神经氨酸酶抑制剂的例子包括但不限于唾液酸或唾液酸的衍生物，例如2,3-二氟唾液酸。其他合适的神经氨酸酶抑制剂包括：
及其衍生物。
如本文所使用，关于抗体与第二化学物种相互作用的术语“特异结合”或“特异性结合”意指相互作用依赖于在化学物种上存在的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)，例如，抗体通常识别并结合特定蛋白结构而不是蛋白。
如本文所使用，术语“抗体”广泛地指由四条多肽链，两条重链(H)和两条轻链(L)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其任何功能片段、突变体(mutant)、变体(variant)或衍生物，其保留Ig分子的基本表位结合特征。这种突变体、变体或衍生物抗体形式是本领域已知的。下面讨论其非限制性实施方案。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(type)(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(class)(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类(subclass)。
如本文所使用，术语抗体的“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是指保留特异性与抗原结合的能力的抗体或蛋白质的一个或多个片段(例如IL-12)。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。此类抗体实施方案也可以是双特异性(bispecific)、双重特异性(dual specific)或多特异性形式；其特异性结合两种或多种不同的抗原。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，1989Nature 341 544-6，Winter等人，PCT公开WO90/05144Al，通过引用并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成连接子连接，这使得它们能够制成单一蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；(参见例如Bird等人，1988 Science 242 423-6；Huston等人1988 Proc Natl Acad Sci USA 85 5879-83)。这种单链抗体也只在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。也包括其他形式的单链抗体，如双抗体。双抗体是其中VH和VL结构域表达在单一多肽链上的二价双特异性抗体，但是其使用的连接子太短而不能在相同链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.,等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.,等人,1994,Structure 2:1121-1123)。这种抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubel编辑，Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag.New York.第790页,ISBN 3-540-41354-5)。
在一个实施方案中，锚定基团在各出现处是结合流感病毒表面的任何合适的锚定基团。在一些实施方案中，锚定基团在各出现处是结合神经氨酸酶的基团，其包括神经氨酸酶抑制剂或其衍生物。在某些实施方案中，锚定基团是神经氨酸酶抑制剂或其衍生物，其选自唾液酸，如扎那米韦或拉尼米韦、2,3-二氟唾液酸、奥司他韦、帕拉米韦及其衍生物。在其他实施方案中，锚定基团在各出现处包含特异性结合神经氨酸酶的抗体结合结构域。在其中锚定基团是特异性结合神经氨酸酶的抗体结合结构域的某些实施方案中，锚定基团选自抗体(Ab)、抗体的抗原结合片段、单链抗体片段(scFV)和单结构域抗体(dAb)。本发明的化合物可以包含总共1至6个锚定基团，优选2至4个锚定基团，更优选2个锚定基团。
在另一个实施方案中，所述锚定基团为衍生自式II基团、式III基团、式IV基团和式V基团的单价基团
其中E1选自–COOH、COOHR6、-SO3H、-PO3H2、-PO(OR6)2；
G1选自–NH2、-CH2NH2、-(CH2)2NH2、
T1选自任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、或任选取代的C2-C6炔基；
U1选自-CH2R7、-(CH2)2R7、-CH2CHR7CH2R7；
R7选自H、-OH、-OCH3、-OAc、-NH2、或–SH；
R8和R8’各自独立地选自氢、-N3、-CN、-CH2NH2、胍基、或–NR10R11；
R9选自氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、或任选取代的C2-C6炔基；
R10和R11各自独立地选自氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6酰基、-C(NH)NH2、-CH2COOH、CH2CH2OH或-CH2CH(R12)(R13)；
R12和R13各自独立地选自O和R14N＝；和
R14选自氢、-OH、-OCH3、-NH2、和-N(CH3)2；
R15和R15’各自独立地选自氢和CO2R16；
R16为H或任选取代的C1-C6烷基；
R17选自NH2和-NHC(═NH)NH2；
G2为
R18选自氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、和任选取代的C2-C6炔基。
在另一个实施方案中，锚定基团在各出现处选自式VI和式VII的基团：
其中R1选自-NR2、胍基(guandino)、-ONR2，其中R为H或任选取代的C1-C6烷基；
R2选自H、任选取代的C1-C6烷基、和任选取代的芳基，和
R3选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的芳基、和任选的C1-C6酰基。
在另一个实施方案中，所述锚定基团为式(VIa)的基团：
在另一个实施方案中，所述锚定基团为式(VIIa)的基团：
在一个实施方案中，连接子(如式I的L1和/或L2)在各出现处为任何合适的二价连接子。在一个实施方案中，连接子在各出现处独立地选自一个键、任选取代的C1-C12亚烷基、-C(O)-NR-、-O-C(O)O-NR-、-C＝N-O-、-C＝N-NR-、-SO2-NR-、二硫化物、-C(O)-NR-(CH2)x-NR-、-(CH2)x-NR-、-(CH2)x-(O-(CH2)y-)z-、任选取代的-C＝N-O-、任选取代的-C＝N-NR-亚烷基、任选取代的亚烷基磺酰胺、任选取代的亚烷基二硫化物，其中R独立地为H或C1-C6烷基并且其中x、y和z各自为独立地选自0、1、2、3和4的整数。
在一个实施方案中，其中，所述锚定基团为式(VI)或式(VIa)的基团，式(I)的连接子L1选自-C(O)-NR-(CH2)x-NR-、-(CH2)x-NH-和-(CH2)x-(O-(CH2)y)z，其中x、y和z各自为独立地选自0、1、2、3和4的整数。在另一个实施方案中，其中，所述锚定基团为式(VII)或式(VIIa)的基团，式(I)的连接子L1为-(CH2)x-NH-，其中x为选自0、1、2、3和4的整数。
在一个实施方案中，式(I)的连接子L2为一个键。
在一个实施方案中，所述骨架基团为任何合适的多价基团。在一个实施方案中，所述骨架基团为三价骨架基团。在另一个实施方案中，所述骨架基团为四价骨架基团。在一个实施方案中，所述骨架基团选自任选取代的三羧酸酯基团、任选取代的四羧酸酯基团或多价肽。在另外的实施方案中，所述骨架基团选自任选取代的丙烷-1,2,3-三羧酸酯、任选取代的丙-1-烯-1,2,3-三羧酸酯、任选取代的环丙烷-1,2,3-三羧酸酯、任选取代的环己烷-1,3,5-三羧酸酯、任选取代的苯-1,3,5-三羧酸酯、任选取代的甲烷四羧酸酯、任选取代的1,2,3,4-丁烷四羧酸酯、任选取代的亚乙基-1,1,2,2-四羧酸酯如乙二胺四乙酸(EDTA)、任选取代的环己烷-1,2,4,5-四羧酸酯、和任选取代的苯-1,2,4,5-四羧酸酯。在其他实施方案中，所述骨架基团选自任选取代的丙烷-1,2,3-三羧酸酯、任选取代的环己烷-1,3,5-三羧酸酯、任选取代的苯-1,2,4,5-四羧酸酯、任选取代的均苯四甲酸(pyromellitic acid)和由-C(O)-NH-NH-C(O)-形成的任选取代的二均苯四甲酸(5,5’-(肼-1,2-二羰基)双(苯-1,2,4-三羧酸)。在其他实施方案中，所述骨架基团为多价肽。
在一个实施方案中，所述酸性或阴离子基团为具有酸性和/或阴离子性质的任何合适的官能团，其起到干扰血凝素与细胞结合的作用。在一些实施方案中，所述酸性或阴离子基团为包含选自羧酸、磺酸、磷酸或次膦酸及其电子等排体或生物电子等排体的一个或多个官能团的任何合适的基团。在一些实施方案中，所述酸性或阴离子基团为包含一个或多个酸性官能团的任何合适的氨基酸、二肽、三肽、多肽或其衍生物。在一个实施方案中，所述酸性或阴离子基团为天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸或衍生自天冬氨酸、半胱氨酸和/或谷氨酸的肽。
在一个实施方案中，本发明化合物包含总共2至26个酸性/阴离子残基，优选4至10个酸性/阴离子残基。例如，在酸性或阴离子基团包含二羧酸的情况下，可以理解为这样的部分包含两个不同的酸性/阴离子残基。参考本发明化合物的代表性实例举例，注意到MD349包含总共九个酸性或阴离子残基(五个羧酸残基和四个磺酸残基)，MD348包含总共七个酸性或阴离子残基(四个羧酸残基和三个磺酸残基)，MD345包含总共八个酸性或阴离子残基(一个羧酸残基和七个磺酸残基)，MD352包含总共九个酸性或阴离子残基(两个羧酸残基和七个磺酸残基)，MD356包含总共六个酸性或阴离子残基(两个羧酸残基和四个磺酸残基)，MD357包含总共六个酸性或阴离子残基(两个羧酸残基和四个磺酸残基)，MD358包含总共八个酸性或阴离子残基(八个羧酸残基)，MD359包含总共八个酸性或阴离子残基(两个羧酸残基和六个磺酸残基)，MD373包含总共八个酸性或阴离子残基(八个羧酸残基)，和MD376包含总共十个酸性或阴离子残基(十个羧酸残基)。
在另一个实施方案中，所述酸性或阴离子基团为式VIII的基团：
其中
R4在各出现处独立地选自–COOH、-SO3H、-NHCH2SO3H、-CONH-Cya、-CONH-Asp、-CONH-Asp(-NHCH2SO3H)w、和-CONH-Asp(-NHCH2PO3H)w；其中w为1或2的整数；
R5选自-OH和-NHCH2SO3H；
u为0至3的整数；
t为0至3的整数；
r为0至6的整数；
v为1至12的整数。
在一个实施方案中，n为1至4的整数。在另一个实施方案中，n为1至3的整数。在在某些实施方案中，n为1。在其他实施方案中，n为2。在另一个实施方案中，n为3。在另外的实施方案中，n为4。
在一个实施方案中，p为1至4的整数。在另一个实施方案中，p为1至2的整数。在某些实施方案中，p为1。在其他实施方案中，p为2。在其他实施方案中，p为3。在另外的实施方案中，p为4。
另外或任选地，在一些实施方案中，式(I)的化合物可以在组装之前、期间或之后进行修饰，以增强或改变生物学活性和/或对于流感病毒表面的结合亲和力。在一个实施方案中，其中所述酸性或阴离子基团包含一个或多个羧酸，包括氨基酸，所述羧酸可以通过硫酸化、磷酸化、官能团互变和/或侧链的连接进行修饰。例如，在所述酸性或阴离子基团包含羧酸的情况下，所述羧酸可以被修饰成酰胺或硫酸化酰胺，包括–C(＝O)NH(CH2)nSO3H。可选地，或另外，在所述酸性或阴离子基团包含氨基酸或肽的情况下，C末端可以被修饰以包含替代官能团，例如将末端酸转化为酰胺或硫酸化酰胺，包括–C(＝O)NH(CH2)nSO3H。
对于本文公开的式(I)化合物，预期(i)至(vii)的任何或多个以下组合：
(i)A为式(IIa)；或
A为式(IIIa)；
(ii)B为丙烷-1,2,3-三羧酸；或
B为环己烷-1,3,5-三羧酸酯；或
B为苯-1,2,4,5-四羧酸酯；
(iii)L1为-C(O)-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)2-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)3-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)4-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)5-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)6-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)7-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)8-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)9-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)10-NH-；或
L1为-C(O)-(CH2)12-NH-；或
L1为-(CH2)6-NH-；或
L1为-(CH2)8-NH-；或
L1为-(CH2)9-NH-；或
L1为-(CH2)10-NH-；或
L1为-(CH2)12-NH-；
(iv)L2为一个键；
(v)C为L-天冬氨酸；或
C为D-天冬氨酸；或
C为L-半胱氨酸；或
C为D-半胱氨酸；或
C为-(L-Asp)2-OH；或
C为-(D-Asp)2-OH；或
C为-(L-Cya)2-OH；或
C为-(D-Cya)2-OH；或
C为-(L-Asp)3-OH；或
C为-(D-Asp)3-OH；或
C为-(L-Cya)3-OH；或
C为-(D-Cya)3-OH；或
C为-(L-Cya)7-OH；或
C为-(D-Cya)7-OH；或
C为-(L-Asp-L-Cya)4-OH；或
C为-(L-Asp-L-Cya)4-OH；或
C为-[L-Asp(L-Cya)]3-OH；或
C为-[D-Asp(D-Cya)]3-OH；或
C为-[L-Asp(L-Cya)]4-OH；或
C为–[(L-Asp)4-(L-Cya)3]-OH；或
C为–[(D-Asp)4-(D-Cya)3]-OH；或
C为-[L-Asp(L-Cya)]3-OH；或
C为-[D-Asp(D-Cya)]3-OH；或
C为-[L-Asp(L-Cya)]4-OH；或
C为-[D-Asp(D-Cya)]4-OH；或
C为L-Asp(NHCH2SO3H)2；或
C为D-Asp(NHCH2SO3H)2；或
C为-[L-Asp(NHCH2SO3)]3-NHCH2SO3H；或
C为-[D-Asp(NHCH2SO3)]3-NHCH2SO3H；
(vi)n为2；或
n为3
(vii)p为1；或
p为2。
为了方便引用，可以缩写本发明化合物的代表性实例。例如，在代表性实例的情况下，为了方便引用，锚定基团(包括式(I)的A)和连接子(包括式(I)的L1)，在各出现处可以表示为单个基团，称为Zx或Sy。具体地，当本发明化合物包含式Zx的基团时，这些基团为唾液酸衍生物，其中官能团(氨基或胍基)替代了唾液酸环4位的羟基。这样的修饰使得式Zx的基团能够与流感病毒神经氨酸酶相互作用，但不与哺乳动物神经氨酸酶相互作用。当本发明化合物被施用给哺乳动物包括人时，这提供了安全性的一面。式Sy的基团通过唾液酸的2-羟基连接。具体地，在式Sy中硫代糖苷连接子基团，例如2-S-(CH2)mNHR，与锚定基团一起使用，当与等价的醚连接子，例如2-O-(CH2)mNHR相比时，其对抗酶水解。为了方便引用，Zx或Sy的结构概述如下：
结构Sy 缩写
Y为6 S6
Y为8 S8
Y为9 S9
Y为10 S10
Y为12 S12
为了方便引用，在代表性实例的情况下，可以衍生出式(I)的骨架基团B的化合物缩写如下：
为了方便引用，在代表性实例的情况下，式(I)的锚定基团A、连接子L1和骨架基团B可以缩写如下：
为了方便引用，在代表性实例的情况下，可以衍生出式(I)的酸性或阴离子基团的化合物缩写如下：
本发明化合物的代表性实例概括如下。
本文中单独或组合使用的术语“烷基”是指直链或支链饱和烃基。术语“C1-12烷基”是指含有1至12个碳原子的基团，并且“低级烷基”是指含有1至6个碳原子的C1-6烷基，例如甲基(“Me”)、乙基(“Et”)、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。
术语“环烷基”是指非芳香、饱和的非芳香碳环。术语“C4-9环烷基”例如是指具有4至9个碳原子的基团。实例包括环丁基、环戊基和环己基。
术语“烯基”是指含有一个或多个双键，优选一个或两个双键的直链或支链烃。术语“C2-12烯基”例如是指含有2至12个碳原子的基团。烯基的实例包括烯丙基、1-甲基乙烯基、丁烯基、异丁烯基、1,3-丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1,4-戊二烯基、1-戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基和1,3,5-己三烯基。
术语“炔基”是指含有一个或多个三键，优选一个或两个三键的直链或支链烃。术语“C2-12炔基”例如是指含有2-12个碳原子的基团。实例包括2-丙炔基和2-或3-丁炔基。
单独或组合使用的术语“烷氧基”是指经由氧键(-O-)共价结合的直链或支链烷基，并且术语“C1-6烷氧基”和“低级烷氧基”指含有1至6个碳原子的这类基团，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基等。
术语“环烯基”是指具有单个环或多个稠和环和至少一个内部不饱和点的环状烯基基团，优选含有4至11个碳原子。合适的环烯基的实例包括，例如环丁-2-烯基、环戊-3-烯基、环己-4-烯基、环辛-3-烯基、茚基等。
术语“酰基”是指基团HC(O)-、烷基-C(O)-、环烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-和杂环基-C(O)-，其中本文描述了烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基。
术语“芳基”是指碳环(非杂环)芳环或环体系。芳环可以为单环或双环环系。芳环或环系通常由5至10个碳原子组成。合适的芳基的实例包括但不限于苯基、联苯基、萘基、四氢萘基等。
术语“亚烷基”是指饱和的支链或直链或环状烃基，其具有通过从母体烷烃的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子而衍生的两个单价基团中心。例如，亚烷基可具有1至20个碳原子，1至10个碳原子，或1至6个碳原子。典型的亚烷基包括但不限于亚甲基(-CH2-)、1,1-乙基(-CH(CH3)-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,1-丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。
术语“亚烯基”是指不饱和的支链或直链或环状烃基，其具有通过从母体烯烃的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子而衍生的两个单价基团中心。例如，亚烯基可具有1至20个碳原子，1至10个碳原子，或1至6个碳原子。典型的亚烯基包括但不限于1,2-乙烯基(-CH＝CH-)。
术语“亚炔基”是指不饱和的支链或直链或环状烃基，其具有通过从母体炔烃的相同或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的两个单价基团中心。例如，亚炔基可以具有1至20个碳原子，1至10个碳原子，或1至6个碳原子。典型的亚炔基包括但不限于亚乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡CH-)。
术语“亚芳基”是指芳基，其具有通过从母体芳基的相同或两个不同的碳或杂原子去除两个氢原子而衍生的两个单价基团中心。
术语“卤代”和“卤素”指氟、氯、溴和碘基团。
术语“卤代烷基”基团是烷基上的一个或多个氢原子被卤素替代。
术语“杂芳基”指单价芳香碳环基团，优选在环内具有2至10个碳原子和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的。杂原子优选为氮。这样的杂芳基可以具有单环(例如吡啶基、吡咯基或呋喃基)或多个稠和环(例如，吲哚嗪基、苯并噻吩基或苯并呋喃基)。
术语“杂环基”是指具有单环或多个稠和环的单价饱和或不饱和基团，优选在环内具有1至8个碳原子和1至4个选自氮、硫、氧、硒或磷的杂原子。
术语“任选取代的”是指一个基团可以包括一个或多个取代基。该基团上的一个或多个氢原子可以被取代基替代，所述取代基独立地选自卤素(例如卤代烷基，如–CF3或–CF2H)、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-(CH2)vC3-7环烷基、-(CH2)vC4-7环烯基、-(CH2)v芳基、-(CH2)v杂环基、-(CH2)v杂芳基、-C6H4S(O)qC1-6烷基、-C(Ph)3、-CN、-OR、-O-(CH2)1-6-R、-O-(CH2)1-6-OR、-OC(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)NR'R"、-NR'R"、-NO2、-NRC(O)R'、-NRC(O)NR'R"、-NRC(S)NR'R"、-NRS(O)2R'、-NRC(O)OR'、-C(NR)NR'R"、-C(＝NOR')R、-C(＝NOH)NR'R"、-C(O)NR'R"、-C(＝NCN)-NR'R"、-C(＝NR)NR'R"、-C(＝NR')SR"、-NR'C(＝NCN)SR"、-CONRSO2R'、-C(S)NR'R"、-S(O)qR、-SO2NR'R"、-SO2NRC(O)R'、-OS(O)2R、-PO(OR)2和-NO2；其中v为0-6，q为0-2，并且R、R'和R"各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C4-7环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、C 1-6烷基芳基、C1-6烷基杂芳基、和C1-6烷基杂环基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、C1-6烷基芳基、C1-6烷基杂芳基、或C1-6烷基杂环基，可以任选被选自卤素、羟基、低级烷基、低级烷氧基、-CO2H、CF3、CN、苯基、NH2和-NO2的1至6个相同或不同的基团取代；或者，当R'和R"连接到相同的氮原子时，它们可以与它们所连接的原子一起形成5-7元含氮杂环。
在本文定义的可能的官能团列表中，当给定的基团含有两个或多个亚基团时，例如该亚基团可以如在烷基芳基中列为[亚基团A][亚基团B]形式，或如在芳氧基烷基中列为[亚基团A][亚基团B][亚基团C]形式，它们如上所列出的亚基团的顺序并非旨在限制于其呈现的顺序。因此，具有被定义为[亚基团A][亚基团B]的两个亚基团的基团，例如烷基芳基，也旨在是指具有被定义为[亚基团B][亚基团A]的两个亚基团的基团，例如芳基烷基。
术语“手性”是指具有不可重叠的镜像配对物的性质的分子，而术语“非手性”是指其镜像配对物可重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但在空间中的原子或基团的排列方面不同的化合物。
术语“非对映异构体”是指具有两个或多个手性中心并且其分子不是彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率分析程序下分离，例如电泳或色谱法。
术语“对映异构体”是指化合物的两个立体异构体，它们彼此是不可重叠的镜像。
本文中使用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；和Eliel,E.and Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子手性中心的绝对构型。采用前缀d和l或(+)和(-)来表示化合物的平面偏振光的旋转符号，其中(-)或l表示化合物为左旋。前缀为(+)或d的化合物为右旋。对于给定的化学结构，这些立体异构体是相同的，除了它们彼此是镜像的。特定的立体异构体也可称为对映异构体，这种异构体的混合物经常被称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，其可以在化学反应或过程中没有立体选择性或立体定向性的情况下发生。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种对映体物质的等摩尔混合物，没有光学活性。
如本文所使用的，氨基酸及其衍生物可以适当地缩写为其各自的三字母或单字母代码。例如，在本文中，半胱氨酸可以称为Cya、Cyst或Cyst-SO3H，天冬氨酸可以称为Asp。
本发明化合物的盐优选是药学上可接受的，但应理解，非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内，因为它们可用作制备药学上可接受的盐的中间体。
应理解，本发明化合物及其盐可以以药学上可接受的衍生物的形式存在。术语“药学上可接受的衍生物”包括式(I)化合物的药学上可接受的酯、前药、溶剂化物和水合物，或其盐。药学上可接受的衍生物可以包括任何药学上可接受的水合物或任何其他化合物或前药，其在施用至受试者后，能够(直接或间接)提供本发明化合物或其活性代谢产物或残余物。
药学上可接受的盐包括酸式加成盐、碱式加成盐、和季胺和吡啶鎓(pyridinium)的盐。酸式加成盐由本发明化合物和药学上可接受的无机或有机酸形成，所述无机或有机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、乙酸、丙酸、抗坏血酸、柠檬酸、丙二酸、富马酸、马来酸、乳酸、水杨酸、氨基磺酸、酒石酸或氨基酸。季胺和吡啶鎓的反离子包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、丙二酸盐、富马酸盐、氨基磺酸盐和酒石酸盐。碱式加成盐包括但不限于盐如钠、钾、钙、锂、镁、铵和烷基铵。另外，含有碱性氮的基团可以用试剂例如低级烷基卤化物、二烷基硫酸酯等季铵化(quaternised)，所述低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；所述二烷基硫酸酯如硫酸二甲酯和硫酸二乙酯。所述盐可以以已知的方式制备，例如通过在合适的溶剂存在下用合适的酸或碱处理化合物。
本发明化合物可以以结晶形式和/或溶剂化物(例如水合物)形式存在，并且旨在两种形式均在本发明的范围内。术语“溶剂化物”是指溶质(在本发明中为本发明化合物)和溶剂的可变化学计量的复合物。这些溶剂不应该干扰溶质的生物活性。举例来说，溶剂可以为水、乙醇或乙酸。溶剂化的方法在本领域中通常是已知的。
术语“前药”以其最广泛的含义使用，并涵盖体内转化为本发明化合物的那些衍生物。本领域技术人员容易想到这些衍生物，并且包括例如，化合物其中游离羟基被转化成酯衍生物或环氮原子被转化成N-氧化物。酯衍生物的实例包括烷基酯、磷酸酯和由氨基酸形成的那些，优选缬氨酸。任何作为本发明化合物前药的化合物均在本发明的范围和精神内。
术语“药学上可接受的酯”包括本发明化合物的生物学上可接受的酯，例如磺酸、膦酸和羧酸衍生物。
因此，在本发明的另一方面，提供了本发明化合物的前药或药学上可接受的酯或其盐。
可以理解的是，本发明的化合物具有至少一个不对称中心，因此能够以多于一种立体异构的形式存在。本发明分别延伸到这些形式的每一个和它们的混合物，包括外消旋体。通常可以通过色谱法或使用拆分剂将异构体分离。可选地，可以通过使用手性中间体的不对称合成来制备个体异构体。当化合物具有至少一个碳-碳双键时，其可以Z-和E-形式出现，化合物的所有异构体形式均包括在本发明中。
本发明在可能的情况下还包括盐或药学上可接受的衍生物，例如本发明上述实施方案的药学上可接受的酯、溶剂化物和/或前药。
在本发明的另一方面中，提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种上述化合物或其药学上可接受的盐，包括其药学上可接受的衍生物，和任选的药学上可接受的载体或稀释剂。
在另一方面中，本发明提供用于治疗或预防流感病毒感染的药物组合物，所述组合物包含有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐，包括其药学上可接受的衍生物，和任选的药学上可接受的载体或稀释剂。
术语“组合物”旨在包括活性成分与作为载体的包封材料的制剂，以得到其中活性成分(具有或不具有其他载体)被载体包围的胶囊。
所述药物组合物或制剂包括适合于口服、直肠、鼻腔、局部(包括口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包括肌肉内、皮下和静脉内)施用的那些，或以适合于通过吸入或吹入施用的形式。在一个实施方案中，本发明化合物被配制用于吸入、口服施用、鼻内施用、腹腔内施用、静脉内施用或肌肉内施用。
可以在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Sixteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)和Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版(Lippincott Williams&Wilkins,2005)中找到配制和/或制备药物组合物试剂的一般考虑因素。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物和制剂可以通过任何合适的吸入、吹入或鼻内递送方法施用给需要其的人。用于吸入、吹入或鼻内施用的合适方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
在一个实施方案中，本发明化合物的组合物或制剂可以是适于通过吸入或吹入施用的形式。例如，本发明化合物的组合物或制剂可以被制备成干粉、溶液、混悬剂或气雾剂，以用于通过口或鼻吸入或吹入。适合于气溶胶或干粉施用的制剂可根据常规方法制备，并可与其他治疗剂，例如迄今为止用于治疗或预防本文所述感染的化合物一起递送。
在一个实施方案中，本发明化合物的组合物或制剂可以利用干粉吸入器施用。可以使用现有技术中已经公开的类型的干粉吸入器，以及可以使用等静压片剂(isostatically compressed tablet)的微粉化刨片(micronized shaving)或者具有或不具有惰性粘合剂例如乳糖的药物圆片(discs of drug)。这种施用方法提供特别迅速的肺部递送。当本发明化合物以干粉形式提供时，其可以单独存在或与合适的药学上可接受的稀释剂例如淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、糖衍生物如甘露醇或乳糖混合存在。粉末组合物可以以单位剂量形式存在，例如，以例如明胶的胶囊或弹筒(cartridges)或成型塑料或泡罩包装存在，从中可以利用吸入装置施用粉末，或者从例如粉末储存器中以多剂量形式施用粉末。
对于液滴、雾(mist)和气溶胶的吸入，各种装置如喷雾器或加压气溶胶发生器是现成的。另外，这些装置可以被计量以提供剂量的均匀性。
所有吸入器可以被设计和塑造成将液体或固体颗粒递送至鼻粘膜以及上呼吸道和/或下呼吸道。
在另一个实施方案中，本发明化合物的组合物或制剂可以利用湿式气溶胶吸入器通过吸入或吹入施用。例如，本发明化合物的组合物或制剂可以被制备用于通过在预先计量的吸入器中的湿式气溶胶吸入来施用。
在另一个实施方案中，本发明化合物的组合物或制剂为适合于鼻内施用的形式。本文公开的鼻内组合物可以作为喷雾或滴剂施用。因此，含有鼻内制剂的合适的商购包装可以在本领域已知的任何喷雾容器中。在一个或多个实施方案中，根据本发明的制剂可以通过喷雾装置或容器施用。根据本发明的喷雾装置可以为单个单位剂量系统或多剂量系统，例如包括瓶、泵和/或致动器。这种喷雾装置为商业可得的。合适的商购喷雾装置包括获得自Nemera、Aptar、Bespak和Becton-Dickinson的那些装置。用于施用根据本发明的鼻内组合物或制剂的其他合适手段包括通过滴管、注射器、挤压瓶，以及本领域已知的用于以精确和可重复方式将液体应用到鼻粘膜的任何其他手段。
本发明化合物也可以以各种口服或肠胃外剂型施用。对于本领域技术人员显而易见的是以下剂型可以包含作为活性组分的本发明化合物或本发明化合物的药学上可接受的盐。
本发明化合物的组合物或制剂可以为无菌注射制剂的形式，如无菌注射水或油性混悬液。可以根据已知技术使用本文已提及的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制混悬液。无菌注射制剂还可以为无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如1,3-丁二醇中的溶液中的无菌注射溶液或混悬液或者被制备成冻干粉末。在可接受的载体和溶剂中，可以使用的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，通常可以使用无菌固定油作为溶剂或混悬介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可能会用于制备注射剂。此外，适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可以包含混悬剂和增稠剂。
本发明化合物的组合物或制剂也可以口服施用，例如可以制备片剂、糖锭(troche)、锭剂(lozenge)、水或油混悬剂、可分散粉末剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂、糖浆或酏剂。可以根据本领域已知用于制造药物组合物的任何方法制备旨在口服使用组合物，并且这样的组合物可以包含一种或多种试剂，包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供可口的制剂。
本发明化合物与常规佐剂、载体或稀释剂一起可以被置于药物组合物和其单位剂量的形式，并且这种形式可以为固体，例如片剂或填充胶囊；或液体如溶液剂、混悬剂、乳剂、酏剂、或填充其的胶囊，全部用于口服使用；为直肠施用的栓剂形式；或为肠胃外(包括皮下)使用的无菌注射溶液形式。
这种药物组合物和其单位剂量形式可以包含常规比例的常规成分，具有或不具有额外的活性化合物或成分，并且这种单位剂量形式可以含有与将采用的目标日剂量范围相当的任何合适的有效量的活性成分。每片含有十(10)毫克活性成分，或更宽泛地0.1至一百(100)毫克的制剂因此为合适的代表性单位剂量形式。
为了从本发明化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可以为固体或液体。固体形式的制剂包括粉末剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂或可分散颗粒剂。固体载体可以为一种或多种物质，它们也可以作为稀释剂、调味剂、溶解剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂、或包封材料。
在粉末中，载体为细碎的固体，其与细碎的活性组分混合。
在片剂中，活性组分与具有必要结合能力的载体以合适的比例混合并压制成所需形状和尺寸。
粉末和片剂优选含有百分之五或十至约七十的活性化合物。合适的载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂”旨在包括活性化合物与作为载体提供了胶囊的包封材料的制剂，其中活性成分(具有或不具有载体)被载体包围，因此载体与活性成分关联。同样地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉末剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适合于口服施用的固体形式。
为了制备栓剂，首先熔化低熔点蜡如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，然后通过搅拌将活性成分均匀地分散于其中。然后将熔融的均匀混合物倒入适宜尺寸的模具中，使其冷却，从而固化。
适用于阴道施用的制剂可以为阴道栓、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，其除了活性成分还含有本领域已知适合的载体。
液体形式制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂，例如水或水-丙二醇溶液。例如，肠胃外注射液体制剂可以被配制成聚乙二醇水溶液中的溶液。
无菌液体形式组合物包括无菌溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。可以将活性成分溶解或悬浮在药学上可接受的载体中，例如无菌水、无菌有机溶剂或两者的混合物中。
因此，根据本发明的化合物可以被配制用于肠胃外施用(例如通过注射，例如快速灌注或连续输注)，并且可以以单位剂量形式存在于安瓿、预填充注射器、小体积输液或在具有添加的防腐剂的多剂量容器中。所述组合物可以采用如在油性或含水载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂形式，并且可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分可以为粉末形式，通过无菌固体的无菌性分离获得或通过溶液冻干获得，在使用前用合适的载体，例如无菌、无热原水构建。
可以通过在水中溶解活性组分和根据需要添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备适合于口服使用的水性溶液。
可以通过将细碎的活性组分与粘性材料如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、或其他公知的悬浮剂分散于水中来制备适合于口服使用的水性混悬剂。
还包括固体形式的制剂，其旨在使用前不久被转换成液体形式的制剂以用于口服施用。这种液体形式包括溶液剂、混悬剂和乳剂。除了活性组分之外，这些制剂还可含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
对于表皮局部施用，根据本发明的化合物可以被配制成软膏剂、乳膏剂或洗剂，或者作为透皮贴剂。例如，可以用水性或油性基质，添加合适的增稠剂和/或凝胶剂，来配制软膏剂和乳膏剂。可以用水性或油性基质配制洗剂，并且洗剂一般还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。
适用于口腔局部施用的制剂包括锭剂，其在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性成分；软锭剂(pastilles)，其在惰性基质(如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中包含活性成分；和漱口剂，其在合适的液体载体中包含活性成分。
通过常规手段，例如使用滴管、移液管或喷雾器将溶液剂或混悬剂直接应用于鼻腔。制剂可以以单剂量或多剂量形式提供。在滴管或移液管的后一种情况中，这可以通过患者施用适当的、预定体积的溶液或混悬液来实现。在喷雾器的情况中，这可以例如利用计量雾化喷雾泵实现。为了改善鼻内递送和留置性，根据本发明的化合物可以用环糊精包封，或与期望增强鼻粘膜中递送和留置性的其他试剂一起配制。
也可以通过气溶胶制剂来实现对呼吸道的施用，其中在含有推进剂例如氢氟烷烃(HFA)或氯氟烃(CFC)例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其他合适的气体的加压包装中，提供活性成分。气雾剂还可以方便地含有表面活性剂如卵磷脂。药物的剂量可以通过计量阀的提供来控制。
可选地，可以以干粉形式提供活性成分，例如化合物在合适的粉末基质如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的粉末混合物。方便地，粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。所述粉末组合物可以以单位剂量形式存在，例如，以例如明胶的胶囊或弹筒或泡罩包装存在，从中可以通过吸入器施用粉末。
在旨在施用于呼吸道的制剂中(包括鼻内制剂)，化合物通常具有例如5至10微米或更小的小粒径。这种粒径可以利用本领域已知的方式获得，例如通过微米化(micronisation)。
当需要时，可以使用适合于持续释放活性成分的制剂。
药物制剂优选为单位剂量形式。在这种形式下，制剂被细分为含有适量活性组分的单位剂量。单位剂量形式可以为包装制剂，所述包装中含有不连续量的制剂，如包装的片剂、胶囊剂和小瓶或安瓿中的粉末剂。另外，单位剂量形式可以为胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它们可以为包装形式中的适当数量的任何这些剂型。
本发明还包括不含载体的化合物，其中化合物为单位剂量形式。
取决于化合物的活性和待治疗的疾病，待施用的本发明化合物的量可以在每天约0.01mg至2000mg的范围内。
用于治疗所需的化合物的量将随着施用途径，被治疗的病症的性质，以及动物(包括人类患者)的年龄和状况而变化，并且最终由提供服务的兽医或医生自由裁量。
例如，合适的剂量将在约0.1mg至100mg/kg体重/天的范围内，优选在0.1mg至50mg/kg/天的范围内。
在一些实施方案中，用于口服施用的剂量在1mg/kg/天至100mg/kg/天的范围内。注射剂量在1mg/kg/天至100mg/kg/天的范围内。吸入剂量在0.01mg/kg/天至1mg/kg/天的范围内。在一些优选的实施方案中，对于口服或注射施用，剂量在5mg-50mg/kg的范围内，每天2至3次，持续1至15天，优选3至12天，更优选5至10天。在其他优选的实施方案中，对于吸入，剂量在0.1-0.5mg/kg的范围内，每天1至5次，持续1至15天，优选3至12天，更优选5至10天。可选地，在其他优选的实施方案中，对于吸入，剂量在0.2mg/kg-0.4mg/kg的范围内，治疗期间为每天一次施用。应当理解，期望的剂量可以为以单剂量施用或作为分开的剂量以适当的时间间隔施用，例如每天两个、三个、四个或多个子剂量。
本发明化合物方便地以单位剂量形式施用，例如每单位剂量形式含有0.1至10mg活性成分。
尽管可能将化合物以原料化学品形式施用用于治疗，但优选将活性成分以药物制剂的形式呈现。因此，本发明进一步提供一种药物制剂，其包含所述化合物以及一种或多种其药学上可接受的载体，和任选的其他治疗和/或预防成分。从与制剂中的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上讲，载体必须是“可接受的”。
药物制剂包括适用于口服、直肠、鼻内、或肠胃外(包括肌肉内、皮内、皮下和静脉内)施用的制剂，或者适合于胃肠道施用的形式，或适合于呼吸道(包括鼻道)(例如通过吸入或吹入)的形式，或用于皮内或皮下植入的形式，或用于经皮贴剂的形式。适当时，所述制剂可方便地以不连续的剂量单位呈现，并可通过本领域熟知的任何方法制备。所有的方法均包括使活性化合物与载体(例如液体载体或细碎的固体载体或其组合)相关联的步骤，然后，如果需要，将产品成形为所需的制剂。
用于鼻内施用的液体或粉末，用于口服施用的片剂或胶囊，和用于静脉内施用的液体是优选的组合物。
根据本发明的化合物的药物制剂可以与一种或多种其他活性剂在联合治疗中一起施用。例如，活性化合物的药物制剂可以与一种或多种其他抗病毒剂、抗生素、和抗炎药物一起施用(例如，分别、同时或顺序施用)。
术语“治疗有效量”指当施用至需要该治疗的受试者，如哺乳动物包括人时，足以有效治疗的如上所定义的量。治疗有效量将根据受试者和待治疗的疾病状态、痛苦的严重程度和施用方式而变化，并且可以常规地由本领域普通技术人员确定。
如本文所使用，术语“治疗”涵盖动物，优选哺乳动物，更优选人中疾病或病症的任何治疗，其包括：(i)预防受试者中疾病或病情的发生；(ii)抑制疾病或病情；(iii)减轻疾病或病情；或(iv)减轻由疾病引起的病情/症状。
如本文所使用，术语“预防(preventing)”或“预防(prophylaxis)”指预先施用药物以避免或预先阻止疾病或病症的一种或多种症状的出现。医药领域的普通技术人员认同术语“预防”并不是绝对术语。在医药领域，其被理解为指预防性施用药物以基本上减少病情的可能性或严重性，或者减少病情的症状，这是本公开的意图。如在本领域的标准文本(医师办公参考(Physician’s Desk Reference))中所使用的，针对病症或疾病的术语“预防(prevent)”、“预防“preventing””和“预防(prevention)”指在疾病或病症本身完全显现之前避免疾病或病症的起因、作用、症状或发展。
关于本发明化合物、组合物或制剂的术语“施用(administer)”、“施用(administering)”或“施用(administration)”意指将化合物引入需要治疗的动物系统中。当本发明化合物与一种或多种其他活性剂联合时，“施用”及其变体每一个被理解为包括化合物和其他活性剂的同时和/或顺序引入。
实施例
通过以下非限定性实施例进一步描述本文公开的各个方面。
一般方法和说明
除非另有说明，在Bruker Avance 300，DPX 300上的Xwin-NMR版本3.5上记录NMR谱。
除非另有说明，在使用ESI(电喷雾电离探针)的Mass Spectrometer WatersMicromass ZMD上记录质谱，使用Water Mass Lynx NT软件。
除非另有说明，在硅胶60 F245(E.Merck)上进行闪式柱色谱法。
在硅胶预铺板(E.Merck)上进行薄层色谱法(TLC)。
除非另有说明，在Waters Alliance 2690分离模块上进行高效液相色谱法(HPLC)，使用Waters双波长2487 UV检测器和Waters Millennium 32软件。
管理实验室动物的一般程序
根据相应机构/大学的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee)的批准进行利用实验室动物的相关实验的道德规范。
空斑减少试验(plaque reduction assay)的一般程序
将MDCK细胞接种到六孔组织培养板中，并通过标准方法生长至融合。在补充有0.2％BSA的最小体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释流感病毒以产生每孔50至100PFU的估计滴度。在5％CO2气氛中，于37℃，在MDCK细胞上吸收1小时后，吸出病毒接种物并用病毒生长培养基(补充有BSA、胰蛋白酶和胰岛素-转铁蛋白-硒的最小量伊格尔培养基)替换，所述病毒生长培养基含有足以使培养基在室温下凝胶化的量(通常1至2％)的琼脂或琼脂糖。将板在37℃，CO2气氛中孵育直至出现斑块(通常2至4天)。用合适的染色剂(例如，在正式生理盐水(formal saline)中的0.4％结晶紫)使斑块可视化，然后对它们进行计数。将抗病毒效力(EC50)确定为将斑块数减少至未处理对照值的50％的培养基中的化合物的浓度。
CPE试验的材料和一般程序
将测试化合物溶解于无菌水中并于-20℃储存。随后，将化合物稀释在试验介质(MEM+胰蛋白酶)中至需要的浓度。
试验介质包含补充有1mM MEM非必需氨基酸、50U-青霉素50μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠的Gibco 1 MEM(500mL)。将胰蛋白酶(TPCK处理)添加至介质中至终浓度为1μg/ml，然后进行试验。
MDCK细胞(ATCC)在补充有1mM MEM非必需氨基酸、50U-青霉素-50μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠和10％FBS的生长介质-Gibco 1x MEM(500mL)中生长。
病毒原液用PBS稀释。
使用CellTitre 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)进行试验。
除非另有说明，对于CPE试验使用以下一般方法：
i)在96孔板中，在生长介质中，使MDCK细胞生长至融合；
ii)除去介质；
iii)每孔(包括模拟感染的孔)加入46μL稀释的病毒；
iv)在37℃孵育板1.5小时，这期间制备测试化合物。
v)1.5小时后，除去病毒培养液。
vi)通过在上述板上进行化合物的1:3连续稀释制备待测化合物：
a)将100μL试验介质添加入第3至11排；
b)将150μL化合物添加入第2排；
c)第2至10排滴定50μL，然后从第10排弃去50μL。
d)第11排作为阳性和阴性对照。
vii)于37℃孵育细胞48小时-96小时。
viii)感染后48小时-96小时，除去介质。
ix)用100μL不含胰蛋白酶的试验介质替换介质。
x)加入每孔20μL检测溶液。
xi)于37℃将板进一步孵育1小时。
xii)测定板在490nm的吸光度。
实施例1：在MDCK细胞感染之前用测试化合物预处理病毒
在MDCK细胞感染之前，使用代表性的式(I)化合物评估抗病毒活性。测试MD345[(PK2 TCA(Z0)2-[D-Cya-SO3H)7-OH]、MD345[(PK2 TCA(Z0)2-[Cya)7-OH]、MD348[(CHTCA(Z0)2-D-Asp-(D-Cya)-D-Asp-(D-Cya)-D-Asp-(D-Cya)-OH]和MD348[(CHTCA(Z0)2-D-Asp-(D-Cya-SO3H)-D-Asp-(D-Cya-SO3H)-D-Asp-(D-Cya-SO3H)-OH]作为式(I)的代表性化合物。测试对于两种病毒株A/悉尼/250/99(H1N1)和A/悉尼/5/97(H3N2)的活性。使用扎那米韦作为对照。
条件详细列于表1中，并且图1中提供总结。
表1：在MDCK细胞感染之前预处理病毒的条件总结
A/悉尼/250/99的结果总结于表2和图2A、2B和2C中。A/悉尼/5/97的结果总结于表3和图3A、3B和3C中。
结果表明式(I)化合物MD345和MD348在细胞外中和了病毒A/悉尼/25/99(H1N1)和A/悉尼/5/97(H3N2)。用扎那米韦预处理病毒不会影响病毒的传染性。
随后MD345-2和扎那米韦对抗A/悉尼/250/99的时间进程比较表明MD345-2在不到1分钟内中和了两种病毒。A/悉尼/250/99的结果总结于表2和图2A、2B和2C中。A/悉尼/5/97的结果总结于表4和图4中。
表2：在MDCK细胞感染之前预处理病毒
测试化合物：MD348-2、MD345-2和扎那米韦(对照)病毒滴度(Virus Titre)：A/悉尼/25/99
说明：将化合物溶解于H2O中至50μg/mL。在1x PBS中进一步稀释至5μg/mL。在含有1μg/mL胰蛋白酶的介质中维持细胞。在感染后72小时进行测试。(1000 140711)0.5x 10-4病毒预吸附1小时，除去病毒，将细胞洗涤一次，加入新鲜介质，孵育72小时。
表3：在MDCK细胞感染之前预处理病毒
测试化合物：MD348-2、MD345-2和扎那米韦(对照)
病毒滴度：A/悉尼/5/97
说明：将化合物溶解于H2O中至50μg/mL。在1x PBS中进一步稀释至5μg/mL。在含有1μg/mL胰蛋白酶的介质中维持细胞。在感染后72小时进行测试。(2000 271011)1x 10-4病毒预吸附1小时，除去病毒，将细胞洗涤一次，加入新鲜介质，孵育72小时。
表4：在MDCK细胞感染之前用于预处理病毒的时间进程比较
测试化合物：MD345-2和扎那米韦(对照)
病毒滴度：A/悉尼/250/99
说明：将化合物溶解于H2O中至50μg/mL。在1x PBS中进一步稀释至0.5μg/mL。在含有1μg/mL胰蛋白酶的介质中维持细胞。在感染后72小时进行测试。(1000 140711)1x 10-4病毒预吸附1小时，除去病毒，将细胞洗涤一次，加入新鲜介质，孵育72小时。
实施例2：可变的酸性/阴离子基团对于测试化合物抗病毒活性的比较
使用式(I)的代表性化合物比较酸性/阴离子基团对抗病毒活性的影响。测试以下化合物作为式(I)的代表性化合物：
·MD314-1：(CHTCA(Z0)2-L-Asp-(L-Cyst-SO3H)-Asp-(L-Cyst-SO3H)-L-Asp-(L-Cyst-SO3H)-OH，包含三个硫酸和四个羧酸；
·MD021-7：CHTGA(Z)2-L-Asp，包含2个羧酸；和
·MD051-3：PK2 TCA(Z)2-L-Asp-L-Asp，包含3个羧酸。
测试对于三种病毒株，A/悉尼/250/99(H1N1)、A/密西西比/03/01(H1N1)野生型、和A/密西西比/03/01(H1N1)H274Y(奥司他韦耐受)的活性。
A/悉尼/5/97(H3N2)的结果总结于表5和图5中。A/密西西比/03/01(H1N1)野生型的结果总结于表5和图6和7中。A/密西西比/03/01(H1N1)H274Y(奥司他韦耐受)的结果总结于表5和图8和9中。
表5：酸性/阴离子基团对于抗病毒活性的比较
结果显示化合物的抗病毒活性与酸性/阴离子基团的数量成正比。
实施例3：肺和鼻甲中病毒清除率的改变
评估式(I)的代表性化合物对于小鼠肺和鼻甲中病毒清除率的影响。测试MD021(CHTCA(Z)2-L-Asp)作为式(I)的代表性化合物。扎那米韦和PBS被用作对照。
在第-1、+1、+2、+3、+4和+5天用2μg MD021、2μg扎那米韦或PBS在麻醉下鼻内处理每组20只小鼠，在第0天感染50pfu PR8流感病毒的亚致死剂量。每天称重小鼠。感染后第1、3、5和7天处死每个处理组五只小鼠，并收获它们的肺和鼻甲。测定肺的病毒载量。鼻甲在-80℃储存直至分析。
在前一天的干预后24小时，在两小时窗内，进行小鼠的所有处理(treatment)、感染和处死。小鼠在被处死当天不接受处理。处理感染和器官收获的时间总结于图10中。
结果于表6和图11至14中详细描述。在所有时间点，MD021处理的小鼠的肺病毒载量(表示为log10)显著低于PBS处理的小鼠。感染后第3天和第7天，MD021处理的小鼠的肺病毒载量也显著低于扎那米韦处理的小鼠。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)评估结果，其具有第1、3和5天的数据的图基事后检验(Tukey post-test)和第7天的数据的曼维尼特氏t检验(Mann Witney t-test)。测定的阈值为101.07。阴性样品分配值为101。尽管给予低剂量的病毒，但未处理的小鼠(PBS对照处理)不能存活至第7天。
直至感染后第7天，评估未被处死的小鼠组的体重减轻。结果表明用MD021处理后体重减轻最小，明显少于后来时间点施用扎那韦韦时观察到的体重减轻。
表6：肺和鼻甲中病毒清除率的改变
通过双向重复测量方差分析对体重减轻曲线的统计学分析显示处理曲线有非常显著的差异(p<0.0001)。注意，仅对于直至感染后第5天获得的数据完成双向重复测量方差分析，因为PBS组在第6天和第7天由于过早死亡而没有完整的数据。邦弗朗尼事后检验(Bonferroni post-test)显示，扎那米韦和MD021在第3、4和5天与PBS具有显著性差异(p<0.001)。对于MD021和扎那米韦的完整的体重减轻曲线进行的相同分析仅显示两个体重减轻曲线整体上具有统计学显著差异(p＝0.0443)，其中邦弗朗尼事后检验显示显著性差异出现在第6天(p<0.01)和第7天(p<0.001)。
结果表明，与在感染后第1、3和5天用PBS相似处理的小鼠相比，并且也与在感染后第3和7天用2μg扎那米韦相似处理的小鼠相比，用2μg化合物MD021每日多次的处理能够显著降低肺病毒载量。病毒载量的显著降低伴随着小鼠的更少的体重减轻，并且预期等同于疾病严重程度的实质性降低。整个疾病过程中MD021的最小体重减轻比在后来时间点的扎那米韦引人注目并且显著更好。
虽然小鼠接受了一剂PR8病毒，但在正常情况下，其是亚致死性的，所有接受PBS对照处理的小鼠均减轻体重，并在感染后第7天之前死亡。意想不到的过早死亡可能与每日麻醉剂和鼻内施用50μL液体的有害作用有关。然而，MD021和扎那米韦组的处理胜过任何有害影响。
实施例4：CPE试验筛选
根据上述CPE试验的一般程序进行式(I)的代表性化合物的CPE试验筛选。结果详见表7和8。还针对一系列病毒株进行了特异性体外抗病毒筛选，所述病毒株包括甲型流感H7N9A/安徽/1/2003(表9)、甲型流感H5N1香港/213/2003(表10)、甲型流感H3N2珀斯/16/2009(表11)、甲型流感H7N9A/安徽/1/2003(表12)、甲型流感H1N1加利福尼亚07/2009(表13)、甲型流感H5N1鸭/MN/1525/81(表14)、甲型流感H5N1泰国/16/2004(表15)、甲型流感病毒H1N1、A/密西西比/3/2001H275Y、奥司他韦耐受(表16)、甲型流感病毒H5N1鸭/MN/1525/81(表17)、乙型流感病毒、B/布里斯班/60/2008(表18)、乙型流感病毒、B/弗罗里达/4/2006(表19)和A/悉尼/250/99(H1N1)(表20)。
抗流感活性数据显示式(I)化合物中的酸性基团越多，其抗病毒活性越高。
在随后的CPE试验中(表38)以不同的病毒滴度(表39)进一步评估式(I)的代表性化合物的抗流感活性。
实施例5：对于奥司他韦耐受株的抗流感病毒活性
评估式(I)的代表性化合物对于奥司他韦耐受株的抗流感病毒活性。记录斑块大小和斑块数量的抑制。使用奥司他韦作为对照。结果详细列于表21中。
实施例6：病毒空斑减少试验
在病毒空斑减少中，针对CA/07/2009病毒H1N1和A/PR/8病毒H1N1中每一种评估式(I)的代表性化合物。使用扎那米韦作为对照。结果分别详细列于表22和23中。
实施例7：式(I)的代表性化合物的小鼠体内功效数据
在小鼠中评估式(I)的代表性化合物对于一系列病毒感染的体内功效。
表24详述了用A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)A/维多利亚/3/75(H3N2)、A/密西西比/3/01H275Y、奥司他韦耐受病毒(H1N1)、A/鸭/MN/1525/81(H5N1)、或B/四川/379/99(乙型流感(FluB))之一进行病毒感染，并用不同剂量的式(I)的代表性化合物进行单一化合物处理后，小鼠的存活情况。
表25详述了通过A/PR/8病毒进行鼻内病毒感染(500pfu/小鼠)，并用不同剂量和时间的式(I)的代表性化合物进行单一化合物处理后，小鼠的存活情况。
表26详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后以不同剂量施用时)的单一鼻内处理对于小鼠从甲型流感/加利福尼亚/04/2009(H1N1pdm)病毒感染中存活的作用。扎那米韦用作对照，生理盐水用作安慰剂。
表27详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后48小时以不同剂量施用时)的单一鼻内处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒感染中存活的作用。扎那米韦用作对照，生理盐水用作安慰剂。
表28详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后48小时施用时)的单一鼻内处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒感染中存活的作用。扎那米韦用作对照，生理盐水用作安慰剂。
表29详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后48小时以不同剂量施用时)的单一鼻内处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)感染中存活的作用。扎那米韦用作对照，生理盐水用作安慰剂。
表30详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后60小时以不同剂量施用时)的单一鼻内处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)感染中存活的作用。扎那米韦用作对照，生理盐水用作安慰剂。扎那米韦用作对照，生理盐水用作安慰剂。
表31详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后60小时施用时)的单一鼻内处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)感染中存活的作用。扎那米韦用作对照，生理盐水用作安慰剂。
表32详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后72小时施用时)的单一鼻内处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)感染中存活的作用。
表33详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后72小时施用时)的单一鼻内处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)感染中存活的作用。
表34详述了用式(I)的代表性化合物(当在甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)致命攻击之前1小时腹腔内施用时)的单一处理对于小鼠的作用。
表35详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后4小时腹腔内施用(20μg/小鼠/天x 5天)时)的处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)感染中存活的作用。
表34和35中呈现的结果表明式(I)化合物可以被用于感染的全身性治疗。
表36详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后60小时鼻内施用时)的处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)感染中存活的作用。
表37详述了用式(I)的代表性化合物(当在感染后60小时鼻内施用时)的处理对于小鼠从甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)感染中存活的作用。
表38详述了用式(I)的代表性化合物(当在甲型流感/PR/8(H1N1)病毒(500pfu/小鼠)致命攻击之前1小时腹腔内施用时)的处理对于小鼠的作用。
体外和体内试验的结果表明，式(I)的化合物对许多流感毒株有效，包括甲型流感、乙型流感、禽流感和耐药株。此外，结果证明式(I)的化合物不显示细胞毒性。
对于小鼠研究，发现与生理盐水安慰剂和/或对照(即扎那米韦)相比较，当用式(I)化合物处理时，感染小鼠通常体重减轻更少和/或恢复更快。此外，发现式(I)的化合物在施用于小鼠的鼻腔后一段时间或多于11天是有效的。
体内功效数据表明式(I)化合物比扎那米韦对照更具活性至少75倍(以重量剂量计)或>400倍(以摩尔剂量计)。
关于感染病毒甲型流感(Flu A)PR8(500pfu/小鼠)的小鼠的体内功效数据，基于感染后48小时、60小时或72小时鼻内施用本发明的代表性化合物的时间比较导致大部分小鼠存活，最大体重减轻<15％(只有三只小鼠的体重减少在20-25％之间)。
关于感染病毒甲型流感/PR/8病毒(500pfu/小鼠)的小鼠的体内功效数据，腹腔内施用本发明的代表性化合物导致所有小鼠存活，并表明本发明化合物可以用于感染的全身性治疗。
在hERG IC50(hERG-CHO，自动膜片钳)试验中，测试两个式(I)的代表性化合物，MD185和MD317。结果均表明这两个化合物在心脏毒性方面是安全的。此外，在蛋白激酶组扫描(Kinome scan)中测试MD185和MD317，在100nM时，化合物与激酶之间没有显著的相互作用。
实施例8：式(I)的代表性化合物的ADME毒理学
在hERG IC50(hERG-CHO，自动膜片钳)试验中测试了两个式(I)的化合物，MD185和MD317。MD185的IC50值不可计算。MD317的浓度-响应曲线在最高验证的测试浓度下显示小于25％的作用，即IC50>100nM。
结果表明MD185和MD317在心脏毒性方面是安全的。
实施例9：式(I)的代表性化合物的蛋白激酶组扫描性能分析(KINOME scanprofiling)
根据以下激酶试验方案测试两个式(I)的化合物，MD185和MD317。
对于大多数的试验，激酶标记的T7噬菌体菌株平行生长在源自BL21菌株的大肠杆菌宿主中的24孔块中。将大肠杆菌培养至对数期并用来自冷冻原液的T7期感染(感染复数＝0.4)，并于32℃振荡孵育直至细胞裂解(90-150分钟)。将裂解物离心(6,000x g)并过滤(0.2μm)以除去细胞残渣。剩余的激酶在HEK-293细胞中产生，随后用DNA标记用于qPCR检测。在室温用生物素化的小分子配体处理链霉亲和素包被的磁珠30分钟以产生用于激酶试验的亲和性树脂。用过量生物素封闭配体珠并用封闭缓冲液(SeaBlock(pierce)，1％BSA，0.05％吐温20，1mM DTT)洗涤以除去未结合的配体并减少非特异性噬菌体结合。通过在1x结合缓冲液(20％SeaBlock，0.17xPBS，0.05％吐温20，6mMDTT)中组合激酶、配体亲和珠、和测试化合物来装配结合反应。将测试化合物制备成100％DMSO中40x的原液，并直接稀释于试验中。所有反应均在聚丙烯384孔板中以0.04ml的最终体积进行。试验板在室温振荡孵育1小时，用缓冲液(1xPBS，0.05％吐温20)洗涤亲和珠。然后将珠再悬浮于洗脱缓冲液(1xPBS，0.05％吐温20，0.5μM非生物素化亲和配体)中，并在室温振荡孵育30分钟。通过qPCR测量洗脱液中的激酶浓度。
于100nM时，化合物和激酶之间没有显著的相互作用。结果总结于表41中。
表41：选择性评分表
本发明代表性化合物的制备
方便起见，使用熟知的缩写表示许多化学部分，包括但不限于，甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(nPr)、异丙基(iPr)、正丁基(nBu)、叔丁基(tBu)、正己基(nHex)、环己基(cHex)、苯基(Ph)、甲氧基(MeO)、乙氧基(EtO)、三甲基硅烷基(TMS)、叔丁氧羰基(Boc)、和乙酰基(Ac)。
方便起见，使用熟知的缩写表示许多化合物，包括但不限于，甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、二乙醚(Et2O)、乙酸乙酯(EtOAc)、三乙胺(TEA)、二氯甲烷(亚甲基氯、DCM、CH2Cl2)、三氟乙酸(TFA)、三氟乙醇(TFE)、二甲基甲酰胺(DMF)、硫酸钠(Na2SO4)、四氢呋喃(THF)、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、六甲基二硅烷钠盐(NaHMDS)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲六氟磷酸酯(HBTU)、二甲基亚砜(DMSO)、硫酸镁(MgSO4)、碳酸氢钠(NaHCO3)、叔丁醇(t-BuOH)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDCl.HCl)、四-正丁基氟化铵(TBAF)、N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)、叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、反-二氯二(三苯基膦)钯(II)(PdCl2(PPh3)2)、四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)、三(二亚苄叉丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3)、三-叔丁基磷四氟硼酸盐(t-Bu3PH.BF4)、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)、三苯基膦(PPh3)、二异丙基偶氮二羧酸酯(DIAD)、氯铬酸吡啶(PCC)、硼烷二甲硫醚(BMS)、异丙醇钛(TiOiPr4)、三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)、氰基硼氢化钠(NaBH3(CN))、硼氢化钠(NaBH4)、氯化铵(NH4Cl)、氯仿(CHCl3)、二氧化锰(MnO2)、碳酸钾(K2CO3)、1,2-二氯乙烷(DCE)、叠氮化钠(NaN3)、亚硝酸钠(NaNO2)、二-叔丁基二碳酸酯(Boc2O)、和S-乙酰氨基甲基(Acm)。
式(I)化合物的一般合成总结于以下方案1中：
方案1：式(I)化合物的一般合成
实施例10：N-Boc-1,9-二氨基壬烷的制备
将1.9-二氨基壬烷(1g，6.329mmol)溶解于50ml乙醇和50ml水的混合物中，然后于室温加入二碳酸二叔丁酯(1.38g，6.329mmoles)。于室温将整个混合物搅拌16小时，得到白色混悬液。滤出该混悬液。在空气干燥后，固体为二-Boc-1,9-二氨基壬烷488mg(1.36mmol，收率21.53％)。滤液用二氯甲烷(150ml，100ml)萃取。含未反应的1,9-二氨基壬烷(289mg，1.83mmol)的水层可循环回到下一批制备中。将有机萃取物合并，并用50ml水洗涤，然后于室温用10g无水Na2SO4搅拌过夜。过滤有机混悬液。将滤液真空蒸发至干，得到无色固体状的N-Boc-1,9-二氨基壬烷809mg(收率49.5％)。MS 295(M+1)。
实施例11：锚定化合物Zn’的制备
合成详见以下方案2。以下化合物参考编号和合成步骤参考涉及方案2。
步骤A)将唾液酸(1)(5g，16.18mmol)和Dowex 50×8(H+)树脂(10g)在无水甲醇(400mL)中于60-62℃搅拌48小时。将混合物滤出。滤液真空蒸发至干，得到白色固体状的化合物(2)4.5g(13.25mmol，收率82.5％)。MS 338(M+1)。
步骤B)将化合物(2)(4g，11.87mmol)与乙酸酐(40mL，d 1.08，MW102.29，423mmol)和硫酸(2mL)一起搅拌。然后将混合物于32-35℃在油浴中搅拌72小时。在冰浴中将反应混合物滴加到Na2CO3(51g)在水(280mL)和乙酸乙酯(14mL)中的搅拌混合物中。然后，将混合物在冰浴中再搅拌1.5小时，随后用乙酸乙酯(400mL，270mL)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，并用10％NaHCO3溶液(270mL x 2)，饱和NaCl溶液(270mL x 2)洗涤，经无水Na2SO4干燥过夜。滤出，滤液真空蒸发至干，得到化合物(3)4.78g(11.57mmol，97.5％)。MS 414(M+1)。在干燥器中经P2O5储存3天后，油性残余物变成灰白色固体。
步骤C)将化合物(3)(3.47g，8.4mmol)溶解于叔丁醇(25mL)中。向溶液中加入叠氮三甲基硅烷(1.81mL，13.63mmol)。在氩气氛下，于80-82℃，将整个混合物搅拌24小时。用乙酸乙酯(100mL)稀释反应混合物，然后与0.9g NaNO2在25mL水中搅拌，并于室温用5N HCl在1小时内调节至pH 2。分离两相混合物，水层用乙酸乙酯(50mL)萃取。合并有机萃取物，依次用水(25mL×2)，6％NaHCO3溶液(25mL)，水(25mL×3)洗涤，然后经Na2SO4干燥。滤液真空蒸发至干，得到油状物的化合物(4)3.17g(6.95mmol，82.7％收率)。MS457(M+1)、479(M+Na)、925(2M+Na)。
步骤D)将化合物(4)(3.15g，6.91mmol)溶于甲醇(100mL)和甲苯(70mL)中。将溶液置于真空下以除去空气(氧气)，然后用氩气回填。向混合物中加入Pd/C(10％)(616mg)，然后置于真空下排出氩气，随后用氢气(H2)替换氩气。于室温进行氢化2小时，然后滤出催化剂。将滤液真空蒸发至干，得到灰白色固体状的化合物(5)2.82g(6.55mmol，收率94.7％)。MS 431(M+1)。
步骤E)将化合物(5)(2.80g，6.51mmol)溶于无水乙腈(15mL)中。向该溶液中加入N,N'-二-Boc-1H-吡唑-1-甲脒[Bis(Boc)PCH](3.03g，9.76mmol)。在氩气氛下，于室温，将整个混合物搅拌40小时。将反应混合物真空蒸发至干。将残余物溶于乙酸乙酯(4mL)中，然后用己烷(4mL)稀释，上样于闪式柱色谱法，用己烷(150mL)洗涤，然后用溶剂(乙酸乙酯:己烷1:1)(150mL)洗涤，最后用溶剂(乙酸乙酯:己烷1:1)洗脱。真空蒸发收集的级分，得到白色固体的产物化合物(6)，3.23g(4.8mmol，收率73.7％)。MS 673(M+1)。
步骤F)将化合物(6)(2.8715g，4.273mmol)溶于无水甲醇(22mL)中。在氩气氛下，向溶液中加入NaOCH3(4.9134mg，0.2136mmol)。在氩气氛下，于室温，将整个混合物搅拌2.5小时，然后用Dowex50×8(H+)树脂调节至pH 6.5，随后将树脂过滤。滤液真空蒸发至干，得到白色固体状的化合物(7)2.2024g(4.0337mmol，收率94.4％)。MS 547(M+1)。
步骤G)将化合物(7)(2g，3.66mmol)溶于无水乙腈中。向溶液中加入1,1'-羰基二咪唑(714mg，4.403mmol)。在氩气氛下，于20-30℃，将整个混合物搅拌18小时。将其真空蒸发至干，然后使残余物经历闪式柱色谱法，首先用己烷(150mL)洗涤，然后用溶剂(乙酸乙酯:己烷2:1)展开。将Rf值为0.5(乙酸乙酯:己烷2:1)的级分合并，真空蒸发至干，得到白色固体状的化合物(8)1.35g(2.36mmol，收率64.5％)。MS 573(M+1)。
步骤H)将化合物(8)(1.3g，2.27mmol)溶于无水吡啶(12.5mL)中。向该溶液中加入对硝基苯基氯甲酸酯(503.3mg，2.497mmol)、4-二甲氨基-吡啶(808.5mg，6.62mmol)。在氩气氛下，于30℃，将整个混合物搅拌7小时。向该反应混合物中加入N-Boc-1,9-二氨基壬烷(690mg，2.67mmol)和4-二甲氨基吡啶(166mg，1.36mmol)的无水吡啶溶液(4mL)。在氩气氛下，于30℃，将反应混合物搅拌16小时，然后真空蒸发除去吡啶。将残余物在乙酸乙酯(300mL)和含有2.45mL 5NHCl的水(50mL)之间分配，依次用水(50mL×2)、2％NaHCO3溶液(50mL×6)、水(50mL x 2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液真空蒸发至干，得到2.25g油状物。使其经历闪式柱色谱法(乙酸乙酯:己烷1.5:1作为洗脱液)。将级分(TLC中Rf值为0.27，乙酸乙酯:己烷1.5:1作为展开剂)合并，真空蒸发至干，得到白色固体状的化合物(9)1.057g(1.234mmol，收率54.4％)。MS 857(M+1)、879(M+Na)。1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)11.42(1H,s,胍NHBoc),8.25(1H,d,NH-4),7.95(1H,d,AcNH),7.16(1H,t,OCONH),6.75(1H,t,壬基NHBoc),5.80(1H,s,H-3),4.92(2H,m,H-7,H-8),4.75(1H,m,H-4),4.31-4.62(4H,m,H-5,H-6,H-9,H-9'),3.74(3H,s,COOCH3),2.90(4H,m,NHCH2(CH2)7CH2NH),1.86(3H,s,NHCOCH3),1.49(9H,s,Boc),1.38(18H,s,Boc),1.2-1.6(14H,m,NHCH2(CH2)7CH2NH)。
步骤I)将化合物(9)(1g，1.168mmol)溶于三氟乙酸(TFA)(36ml)和甲基苯基醚(苯甲醚)(3.9ml)在二氯甲烷(CH2Cl2)(36ml)中的混合物中。于25℃将整个混合物搅拌2小时40分钟，然后于35℃真空蒸发2小时。于室温，将残余物在己烷(100ml)中搅拌过夜，倾析己烷，加入新鲜己烷(60ml)，并于室温继续搅拌4小时。然后除去己烷。将残余物溶于CH2Cl2(10ml)中，并于35-40℃蒸发至干。将残余物溶于水(25ml)中。将水溶液冷冻干燥，得到1.026g(1.143mmol，收率97.8％)的化合物(10)，为白色泡沫状的TFA3Zn'盐。MS 557(M+1)[Zn'的MW＝556,TFA3Zn'的MW＝898]。
方案2：锚定化合物Zn’的制备
实施例12：锚定骨架化合物PYR(Zn')2的制备
合成详述于以下方案3中。以下化合物参考编号涉及方案3。
于室温向均苯四甲酸二酐(11)(27.25mg，0.125mmol)的无水DMF(2ml)溶液中加入Zn'(10)(224.5mg，0.25mmol)和二异丙基乙基胺(DIPEA)(130.64μl，0.75mmol)。允许整个反应混合物在氩气氛下于25℃搅拌36小时，然后用乙醚:石油醚1:1(100ml)处理。过滤沉淀，用乙醚洗涤，空气干燥，得到灰白色固体(197mg)，然后使其经历HPLC分离和纯化。
分析型HPLC：pepl梯度
柱：Gemini C18柱100A 5μm 150x 3.00mm。波长：220/280nm。流速：0.7ml/分钟。溶剂A＝0.1％三氟乙酸。溶剂B＝100％乙腈。温度：30℃。梯度：0-50％B，15分钟。保留时间：PK1PYR(Zn')2(12)在14.35分钟，PK2PYR(Zn')2(13)在14.53分钟。
制备型HPLC：
柱：Water Xterra C18 prep MS柱19x 50mm，5μm。波长：220/280nm。流速：8ml/分钟。溶剂A＝0.1％三氟乙酸。溶剂B＝100％乙腈。温度：30℃。梯度：10-100％B，80分钟。收集PK1PYR(Zn')2和PK2PYR(Zn')2(13)的纯级分，并分开冷冻干燥，分别得到PK1PYR(Zn')2(12)49mg和PK2PYR(Zn')2(13)42mg。
PK1PYR(Zn')2(12)MS显示ESI+ve 10V 1331.5离子。1H-NMR(D2O)δ(ppm):8.00(2H,s,芳香对位H x 2),6.00(2H,d,H-3 x 2),5.20-5.50(4H,m,H-7 x 2,H-8x2),4.35-4.90(8H,m,H-4 x 2,H-5 x 2,H-6 x 2,H-9 x 2),4.15(2H,dd,H-9' x 2),3.80(6H,s,COOCH3x 2),3.25-3.45(4H,m,OCONHCH2 x 2),2.90-3.20(4H,m,NHCH2 x 2),1.95(6H,s,CH3C0 x2),1.20-1.70(28H,m,(CH2)7 x 2)。
PK2PYR(Zn')2(13)MS显示ESI+ve 10V 1331.5离子。1H-NMR(D2O)δ(ppm)8.35(1H,s,芳香H x 1),7.50(1H,s,芳香H x 1),6.00(2H,d,H-3 x 2),5.20-5.50(4H,m,H-7 x 2,H-8 x 2),4.35-4.90(8H,m,H-4 x 2,H-5 x 2,H-6 x 2,H-9 x 2),4.15(2H,dd,H-9' x2),3.80(6H,s,COOCH3 x 2),3.25-3.45(4H,m,OCONHCH2 x 2),2.90-3.20(4H,m,NHCH2 x2),1.95(6H,CH3CO x 2),1.20-1.70(28H,m,(CH2)7 x 2)。
方案3：锚定骨架化合物PYR(Zn')2的制备
实施例13：酸性/阴离子基团D-Asp(NHCH2SO3H)2的制备
合成详述于以下方案4中。以下化合物参考编号涉及方案4。
Boc-D-天冬氨酸(14)(233mg，1mmol)和HBTU[O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲六氟磷酸盐](758mg，2mmol)溶于DMF(10ml)中。向该溶液中加入DIPEA(二异丙基乙基胺)(349μl，2mmol)。将该溶液于室温搅拌10分钟，然后与氨基甲磺酸钠(332mg，2.5mmol)在DMF(3ml)中的溶液合并。将所得溶液于室温搅拌过夜。真空蒸发反应混合物，得到浅橙色固体。将其溶解于水(20ml)中，用乙酸乙酯(20ml×3)洗涤，将水相真空蒸发以除去有机溶剂，然后冷冻干燥，得到白色固体状的粗产物(15)310mg，使其经历HPLC分离和纯化。
分析型HPLC：pep1梯度
柱：Gemini C18柱100A 5μm 150x 30min。波长：220nm。流速：0.7ml/分钟。溶剂A＝0.1％三氟乙酸。溶剂B＝100％乙腈。温度：30℃。梯度：0-50％B，15分钟。保留时间：作为游离酸的化合物(15)在4.669分钟MS ESI–ve 418(M-1)，溶剂峰在1.658分钟，氨基甲磺酸在2.722分钟，HBTU物质在5.520分钟，单Boc-D-Asp-NHCH2SO3H在5.802分钟。
制备型HPLC
柱：Germini AXIA C18柱，5μm 50x 21.2mm波长：220min。流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1％三氟乙酸；溶剂B＝100％乙腈；温度：30℃。梯度：0-100％B，100分钟。
将含有(15)的级分收集和汇集在一起，然后冷冻干燥，得到作为游离酸的纯产物(15)。MS ESI-ve 418(M-1)。将作为游离酸的化合物(15)(200mg，0.477mmol)溶于含有苯甲醚(1ml)的三氟乙酸(10ml)中。将溶液在室温搅拌1小时，然后真空蒸发至干。将残余物在乙醚(20ml×2)中研磨，滤出。将固体空气干燥，然后再次溶于水中，冷冻干燥，得到白色固体状的产物(16)106mg。MS ESI-ve 318(M-1)。将产物溶于水(10ml)中，然后用2当量氢氧化钠中和，冷冻干燥，得到白色固体状的(16)的二钠盐。
方案4:酸性/阴离子基团D-Asp(NHCH2SO3H)2的制备
实施例14:化合物MD185，PK2PYR(Zn)2[(D-Asp)(NHCH2SO3)2]2的制备
合成详述于以下方案5中。以下化合物参考编号涉及方案5。
向PK2PYR(Zn')2(13)(30mg，22.56μmol)的干燥DMF(5ml)溶液中加入HATU[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲六氟磷酸盐](17.14mg，45.11μmol)和DIPEA(7.9μl，45.31μmol)。将所得溶液于室温搅拌10分钟，然后加入DMF(5ml)中的(16)[D-Asp(NHCH2SO3Na)2]的二钠盐(33mg，91.16μmol)。将反应混合物于室温搅拌18小时，然后使其经历HPLC分离和纯化。
分析型HPLC：pep 1梯度
柱：Gemini C18柱100A 5μm 150 x 3.00mm；波长：220/280nm；流速：0.7ml/分钟；溶剂A＝0.1％三氟乙酸；溶剂B＝100％乙腈；温度：30℃；梯度：0-50％B，15分钟；保留时间：作为游离酸的产物(17)在14.270分钟。MS ESI+ve+30V 967.5，MS ESI-ve，-25v 965.4。其他峰如下：起始材料PK2PYR(Zn')(13)在11.7分钟，PK2PYR(Zn')2-D-Asp(NHCH2SO3H)2在13.6分钟。
制备型HPLC
柱：Water Xterra prep MS C18柱19 x 50mm 5μm；波长：220/280nm；流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1％三氟乙酸；溶剂B＝100％乙腈；温度：30℃；梯度：0-100％B 100分钟。
产物以与分析型Gemini相反的曲线洗脱。洗脱曲线(elution profile)在25-35％乙腈之间。将采样的级分和纯度大于90％的管汇集起来，并在Gemini AXIA柱上分离其他物质。
将产物(17)冷冻干燥，得到白色蓬松粉末。MS ESI-ve-25v 965.4，显示MW为1932。将化合物(17)PK2PYR(Zn')2[D-Asp(NHCH2SO3H)2]2(8mg，4.14μmol)溶解于50％甲醇水溶液(2ml)中，然后加入三乙胺(40μl，287.5μmol)。所得溶液于室温搅拌。通过分析型HPLC监测反应，峰在10.848分钟处。2小时后，将反应混合物用乙酸(60μl，1049μmol)酸化并用水稀释至10ml。该溶液在Kinetex柱上纯化。合并纯级分并冷冻干燥，以得到白色粉末状的产物(18)PK2PYR(Zn)2[D-Asp(NHCH2SO3H)2]2 6mg。
HPLC保留时间10.695分。MS ESI-ve-30V 925.6。
为了除去化合物中TFA的残留物，将纯物质溶解在60ml 4mM HCl中并冷冻干燥，然后将其溶解在60ml 1mM HCl中并冷冻干燥，最后从60ml水中冷冻干燥。产量5.6mg(18)MD185MW1852。
方案5：化合物MD185，PK2PYR(Zn)2[(D-Asp)(NHCH2SO3)2]2的制备
实施例15：锚定化合物Z0’的制备
合成详述于以下方案6中。以下化合物参考编号和合成步骤参考涉及方案6。
根据实施例11所述的步骤(H)和(I)，化合物(8)与对硝基苯基氯甲酸酯反应，然后与N-Boc-1,8-二氨基辛烷反应，色谱法后，得到白色固体状的化合物(19)。MS 843(M+1)。用三氟乙酸(TFA)处理化合物(19)，后处理后得到化合物(20)Z0'，为白色泡沫状的TFA3Z0'盐MS543(M+1)[Zo'的MW＝542,TFA3Z0'的MW＝884]。
方案6：锚定化合物Z0'的制备
实施例16：锚定骨架化合物PK1TCA(Z0’)2和PK2TCA(Z0’)2的制备
合成详述于以下方案7中。以下化合物参考编号涉及方案7。
向TCA(21)(3.085mg，17.52μmol)的DMF(309μl)溶液中加入HATU(13.32mg，35.03μmol)和DIPEA(6.5μl，37.32μmol)。将整个混合物于室温搅拌10分钟，然后向其中滴加入Zo’,(20)(30.97mg，35.03μmol)和DIPEA(18.44μl，105.9μmol)的DMF(600μl)溶液。将反应混合物于室温搅拌过夜。使所得混合物经历HPLC分离和纯化。
分析型HPLC：pepl梯度
柱：Phenomenex C18 5μl 110A 150 x 3mm波长：220/280nm；流速：0.7ml/分钟；溶剂A＝0.1％三氟乙酸；溶剂B＝100％乙腈；温度：30℃；梯度：100-50％B 15分钟。保留时间：PK1TCA(Zo’)2(22)11.100分钟和PK2TCA(Zo’)2(23)11.156分钟。
PK1TCA(Zo’)2(22)1H-NMR(D2O)δppm在2.5ppm(AB对称dd,4H,CaH2＝CbH2)显示其对称结构。MS 1225.4(MW 1224)。
PK2TCA(Zo’)2(23)1H-NMR(D2O)δppm在2.35-2.75ppm(不对称,dd,4H,(CaH2≠CbH2)显示其不对称结构。MS 1225.4(MW 1224)。
制备型HPLC
将溶液用少量1M乙酸酸化并在水中稀释至25ml。其通过0.45μm注射器过滤器过滤并泵入Water Xterra prep MS C18柱19 x 50mm 20％-80％缓冲液A。流速8ml/分钟梯度0-100％B 100分钟，波长210/280nm。洗脱曲线空隙(Elution Profile Void)DMF/DIPEA/HATU。
进一步纯化PK1TCA(Zo’)2和PK2TCA(Zo’)2，并在Phenomenex Gemini 5μm C18 110AAxia 50 x 21.2mm柱上0.1％TFA缓冲液中分离。
PK1/PK2比例约为1:2，均为MS ESI+30V 1225.4。
方案7：锚定骨架化合物PK1TCA(Z0’)2和PK2TCA(Z0’)2的制备
实施例17：酸性/阴离子基团[D-Cya-SO3H]7OH的制备
合成详述于以下方案8中。以下化合物参考编号涉及方案8。
如方案8所详述，应用固相合成制备[D-Cys-SH]7-OH(33)，然后氧化多半胱氨酸(33)得到[D-CyaSO3H]7-OH(34)。
将Fmoc-D-Cys(Trt)-OH(24)(2.93g，5mmol)溶解在50ml离心管中的干燥二氯甲烷(DCM)(35ml)中，然后加入2-氯三苯甲基氯树脂(25)(5g)，剧烈振摇，加入二异丙基乙基胺(DIPEA)(3.5ml，20mmol)。5分钟后，加入另一份DIPEA(1.3ml，7.5mmol)。将整个混合物再振荡4小时。为了封闭任何剩余的反应性2-氯三苯甲基氯，加入甲醇(4ml)。将混合物再振摇30分钟。树脂依次用DMF(20ml×3)，DCM(20ml×3)，甲醇(20ml×3)洗涤，然后真空干燥过夜。产量表明负载量为0.57mM/g(26)。
为了从树脂除去Fmoc基团，将树脂(26)在DCM(35ml)中预先溶胀，然后加入DMF(30ml)中50％的哌啶。将整个混合物置于旋转器上30分钟。用50％哌啶在DMF(30ml)中的新鲜溶液重复60分钟。然后依次用DMF(20ml×2)，DCM(20ml×2)，DMF(20ml×3)洗涤树脂。呈现阳性茚三酮试验。树脂(27)准备好偶联。
向Fmoc-D-Cys(Trt)-OH(24)(1758mg，3mmol)的DMF(6ml)溶液中加入HBTU[O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲六氟磷酸盐](1140mg，3mmol)和DIPEA(523μl，3mmol)。将混合物于室温搅拌10分钟，然后加入树脂(27)(2.5g，0.57mM/g，1.5mmol)。将反应混合物搅拌24小时。茚三酮试验阴性，将树脂用DMF(20ml×3)洗涤，然后用DMF(20ml)中5％乙酸酐，1％DIPEA处理30分钟。然后用DMF(20ml×3)，DCM(20ml×3)，甲醇(20ml×3)洗涤树脂(28)。在DCM中预先溶胀树脂(28)，并加入DMF(20ml)中30％的哌啶/N-甲基吡咯烷酮。在用DMF(20ml×2)，DCM(20ml×2)，DCF(20ml×2)洗涤后，将整个混合物置于旋转器30分钟，然后用30％哌啶和N-甲基吡咯烷酮的新鲜溶液再进行60分钟，得到树脂(29)。
树脂(29)与(24)(1758mg，3mmol)(用HBTU(1140mg，3mmol)和DIPEA(523μl，3mmol)预先活化10分钟)在DMF(6ml)中进一步偶联24小时，后处理后得到树脂(30)。然后其中一半遵循以下程序：用哌啶/甲基吡咯烷酮脱保护，与用HBTU/DIPEA预活化的(24)重新偶联，重复该步骤4次以产生树脂(31)。
将树脂(31)用DCM(20ml×5)洗涤，然后置于50ml离心管中，加入DCM(35ml)中40％的乙酸，于室温在旋转器上振荡6小时。过滤树脂混悬液，将滤液真空蒸发至淡黄色泡沫。将残余物用水(100ml×3)洗涤，干燥后得到白色固体(32)[D-Cys(Trt)]7-OH。
(32)在TFA(20ml)、三异丙基硅烷(1ml)和水(0.5ml)的溶液中搅拌3小时。将得到的混悬液过滤。将滤液蒸发至油状物，然后用乙醚(20ml×4)研磨，得到白色固体。将其在50％乙腈水溶液(100ml)中搅拌。将该材料超声处理以形成白色混悬液，将其冷冻干燥，得到粗产物(33)[D-Cys-SH]7-OH(380mg)。
分析型HPLC
柱：Phenomenex Gemini 5μm C18 110A 150 x 3.00mm溶剂A＝0.1％三氟乙酸,溶剂B＝100％乙腈，流速：0.7ml/分钟，波长：210/280nm，温度：30℃，梯度：0-50％B 15分钟，保留时间：9.356分钟。
MS锥孔+25V主峰740锥孔-25V主峰738显示(33)的MW为739[D-Cys-SH]7-OH。
将化合物(33)(10mg，13.53μmol)加入在冰盐浴中预冷的过甲酸溶液(1ml)中。将整个混合物在冰浴中搅拌1小时，然后用100ml冷水稀释，冷冻干燥，得到淡黄色形式(34)。用等度0.1％TFA作为洗脱液，在Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 100A柱上纯化该材料，得到无色粉末状的化合物(34)[D-Cyst-SO 3H]7-OH MW1075，MS锥孔+50V 1076(M+1)。
通过混合甲酸(8.74ml)、水(0.96ml)和30％过氧化氢(1ml)制备过甲酸，并使混合物在室温在停止的烧瓶中静置30分钟。该过氧化物应当在使用前新鲜制成。
方案8：酸性/阴离子基团[D-Cyst-SO3H]7OH的制备
实施例18：化合物MD345,PK2TCA(Z0)2-[D-Cyst-SO3H]7-OH的制备
合成详述于以下方案9中。以下化合物参考编号涉及方案9。
向PK2TCA(Z0’)2(23)(4mg，3.268μmol)的无水DMF(2ml)溶液中加入HATU(1.242mg，3.268μmol)和DMF中的2％DIPEA(30μl,3.44μmol)。将混合物于室温搅拌10分钟，然后与(34)，[D-Cyst-SO3H]7-OH(7.03mg，6.54μmol)和DIPEA(9.11μl，52.32μmol)的DMF(3ml)溶液混合。于室温将整个反应混合物搅拌过夜。用水/甲醇1/1将混合物稀释至15ml，然后使其经历HPLC分离和纯化。
制备型HPLC：
柱：Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 50 x 21.2mm；波长：220/280nm；流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1％三氟乙酸(TFA)；溶剂B＝100％乙腈；温度：30℃；梯度：0-100％B，80分钟。将含有(35)游离酸(B＝H)的级分合并，并冷冻干燥，得到白色粉末状的化合物(35)游离酸(B＝H)4mg。MS ESI+ve锥孔35V 1142.12+离子。
将化合物(35)游离酸(B＝H)、PK2TCA(Z0’)2-[D-Cyst-SO3H]7-OH(4mg，1.754μmol)溶解在含有三乙胺(TEA)(20μl，146μmol)的50％甲醇水溶液(800μl)中。于室温搅拌混合物，通过HPLC监测。3小时后将其后处理。将溶液在Kinetex柱上纯化。将保留时间为11.254分钟的纯级分合并，并冷冻干燥，得到白色粉末状的化合物(36)2mg。MS ESI+ve锥孔40V1102.22+离子。
为了去除化合物中的TFA残留物，将化合物(36)溶解在4mM HCl(30ml)中并冷冻干燥。然后将其溶解在1mM HCl(30ml)中并冷冻干燥。最后将其从水(30ml)冷冻干燥，得到产物(36)1.1mg，MD345PK2TCA(Z0)2[D-Cyst-SO3H]7-OH MW2201[MS 2202(M+1)]。
方案9：化合物MD345，PK2TCA(Z0)2-[D-Cyst-SO3H]7-OH MW2201的制备
实施例19：锚定化合物Z’的制备
合成详述于以下方案10中。以下化合物参考编号和合成步骤参考涉及方案10。根据实施例11中描述的步骤(H)和(I)，化合物(8)与对硝基苯基氯甲酸酯反应，然后与N-Boc-1,6-二氨基己烷反应，色谱法后得到白色固体状的化合物(37)，MS 815(M+1)。化合物(37)用三氟乙酸(TFA)和苯甲醚处理，后处理后，得到化合物(38)Z'，为白色形式的TFA盐。MS515(M+l)。[Z’的MW＝514,TFA3Z’的MW＝856]。
方案10：锚定化合物Z’的制备
实施例20：锚定骨架化合物CHTCA(Z’)2的制备
合成详述于以下方案11中。以下化合物参考编号涉及方案11。
向CHTCA(39)(4.4mg，20μmol)的DMF(300μl)溶液中加入HATU(15.2mg，40μmoles)和DIPEA(7.4μl，42.4μmol)。将整个混合物于室温搅拌10分钟，然后滴加入Z'(38)(34.24mg，40μmoles)和DIPEA(21.06μl，120.9μmol)的DMF(700μl)溶液。将反应混合物于室温搅拌过夜。所得混合物用1M HAc(50μl)和水(25ml)稀释。将其通过0.45μm注射器过滤器进行过滤。使滤液经历HPLC分离和纯化。
柱：Water Xterra prep MS C18柱19 x 50mm；波长：210/280nm；流速：8ml/分钟，溶剂A＝0.1％TFA溶剂B＝100％乙腈；温度：30℃；梯度：0-100％B 100分钟；洗脱曲线空隙DMF/DIPEA/HATU。
含有化合物(40)的级分在Phenomenex Gemini 5μm C18 110A AXIA 50x21.2mm柱上，0.1％TFA缓冲液中进一步纯化。将级分冷冻干燥，得到白色泡沫状的化合物(40)CHTCA(Z’)2 15mg。MS ESI+ve,+30v,1209表明MW为1208。
方案11：锚定骨架化合物CHTCA(Z’)2的制备
实施例20：锚定化合物S6的制备
合成详述于以下方案12中。以下化合物参考编号和合成步骤参考涉及方案12。
步骤A)于室温，将化合物(1)在无水甲醇(100ml)中搅拌48小时，过出混合物。将滤液真空蒸发至干，得到白色固体状的化合物(41)1.25g(6.037mmol，收率93％)。MS 324(M+1)。
步骤B)于室温，将化合物(41)(1.95g，6.037mmol)在乙酰氯(20ml，281mmol)中搅拌3天，然后真空蒸发至干，得到化合物(42)3.06g(6.01mmol，收率99％)。MS 510.5(M+1)。
步骤C)将残余物(42)(3.06g，6.01mmol)在二氯甲烷(DCM)(35ml)中搅拌，然后加入KSAc(3.57g，31.26mmol)。在氩气氛下，于室温将反应混合物搅拌40小时，用二氯甲烷(50ml)稀释，然后在二氯甲烷和水(50ml)之间分配。有机层用5％NaCl溶液(22ml×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥过夜，滤出。将滤液蒸发至干，得到灰白色泡沫状的(43)2.93g(5.34mmol，收率88.8％)。MS 550(M+l)。
步骤D)将化合物(43)(200mg，0.364mmol)和Boc-氨基己烷溴化物(107.4mg，0.385mmol)在DMF(2ml)中搅拌，向其中加入二乙胺(0.81ml，7.83mmol)。在氩气氛下，于25℃，将整个混合物搅拌2.5小时。将反应混合物在乙酸乙酯(EA)(80ml)和饱和NaCl溶液之间分配。有机层用饱和NaCl溶液(15ml×3)，水(10ml×3)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，将滤液真空蒸发至干。使残余物经历硅胶柱色谱法(甲苯:丙酮＝2:1)。将含有化合物(44)的级分合并，真空蒸发至干，得到白色泡沫状的化合物(44)98mg(0.139mmol，收率38％)。MS706(M+1)。
步骤E)将化合物(44)(95mg，0.135mmol)溶于无水甲醇(1ml)中。在氩气氛下向该溶液中加入甲醇钠(0.16mg，6.94μmoles)，将反应混合物于室温搅拌2.5小时，然后用Dowex50×8(H+)树脂调节至pH 6.0-6.5，滤出。将滤液真空蒸发至干，得到白色泡沫状的化合物(45)71mg(0.132mmol，收率97.9％)。MS 538(M+1)。
步骤F)在氩气氛下，于室温将化合物(45)(60mg，0.109mmol)在0.2N NaOH(2ml，0.4mmol)中搅拌2.5小时。用Dowex50×8(H+)树脂将溶液调节至pH 3-4，滤出。将滤液冷冻干燥，得到白色泡沫状化合物(46)56mg(0.107mmol，收率98％)。MS 524(M+1)。
步骤G)将化合物(46)(50mg，0.0956mmol)溶于三氟乙酸(TFA)(2ml，25.96mmol)和甲基苯基醚(苯甲醚)(0.2ml，1.84mmol)在二氯甲烷(2ml)中的混合物中。于25℃将整个混合物搅拌2.5小时，然后于35℃真空蒸发2小时。于室温将残余物在己烷(10ml×2)中洗涤过夜，倾析己烷。于室温将残余物在乙醚(10ml×2)中搅拌，然后除去乙醚。将残余物溶解于水(1ml)中，冷冻干燥，得到化合物(47)，为白色泡沫状的S6·TFA盐，51mg(0.0949mmol，收率99％)。MS 424(M+I)[S6的MW＝423，S6·TFA盐＝537]。
方案12：锚定化合物S6的制备
实施例21：化合物MD012,CHTCA(Z)2(S6)的制备
合成详述于以下方案13中。以下化合物参考编号和合成步骤参考涉及方案13。
向CHTCA(Z’)2(40)(4mg，3.3μmol)的DMF(100μl)溶液中加入HATU(1.254mg，3.3μmol)和DIPEA(0.6μl，3.44μmol)。将混合物于室温搅拌10分钟，然后加入S6·TFA盐(47)(1.8mg，3.35μmol)和DIPEA(1.20μl，6.89μmol)的DMF(100μl)溶液。将反应混合物于室温搅拌过夜。将所得混合物用1M HAc(5μl)和水(2ml)稀释，然后通过0.45μm注射器过滤器进行过滤。使滤液经历HPLC分离和纯化。
柱：Phenomenex Gemini AXIA 5μm,C18 110A 50 x 21.2mm；波长：210/280nm；流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1％超纯净水中的三氟乙酸；溶剂B＝100％乙腈；梯度：0-100％B，100分钟，线性；温度：30℃。
收集含有化合物(48)的级分并冷冻干燥，得到白色泡沫状的化合物(48)CHTCA(Z’)2(S6)2.4mg。MS ESI+30v 1615表明MW为1614。
于室温，将化合物(48)(2.4mg，1.486μmol)在含有三乙胺(6.6μl)的50％甲醇水溶液(90μl)中搅拌5小时，然后真空蒸发至干。将残余物再次溶解于水(100μl)中，冷冻干燥，得到白色泡沫状的产物(49)CHTCA(Z)2(S6)2mg(1.303mmol，收率87.7％)。MS ESI+30v1535.7，表明MW为1534.7。
方案13：化合物MD012，CHTCA(Z)2(S6)的制备
实施例22：锚定骨架化合物CHTCA(Z0’)2的制备
合成详述于以下方案14中。以下化合物参考编号涉及方案14。
实施例15中详述了锚定化合物(20)Z0’的制备。根据实施例20中详述的步骤制备锚定骨架化合物(50)CHTCA(Z0’)2。获得白色固体状的锚定骨架化合物(50)CHTCA(Z0’)2。MSESI+ve，+30v 1265表明MW为1264。
方案14：锚定骨架化合物CHTCA(Z0’)2的制备
实施例23：酸性/阴离子基团D-Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya)-OH的制备
合成详述于以下方案15中。以下化合物参考编号(A)至(I)和合成步骤参考涉及方案15。
将Boc-D-半胱氨酸(Acm)甲基酯，[Boc-D-Cys(Acm)-OMe](1.532g，5mmol)溶于含苯甲醚(1ml)的三氟乙酸(TFA)(10ml)中，并于室温搅拌30分钟。然后真空蒸发反应混合物以除去TFA，得到油状物，将其在乙醚(100ml×2)中研磨，然后将其再次溶解于20％乙腈水溶液(100ml)中，并冷冻干燥72小时，得到化合物TFA·D-Cys(Acm)-OMe，1.60g。HPLC/MS表明MW为206.35(作为游离碱)。
于室温，用HBTU(MW 379.25)(1.517g，4mmol)和DIPEA(MW 129.25)(0.517g，4mmol)在DMF(20ml)中将Fmoc-D-α-天冬氨酸-β-O-叔丁基酯[Fmoc-D-Asp-Obut](1.646g，4mmol)活化10分钟，然后与TFA·D-Cys(Acm)-OMe(1.47g，4.2mmol)和DIPEA(0.542g，4.2mmol)的DMF(10ml)溶液合并。将整个反应混合物于室温搅拌16小时。通过HPLC监测反应。将混合物真空蒸发除去DMF。然后将水(5×70ml)加入到残余物中以洗去残留的DMF和D-Cys(Acm)OMe，得到灰白色固体，然后真空干燥得到白色固体状的化合物(A)，Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-O-But。HPLC/MS表明MW为599.7。
于室温，将化合物(A)(1.2g，2mmol)用在乙腈(20ml)中的20％哌啶处理30分钟，然后滤出。将滤液在真空下蒸发，得到化合物(B)，D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut。HPLC/MS表明MW为377.4。
于室温，将化合物(A)(599.7mg，1mmol)用TFA(6ml)处理1小时。然后真空蒸发至干。将残余物在乙醚(50ml×3)中研磨，然后溶解于30％乙腈水溶液(100ml)中，冷冻干燥，得到白色固体状的化合物(C)，Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH。HPLC/MS表明MW为542.7。
于室温，用HBTU(303.4mg，0.8mmole)和DIPEA(103.4mg，0.8mmol)在DMF(8ml)中将化合物(C)，Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH(434mg,0.8mmol)活化10分钟，然后加入化合物(B)，D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut(9332mg,0.88mmol)。将反应混合物于室温搅拌16小时。在真空下蒸发DMF，通过用水小心洗涤白色固体物质除去残留的DMF。然后将白色固体真空干燥24小时，得到白色固体状的化合物(D)，Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut。HPLC/MS显示MW为902.19。于室温，用TFA(16ml)处理化合物(D)1小时以除去叔丁基酯。将TFA真空蒸发至干。残余物用水洗涤以除去残留的TFA，并将固体真空干燥72小时，以得到Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH。HPLC/MS显示MW为846。
于室温，用HBTU(189.5mg，0.5mmole)和DIPEA(64.63mg，0.5mmol)在DMF(5ml)中将Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH(423mg，0.5mmol)活化10分钟，然后加入化合物(B)，D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut(317mg,0.84mmol)。于室温将整个混合物搅拌16小时。通过HPLC检查反应完成，并且在真空下除去DMF。将得到的白色固体用冷水小心洗涤，然后真空干燥48小时，得到化合物(E)，Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut，MW 1206，其通过HPLC进一步纯化。
该物质的分析型HPLC显示纯度为70％。将该物质溶于50％甲醇/水中，并通过0.2μm过滤器进行过滤以用于制备型HPLC。
制备型HPLC
柱：Waters Xterra C18柱5μm 19 x 50mm在40mg的批次中；波长：220/280nm；流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1％三氟乙酸；溶剂B＝100％乙腈；梯度：10-100％B，100分钟；温度：30℃。
然后，于室温，用TFA(10ml)将化合物(E)，Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut处理1小时，并真空蒸发至干。将残余物溶解于40％乙腈水溶液(100ml)中，并冷冻干燥，得到白色固体状的化合物(F)，Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH。HPLC/MS表明MW为1150.27。
于室温，搅拌下，用乙腈(10ml)中的20％哌啶将化合物(F)，Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH(200mg,0.1738mmol)处理30分钟，随后滤出。滤液真空蒸发。于室温，将残余物在含有三乙胺(500μl)的50％水/甲醇(20ml)中搅拌6小时，通过HPLC监测显示反应完成。将该混合物真空蒸发至干，得到化合物(G)，D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-OH。HPLC/MS显示MW为885.9。
分析型HPLC显示50％纯度。
通过制备型HPLC进一步纯化化合物(G)。
柱：Phenomenex Gemini Axia 110A 5μm 50 x 21.2mm C18HPLC柱；波长：210/280nm；流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1％TFA；溶剂B＝100％乙腈；梯度：0-100％B，100分钟；温度：30℃。
将样品(100mg)溶解于10％甲醇水溶液中，超声处理，并通过0.2μm过滤器进行过滤。用梯度泵将20mg/批次泵入柱中。使用Phenomenex Gemini C185μm柱，通过分析型RF-HPLC监测级分。流速0.7ml/分钟；波长210/280nm；梯度0-50％B15分钟；溶剂A＝0.1％TFA；溶剂B＝100％乙腈。
汇集具有纯度大于90％的正确MS的级分，并冷冻干燥，得到纯化的化合物(G)。
将化合物(G)，D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp-[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-OH，(21.8mg，0.0246mmol)溶于含有苯甲醚(200μl)的TFA(10ml)中，然后加入三氟甲磺酸银(504mg，1.96mmol)。于室温将反应混合物搅拌1小时。然后将其真空蒸发至干。将残余物在乙醚(40ml×2)中研磨，倾析乙醚洗涤液。于25℃，将残余物在含有二硫苏糖醇(403mg，2.62mmol)的1M乙酸(20ml)中搅拌3小时。将混悬液在50ml离心管中以4000rpm离心10分钟。小心收集上清液，然后通过HPLC纯化并冷冻干燥，得到化合物(H)，D-Asp(D-Cys-SH,-OH)-D-Asp(D-Cys-SH,-OH)-D-Asp(D-Cys-SH,-OH)-OH，HPLC/MS表明MW为672.3。
将95％甲酸(7.36ml)、30％H2O2(0.8ml)和H2O(0.368ml)的混合物于室温放置30分钟，然后于-5℃冰浴下搅拌，向其中加入化合物(H)(8mg，0.0119mmol)并搅拌1小时，然后在真空下10分钟。然后将剩余的溶液用水稀释至200ml并冷冻干燥，得到白色固体状的化合物(I)9.5mg，D-Asp[D-Cya-SO3H,-OH]-D-Asp[D-Cya-SO3H,-OH]-D-Asp[D-Cya-SO3H,-OH]-OH，HPLC/MS显示MW为816.78。
通过在以下条件下脱盐纯化该化合物。
柱：Phenomenex Gemini Axia 110A 5μm 50 x 21.2mm C18 HPLC柱；波长：210/280nm；流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1％TFA；溶剂B＝100％乙腈；梯度：0-100％B，100分钟；温度：30℃。化合物(I)在空隙附近洗脱。
然后冷冻干燥该物质以产生白色粉末状的纯化合物(I)。用三乙胺(TEA)中和化合物(I)，形成如下TEA盐(51)：
*HBTU：O-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基-脲六氟磷酸盐MW379.24
TFA：三氟乙酸MW114.02
DIPEA：二异丙基乙基胺MW 129.25
TEA；三乙胺MW 101.19
Acm：S-乙酰氨基甲基，作为硫保护基
OBut：叔丁基酯
方案15：酸性/阴离子基团D-Asp(D-Cyst)-D-Asp(D-Cyst)-D-Asp(D-Cyst)-OH的制备
实施例24：化合物MD348，CHTCA(Z0)2-[D-Asp(D-Cyst)-D-Asp(D-Cyst)-D-Asp(D-Cyst)]-OH的制备
合成详述于以下方案16中。以下化合物参考编号参考号涉及方案16。
于室温，将来自实施例22的化合物(50)，CHTCA(Z0’)2(10.744mg，8.5μmol)与HATU(3.23mg，8.5μmol)和DIPEA(1.496μl，8.56μmol)在DMF(5ml)中搅拌10分钟，然后将其与来自实施例23的化合物(51)，D-Asp(D-Cya-SO3B,-OB)-D-Asp-(D-Cya-SO3B,-OB)-D-Asp(D-Cya-SO3B,-OB)-OB，(13.2mg，8.67μmoles)在DMF(5ml)中合并。于室温将整个混合物搅拌16小时。通过分析型HPLC/MS在峰1，保留时间12.903分钟处监测所得混合物。44％MS ESI+ve，+20v 1032.3 2+离子，ESI-ve，-40v 1030.7 2+离子表明MW为2062，为不含碱的化合物(52)，即，CHTCA(Z0)2[D-Asp(D-Cya-SO3H,-OH)-D-Asp(D-Cya-SO3H,-OH)-D-Asp-(D-Cyst-SO3H,-OH)]-OH。
分析型HPLC：
柱：Phenomenex Kinetex EVO 5μm C18 100A 150 x 4.6mm；波长：210/280nm；流速：0.7ml/分钟；溶剂A＝0.1％TFA；溶剂B＝100％乙腈；梯度：0-50％B，15分钟，线性；温度：30℃。
将所得混合物用柠檬酸酸化，用水稀释至20ml，并通过0.2μm过滤器进行过滤，然后使其经历制备型HPLC分离和纯化。
制备型HPLC
柱：Phenomenex Gemini AXIA 5μm C18 110A 50 x 21.2mm；波长：210/280nm；流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1TFA；溶剂B＝100％乙腈；梯度：0-100％B，100分钟，线性；温度：30℃。
保留时间31.087分钟的主峰为产物(52)。收集含有产物的级分，并通过进一步的如下的HPLC纯化。
柱：Phenomenex Kinetex x B 5μm C18 100A 50 x 21.2mm；波长：210/280nm；流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1TFA；溶剂B＝100％Acetonitrile；梯度：5％-100％B，80分钟，线性；温度30℃。
保留时间19.597分钟的纯化的化合物(52)与保留时间21.714分钟的起始原料完全分离。
将化合物(52)(3.5mg，1.697μmol)溶解于含有三乙胺(TEA)(18μl，129μmol)的50％甲醇/水(5ml)中。将其于室温搅拌3小时。HPLC显示反应未完成，因此，另外添加11μlTEA。将混合物再搅拌60分钟，然后通过HPLC表明反应完成。然后用1M乙酸将反应溶液中和至pH 6。然后用水将溶液稀释至20ml。使混合物经历HPLC。
分析型HPLC
柱：Phenomenex Kinetex Evo 5μm C18 100A 150 x 3mm；波长：210/280nm流速：0.7ml/分钟；溶剂A＝20mM NaHPO4pH 7.0缓冲液；溶剂B＝10mM NaHPO4pH 7.0缓冲液+50％乙腈；梯度：0-100％B，30分钟，线性；温度：30℃。
制备型HPLC
柱：Phenomenex Kinetex XB 5μm C18 100A 50 x 21.2mm；波长：210/280nm流速：8ml/分钟；溶剂A＝0.1％TFA溶剂B＝100％乙腈；梯度：0-100％B，80分钟，线性；温度：30℃。
在保留时间16.431分钟处洗脱产物(53)。
合并纯级分并冷冻干燥，然后使用HCl交换以除去残留TFA。冷冻干燥得到白色固体状的产物(53)CHTCA(Z0)2[D-Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya]-OH，纯度>99％。MS ESI锥孔-20v,990.5 2+离子表明MW为1982。
方案16：化合物MD348，CHTCA(Z0)2-[D-Asp(D-Cyst)-D-Asp(D-Cyst)-D-Asp(D-Cyst)]-OH的制备
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Claims (55)

1.一种化合物，其包含第一结构域和第二结构域，
所述第一结构域包含至少一个与流感病毒表面结合的锚定基团；和
所述第二结构域包含至少一个阴离子基团；
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中所述第一结构域和第二结构域共价连接。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述第一结构域和第二结构域通过至少一个二价连接子共价连接。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其进一步包含多价骨架基团。
4.根据权利要求3所述的化合物，其为式(I)：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中：
A在各出现处为锚定基团；
B为多价骨架基团；
C在各出现处为阴离子基团；
L1和L2在各出现处为二价连接子；
n为1至4的整数；和
p为1至4的整数。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中n为1至3的整数。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的化合物，其中p为1至3的整数。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中所述至少一个锚定基团为与神经氨酸酶结合的基团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中所述锚定基团在各出现处选自任选取代的唾液酸；唾液酸衍生物；或者衍生自式II基团、式III基团、式IV基团和式V基团的单价基团，
其中E1选自–COOH、COOHR6、-SO3H、-PO3H2、-PO(OR6)2；
G1选自–NH2、-CH2NH2、-(CH2)2NH2、
T1选自任选取代的C1-C6烷基，任选取代的C2-C6烯基，或任选取代的C2-C6炔基；
U1选自-CH2R7、-(CH2)2R7、-CH2CHR7CH2R7；
R7选自H、-OH、-OCH3、-OAc、-NH2、或–SH；
R8和R8’各自独立地选自氢、-N3、-CN、-CH2NH2、胍基或–NR10R11；
R9选自氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、或任选取代的C2-C6炔基；
R10和R11各自独立地选自氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6酰基、-C(NH)NH2、-CH2COOH、CH2CH2OH或-CH2CH(R12)(R13)；
R12和R13各自独立地选自O和R14N＝；和
R14选自氢、-OH、-OCH3、-NH2、和-N(CH3)2；
R15和R15’各自独立地选自氢和CO2R16；
R16为H或任选取代的C1-C6烷基；
R17选自NH2和-NHC(═NH)NH2；
G2为
R18选自氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、和任选取代的C2-C6炔基。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中所述锚定基团选自扎那米韦、拉尼那米韦、奥司他韦、帕拉米韦、2,3-二氟唾液酸及其衍生物。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中所述锚定基团在各出现处选自式VI基团和式VII基团：
其中R1选自-NR2、胍基、-ONR2，其中R为H或任选取代的C1-C6烷基；
R2选自H、任选取代的C1-C6烷基、和任选取代的芳基；和
R3选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的芳基、和任选C1-C6酰基。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中所述锚定基团包含抗体结合结构域，其特异性与神经氨酸酶结合。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述锚定基团选自抗体(Ab)或抗体的抗原结合片段、单链抗体片段(scFV)和单结构域抗体(dAb)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中所述阴离子基团在各出现处为含有一个或多个选自羧酸、磺酸、磷酸、和次磷酸及其电子等排体或生物电子等排体的官能团的基团。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中所述阴离子基团在各出现处为氨基酸、二肽、三肽、多肽或其衍生物，其包含一个或多个选自羧酸、磺酸、磷酸、和次磷酸及其电子等排体或生物电子等排体的官能团。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述阴离子基团在各出现处为式VIII基团：
其中
R4在各出现处独立地选自–COOH、-SO3H、-NHCH2SO3H、-CONH-Cya、-CONH-Asp、-CONH-Asp(-NHCH2SO3H)w、和-CONH-Asp(-NHCH2PO3H)w，其中w为1或2的整数；
R5选自-OH和-NHCH2SO3H；
u为0至3的整数；
t为0至3的整数；
r为0至6的整数；
v为1至12的整数。
16.根据权利要求2至15中任一项所述的化合物，其中所述连接子在各出现处独立地选自一个键、任选取代的C1-C12亚烷基、-C(O)-NR-、-O-C(O)O-NR-、-C＝N-O-、-C＝N-NR-、-SO2-NR-、二硫化物、-C(O)-NR-(CH2)x-NR-、-(CH2)x-NR-、-(CH2)x-(O-(CH2)y-)z-、任选取代的-C＝N-O-、任选取代的-C＝N-NR-亚烷基、任选取代的亚烷基磺酰胺、任选取代的亚烷基二硫化物，其中R独立地为H或C1-C6烷基，并且其中x、y和z各自为独立地选自0、1、2、3和4的整数。
17.根据权利要求3至16中任一项所述的化合物，其中所述骨架基团为选自任选取代的三羧酸酯基团和任选取代的四羧酸酯基团的多价基团。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中所述骨架基团选自任选取代的丙烷-1,2,3-三羧酸酯、任选取代的丙-1-烯-1,2,3-三羧酸酯、任选取代的环丙烷-1,2,3-三羧酸酯、任选取代的环己烷-1,3,5-三羧酸酯、任选取代的苯-1,3,5-三羧酸酯、任选取代的甲烷四羧酸酯、任选取代的1,2,3,4-丁烷四羧酸酯、任选取代的亚乙基-1,1,2,2-四羧酸酯、任选取代的环己烷-1,2,4,5-四羧酸酯、和任选取代的苯-1,2,4,5-四羧酸酯。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中所述骨架基团选自任选取代的丙烷-1,2,3-三羧酸酯，任选取代的环己烷-1,3,5-三羧酸酯，和任选取代的苯-1,2,4,5-四羧酸酯。
20.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z为
21.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z0为
22.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z0为
23.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z为
24.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z为
25.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。
26.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z0为
27.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。
28.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z0为
29.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z0为
30.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z0为
31.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。
32.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。
33.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Z0为
34.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Zn为
35.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Zn为
36.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Zn为
37.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Zn为
38.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Zn为
39.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Zn为
40.根据权利要求1所述的化合物，其为
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中Zn为
41.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至40中任一项所述的化合物。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述组合物用于吸入、口服施用、鼻内施用、腹腔内施用、静脉内施用或肌肉内施用。
43.根据权利要求41或42所述的药物组合物，其进一步包含另外的活性剂。
44.一种用于治疗或预防流感病毒感染的方法，其包括向需要其的人施用治疗有效量的根据权利要求1至40中任一项所述的化合物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述流感病毒感染为甲型流感、乙型流感、禽流感、或流感的耐药株。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述感染为呼吸道感染或全身性感染。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中通过吸入、口服施用、鼻内施用、腹腔内施用、静脉内施用或肌肉内施用来施用。
48.根据权利要求1至40中任一项所述的化合物在制备用于治疗或预防流感病毒感染的药物中的用途。
49.根据权利要求48所述的用途，其中所述流感病毒感染为甲型流感、乙型流感、禽流感、或流感的耐药株。
50.根据权利要求48或49所述的用途，其中所述感染为呼吸道感染或全身性感染。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的用途，其中所述药物被配制用于吸入、口服施用、鼻内施用、腹腔内施用、静脉内施用或肌肉内施用。
52.根据权利要求1至40中任一项所述的化合物，其用于治疗或预防流感病毒感染的用途。
53.根据权利要求52所述的化合物，其中所述流感病毒感染为甲型流感、乙型流感、禽流感、或流感的耐药株。
54.根据权利要求52或53所述的化合物，其中所述感染为呼吸道感染或全性身感染。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的化合物，其中所述化合物用于通过吸入、口服施用、鼻内施用、腹腔内施用、静脉内施用或肌肉内施用来施用。
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