ES2911027T3 - Compuestos para aplicaciones medicinales - Google Patents

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ES2911027T3 ES16865298T ES16865298T ES2911027T3 ES 2911027 T3 ES2911027 T3 ES 2911027T3 ES 16865298 T ES16865298 T ES 16865298T ES 16865298 T ES16865298 T ES 16865298T ES 2911027 T3 ES2911027 T3 ES 2911027T3
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Betty Jin
Ee-Ling Seah
Paul Arthur Jones
Peter James Jenkins
Henry Kenneth Windle
Wen Yang Wu
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Ausvir Therapeutics Pty Ltd
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Abstract

Un compuesto de Fórmula (I): **(Ver fórmula)** o una de sus sales, solvatos, ésteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables, en donde: A en cada aparición es un grupo de anclaje seleccionado del grupo que consiste en zanamivir, laninamivir, oseltamivir, peramivir y ácidos 2,3-difluorosiálicos o un dominio de unión de anticuerpo que se une específicamente a la neuraminidasa; B es un grupo central multivalente seleccionado del grupo que consiste en propano-1,2,3-tricarboxilato, prop-1-eno- 1,2,3-tricarboxilato, ciclopropano-1,2,3-tricarboxilato, ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato, benceno-1,3,5-tricarboxilato, tetracarboxilato de metano, tetracarboxilato de 1,2,3,4-butano, etileno-1,1,2,2-tetracarboxilato, ciclohexano-1,2,4,5- tetracarboxilato y benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato; C en cada aparición es un grupo aniónico de fórmula VIII: **(Ver fórmula)** en donde R4 en cada aparición se selecciona independientemente del grupo que consiste en - COOH, -SO3H, -NHCH2SO3H, -CONH-Cya, -CONH-Asp, -CONH-Asp(-NHCH2SO3H)w, y -CONH-Asp(-NHCH2PO3H)w, en donde w es un número entero 1 o 2; R5 se selecciona del grupo que consiste en -OH y -NHCH2SO3H u es un número entero de 0 a 3; t es un número entero de 0 a 3; r es un número entero de 0 a 6; v es un número entero de 1 a 12; L1 y L2 en cada aparición son conectores divalentes; n es 2 o 3; y p es un número entero de 1 a 3.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos para aplicaciones medicinales
Datos de presentación
Esta solicitud está asociada con y reivindica la prioridad de la solicitud de patente australiana n.° 2015904895 presentada el 20 de noviembre de 2015.
Campo de la invención
Esta solicitud se refiere a compuestos para uso medicinal, en particular para el tratamiento o profilaxis de infecciones virales. Esta solicitud también se refiere a métodos para preparar los compuestos.
Antecedentes
La influenza es una infección respiratoria que contrae anualmente entre el 5 % y el 25 % de la población de los EE. UU., aproximadamente 200.000 de los cuales son hospitalizados y 25.000 mueren. La infección por influenza continúa siendo una amenaza constante para la salud humana y una carga para los servicios de salud. Más recientemente, la aparición de virus altamente patógenos H5N1 y H7N9 de fuentes aviares y su potencial para adquirir transmisibilidad humana han aumentado el riesgo asociado con la infección por influenza. Aunque las vacunas siguen siendo la piedra angular de la prevención, se requiere un tiempo significativo para desarrollar una vacuna eficaz contra las mutaciones frecuentes de cualquier nueva cepa de virus. Los fármacos contra la influenza, tales como los inhibidores de la neuraminidasa viral (inhibidores de NA), incluidos Zanamivir (Relenza) y Oseltamivir (Tamiflu), y los bloqueadores de los canales iónicos M2 derivados de los adamantanos, incluyendo la amantidina y la rimantidina, están disponibles y se han comercializado durante más de 20 años, pero su eficacia está limitada por el mecanismo de acción. Su eficacia puede verse comprometida aún más por la mutación viral y el desarrollo posterior de resistencia a los fármacos.
Por ejemplo, actualmente no se recomienda el uso de bloqueadores de canales iónicos M2 porque casi todos los virus estacionales circulantes A (incluido H1Nipcim09) portan una mutación puntual S31N en el gen M2 que imparte resistencia tanto a la amantadina como a la rimantadina. Esto ha dado lugar a una gran dependencia de inhibidores de NA alternativos tales como Zanamivir, Oseltamivir y Peramivir.
Los inhibidores de NA afectan el ensamblaje y gemación de virus de Influenza A en el ciclo de vida viral. Para que los viriones de la progenie se liberen de la célula, la neuraminidasa (NA) debe escindir el grupo de ácido siálico de las glicoproteínas del huésped, lo cual es esencial para la propagación y reinfección viral. Por lo tanto, el bloqueo de la función de la neuraminidasa con inhibidores específicos (inhibidores de NA) es una forma de tratar la influenza. Sin embargo, como tal inhibición ocurre en la etapa tardía del ciclo de vida viral (es decir, después de la entrada, replicación, ensamblaje y gemación viral en la superficie celular), gran parte del daño ya se ha hecho en la célula. Además, solo los virus en gemación en la superficie celular se han visto afectados. La progenie viral no inhibida puede infectar nuevas células. Esto conduce a la progresión de la gravedad de la enfermedad. Con el fin de reducir la gravedad de la enfermedad, la ventana terapéutica óptima para el tratamiento con fármacos inhibidores de NA se encuentra al principio de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, dado que la eficacia terapéutica de un agente activo dado generalmente está determinada por el mecanismo de acción, los fármacos inhibidores de NA se consideran relativamente suaves y con un beneficio clínico limitado. El documento WO02/20514 describe inhibidores de neuraminidasa multivalentes y el documento WO00/55149 describe inhibidores de neuraminidasa diméricos.
Existe la necesidad de nuevos enfoques para el tratamiento de la influenza.
El ciclo de vida de la Influenza A comprende varias etapas:
(a) El virus de la influenza A tiene una envoltura de bicapa lipídica, dentro de la cual hay ocho segmentos genómicos de ARN, cada uno de los cuales está asociado con la ARN polimerasa viral trimérica (PB1, PB2, PA) y recubierto con múltiples nucleoproteínas (NP) para formar las RNPv. La capa externa de la envoltura lipídica está enriquecida con múltiples copias de HA, NA y una pequeña cantidad de M2, mientras que las moléculas de M1 mantienen las RNPv unidas a la capa interna.
(b) La glicoproteína HA de la superficie viral se une a los receptores de ácido siálico de la superficie de la célula huésped y el virus es transportado al interior de la célula en una vesícula endocítica. El bajo pH en el endosoma desencadena un cambio conformacional en la proteína HA que conduce a la fusión de las membranas viral y endosómica. El pH bajo también desencadena el flujo de protones al interior del virus vía el canal de iones M2, lo que disocia las RNPv de las proteínas de la matriz M1. Cuando las moléculas M1 se disocian, las RNPv que se liberan en el citoplasma se transportan al núcleo mediante el reconocimiento de las secuencias de localización nuclear (NLS) en las nucleoproteínas.
(c) En el núcleo, la síntesis de ARNm viral iniciada por la polimerasa viral con fragmentos de ARN cubiertos en 5' se escinde de los pre-ARNm del huésped. La subunidad PB2 se une a la cubierta 5' de los pre-ARNm del huésped, y el dominio de endonucleasa en la subunidad PA escinde el pre-ARNm 10 a 13 nucleótidos aguas abajo de la cubierta.
La transcripción del ARNm viral se inicia posteriormente desde el extremo 3' escindido del segmento de ARN cubierto. Este "arranque de la cubierta" se produce en los pre-ARNm nacientes.
(d) Los ARNm virales se transportan al citoplasma para su traducción en proteínas virales. Las proteínas de superficie HA, M2 y NA se procesan en el retículo endoplásmico (ER), se glicosilan en el aparato de Golgi y se transportan a la membrana celular.
(e) La proteína NS1 del virus de la influenza A desempeña un papel fundamental en la supresión de la producción de ARNm del huésped al inhibir el procesamiento del extremo 3' de los pre-ARNm del huésped, lo que en consecuencia bloquea la producción de los ARNm del huésped, incluidos los ARNm de interferón-p. A diferencia de los pre-ARNm del huésped, los ARNm virales no requieren procesamiento en el extremo 3' por parte de la maquinaria de la célula huésped. Por lo tanto, los ARNm virales se transportan al citoplasma, mientras que la síntesis de los ARNm del huésped se bloquea predominantemente.
(f) La polimerasa viral es responsable no solo de la síntesis de ARNm cebado con ARN con cubierta, sino también de la replicación no cebada de los ARNv de la siguiente manera:
Figure imgf000003_0001
Las moléculas de nucleoproteína son necesarias para estas dos etapas de replicación y se depositan en el ARNc y el ARNv durante la síntesis del ARN. Las RNPv resultantes se transportan posteriormente al citoplasma, mediado por el complejo M1-NS2 que se une a las RNPv; NS2 interacciona con la proteína CRM1 humana que exporta las RNPv desde el núcleo.
(g) Las RNPv llegan a la membrana celular para incorporarse a nuevos virus que se producen por gemación. Las proteínas HA y NA en los nuevos virus contienen ácidos siálicos terminales que harían que los virus se agruparan entre sí y se adhirieran a la superficie celular. La NA de los virus recién formados escinde estos residuos de ácido siálico, liberando así el virus de la célula huésped.
Durante las etapas (a) y (b) del ciclo de vida viral de influenza, la glicoproteína la de superficie vira1Hemaglutinina (HA) se une a los receptores de ácido siálico en la célula huésped, seguido de endocitosis mediada por receptor del virus en la célula. El bajo pH en el endosoma desencadena un cambio conformacional en la proteína HA, que conduce a la fusión de la membrana viral y endosornal. Mientras tanto, el pH bajo también desencadena el flujo de protones en el virus a través del canal de iones M2, liberando así material genético viral al núcleo para iniciar el proceso de infección viral en la célula.
Se reconoce que la exposición del virus a un pH bajo en el entorno extracelular inactiva el virus. Se ha demostrado que los aerosoles de gel intranasal de pH bajo suprimen los virus de la influenza in vitro y protegen a los hurones contra la infección por influenza. Sin embargo, en tales estudios, la concentración efectiva de los ácidos es de alrededor de 0,15 M (aproximadamente pH 3,5). Además, es necesario que haya contacto con el virus para que tenga un efecto viricida. Además, los aerosoles han demostrado eficacia solo durante las primeras etapas de la infección viral. Aunque se puede lograr un valor de pH cercano a 3,5 mediante la administración de un aerosol nasal tamponado a pH 3,5, existe una limitación de esta administración nasal, que proporciona un tiempo de retención del producto relativamente corto en la nariz debido a la eliminación mucociliar. El tiempo de residencia normal de la solución administrada por vía nasal en los seres humanos es de alrededor de 12 a 15 minutos.
Además, en el caso del tratamiento de una infección viral, sería necesario administrar un tampón ácido profundamente en las vías respiratorias. Es probable que la naturaleza ácida de dicho tampón provoque irritación e intolerancia en los seres humanos. Por lo tanto, los aerosoles intranasales ácidos no serían adecuados como agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por el virus influenza ya que son esencialmente limitados e inespecíficos.
Los compuestos polianiónicos ofrecen características atractivas como agentes anti-VIH. El espectro de actividad antiviral de los polianiones se extiende a una variedad de virus con cubierta, incluidos los orto y paramixovirus (virus de la influenza). Se ha demostrado que dichos polianiones inhiben la replicación viral en cultivos celulares a una concentración de 0,1 a 1 pg/mL. Ventajosamente, dichos compuestos no son citotóxicos incluso a concentraciones de hasta 10.000 veces superiores. Sin embargo, estas sustancias adolecen de una serie de inconvenientes farmacocinéticos y toxicológicos que parecen comprometer su utilidad clínica, por ejemplo, en el torrente sanguíneo pueden ser retenidas por diversas proteínas plasmáticas antes de alcanzar su sitio de acción. Además, algunos polisacáridos sulfatados son conocidos por su actividad anticoagulante no deseada.
Existe la necesidad de nuevos agentes antivirales que sean eficaces frente a influenza. En particular, existe la necesidad de nuevos agentes antivirales que muestren uno o más de los siguientes: i) alta potencia contra los virus de influenza, ii) acción rápida para controlar la infección, iii) actividad antiviral de amplio espectro (incluyendo influenza A, B, gripe aviar), iv) eficacia contra cepas resistentes a los fármacos, v) baja tendencia a la resistencia a los fármacos, vi) mayor duración de la eficacia, vii) alta selectividad, viii) ventana terapéutica mejorada; ix) baja toxicidad, x) menos efectos secundarios y/o xi) son adecuados para aplicación terapéutica y profiláctica.
Resumen
La presente invención proporciona compuestos y estos compuestos para su uso en el tratamiento y/o prevención de la infección por influenza.
Se cree que los compuestos de la presente invención, también denominados "compuestos de ingeniería de superficie", alteran la superficie viral, convirtiendo la superficie en un entorno microácido/aniónico para interferir selectivamente con el ciclo de vida viral, incluidas las etapas (a) y (b) descritas anteriormente.
Se cree que esto se consigue con los compuestos de la presente invención que combinan un grupo que se une al virus influenza y con uno o varios grupos ácidos o aniónicos que actúan interfiriendo con la unión de la hemaglutinina a la célula. Esto proporciona una ventaja ya que los compuestos de la invención actúan para prevenir la infección de la célula y ejercen su efecto extracelularmente. Esto evita la necesidad de que la molécula invada la célula, lo que debería dar como resultado una menor toxicidad y/o menos efectos secundarios.
En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula (I),
Figure imgf000004_0001
o una de sus sales, solvatos, ésteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables, en donde:
A en cada aparición es un grupo de anclaje seleccionado del grupo que consiste en zanamivir, laninamivir, oseltamivir, peramivir y ácidos 2,3-difluorosiálicos o un dominio de unión de anticuerpo que se une específicamente a la neuraminidasa;
B es un grupo central multivalente seleccionado del grupo que consiste en propano-1,2,3-tricarboxilato, prop-1-eno-1,2,3-tricarboxilato, ciclopropano-1,2,3-tricarboxilato, ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato, benceno-1,3,5-tricarboxilato, metano tetracarboxilato, 1,2,3,4-butano tetracarboxilato, etileno-1,1,2,2-tetracarboxilato, ciclohexano-1,2,4, 5-tetracarboxilato y benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato;
C en cada aparición es un grupo aniónico de fórmula VIII:
Figure imgf000004_0002
en donde
R4 en cada aparición se selecciona independientemente del grupo que consiste en -COOH, -SO3H, -NHCH2SO3H, -CONH-Cya, -CONH-Asp, -CONH-Asp(-NHCH2SO3H)w, y -CONH-Asp(-NHCH2PO3H)w, en donde w es un número entero 1 ó 2;
R5 se selecciona del grupo que consiste en -OH y -NHCH2SO3H
u es un número entero de 0 a 3;
t es un número entero de 0 a 3;
r es un número entero de 0 a 6;
v es un número entero de 1 a 12;
L1 y L2 en cada aparición son conectores divalentes;
n es 2 ó 3; y
p es un número entero de 1 a 3.
En otros aspectos, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención o una de sus sales, solvatos, ésteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables.
En otros aspectos, se proporciona un compuesto de la invención o una de sus sales, solvatos, ésteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones virales seleccionadas de influenza A, influenza B, gripe aviar o una cepa de influenza resistente a fármacos.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usado en la presente memoria tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Breve descripción de las figuras
Fig. 1: Resumen de condiciones variables para el pretratamiento del virus (A/Sydney/250/99 o A/Sydney/5/97) con compuestos de ensayo antes de la infección de células MDCK.
Fig. 2: Pretratamiento del virus (A/Sydney/250/99) con compuestos de ensayo antes de la infección de células MDCK, A) MD348, B) MD345 y C) Zanamivir (control).
Fig. 3: Pretratamiento del virus (A/Sydney/5/97) con compuestos de ensayo antes de la infección de células MDCK, A) MD348, B) MD345 y C) Zanamivir (control).
Fig. 4: Pretratamiento del virus (A/Sydney/250/99) con MD345 (compuesto de ensayo) y Zanamivir (control) durante períodos de tiempo y condiciones variables antes de la infección de las células MDCK.
Fig. 5: Comparación de la actividad antiviral de MD314-1 y MD021-7 frente a A/Sydney/5/97 (H3N2).
Fig. 6: Comparación de la actividad antiviral de MD314-1 y MD021-7 frente a A/Misisipi/03/01 (H1N1) de Tipo Salvaje.
Fig. 7: Comparación de la actividad antiviral de MD021-7 y MD051-3 frente a A/Misisipi/03/01 (H1N1) de Tipo Salvaje.
Fig. 8: Comparación de la actividad antiviral de MD021-7 y MD051-3 frente a A/Misisipi/03/01 (H1N1) H274Y (resistente a Oseltamivir).
Fig. 9: Comparación de la actividad antiviral de MD314-1 y MD021-7 frente a A/Misisipi/03/01 (H1N1) H274Y (resistente a Oseltamivir).
Fig. 10: Resumen del esquema de tiempo de los tratamientos, la infección y la recogida de órganos para la evaluación de las tasas de aclaramiento viral en los pulmones y cornetes nasales en ratones.
Fig. 11 : Valoraciones virales pulmonares comparativas en ratones para la evaluación de las tasas de aclaramiento viral con MD021, Zanamivir y PBS.
Fig. 12: Valoraciones virales pulmonares comparativas en ratones para la evaluación de las tasas de aclaramiento viral con MD021, Zanamivir y PBS en los días 1,3, 5 y 7 posteriores a la infección.
Fig. 13: Valoración viral comparativa expresada como porcentaje de la media del grupo de control de PBS.
Fig. 14: Pérdida de peso comparativa en ratones para la evaluación de las tasas de aclaramiento viral con MD021, Zanamivir y PBS.
Fig. 15: Neutralización de A/California/7/09 (H1N1 general) in vitro.
Descripción detallada
Como se discutió anteriormente, se cree que los compuestos de la presente invención alteran la superficie viral, convirtiendo la superficie en un entorno microácido/aniónico para interferir selectivamente con las etapas del ciclo de vida viral.
Se cree que los grupos ácidos/aniónicos de los compuestos de la presente invención convierten la superficie viral en un entorno microácido/aniónico que reduce o inactiva la actividad viral. Además, se cree que estos compuestos actúan extracelularmente y, por lo tanto, pueden estar asociados con una incidencia reducida de efectos secundarios, toxicidad reducida y/o una reducción en la tendencia a la resistencia. Más particularmente, se cree que los compuestos de la presente invención actúan extracelularmente en múltiples puntos dianas del ciclo de vida viral, que incluyen, pero no se limitan a:
• Los grupos ácidos/aniónicos generan un pH bajo en la superficie viral, lo que desencadena un cambio conformacional prematuro en la proteína hemaglutinina (HA), que posteriormente puede reducir o retardar la fusión del virus y las células. Esto es específico de la etapa (b) del ciclo de vida viral mencionada anteriormente.
• Además, se cree que la creación de un entorno de pH bajo en la superficie viral provoca un flujo de protones en el virus a través del canal de iones M2, lo que puede provocar la liberación de material genético fuera de las células. Esto es específico de la etapa (b) del ciclo de vida viral mencionada anteriormente.
• Se cree que los grupos de anclaje de los compuestos de la invención pueden entrecruzar NA/HA y agregar las partículas de virus para reducir la movilidad y la infectividad de los virus. Esto es específico de las etapas (a) y (b) del ciclo de vida viral mencionadas anteriormente.
• Se cree que los grupos de anclaje inhiben la función de la neuraminidasa (NA) para reducir o prevenir la liberación de nuevos virus desde la membrana celular. Esto es específico de la etapa (g) del ciclo de vida viral mencionada anteriormente.
Se cree que la disrupción de las etapas (a) y (b) del ciclo de vida viral puede reducir la gravedad potencial de la infección al reducir la infectividad viral, incluida la invasión viral en las células, la disrupción viral de las funciones normales del núcleo celular y/o la replicación viral. Por consiguiente, se considera que la administración de los compuestos de la presente invención puede proporcionar un tratamiento más eficaz de la infección viral y/o una recuperación más rápida de los pacientes que los fármacos inhibidores de NA actualmente disponibles. Además, se cree que los compuestos de la presente invención se pueden usar profilácticamente en la prevención de la infección por influenza.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula (I),
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o una de sus sales, solvatos, ésteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables, en donde:
A en cada aparición es un grupo de anclaje seleccionado del grupo que consiste en zanamivir, laninamivir, oseltamivir, peramivir y ácidos 2,3-difluorosiálicos o un dominio de unión de anticuerpo que se une específicamente a la neuraminidasa;
B es un grupo central multivalente seleccionado del grupo que consiste en propano-1,2,3-tricarboxilato, prop-1-eno-1,2,3-tricarboxilato, ciclopropano-1,2,3-tricarboxilato, ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato, benceno-1,3,5-tricarboxilato, metano tetracarboxilato, 1,2,3,4-butano tetracarboxilato, etileno-1,1,2,2-tetracarboxilato, ciclohexano-1,2,4,5-tetracarboxilato y benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato;
C en cada aparición es un grupo aniónico de fórmula VIII:
Figure imgf000006_0002
en donde
R4 en cada aparición se selecciona independientemente del grupo que consiste en -COOH, -SO3H, -NHCH2SO3H, -CONH-Cya, -CONH-Asp, -CONH-Asp(-NHCH2SO3H)w, y -CONH-Asp(-NHCH2PO3H)w, en donde w es un número entero 1 ó 2;
R5 se selecciona del grupo que consiste en -OH y -NHCH2SO3H
u es un número entero de 0 a 3;
t es un número entero de 0 a 3;
r es un número entero de 0 a 6;
v es un número entero de 1 a 12;
L1 y L2 en cada aparición son conectores divalentes;
n es 2 ó 3; y
p es un número entero de 1 a 3.
p es un número entero de 1 a 4.
Tal y como se usa en la presente memoria, "un compuesto de la invención" o "un compuesto de fórmula (I)" significa un compuesto o una de sus sales, solvatos, ésteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables.
El término "grupo de anclaje", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier grupo adecuado que se una a la superficie de los virus influenza. En algunas realizaciones, el grupo de anclaje es un grupo que se une a la neuraminidasa, tal como un inhibidor de la neuraminidasa o un derivado del mismo. Los ejemplos de grupos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un ácido siálico o un derivado del mismo, que incluye derivados sustituidos en N u O del ácido neuramínico tal como zanamivir o laninamivir, oseltamivir, peramivir, ácidos 2,3-difluorosiálicos (DFSA) y derivados de los mismos. En otras realizaciones, el grupo de anclaje comprende un dominio de unión de anticuerpo que se une específicamente a la neuraminidasa. Los ejemplos de grupos de anclaje adecuados que comprenden un dominio de unión de anticuerpo que se une específicamente a neuraminidasa incluyen un anticuerpo (Ab) o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de cadena única (scFV) o un anticuerpo de dominio único (dAb).
El término "grupo central", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier grupo multivalente adecuado al que se unen uno o más grupos de anclaje y uno o más grupos ácidos o aniónicos. En algunos aspectos, el grupo central puede ser un grupo trivalente. En otros aspectos, el grupo central puede ser un grupo tetravalente. Los ejemplos de grupos centrales adecuados incluyen, pero no se limitan a, propano-1,2,3-tricarboxilato, ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato y benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato.
De acuerdo con la invención, los términos "grupo ácido o aniónico" son como se definen en las reivindicaciones. También se describe en la presente memoria, pero no forma parte de la invención, lo siguiente: los términos "grupo ácido o aniónico" y "grupo ácido/aniónico" se refieren a cualquier grupo funcional adecuado que tenga propiedades ácidas y/o aniónicas que actúe para interferir con la unión de la hemaglutinina a la célula. Específicamente, el término "aniónico" describe la carga negativa neta de un grupo funcional o material. Se entenderá que un material cargado negativamente dado puede tener uno o más contraiones cargados positivamente asociados con él, o viceversa. En solución, un material cargado negativamente puede haberse disociado de uno o más contraiones cargados positivamente con los que está asociado. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aniónico" se usa para describir una propiedad de ese material o grupo funcional y no el complejo total con uno o más contraiones que típicamente harán que el complejo sea neutro. Se entiende que ciertos grupos funcionales están cargados negativamente, son neutros o cargados positivamente a valores variables de pH. La determinación de si un material es aniónico se basará en la suma de estas cargas. Por ejemplo, dentro del alcance de la invención, un grupo ácido o aniónico puede incluir uno o más de los siguientes grupos funcionales ácidos carboxílico, sulfónico, fosfórico y fosfínico y sus isósteros o bioisósteros. Los ejemplos de grupos ácidos o aniónicos adecuados incluyen ácidos carboxílicos, aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos o polipéptidos o un derivado de los mismos que tiene propiedades ácidas y/o aniónicas, tal como ácido aspártico, ácido cisteico, ácido glutámico o péptidos derivados del ácido aspártico, ácido cisteico y/o ácido glutámico.
El término "ácido siálico" se entiende bien en la técnica y se refiere a un monosacárido de 9 carbonos, especialmente los derivados del ácido neuramínico. Los ejemplos de grupos adecuados incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos derivados de sustituciones en N y/u O del ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc).
El término "inhibidor de neuraminidasa" se entiende bien en la técnica y se refiere a una clase de compuestos que bloquean la enzima neuraminidasa. En algunas realizaciones, el grupo de anclaje puede ser un inhibidor de neuraminidasa o un derivado del mismo. Los ejemplos de inhibidores de neuraminidasa adecuados incluyen, pero no se limitan a, un ácido siálico o un derivado de un ácido siálico, tal como un ácido 2,3-difluorosiálico. Otros inhibidores de neuraminidasa adecuados incluyen:
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y derivados de los mismos.
Los términos "unión específica" o "se une específicamente", tal y como se usan en la presente memoria, en referencia a la interacción de un anticuerpo con una segunda especie química, significan que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (p. ej., un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de a las proteínas en general.
El término "anticuerpo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere en general a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o a cualquier fragmento funcional, mutante, variante o derivación. del mismo, que retiene las características esenciales de unión al epítopo de una molécula de Ig. Dichos formatos de anticuerpos mutantes, variantes o derivados son conocidos en la técnica. Realizaciones no limitantes de las cuales se discuten a continuación.
En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera se compone de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de h i pe rvari abil id ad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
El término "dominio de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo o proteína que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (p. ej., IL-12). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Dichas realizaciones de anticuerpos también pueden ser formatos biespecíficos, específicos duales o multiespecíficos; que se unen específicamente a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados en el término "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. 1989 Nature 341 544-6, Winter et al., publicación PCT WO 90/05144 A1), que comprende un único dominio variable; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse usando métodos recombinantes mediante un conector sintético que permite su formación como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); (véase, por ejemplo, Bird et al. 1988 Science 242423-6; Houston et al. 1988 Proc Natl Acad Sci U S A 855879-83). Se pretende que dichos anticuerpos de cadena única también estén englobados dentro del término "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios. de otra cadena y la creación de dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123). Dichas partes de unión de anticuerpos son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag. Nueva York. 790 p., ISBN 3-540-41354-5).
El grupo de anclaje en cada aparición se selecciona del grupo que consiste en zanamivir, laninamivir, oseltamivir, peramivir y ácidos 2,3-difluorosiálicos o un dominio de unión de anticuerpo que se une específicamente a la neuraminidasa. En algunas realizaciones en las que el grupo de anclaje es un dominio de unión de anticuerpo que se une específicamente a la neuraminidasa, el grupo de anclaje se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo (Ab), un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de cadena única (scFV) y un anticuerpo de dominio único (dAb). Los compuestos de la invención pueden comprender 2 grupos de anclaje.
En un ejemplo, que no forma parte de la presente invención, el grupo de anclaje es un radical monovalente derivado de un grupo de fórmula II
Figure imgf000009_0001
(Fórmula II)
un grupo de fórmula III
Figure imgf000009_0002
un grupo de fórmula IV
Figure imgf000009_0003
y un grupo de fórmula V
donde Ei se selecciona del grupo que consiste en -COOH, COOHR6 , -SO3H, - PO3H2, -PO(OR6)2
G i se selecciona de -NH2, -CH2NH2, -(CH2)2NH2,
Figure imgf000010_0001
T i se selecciona del grupo que consiste en un alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, o un alquinilo C2-C6
Ui se selecciona del grupo que consiste en -CH2R7, -(CH2)2R7 , -CH2CHR7CH2R7
R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH, -OCH3, -OAc, -NH2 o -SH.
R8 y R8' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno -N3, -CN, -CH2NH2, guanadino o -NR10R11 ;
R9 se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, o alquinilo C2-C6;
R10 y R11 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, grupo alquilo C1-C6, acilo C1-C6, -C(NH)NH2, -CH2COOH, CH2CH2OH o -CH2CH(R12)(R13),
R12 y R13 se seleccionan cada uno independientemente de O y Rm N=, y
R14 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -OH, -OCH3, -NH2 y -N(CH3)2,
R15 y R15- se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno y CO2R16,
R16 es H o alquilo C1-C6;
R17 se selecciona de NH2 y -NHC(=NH)NH2;
Figure imgf000010_0002
R18 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, y alquinilo C2-C6.
En otros ejemplos, que no forman parte de la presente invención, el grupo de anclaje en cada aparición se selecciona del grupo que consiste en un grupo de Fórmula VI y un grupo de Fórmula VII:
en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en -NR2 , guandino, -ONR2 ,
en donde R es H o alquilo C1-C6 ,
R2 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6 y arilo, y
R3 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6 , arilo y opcionalmente acilo C1-C6
En otro ejemplo, que no forma parte de la presente invención, el grupo de anclaje es un grupo de Fórmula (VIa):
Figure imgf000011_0001
En un ejemplo adicional, que no forma parte de la presente invención, el grupo de anclaje es un grupo de Fórmula (VIIa):
Figure imgf000011_0002
Los conectores L1 y L2 de Fórmula I en cada aparición es cualquier conector divalente adecuado. En una realización, el conector en cada aparición se selecciona independientemente de un enlace, un alquileno C1-C12, -C(O)-NR-, -O-C(O)O-NR-, -C=N-O-, -C=N-NR-, -SO2-NR-, disulfuro, -C(O)-NR-(CH2)X-NR-, -(CH2)X-NR-, -(CH2)X-(O-(CH2)y-)z-, C=N-O- sustituido opcionalmente, -C=N-NR-alquileno, sulfonamida de alquileno, un disulfuro de alquileno, en donde R es independientemente H o alquilo C1-C6 y en donde x, y y z son cada uno números enteros seleccionados independientemente de 0, 1,2, 3 y 4.
En un ejemplo en donde el grupo de anclaje es un grupo de Fórmula (VI) o Fórmula (VIa), el conector L1 de Fórmula (I) se selecciona de -C(O)-NR-(CH2)x-NR-, -(CH2)x-NH- y -(CH2)X-(O-(CH2)y)z, en donde x, y y z son cada uno números enteros seleccionados independientemente de 0, 1, 2, 3 y 4. En otra realización en donde el grupo de anclaje es un grupo de Fórmula (VII) o Fórmula (VIIa), el conector L1 de Fórmula (I) es -(CH2)x-NH-, en donde x es un número entero seleccionado entre 0, 1, 2, 3 y 4.
En una realización, el conector L2 de Fórmula (I) es un enlace.
El grupo central se selecciona de propano-1,2,3-tricarboxilato, prop-1-eno-1,2,3-tricarboxilato, ciclopropano-1,2,3-tricarboxilato, ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato, benceno-1,3,5-tricarboxilato, tetracarboxilato de metano, tetracarboxilato de 1,2,3,4-butano, etilen-1,1,2,2-tetracarboxilato, tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ciclohexano-1,2,4,5-tetracarboxilato y benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato. En otras realizaciones, el grupo central se selecciona de propano-1,2,3-tricarboxilato, ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato, benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato, ácido piromelítico y ácido dipiromelético formado por enlace -C(O)-NH-NH-C(O)- (ácido 5,5'-(hidrazina-1,2-dicarbonil)bis(benceno-1,2,4-tricarboxílico). En otras realizaciones, el grupo central es un péptido multivalente.
En algunas realizaciones, el grupo ácido o aniónico es cualquier grupo adecuado que comprende uno o más grupos funcionales seleccionados de ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ácidos fosfóricos y ácidos fosfínicos y sus isósteros o bioisósteros. En algunas realizaciones, el grupo ácido o aniónico es cualquier aminoácido adecuado, un dipéptido, un tripéptido, un polipéptido o derivados de los mismos que comprenden uno o más grupos funcionales ácidos. En una realización, el grupo ácido o aniónico es ácido aspártico, ácido cisteico, ácido glutámico o péptidos derivados del ácido aspártico, ácido cisteico y/o ácido glutámico.
En una realización, los compuestos de la invención comprenden un total de 4 a 10 residuos ácidos/aniónicos. Por ejemplo, cuando el grupo ácido o aniónico comprende un ácido dicarboxílico, se aprecia que dicho resto comprende dos residuos ácidos/aniónicos distintos. A modo de ejemplo con referencia a los ejemplos representativos de compuestos de la invención, se observa que MD349 comprende un total de nueve residuos ácidos o aniónicos (cinco residuos de ácido carboxílico y cuatro residuos de ácido sulfónico), MD348 comprende un total de siete residuos ácidos o aniónicos (cuatro residuos de ácido carboxílico y tres residuos de ácido sulfónico), MD345 comprende un total de ocho residuos ácidos o aniónicos (un residuo de ácido carboxílico y siete residuos de ácido sulfónico), MD352 comprende un total de nueve residuos ácidos o aniónicos (dos residuos de ácido carboxílico y siete residuos de ácido sulfónico), MD356 comprende un total de seis residuos ácidos o aniónicos (dos residuos de ácido carboxílico y cuatro residuos de ácido sulfónico), MD357 comprende un total de seis residuos ácidos o aniónicos (dos residuos de ácido carboxílico y cuatro residuos de ácido sulfónico), MD358 comprende un total de ocho residuos ácidos o aniónicos (ocho residuos de ácido carboxílico), MD359 comprende un total de ocho residuos ácidos o aniónicos residuos (dos residuos de ácido carboxílico y seis residuos de ácido sulfónico), MD373 comprende un total de ocho residuos ácidos o aniónicos (ocho residuos de ácido carboxílico), y MD376 comprende un total de diez residuos ácidos o aniónicos (diez residuos de ácido carboxílico).
El grupo ácido o aniónico es un grupo de Fórmula VIII:
Figure imgf000012_0001
en donde
R4 en cada aparición se selecciona independientemente del grupo que consiste en - COOH, -SO3H, -NHCH2SO3H, -CONH-Cya, -CONH-Asp, -CONH-Asp(-NHCH2SO3H)w, y -CONH-Asp(-NHCH2PO3H)w, en donde w es un número entero 1 o 2;
R5 se selecciona del grupo que consiste en -OH y -NHCH2SO3H
u es un número entero de 0 a 3;
t es un número entero de 0 a 3;
r es un número entero de 0 a 6;
v es un número entero de 1 a 12.
De acuerdo con la presente invención, n es 2 o 3.
De acuerdo con la presente invención, p es un número entero de 1 a 3. En otra realización, p es un número entero de 1 a 2. En ciertas realizaciones, p es 1. En otras realizaciones, p es 2. En otras realizaciones más, p es 3. En realizaciones adicionales, p es 4.
Adicionalmente, o alternativamente, en algunas realizaciones, los compuestos de Fórmula (I) pueden modificarse, ya sea antes, durante o después del ensamblaje, para aumentar o modificar la actividad biológica y/o la afinidad de unión por la superficie del virus de la influenza. En una realización, donde los grupos ácidos o aniónicos comprenden uno o más ácidos carboxílicos, incluidos los aminoácidos, el ácido carboxílico puede modificarse mediante sulfatación, fosforilación, interconversión de grupos funcionales y/o unión de cadenas laterales. Por ejemplo, cuando los grupos ácidos o aniónicos comprenden un ácido carboxílico, el ácido carboxílico puede modificarse a una amida o amida sulfatada, que incluye -C(=O)NH(CH2)nSO3H. Alternativamente, o adicionalmente, cuando los grupos ácidos o aniónicos comprenden un aminoácido o péptido, el extremo C puede modificarse para incluir grupos funcionales alternativos, tal como la conversión del ácido terminal en una amida o amida sulfatada que incluye -C(=O)NH(CH2)nSO3H.
Con respecto a los compuestos de fórmula (I) descritos en la presente memoria, se contemplan las siguientes combinaciones de cualquiera o más de (i) a (vii):
(i) A es la Fórmula (IIa); o
A es la Fórmula (IIIa);
(ii) B es ácido propano-1,2,3-tricarboxílico; o
B es ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato, o
B es benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato;
(iii) L1 es -C(O)-NH-; o
L1 es -C(O)-NH-(CH2)2-NH-; o
L1 es -C(O)-NH-(CH2)2-NH-; o
L1 es -C(O)-NH-(CH2)2-NH-; o
L1 es -C(O)-NH-(CH2)2-NH-; o
L1 es -C(O)-NH-(CH2)2-NH-; o
L1 es -C(O)-NH-(CH2)2-NH-; o
L1 es -C(O)-(CH2)8-NH-; o
L1 es -C(O)-(CH2)9-NH-; o
L1 es -C(O)-(CH2)10-NH-; o
L1 es -C(O)-(CH2)12-NH-; o
L1 es -(CH2)6-NH-; o
L1 es -(CH2)8-NH-; o
L1 es -(CH2)9-NH-; o
L1 es -(CH2)10-NH-; o
L1 es -(CH2)12-NH-;
(iv) L2 es un enlace;
(v) C es ácido L-aspártico; o
C es ácido D-aspártico; o
C es ácido L-cisteico; o
C es ácido D-cisteico; o
C es -(L-Asp)2-OH; o
C es -(D-Asp)2-OH; o
C es -(L-Cya)2-OH; o
C es -(D-Cya)2-OH; o
C es -(L-Asp)3-OH; o
C es -(D-Asp)3-OH; o
C es -(L-Cya)3-OH; o
C es -(D-Cya)3-OH; o
C es -(L-Cya)7-OH; o
C es -(D-Cya)7-OH; o
C es -(L-Asp-L-Cya)4-OH; o
C es -(L-Asp-L-Cya)4-OH; o
C es -[L-Asp(L-Cya)]3-OH; o
C es -[D-Asp(D-Cya)]3-OH; o
C es -[L-Asp(L-Cya)]4-OH; o
C es -[(L-Asp)4-(L-Cya)3]-OH; o
C es -[(D-Asp)4-(D-Cya)3]-OH; o
C es -[L-Asp(L-Cya)]3-OH; o
C es -[D-Asp(D-Cya)]3-OH; o
C es -[L-Asp(L-Cya)]4-OH; o
C es -[D-Asp(D-Cya)]4-OH; o
C es L-Asp(NHCH2SO3H)2; o
C es D-Asp(NHCH2SO3H)2; o
C es -[L-Asp(NHCH2SO3)]3- NHCH2SO3H; o
C es -[D-Asp(NHCH2SO3)]3- NHCH2SO3 H;
(vi) n es 2; o
n es 3
(vii) p es 1; o
p es 2.
Para mayor facilidad o como referencia, los ejemplos representativos de los compuestos de la invención pueden abreviarse. Por ejemplo, en el contexto de los ejemplos representativos, para facilitar la referencia, el grupo de anclaje (que incluye A de Fórmula (I)) y el conector (que incluye L1 de Fórmula (I)), en cada aparición, puede representarse como un solo grupo, denominado Zx o Sy. Específicamente, cuando los compuestos de la invención comprenden un grupo de Fórmula Zx, dichos grupos son derivados del ácido siálico en los que un grupo funcional (amino o guanidino) reemplaza al grupo hidroxilo en la posición 4 del anillo del ácido siálico. Tal modificación permite que los grupos de Fórmula Zx interaccionen con las neuraminidasas virales de influenza, pero no con las neuraminidasas de mamíferos. Esto proporciona un aspecto de seguridad cuando los compuestos de la invención se administran a mamíferos, incluidos los seres humanos. Los grupos de Fórmula Sy están unidos a través del grupo 2-hidroxi del ácido siálico. Específicamente, se usa un grupo conector de tioglucósido junto con el grupo de anclaje en la Fórmula Sy, tal como 2-S-(CH2)mNHR, que resiste la hidrólisis enzimática en comparación con conectores de éter equivalentes, tales como 2-O-(CH2)mNHR. Para facilitar la referencia, las estructuras de Zx o Sy se describen a continuación:
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Para mayor facilidad o como referencia, en el contexto de los ejemplos representativos, los compuestos de los que se puede derivar el grupo B central de Fórmula (I) se abrevian como sigue
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Para mayor facilidad o como referencia, en el contexto de los ejemplos representativos, el grupo de anclaje A, conector L1 y el grupo B central de Fórmula (I), puede abreviarse como sigue:
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Para mayor facilidad o como referencia, en el contexto de los ejemplos representativos, los compuestos de los que se pueden derivar los grupos ácidos o aniónicos de Fórmula (I) se abrevian como sigue:
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A continuación, se describen ejemplos representativos de compuestos de la invención.
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El término "alquilo", como se usa solo o en combinación en la presente memoria, se refiere a un grupo hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada. El término "alquilo C1-12" se refiere a un grupo como ese que contiene de uno a doce átomos de carbono y "alquilo inferior" se refiere a grupos alquilo C1 -6 que contienen de uno a seis átomos de carbono, tales como metilo ("Me"), etilo ("Et"), n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo y similares. El término "cicloalquilo" se refiere a carbociclos no aromáticos, no aromáticos, saturados. El término "cicloalquilo C4-9", por ejemplo, se refiere un grupo como ese que tiene de 4 a 9 átomos de carbono. Los ejemplos incluyen ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
El término "alquenilo" se refiere a un hidrocarburo lineal o ramificado que contiene uno o más enlaces dobles, preferiblemente uno o dos enlaces dobles. El término "alquenilo C2-12", por ejemplo, se refiere a un grupo como ese que contiene de dos a doce átomos de carbono. Los ejemplos de alquenilo incluyen alilo, 1 -metilvinilo, butenilo, isobutenilo, 1,3-butadienilo, 3-metil-2-butenilo, 1,3-butadienilo, 1,4-pentadienilo, 1-pentenilo, 1-hexenilo, 3-hexenilo, 1,3-hexadienilo, 1,4-hexadienilo y 1,3,5-hexatrienilo.
El término "alquinilo" se refiere a un hidrocarburo lineal o ramificado que contiene uno o más enlaces triples, preferiblemente uno o dos enlaces triples. El término "alquinilo C2-12", por ejemplo, se refiere a un grupo como ese que contiene de dos a doce átomos de carbono. Los ejemplos incluyen 2-propinilo y 2 o 3-butinilo.
El término "alcoxi", como se usa solo o en combinación, se refiere a un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada unido covalentemente a través de un enlace de oxígeno (-O-) y los términos "alcoxi C1 -6" y "alcoxi inferior" se refieren a grupos como esos que contienen de uno a seis átomos de carbono, tales como metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, t-butoxi y similares.
El término "cicloalquenilo" se refiere a grupos alquenilo cíclicos que tienen un solo anillo cíclico o múltiples anillos condensados, y al menos un punto de insaturación interna, incorporando preferiblemente de 4 a 11 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos cicloalquenilo adecuados incluyen, por ejemplo, ciclobut-2-enilo, ciclopent-3-enilo, ciclohex-4-enilo, ciclooct-3-enilo, indenilo y similares.
El término "acilo" se refiere a los grupos HC(O)-, alquil-C(O)-, cicloalquil-C(O)-, aril-C(O)-, heteroaril-C(O)- y heterociclil-C(O)-, donde alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo y heterociclilo se describen en la presente memoria.
El término "arilo" se refiere a anillos o sistemas de anillos aromáticos carbocíclicos (no heterocíclicos). Los anillos aromáticos pueden ser sistemas de anillos mono o bicíclicos. Los anillos o sistemas de anillos aromáticos generalmente están compuestos de 5 a 10 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos arilo adecuados incluyen, pero no se limitan a, fenilo, bifenilo, naftilo, tetrahidronaftilo y similares.
El término "alquileno" se refiere a un radical hidrocarburo saturado, de cadena lineal o ramificada o cíclica que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o de dos átomos de carbono diferentes de un alcano original. Por ejemplo, un grupo alquileno puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, de 1 a 10 átomos de carbono o de 1 a 6 átomos de carbono. Los radicales alquileno típicos incluyen, pero no se limitan a, metileno (-CH2-), 1, 1 -etilo (-CH(CH3)-), 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1, 1 -propilo (-CH(c H2CH3)-), 1,2-propilo (-CH2CH(CH3)-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-) y similares.
El término "alquenileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado de cadena lineal o ramificada o cíclica que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o de dos átomos de carbono diferentes de un alqueno original. Por ejemplo, un grupo alquenileno puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, de 1 a 10 átomos de carbono o de 1 a 6 átomos de carbono. Los radicales alquenileno típicos incluyen, pero no se limitan a, 1,2-etileno (-CH=CH-).
El término "alquinileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado de cadena lineal o ramificada o cíclica que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o de dos átomos de carbono diferentes de un alquino original. Por ejemplo, un grupo alquinileno puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, de 1 a 10 átomos de carbono o de 1 a 6 átomos de carbono. Los radicales alquinileno típicos incluyen, pero no se limitan a, acetileno (-C=C-), propargilo (-CH2CEC-), y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2CECH-).
El término "arileno" se refiere a un radical arilo que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo o de dos carbonos o heteroátomos diferentes de un grupo arilo original.
Los términos "halo" y "halógeno" se refieren a grupos flúor, cloro, bromo y yodo.
El término grupo "haloalquilo" tiene uno o más de los átomos de hidrógeno en un grupo alquilo reemplazados con halógenos.
El término "heteroarilo" se refiere a un grupo carbocíclico aromático monovalente, preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre dentro del anillo. Preferiblemente, el heteroátomo es nitrógeno. Dichos grupos heteroarilo pueden tener un solo anillo (p. ej., piridilo, pirrolilo o furilo) o múltiples anillos condensados (p. ej., indolizinilo, benzotienilo o benzofuranilo).
El término "heterociclilo" se refiere a un grupo monovalente saturado o insaturado que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados, preferiblemente de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, azufre, oxígeno, selenio o fósforo dentro del anillo.
El término "sustituido opcionalmente" significa que un grupo puede incluir uno o más sustituyentes. Uno o más átomos de hidrógeno en el grupo pueden reemplazarse por grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógenos (por ejemplo, haloalquilo tal como -CF3 o -CF2H), alquiloC1-6, alqueniloC2-6, alquiniloC2-6, -(CH2)vcicloalquiloC3-7, -(CH2)vcicloalqueniloC4-7, -(CH2)varilo, -(CH2)vheterociclilo, -(CH2)vheteroarilo, -C6H4SO)qalquiloC1-6, -C(Ph)3, -CN, -O, -O-(CH2)1-6-R, -O-(CH2)1-6-O, -OC(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -OC(O)NR'R", -NR'R", -NO2, -NRC(O)R', -NRC(O)NR'R", -NRC(S)NR'R", -NRS(O)2R', -NRC(O)OR', -C(NR)NR'R", -C(=NOR')R, -C(=NOH)NR'R", -C(O)NR'R", -C(=NCN)-NR'R", -C(=NR)NR'R", -C(=NR')SR", -NR'C(=NCN)SR", -CONRSO2R', -C(S)NR'R", - S(O)qR, -SO2NR'R", -SO2NRC(O)R', -OS(O)2R, -PO(O)2 y -NO2; donde v es 0-6, q es 0-2 y cada R, R' y R" se seleccionan independientemente de H, alquiloC1-6, alqueniloC2-6, alquiniloC2-6, cicloalquiloC3-7, cicloalqueniloC4-7, arilo, heterociclilo, heteroarilo, alquilariloC1-6, alquilheteroariloC1-6 y alquilheterocicliloC1-6, en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heterociclilo, heteroarilo, alquilariloC1-6, alquilheteroariloC1-6 o alquilheterocicliloC1-6, puede tener de uno a seis grupos iguales o diferentes seleccionados de halógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, -CO2H, CF3, CN, fenilo, NH2 y -NO2; o cuando R' y R'' están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden, junto con el átomo al que están unidos, formar un anillo heterocíclico que contiene nitrógeno de 5 a 7 miembros.
En las listas de posibles grupos funcionales definidas en la presente memoria, donde un grupo dado contiene dos o más subgrupos, por ejemplo, los subgrupos se pueden enumerar en el formato [subgrupo A][subgrupo B] como en alquilarilo, o [subgrupo A][subgrupo B][subgrupo C] como en ariloxialquilo, el orden de los subgrupos tal como se enumeran anteriormente no pretende limitarse al orden en el que se presentan. Por lo tanto, un grupo con dos subgrupos definidos como [subgrupo A][subgrupo B], tal como alquilarilo, pretende ser también una referencia a un grupo con dos subgrupos definidos como [subgrupo B][subgrupo A], tal como arilalquilo.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superponerse con la pareja de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponibles con su pareja de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero difieren en cuanto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
El término "diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereoisómeros pueden separarse mediante procedimientos analíticos de alta resolución, tales como electroforesis y cromatografía.
El término "enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en la presente memoria generalmente siguen SP Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada en el plano. Al describir un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S se utilizan para indicar la configuración absoluta de la molécula en torno a su(s) centro(s) quiral(es). Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de la luz polarizada en un plano por el compuesto, con (-) o 1 significando que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico también puede referirse como enantiómero, y una mezcla de tales isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o racemato, que puede ocurrir cuando no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovista de actividad óptica.
Tal y como se usa en la presente memoria, los aminoácidos y los derivados de los mismos se pueden abreviar con sus respectivos códigos de tres letras o de una sola letra, según sea apropiado. Por ejemplo, el ácido cisteico puede referirse en la presente memoria como Cya, Cyst o Cyst-SO3H, el ácido aspártico puede referirse como Asp.
Las sales de los compuestos de la invención son preferiblemente farmacéuticamente aceptables, pero se apreciará que las sales no farmacéuticamente aceptables también se encuentran dentro del alcance de la presente invención, ya que son útiles como productos intermedios en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables.
Se apreciará que los compuestos de la invención y las sales de los mismos pueden presentarse en forma de derivados farmacéuticamente aceptables. El término "derivado farmacéuticamente aceptable" incluye ésteres, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables de los compuestos de Fórmula (I), o sales de los mismos. Los derivados farmacéuticamente aceptables pueden incluir cualquier hidrato farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un sujeto, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de la invención, o un metabolito activo o residuo del mismo.
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácidos, sales de adición de bases y las sales de aminas cuaternarias y piridinios. Las sales de adición de ácido se forman a partir de un compuesto de la invención y un ácido inorgánico u orgánico farmacéuticamente aceptable que incluye, pero no se limitan a, clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, acético, propiónico, ascórbico, cítrico, malónico, fumárico, maleico, láctico, salicílico, sulfámico, tartárico o aminoácidos. El contraión de aminas cuaternarias y piridinios incluye cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, fosfato, metanosulfonato, citrato, acetato, malonato, fumarato, sulfamato y tartrato. Las sales de adición de base incluyen, pero no se limitan a, sales tales como sodio, potasio, calcio, litio, magnesio, amonio y alquilamonio. Además, los grupos básicos que contienen nitrógeno pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo como sulfato de dimetilo y dietilo; y otros. Las sales se pueden preparar de manera conocida, por ejemplo, tratando el compuesto con un ácido o una base apropiados en presencia de un disolvente adecuado.
Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina y/o como solvatos (p. ej., hidratos) y se pretende que ambas formas estén dentro del alcance de la presente invención. El término "solvato" es un complejo de estequiometría variable formado por un soluto (en esta invención, un compuesto de la invención) y un disolvente. Dichos disolventes no deben interferir con la actividad biológica del soluto. Los disolventes pueden ser, por ejemplo, agua, etanol o ácido acético. Los métodos de solvatación son generalmente conocidos en la técnica.
El término "profármaco" se usa en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se convierten in vivo en los compuestos de la invención. Dichos derivados se les ocurrirían fácilmente a los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, compuestos en los que un grupo hidroxi libre se convierte en un derivado de éster o un átomo de nitrógeno del anillo se convierte en un N-óxido. Los ejemplos de derivados de éster incluyen ésteres de alquilo, ésteres de fosfato y los formados a partir de aminoácidos, preferiblemente valina.
El término "éster farmacéuticamente aceptable" incluye ésteres biológicamente aceptables del compuesto de la invención tales como derivados de ácido sulfónico, fosfónico y carboxílico.
Así, en otro aspecto de la invención, se proporciona un éster farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la invención o de una de sus sales.
Se apreciará que los compuestos de la invención tienen al menos un centro asimétrico y, por lo tanto, pueden existir en más de una forma estereoisomérica. La invención se extiende a cada una de estas formas individualmente y a sus mezclas, incluidos los racematos. Los isómeros pueden separarse convencionalmente por métodos cromatográficos o usando un agente de resolución. Alternativamente, los isómeros individuales se pueden preparar mediante síntesis asimétrica usando intermedios quirales. Cuando el compuesto tiene al menos un enlace doble carbono-carbono, puede presentarse en formas Z y E, estando incluidas en la presente invención todas las formas isoméricas de los compuestos.
La invención también incluye cuando sea posible una sal o un éster y/o solvato farmacéuticamente aceptable de las realizaciones de la invención mencionadas anteriormente.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos antes mencionados o sus sales farmacéuticamente aceptables, incluidos sus ésteres y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente un vehículo o diluente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento o la prevención de la infección por el virus influenza, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que incluye un éster y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y opcionalmente un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
El término "composición" pretende incluir la formulación de un ingrediente activo con material de encapsulación como vehículo, para proporcionar una cápsula en la que el ingrediente activo (con o sin otro vehículo) está rodeado por vehículos.
Las composiciones o formulaciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo intramuscular, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada para administración por inhalación o insuflación. En una realización, los compuestos de la invención se formulan para inhalación, administración oral, administración intranasal, administración intraperitoneal, administración intravenosa o administración intramuscular.
Las consideraciones generales en la formulación y/o fabricación de agentes de composiciones farmacéuticas se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Decimosexta Edición, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980), y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición (Lippincott Williams & Wilkins, 2005).
En una realización, las composiciones y formulaciones de acuerdo con la invención se pueden administrar a una persona que lo necesite mediante cualquier método adecuado de inhalación, insuflación o administración intranasal. Los métodos adecuados para la inhalación, insuflación o administración intranasal serán bien conocidos por un experto en la técnica.
En una realización, las composiciones o formulaciones de los compuestos de la invención pueden estar en una forma adecuada para la administración por inhalación o insuflación. Por ejemplo, las composiciones o formulaciones de los compuestos de la invención se pueden preparar como un polvo seco, solución, suspensión o aerosol para inhalación o insuflación por la boca o la nariz. Las formulaciones adecuadas para la administración en aerosol o en polvo seco se pueden preparar de acuerdo con métodos convencionales y se pueden administrar con otros agentes terapéuticos tales como compuestos usados hasta ahora en el tratamiento o profilaxis de infecciones como se describe en la presente memoria.
En una realización, las composiciones o formulaciones de los compuestos de la invención pueden administrarse por medio de un inhalador de polvo seco. Se pueden usar inhaladores de polvo seco de tipos fácilmente descritos en la técnica, así como se pueden usar virutas micronizadas de comprimidos o discos de fármaco comprimidos isostáticamente con o sin aglutinantes inertes tales como lactosa. Este método de administración proporciona una administración particularmente rápida al pulmón. Cuando el compuesto de la invención se proporciona en forma de polvo seco, puede presentarse solo o mezclado con un diluyente adecuado farmacéuticamente aceptable tal como el almidón, derivados del almidón tal como la hidroxipropilmetilcelulosa o la polivinilpirrolidina (PVP), derivados de azúcar tales como manitol o lactosa. La composición en polvo se puede presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos, p. ej., de gelatina o envases de plástico o blíster formados a partir de los cuales se puede administrar el polvo por medio de un dispositivo de inhalación, o en forma de múltiples dosis desde, por ejemplo, un depósito de polvo.
Para la inhalación de gotitas, vapores y aerosoles, están disponibles fácilmente diversos dispositivos, tales como nebulizadores o generadores de aerosol presurizados. Además, dichos dispositivos pueden tener la dosis regulada para proporcionar uniformidad en la dosificación.
Todos los inhaladores pueden diseñarse y fabricarse para administrar partículas líquidas o sólidas a la mucosa nasal, así como a las vías respiratorias superiores y/o inferiores.
En otra realización, las composiciones o formulación de los compuestos de la invención pueden administrarse por inhalación o insuflación por medio de un inhalador de aerosol húmedo. Por ejemplo, las composiciones o formulaciones de los compuestos de la invención se pueden preparar para la administración por inhalación de aerosol húmedo en un inhalador con dosis medida previamente.
En una realización adicional, las composiciones o formulaciones de los compuestos de la invención están en una forma adecuada para la administración por vía intranasal. Las composiciones intranasales descritas en la presente memoria se pueden administrar como un aerosol o gota. Por consiguiente, los envases comerciales adecuados que contienen la formulación intranasal pueden estar en cualquier envase de pulverización conocido en la técnica. En una o más realizaciones, las formulaciones de acuerdo con la invención pueden administrarse a través de un dispositivo o recipiente de pulverización. Los dispositivos de pulverización de acuerdo con la invención pueden ser sistemas de dosis unitaria única o sistemas de dosis múltiples, por ejemplo, que comprenden una botella, una bomba y/o un actuador. Dichos dispositivos de pulverización están disponibles comercialmente. Los dispositivos de pulverización comerciales adecuados incluyen los disponibles en Nemera, Aptar, Bespak y Becton-Dickinson. Otros medios adecuados para administrar las composiciones o formulaciones por vía intranasal de acuerdo con la invención incluyen a través de un cuentagotas, una jeringa, una botella comprimible y cualquier otro medio conocido en la técnica para aplicar líquidos a la mucosa nasal de manera precisa y repetible.
Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar en una amplia variedad de formas de dosificación oral y parenteral. Será obvio para los expertos en la técnica que las siguientes formas de dosificación pueden comprender, como componente activo, bien un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la invención.
Las composiciones o formulaciones de los compuestos de la invención pueden estar en la forma de una preparación inyectable estéril, tal como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados que se han mencionado en la presente memoria. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como una solución en 1,3-butanodiol o preparado como un polvo liofilizado. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se pueden emplear convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico también pueden usarse en la preparación de inyectables. Además, las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.
Las composiciones o formulaciones de los compuestos de la invención también se pueden administrar por vía oral, por ejemplo, se pueden preparar comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes o elixires. Las composiciones destinadas al uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes que incluyen agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, con el fin de proporcionar una preparación con un sabor agradable al paladar.
Los compuestos de la invención, junto con un adyuvante, vehículo o diluyente convencional, pueden ponerse en la forma de composiciones farmacéuticas y dosis unitarias de las mismas, y en dicha forma pueden emplearse como sólidos, tales como comprimidos o cápsulas rellenas, o líquidos, tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires o cápsulas rellenas con las mismas, todos para uso oral, en la forma de supositorios para administración rectal; o en la forma de soluciones inyectables estériles para uso parenteral (incluyendo subcutáneo).
Dichas composiciones farmacéuticas y formas de dosificación unitaria de las mismas pueden comprender ingredientes convencionales en proporciones convencionales, con o sin compuestos o principios activos adicionales, y dichas formas de dosificación unitaria pueden contener cualquier cantidad efectiva adecuada del ingrediente activo acorde con el rango de dosificación diaria previsto que se va a emplear. Las formulaciones que contienen diez (10) miligramos de ingrediente activo o, más ampliamente, de 0,1 a cien (100) miligramos, por comprimido, son formas de dosificación unitaria representativas adecuadas.
Para preparar composiciones farmacéuticas a partir de los compuestos de la presente invención, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios y gránulos dispensables. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes saborizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes de desintegración de comprimidos o material de encapsulación.
En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que se mezcla con el componente activo finamente dividido.
En los comprimidos, el componente activo se mezcla con el vehículo que tiene la capacidad de unión necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y el tamaño deseados.
Los polvos y comprimidos contienen preferiblemente de cinco o diez a aproximadamente setenta por ciento del compuesto activo. Los vehículos adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. El término "preparación" pretende incluir la formulación del compuesto activo con material encapsulante como vehículo que proporciona una cápsula en la que el componente activo, con o sin vehículos, está rodeado por un vehículo, que por lo tanto está asociado con él. Del mismo modo, se incluyen sellos y pastillas para chupar. Los comprimidos, polvos, cápsulas, píldoras, sellos y pastillas para chupar se pueden usar como formas sólidas adecuadas para la administración oral.
Para preparar supositorios, primero se funde una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao, y el componente activo se dispersa homogéneamente en ella, como por agitación. A continuación, la mezcla homogénea fundida se vierte en moldes de tamaño adecuado, se deja enfriar y, por lo tanto, se solidifica.
Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o aerosoles que contienen, además del ingrediente activo, los vehículos que se sabe que son apropiados en la técnica.
Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo, agua o soluciones de agua-propilenglicol. Por ejemplo, las preparaciones líquidas para inyección parenteral se pueden formular como soluciones en una solución acuosa de polietilenglicol.
Las composiciones en forma de líquido estéril incluyen soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires estériles. El ingrediente activo se puede disolver o suspender en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, disolvente orgánico estéril o una mezcla de ambos.
Los compuestos según la presente invención pueden así formularse para administración parenteral (p. ej., mediante inyección, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en envases con múltiples dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de un sólido estéril o por liofilización de la solución, para su reconstitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril, libre de pirógenos, antes de su uso.
Las soluciones acuosas adecuadas para uso oral se pueden preparar disolviendo el componente activo en agua y añadiendo agentes colorantes, saborizantes, estabilizantes y espesantes adecuados, según se desee.
Las suspensiones acuosas adecuadas para uso oral se pueden preparar dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica u otros agentes de suspensión bien conocidos.
También se incluyen preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse, poco antes de su uso, en preparaciones en forma líquida para administración oral. Tales formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, además del componente activo, agentes colorantes, saborizantes, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, solubilizantes y similares.
Para la administración tópica en la epidermis, los compuestos según la invención pueden formularse como ungüentos, cremas o lociones, o como un parche transdérmico. Los ungüentos y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas para chupar que comprenden el agente activo en una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.
Las soluciones o suspensiones se aplican directamente en la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo, con un cuentagotas, pipeta o pulverizador. Las formulaciones se pueden proporcionar en forma de dosis única o múltiple. En el último caso de un cuentagotas o pipeta, esto puede lograrse administrando al paciente un volumen predeterminado apropiado de la solución o suspensión. En el caso de un pulverizador, esto puede lograrse, por ejemplo, por medio de una bomba dosificadora de pulverizador atomizador. Para mejorar la administración y la retención nasal, los compuestos según la invención pueden encapsularse con ciclodextrinas o formularse con otros agentes que se espera que mejoren la administración y la retención en la mucosa nasal.
La administración en el tracto respiratorio también se puede lograr por medio de una formulación en aerosol en la que el ingrediente activo se proporciona en un envase presurizado con un propulsor adecuado, tal como un hidrofluoroalcano (HFA) o un clorofluorocarbono (CFC), por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. El aerosol también puede contener convenientemente un tensioactivo tal como lecitina. La dosis de fármaco puede controlarse mediante la provisión de una válvula dosificadora.
Alternativamente, los ingredientes activos pueden proporcionarse en forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo del compuesto en una base de polvo adecuada tal como lactosa, almidón, derivados de almidón tales como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona (PVP). Convenientemente, el vehículo de polvo formará un gel en la cavidad nasal. La composición en polvo se puede presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, o envases blíster desde los que se puede administrar el polvo por medio de un inhalador.
En las formulaciones destinadas a la administración en el tracto respiratorio, incluidas las formulaciones intranasales, el compuesto tendrá generalmente un tamaño de partícula pequeño, por ejemplo. del orden de 5 a 10 micrómetros o menos. Tal tamaño de partícula puede obtenerse por medios conocidos en la técnica, por ejemplo, por micronización.
Cuando se desee, se pueden emplear formulaciones adaptadas para dar una liberación sostenida del ingrediente activo.
Las preparaciones farmacéuticas están preferiblemente en formas de dosificación unitaria. En tal forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de preparación, tales como comprimidos, cápsulas y polvos envasados en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, comprimido, sello o pastilla para chupar, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estos en forma envasada.
La invención también incluye los compuestos en ausencia de vehículo cuando los compuestos están en forma de dosificación unitaria.
La cantidad del compuesto de la invención a administrar puede estar en el rango de aproximadamente 0,01 mg a 2.000 mg por día, dependiendo de la actividad del compuesto y de la enfermedad a tratar.
La cantidad del compuesto requerida para su uso en el tratamiento variará según la vía de administración, la naturaleza de la afección que se esté tratando y la edad y la condición del animal (incluidos los pacientes humanos) y, en última instancia, quedará a criterio del veterinario o médico responsable.
Por ejemplo, una dosis adecuada estará en el rango de aproximadamente 0,1 mg a 100 mg/kg de peso corporal por día, preferiblemente en el rango de 0,1 mg a 50 mg/kg/día.
En algunas realizaciones, la dosificación para administración oral estaría en el rango de 1 mg/kg/día a 100 mg/kg/día. La dosis para inyección estaría en el rango de 1 mg/kg/día a 100 mg/kg/día. La dosis para inhalación estaría en el rango de 0,01 mg/kg/día a 1 mg/kg/día. En algunas realizaciones preferidas, la dosis estaría en el rango de 5 mg -50 mg/kg para administración oral o por inyección de dos a tres veces al día durante un período de 1 a 15 días, preferiblemente de 3 a 12 días, más preferiblemente de 5 a 10 días. En otras realizaciones preferidas, la dosis estaría en el rango de 0,1 - 0,5 mg/kg para inhalación de una a cinco veces al día durante un período de 1 a 15 días, preferiblemente de 3 a 12 días, más preferiblemente durante un período de 5 a 10 días. Alternativamente, en otra realización preferida, la dosis estaría en el rango de 0,2 mg/kg - 0,4 mg/kg para inhalación como una sola administración diaria durante la duración del tratamiento. Se entiende que la dosis deseada se puede administrar en una sola dosis o como dosis dividida administrada a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis por día.
Los compuestos de la invención se administran convenientemente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, que contiene de 0,1 a 10 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.
51 bien es posible que, para su uso en terapia, los compuestos puedan administrarse como producto químico bruto, es preferible presentar el ingrediente activo como una formulación farmacéutica. Por tanto, la invención proporciona además una formulación farmacéutica que incluye los compuestos junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables de los mismos y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos. El o los vehículos deben ser 'aceptables' en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de la misma.
Las formulaciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo intramuscular, intradérmica, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada para administración en el tracto gastrointestinal, o en una forma adecuada para el tracto respiratorio (incluyendo las fosas nasales) por ejemplo por inhalación o insuflación o para implantación intradérmica o subcutánea o para parche transdérmico. Las formulaciones pueden, cuando sea apropiado, presentarse convenientemente en unidades de dosificación discretas y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el compuesto activo con un vehículo, tal como un vehículo líquido o un vehículo sólido finamente dividido o combinaciones de los mismos, y luego, si es necesario, moldear el producto en la formulación deseada.
Las composiciones preferidas son líquidos o polvos para administración intranasal, comprimidos o cápsulas para administración oral y líquidos para administración intravenosa.
Las preparaciones farmacéuticas de los compuestos según la presente invención se pueden administrar conjuntamente con uno o más de otros agentes activos en terapia de combinación. Por ejemplo, la preparación farmacéutica del compuesto activo se puede administrar conjuntamente (por ejemplo, por separado, concurrente o secuencialmente), con uno o más de otros agentes antivirales, antibióticos y fármacos antiinflamatorios.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que es suficiente para efectuar el tratamiento, como se define anteriormente, cuando se administra a un sujeto, tal como un mamífero, incluido un ser humano que necesita dicho tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del sujeto y del estado de la enfermedad que se esté tratando, de la gravedad de la afección y de la forma de administración, y puede ser determinada de forma rutinaria por un experto en la técnica.
El término "tratamiento" tal y como se usa en la presente memoria engloba cualquier tratamiento de una enfermedad o dolencia en un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, e incluye: (i) prevenir que la enfermedad o afección ocurra en un sujeto; (ii) inhibir la enfermedad o afección, (iii) aliviar la enfermedad o afección, o (iv) aliviar las condiciones/síntomas causados por la enfermedad.
Los términos "prevención" y "profilaxis", tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a la administración previa de un medicamento para evitar o impedir la aparición de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno. El experto en la técnica médica reconoce que el término "prevenir" no es un término absoluto. En la técnica médica se entiende que se refiere a la administración profiláctica de un fármaco para disminuir sustancialmente la probabilidad o gravedad de una afección, o síntoma de la afección y este es el sentido que se pretende en esta descripción. Tal y como se usa en un texto estándar en el campo, Physician's Desk Reference, los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" con respecto a un trastorno o enfermedad, se refieren a evitar la causa, los efectos, los síntomas o la progresión de una enfermedad o trastorno antes de que la enfermedad o trastorno se manifieste por completo.
Los términos "administrar", "administrando" o "administración" en referencia a un compuesto, composición o formulación de la invención significan introducir el compuesto en el sistema del animal que necesita tratamiento. Cuando un compuesto de la invención se proporciona en combinación con uno o más de otros agentes activos, se entiende que la "administración" y sus variantes incluyen la introducción concurrente y/o secuencial del compuesto y los otros agentes activos.
Ejemplos
Los aspectos descritos en la presente memoria se describen adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Métodos generales y notas
A menos que se indique otra cosa, los espectros de RMN se registraron en Bruker Avance 300, Xwin-NMR versión 3.5 en DPX 300A.
A menos que se indique otra cosa, los espectros de masas se registraron en un Espectrómetro de Masas Waters Micromass ZMD usando un ESI (sonda de ionización por electropulverización), usando el software Water Mass Lynx NT.
A menos que se indique otra cosa, la cromatografía en columna ultrarrápida se realizó en gel de sílice 60 F245 (E. Merck).
La Cromatografía en Capa Fina (TLC) se realizó en placas recubiertas previamente con gel de sílice (E. Merck).
A menos que se indique otra cosa, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se realizó en un módulo de separación Waters Alliance 2690, usando un detector Uv 2487 de doble longitud de onda de Waters y el software Waters Millennium 32.
Procedimiento general para la regulación de animales de laboratorio
La regulación ética de los experimentos relevantes que utilizan animales de laboratorio se realizó de acuerdo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de las Instituciones/Universidades correspondientes.
Procedimiento general para el ensayo de reducción de placa
Las células MDCK se sembraron en placas de cultivo de tejidos de seis pocillos y se cultivaron hasta la confluencia mediante métodos estándar. Los virus influenza se diluyeron en un volumen mínimo de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con BSA al 0,2 % para producir una valoración estimada de 50 a 100 UFP por pocillo. Después de la absorción en las células MDCK durante 1 h a 37 °C en una atmósfera con CO2 al 5 %, los inóculos virales fueron aspirados y reemplazados con medio de crecimiento viral (medio de Eagle mínimo suplementado con BSA, tripsina e insulina-transferrina-selenio) que contenía agar o agarosa en una cantidad (generalmente 1 a 2 %) suficiente para hacer que el medio gelifique a temperatura ambiente. Las placas se incubaron a 37 °C en una atmósfera con CO2 hasta que se desarrollaron las placas (generalmente de 2 a 4 días). Las placas se visualizaron con una tinción adecuada (p. ej., cristal violeta al 0,4 % en solución salina formal) antes de contarlas. La potencia antiviral (CE50) se determinó como la concentración del compuesto en el medio que redujo el número de placas al 50 % del valor del control sin tratar.
Materiales y procedimiento general para el ensayo CPE
Los compuestos de ensayo se disolvieron en agua estéril y se almacenaron a -20 °C. Posteriormente, los compuestos se diluyeron en medios de ensayo (MEM tripsina) hasta las concentraciones deseadas.
Los medios de ensayo comprendían Gibco 1 MEM (500 mL) suplementado con aminoácidos no esenciales MEM 1 mM, penicilina 50U, estreptomicina 50 pg/ml, piruvato de sodio 1 mM. Se añadió tripsina (tratada con TPCK) al medio hasta una concentración final de 1 pg/ml, antes de realizar el ensayo.
Las células MDCK (ATCC) se cultivaron en medio de cultivo: Gibco 1 x MEM (500 mL) suplementado con aminoácidos no esenciales MEM 1 mM, 50U-penicilina-50 pg/ml de estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM y PBS al 10 %.
La preparación madre viral se diluyó en PBS.
El ensayo se llevó a cabo usando un Ensayo de Proliferación Celular de Una Solución Acuosa CellTitre 96 (Promega). A menos que se indique otra cosa, se utilizó el siguiente método general para los ensayos de CPE:
i) Las células MDCK se cultivaron hasta la confluencia en bandejas de 96 pocillos en medios de crecimiento; ii) Se quitaron los medios;
iii) Se añadieron 46 pL de virus diluido por pocillo, incluidos los pocillos con infección simulada;
iv) Las placas se incubaron a 37 °C durante 1,5 h. Durante este tiempo, se prepararon los compuestos de ensayo. v) Después de 1,5 horas. se eliminó el inóculo viral.
vi) Se prepararon los compuestos a ensayar realizando una dilución en serie 1:3 de los compuestos en las placas antes mencionadas:
a) Se añadieron 100 pL de medio de ensayo en las Filas 3 a 11;
b) Se añadieron 150 pL de los compuestos a la Fila 2;
c) Valoración de 50 pL de la Fila 2 a la 10, luego se descartaron 50 pL de la Fila 10.
d) La Fila 11 sirvió como control positivo y negativo.
vii) Las células se incubaron a 37 °C durante 48 h-96 h.
viii) 48 h - 96 h después de la infección, se retiró el medio.
ix) El medio se reemplazó con 100 pL de medio de ensayo sin tripsina.
x) Se añadieron 20 pL por pocillo de solución de detección.
xi) Las placas se incubaron a 37 °C durante 1 h más.
xii) La absorbancia de las placas se midió a 490 nm.
Ejemplo 1: Pretratamiento de virus con compuestos de ensayo antes de la infección de las células MDCK
Se utilizaron compuestos representativos de Fórmula (I) para evaluar la actividad antiviral antes de la infección de las células MDCK. Se ensayaron MD345 [(PK2 TCA(Z0)2-[D-Cya-SOaH)7-OH], MD345 [(PK2 TCA(Z0)2-[Cya)7-OH], MD348 [(CHTCA(Z0)2-D-Asp-(D-Cya)-D-Asp-(D-Cya)-D-Asp-(D-Cya)-OH] y MD348 [(CHTCA(Z0)2-D-Asp-(D-Cya-SO3H)-D-Asp-(D-Cya-SO3H)-D-Asp-(D-Cya-SO3H)-OH] como compuestos representativos de Fórmula (I). Se ensayó la actividad contra dos cepas virales, A/Sydney/250/99 (H1N1) y A/Sydney/5/97 (H3N2). Zanamivir se utilizó como control.
Las condiciones se detallan en la Tabla 1 y se proporciona un resumen en la Fig. 1.
Tabla 1: Resumen de las condiciones para el pretratamiento del virus antes de la infección de las células MDCK
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Los resultados para A/Sydney/250/99 se resumen en la Tabla 2 y en las Figuras 2A, 2B y 2C. Los resultados para A/Sydney/5/97 se resumen en la Tabla 3 y en las Figuras 3A, 3B y 3C.
Los resultados indican que los compuestos de Fórmula (I), MD345 y MD348, neutralizaron los virus A/Sydney/25/99 (H1N1) y A/Sydney/5/97 (H3N2) extracelularmente. El pretratamiento de los virus con Zanamivir no afectó la infectividad de los virus.
La posterior comparación del curso temporal de MD345-2 y Zanamivir frente a A/Sydney/250/99 indica que MD345-2 neutralizó ambos virus en menos de 1 minuto. Los resultados para A/Sydney/250/99 se resumen en la Tabla 2 y en las Figuras 2A, 2B y 2C. Los resultados para A/Sydney/5/97 se resumen en la Tabla 4 y en la Figura 4.
Tabla 2: Pretratamiento del virus antes de la infección de células MDCK
Compuestos de ensayo: MD348-2, MD345-2 y Zanamivir (control)
Valoración del virus: A/Sydney/25/99
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Notas: Los compuestos se disolvieron en H2O a 50 pg/mL. Se realizaron diluciones adicionales en 1 x PBS hasta 5 pg/mL. Las células se mantuvieron en medios que contenían 1 pg/ml de tripsina. Ensayado a las 72 h post infección. (1000140711) 0,5 x 10-4 virus preadsorbido durante 1 h, virus retirado, células lavadas una vez y medio fresco añadido, incubado durante 72 h.
Tabla 3: Pretratamiento del virus antes de la infección de las células MDCK
Compuestos de ensayo: MD348-2, MD345-2 y Zanarnivir (control)
Valoración del virus: A/Sydney/5/97
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Notas: Los compuestos se disolvieron en H2O hasta 50 pg/mL. Se realizaron diluciones adicionales en 1 x PBS hasta 5 pg/mL. Las células se mantuvieron en medios que contenían 1 pg/mL de tripsina. Ensayado a las 72 h post infección. (2000271011) 1 x 10-4 virus preadsorbido durante 1 h, virus retirado, células lavadas una vez y medio fresco añadido, incubado durante 72 h.
Tabla 4: Comparación del curso temporal del pretratamiento del virus antes de la infección de las células MDCK Compuestos de ensayo: MD345-2 y Zanamivir (control)
Valoración del virus: A/Sydney/250/99
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Nota: Los compuestos se disolvieron en H2O a 50 pg/mL. Se realizaron diluciones adicionales en 1 x PBS hasta 0,5 pg/ml. Las células se mantuvieron en medios que contenían 1 pg/ml de tripsina. Ensayado a las 72 h post infección. (1000 140711) 1 x 10-4 virus preadsorbido durante 1 h, virus retirado, células lavadas una vez y medio fresco añadido, incubado durante 72 h.
Ejemplo 2: Comparación de grupos ácidos/aniónicos variables en la actividad antiviral de los compuestos de ensayo
Se utilizaron compuestos representativos de Fórmula (I) para comparar el efecto de los grupos ácidos/aniónicos sobre la actividad antiviral. Los siguientes compuestos se ensayaron como compuestos representativos de Fórmula (I):
• MD314-1: (CHTCA(Zü)2-L-Asp-(L-Cyst-SO3H)-Asp-(L-Cyst-SO3H)-L-Asp-(L-Cyst-SO3H)-OH, que comprende tres ácidos sulfónicos y cuatro ácidos carboxílicos;
• MD021-7: CHTGA(Z)2-L-Asp, que comprende que contiene 2 ácidos carboxílicos; y
• MD051-3: PK2 TCA(Z)2-L-Asp-L-Asp, que comprende 3 ácidos carboxílicos.
Se ensayó la actividad contra tres cepas virales, A/Sydney/250/99 (H1N1), A/Misisipi/03/01 (H1N1) Tipo Salvaje y A/Misisipi/03/01 (H1N1) H274Y (resistente al Oseltamivir).
Los resultados para A/Sydney/5/97 (H3N2) se resumen en la Tabla 5 y en la Figura 5. Los resultados para A/Misisipi/03/01 (H1N1) Tipo Salvaje se resumen en la Tabla 5 y en las Figuras 6 y 7. Los resultados para A/Misisipi/03/01 (H1N1) H274Y (resistente al Oseltamivir) se resumen en la Tabla 5 y en las Figuras 8 y 9.
Tabla 5: Comparación de grupos ácidos/aniónicos en la actividad antiviral
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Los resultados indican que las actividades antivirales de los compuestos fueron proporcionales al número de grupos ácidos/aniónicos.
Ejemplo 3: Modificación de las tasas de aclaramiento viral en el pulmón y los cornetes nasales
Se evaluó el efecto de compuestos representativos de Fórmula (I) sobre las tasas de aclaramiento viral en los pulomes y los cornetes nasales de ratones. Se ensayó MD021 (CHTCA(Z)2-L-Asp) como un compuesto representativo de Fórmula (I). Zanamivir y PBS se utilizaron como controles.
Se trataron 20 ratones por grupo por vía intranasal bajo anestesia con 2 pg de MD021, 2 pg de Zanamivir o PBS en los días -1, 1, 2, 3, 4 y 5 y se infectaron con una dosis subletal de 50 ufp de virus influenza PR8 el día 0. Los ratones se pesaron diariamente. Se sacrificaron cinco ratones por grupo de tratamiento los días 1, 3, 5 y 7 después de la infección y se recogieron sus pulmones y cornetes nasales. Los pulmones se ensayaron para determinar la carga viral. Los cornetes nasales se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.
Todos los tratamientos, la infección y el sacrificio de los ratones ocurrieron dentro de una ventana de dos horas 24 horas después de la intervención del día anterior. Los ratones no recibieron tratamiento el mismo día que fueron sacrificados. El esquema temporal de los tratamientos, la infección y la extracción de órganos se resumen en la Fig. 10.
Los resultados se detallan en la Tabla 6 y en las Figs. 11 a 14. En todos los puntos temporales, la carga viral pulmonar (expresada como log10) en ratones tratados con MD021 fue significativamente menor que la de los ratones tratados con PBS. En los días 3 y 7 posteriores a la infección, la carga viral pulmonar de los ratones tratados con MD021 también fue significativamente menor que la de los ratones tratados con Zanamivir. Los resultados se evaluaron usando un ANOVA unidireccional con prueba posterior de Tukey en los datos del día 1,3 y 5 y una prueba t de Mann Witney en los datos del día 7. El umbral del ensayo fue de 10107. A las muestras negativas se les asignó un valor de 101. Los ratones no tratados (tratamiento de control con PBS) no sobrevivieron hasta el día 7 a pesar de la baja dosis de virus administrada.
Se evaluó la pérdida de peso para los grupos de ratones que no se sacrificaron hasta el Día 7 después de la infección. Los resultados indican una pérdida de peso mínima después del tratamiento con MD021, sustancialmente menor que la pérdida de peso observada con la administración de Zanamivir en puntos de tiempo posteriores.
Tabla 6: Modificación de las tasas de aclaramiento viral en el pulmón y los cornetes nasales
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El análisis estadístico de las curvas de pérdida de peso mediante ANOVA de medidas repetidas de 2 vías mostró una diferencia altamente significativa en las curvas de tratamiento (p<0,0001). Obsérvese que el ANOVA de medidas repetidas de 2 vías solo se completó para los datos adquiridos hasta el día 5 después de la infección, ya que el grupo de PBS no tenía datos completos en los días 6 y 7 debido a una muerte prematura. La prueba posterior de Bonferroni reveló que tanto Zanamivir como MD021 fueron significativamente diferentes de PBS en los días 3, 4 y 5 (p<0,001). El mismo análisis realizado en las curvas de pérdida de peso completas para MD021 y Zanamivir solo reveló una diferencia estadísticamente significativa en las dos curvas de pérdida de peso en general (p=0,0443) y la prueba posterior de Bonferroni mostró que las diferencias significativas ocurrieron el día 6 (p< 0,01) y día 7 (p<0,001).
Los resultados indican que múltiples tratamientos diarios con 2 pg del compuesto MD021 pudieron reducir significativamente la carga viral pulmonar en comparación con los ratones tratados de manera similar con PBS en los días 1,3 y 5 posteriores a la infección y también con 2 pg de Zanamivir en los días 3 y 7 posteriores a la infección. La reducción significativa en la carga viral estuvo acompañada por una menor pérdida de peso en los ratones y se espera que equivalga a una reducción sustancial en la gravedad de la enfermedad. La pérdida de peso mínima con MD021 a lo largo de todo el curso de la enfermedad fue sorprendente y significativamente mejor que con Zanamivir en puntos de tiempo posteriores.
Aunque a los ratones se les administró una dosis del virus PR8 que, en circunstancias normales, es subletal, todos los ratones que recibieron el tratamiento de control con PBS perdieron peso y fueron sacrificados antes del día 7 después de la infección. Las muertes prematuras inesperadas pueden estar asociadas con el efecto perjudicial del anestésico diario y la administración intranasal de 50 pL de líquido. Sin embargo, en los grupos MD021 y Zanamivir, el tratamiento superó cualquier efecto perjudicial.
Ejemplo 4: Cribado del ensayo CPE
Se realizaron cribados del ensayo de CPE para compuestos representativos de Fórmula (I) de acuerdo con el procedimiento general para el ensayo de CPE descrito anteriormente. Los resultados se detallan en las Tablas 7 y 8. También se realizaron cribados antivirales específicos in vitro para un rango de cepas virales, incluyendo Influenza A H7N9 A/Anhui/1/2003 (Tabla 9), Influenza A H5N1 Hong Kong/213/2003 (Tabla 10), Influenza A H3N2 Perth/16/2009 (Tabla 11), Influenza A H7N9 A/Anhui/1/2003 (Tabla 12), Influenza A H1N1 California 07/2009 (Tabla 13), Influenza A H5N1 Duck/MN/1525/81 (Tabla 14), Influenza A H5 N1 Tailandia/16/2004 (Tabla 15), virus Influenza A H1N1, A/Misisipi/3/2001 H275Y, resistente a Oseltamivir (Tabla 16), virus Influenza A H5N1 Duck/MN/1525/81 (Tabla 17), virus Influenza B, B/Brisbane/60/2008 (Tabla 18), virus Influenza B, B/Florida/4/2006 (Tabla 19) y A/Sydney/250/99 (H1N1) (Tabla 20).
Los datos de actividad antiinfluenza indican que cuantos más grupos ácidos hay en los compuestos de Fórmula (I), mayor es la actividad antiviral.
La actividad antiinfluenza de los compuestos representativos de Fórmula (I) se evaluó adicionalmente en ensayos de CPE posteriores (Tabla 38) y a diferentes valoraciones virales (Tabla 39).
Ejemplo 5: Actividad viral antiinfluenza frente a cepas resistentes a Oseltamivir
Se evaluó la actividad antivirus influenza frente a cepas resistentes a Oseltamivir para compuestos representativos de Fórmula (I). Se registraron la inhibición del tamaño de las placas y el número de placas. Oseltamivir se utilizó como control. Los resultados se detallan en la Tabla 21.
Ejemplo 6: Ensayo de Reducción de Placa Viral
Se evaluaron compuestos representativos de Fórmula (I) en una reducción de placas virales frente a cada uno de los virus CA/07/2009 H1N1 y virus A/PR/8 H1N1. Zanamivir se utilizó como control. Los resultados se detallan en la Tabla 22 y 23, respectivamente.
Ejemplo 7: Datos de eficacia en ratones in vivo para compuestos representativos de Fórmula (I)
Se evaluó la eficacia in vivo de compuestos representativos de Fórmula (I) en ratones frente a un rango de infecciones virales.
La Tabla 24 detalla la supervivencia de los ratones después de la infección con uno de los virus A/California/04/2009 (H1N1) A/Victoria/3/75 (H3N2), A/Misisipi/3/01 H275Y, virus resistente al Oseltamivir (H1N1), A/Duck/MN/1525/81 (H5N1), o B/Sichuan/379/99 (FluB) y tratamiento con un solo compuesto con compuestos representativos de Fórmula (I) en diferentes dosificaciones.
La Tabla 25 detalla la supervivencia de los ratones después de la infección viral intranasal por el virus A/PR/8 (500 ufp/ratón) y tratamiento con un solo compuesto con compuestos representativos de Fórmula (I) a diferentes dosificaciones y tiempos.
La Tabla 26 detalla los efectos del tratamiento intranasal único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran en diferentes dosificaciones después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/California/04/2009 (H1N1pdm) en ratones. Zanamivir se usó como control y solución salina se usó como placebo.
La Tabla 27 detalla los efectos del tratamiento intranasal único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran en diferentes dosificaciones 48 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) en ratones. Zanamivir se usó como control y solución salina se usó como placebo.
La Tabla 28 detalla los efectos del tratamiento intranasal único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran 48 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) en ratones. Zanamivir se usó como control y solución salina se usó como placebo.
La Tabla 29 detalla los efectos del tratamiento intranasal único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran en diferentes dosificaciones a las 48 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones. Zanamivir se usó como control y solución salina se usó como placebo.
La Tabla 30 detalla los efectos del tratamiento intranasal único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran en diferentes dosificaciones 60 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones. Zanamivir se usó como control y solución salina se usó como placebo. Zanamivir se usó como control y solución salina se usó como placebo.
La Tabla 31 detalla los efectos del tratamiento intranasal único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran 60 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones. Zanamivir se usó como control y solución salina se usó como placebo.
La Tabla 32 detalla los efectos del tratamiento intranasal único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran 72 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones.
La Tabla 33 detalla los efectos del tratamiento intranasal único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran 72 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones.
La Tabla 34 detalla los efectos del tratamiento único con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran por vía intraperitoneal 1 hora antes de la exposición letal del virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones.
La Tabla 35 detalla los efectos del tratamiento con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran por vía intraperitoneal 4 horas después de la infección (20 pg/ratón/día x 5 días) sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp). /ratón) infección en ratones.
Los resultados presentados en las Tablas 34 y 35 indican que los compuestos de Fórmula (I) pueden usarse en el tratamiento sistémico de infecciones.
La Tabla 36 detalla los efectos del tratamiento con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran por vía intranasal 60 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones.
La Tabla 37 detalla los efectos del tratamiento con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran por vía intranasal 60 horas después de la infección sobre la supervivencia de una infección por el virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones.
La Tabla 38 detalla los efectos del tratamiento con compuestos representativos de Fórmula (I) cuando se administran por vía intraperitoneal 1 hora antes de la exposición letal del virus influenza A/PR/8 (H1N1) (500 ufp/ratón) en ratones.
Los resultados de los ensayos in vitro e in vivo demuestran que los compuestos de Fórmula (I) son potentes contra una serie de cepas de gripe, incluidas la gripe A, B, la gripe aviar y las cepas resistentes a los fármacos. Además, los resultados demuestran que los compuestos de Fórmula (I) no mostraron citotoxicidad.
Con respecto a los estudios con ratones, se encontró que los ratones infectados generalmente perdieron menos peso corporal y/o se recuperaron más rápido cuando se trataron con compuestos de Fórmula (I) en comparación con un placebo de solución salina y/o un control (es decir, Zanamivir). Además, se encontró que los compuestos de Fórmula (I) eran efectivos después de la administración en la cavidad nasal de ratones durante un período de más de 11 días.
Los datos de eficacia in vivo indican que los compuestos de Fórmula (I) eran al menos 75 veces (en dosificación ponderal) o > 400 veces (en dosificación molar) más activos que un control de Zanamivir.
Con respecto a los datos de eficacia in vivo para ratones infectados con el virus de la gripe A PR8 (500 ufp/ratón) las administraciones intranasales comparativas basadas en el tiempo de compuestos representativos de la invención a las 48 horas, 60 horas o 72 horas después de la infección dieron como resultado la supervivencia de la mayoría de los ratones, y una pérdida máxima de peso corporal <15 % (solo tres ratones tuvieron una pérdida de peso corporal entre el 20-25 %).
Con respecto a los datos de eficacia in vivo para ratones infectados con el virus Influenza A/PR/8 (500 ufp/ratón), las administraciones intraperitoneales de compuestos representativos de la invención dieron como resultado la supervivencia de todos los ratones, e indica que los compuestos de la invención pueden usarse para el tratamiento sistémico de la infección.
Se ensayaron dos compuestos representativos de Fórmula (I), MD185 y MD317 en un ensayo hERG CI50 (hERG-CHO, registro zonal automatizado). Ambos resultados indicaron que los dos compuestos eran seguros con respecto a la toxicidad cardiaca. Además, MD185 y MD317 se ensayaron en Kinome sean, no hubo una interacción significativa entre los compuestos y las quinasas a 100 nM.
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Ejemplo 8: Toxicología de ADME para compuestos representativos de Fórmula (I)
Se ensayaron dos compuestos de Fórmula (I), MD185 y MD317, en un hERG CI50 (hERG-CHO, registro zonal automatizado). El valor de CI50 de MD 185 no fue calculable. La curva de concentración-respuesta para MD317 mostró un efecto de menos del 25 % en la concentración de ensayo más alta validada, es decir, CI50> 100 nM.
Los resultados indicaron que MD185 y MD317 eran seguros respecto a la toxicidad cardíaca.
Ejemplo 9: Perfilado de KINOME scan para compuestos representativos de Fórmula (I)
Se ensayaron dos compuestos de Fórmula (I), MD185 y MD317, según el siguiente protocolo para ensayos de quinasa.
Para la mayoría de los ensayos, las cepas de fagos T7 marcadas con quinasa se cultivaron en paralelo en bloques de 24 pocillos en un huésped de E. coli derivado de la cepa BL21. Las E. coli se cultivaron hasta la fase logarítmica y se infectaron con el fago T7 de una preparación madre congelada (multiplicidad de infección = 0,4) y se incubó con agitación a 32 °C hasta la lisis (90-150 minutos). Los lisados se centrifugaron (6.000 x g) y se filtraron (0,2 gm) para eliminar los restos celulares. Las quinasas restantes se produjeron en células HEK-293 y posteriormente se etiquetaron con ADN para la detección por qPCR. Se trataron perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina con ligandos de molécula pequeña biotinilados durante 30 minutos a temperatura ambiente para generar resinas de afinidad para ensayos de quinasa. Las perlas con ligando se bloquearon con exceso de biotina y se lavaron con tampón de bloqueo (SeaBlock(pierce), BSA al 1 %, Tween20 al 0,05 %, DTT 1 mM) para eliminar el ligando no unido y reducir la unión de fagos no específica. Las reacciones de unión se ensamblaron combinando quinasas, perlas de afinidad con ligando y compuestos de ensayo en tampón de unión 1 x (SeaBlock al 20 %, 0,17 x PBS, Tween20 al 0,05 %, DTT 6 mM). Los compuestos de ensayo se prepararon como preparaciones madre 40x en DMSO al 100 % y se diluyeron directamente en el ensayo. Todas las reacciones se realizaron en placas de polipropileno de 384 pocillos en un volumen final de 0,04 ml. Las placas de ensayo se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora y las perlas de afinidad se lavaron con tampón (1xPBS, Tween 20 al 0,05%). A continuación, las perlas se resuspendieron en tampón de elución (1xPBS, Tween 20 al 0,05 %, ligando de afinidad no biotinilado 0,5 gM) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. La concentración de quinasa en los eluatos se midió por qPCR.
No hubo una interacción significativa entre los compuestos y las quinasas a 100 nM. Los resultados se resumen en la Tabla 41.
Tabla 41: Tabla de puntuaciones de selectividad
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Preparación de Compuestos Representativos de la Invención
Por conveniencia, muchos restos químicos se representan mediante abreviaturas bien conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, metilo (Me), etilo (Et), n-propilo (nPr), isopropilo (iPr), n-butilo (nBu), terc- butilo (tBu), n-hexilo (nHex), ciclohexilo (cHex), fenilo (Ph), metoxi (MeO), etoxi (EtO), trimetilsililo (TMS), terc-butiloxicarbonilo (Boc) y acetilo (Ac).
Por conveniencia, muchos compuestos químicos se representan mediante abreviaturas bien conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, metanol (MeOH), etanol (EtOH), éter dietílico (Et2O), acetato de etilo (EtOAc), trietilamina (TEA), diclorometano (cloruro de metileno, DCM, CH2Cl2), ácido trifluoroacético (TFA), trifluoroetanol (TFE), dimetilformamida (DMF), sulfato de sodio (Na2SO4), tetrahidrofurano (THF), ácido meta-cloroperoxibenzoico (mCPBA), sal sódica de hexametildisilazano (NaHMDS), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU), hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,W',N-bis(tetrametileno)uronio (HBTu ), dimetilsulfóxido (DMSO), sulfato de magnesio (MgSO4), hidrógenocarbonato de sodio (NaHCOa), terc-butanol (t-BuOH), sal hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDCl.HCl), fluoruro de tetra-n-butilamonio (TBAF), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), terc-butildimetilsililo (TBDMS), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), trans-diclorobis(trifenilfosfina)paladio(II) (PdCl2(PPh3)2), tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (Pd(PPh3)4) tris(dibencilidenacetona) dipaladio(0) (Pd2(dba)3), tetrafluoroborato de tri-t-butilfosfonio (t-Bu3PH.BF4), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (Xantphos), trifenilfosfina (PPh3), azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD), clorocromato de piridinio (PCC), dimetilsulfuro de borano (BMS), isopropóxido de titanio (TiOiPr4), triacetoxiborohidruro de sodio (NaBH(OAc)3), cianoborohidruro de sodio (NaBHa(CN)), borohidruro de sodio (NaBHU), cloruro de amonio (NH4CI), cloroformo (CHCI3), dióxido de manganeso (MnÜ2), carbonato de potasio (K2CO3), 1,2-dicloroetano (DCE), azida de sodio (NaN3), nitrito de sodio (NaNÜ2) dicarbonato de di-terc-butilo (Boc2Ü) y S-Acetamidometilo (Acm).
La síntesis general de compuestos de Fórmula (I) se resume en el Esquema 1 a continuación:
Esquema 1: Síntesis general Je compuestos de Fórmula (I)
Compuestos de Anclaje ---------------> Compuestos Centrales de Anclaje --------^
p e]. p e]. C H TC A {Z ,)i,
TCAíZiÍG,
PYRlZvh
Grupos ácidos/aniónicos -------------- > Compuesto de la invención
p e ] D -A s jH N H C H iS O iU h . p.ej. M D ÍS 5 (M W 1S52J
D*Cyfl“ (I>Cya)é-ÜEI. ?K2 P Y R fZ ^ - ID -
D-Aspí D-Cya)-D-Asp(D-Cy a)-D- Asp(N I IC íh S O iH ^J :.
Asp(Cya)*OI I MD345 (MW22ÜII
PK 2 TC A (Znfe-[ D-Cva ji -OH.
MD34S (MW1Q82)
C KTC A(. Z(, J: - D- As pf D-Cya) ■-D ■ Asp
l(D-Cya )-D-Asp(D-Cya }-OI 1
Ejemplo 10: Preparación de N-Boc-1,9-diaminononano
Se disolvió 1,9-diaminononano (1 g, 6,329 mmoles) en una mezcla de 50 ml de etanol y 50 ml de agua, luego se añadió di-f-butildicarbonato (1,38 g, 6,329 mmoles) a R.T. La mezcla completa se agitó a R.T. durante 16 horas para producir una suspensión blanca. Esta suspensión se retiró por filtración. El sólido era di-Boc-1,9-diaminononano 488 mg (1,36 mmoles, 21,53 % rend.) después de secado al aire. El filtrado se extrajo con diclorometano (150 ml, 100 ml). La capa acuosa que contenía 1,9-diaminononano sin reaccionar (289 mg, 1,83 mmoles) se puede reciclar en el siguiente lote de preparación. Los extractos orgánicos se combinaron y lavaron con 50 ml de agua, luego se agitaron con 10 g de Na2SO4 anhidro a R.T. durante la noche. La suspensión orgánica se filtró. El filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para proporcionar N-Boc-1,9-diaminononano 809 mg (49,5 % rend.) como un sólido incoloro. MS 295 (M+1).
Ejemplo 11: Preparación del Compuesfo de Anclaje Zn’
La síntesis se detalla en el Esquema 2 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos y referencias de etapas sintéticas se relacionan con el Esquema 2.
Etapa A) Se agitaron ácido siálico (1) (5 g, 16,18 mmoles) y resina Dowex 50 x 8 (H+) (10 g) en metanol anhidro (400 ml) a 60-62 °C durante 48 horas. La mezcla se retiró por filtración. El filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para proporcionar el Compuesto (2) como un sólido blanco 4,5 g (13,25 mmoles, 82,5 % rend.). MS 338 (M+1).
Etapa B) Se agitó el compuesto (2) (4 g, 11,87 mmoles) con anhídrido acético (40 ml, d 1,08, PM 102,29, 423 mmoles) y ácido sulfúrico (2 ml). A continuación, la mezcla se agitó a 32-35 °C durante 72 horas en un baño de aceite. La mezcla de reacción se añadió gota a gota a una mezcla en agitación de Na2CO3 (51 g) en agua (280 mL) y acetato de etilo (14 mL) en un baño de hielo. Posteriormente, la mezcla se agitó durante 1,5 h más en un baño de hielo y posteriormente se extrajo con acetato de etilo (400 ml, 270 ml). Los extractos de acetato de etilo se combinaron y lavaron con una solución de NaHCO3 al 10 % (270 ml x 2), solución saturada de NaCl (270 ml x 2), se secó sobre Na2SO4 anhidro durante la noche. Se retiró por filtración, el filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para proporcionar el compuesto (3) 4,78 g (11,57 mmoles, 97,5% rend.). MS 414 (M+1). El residuo aceitoso se convirtió en un sólido blanquecino después del almacenamiento en un desecador sobre P2O5 durante 3 días.
Etapa C) Se disolvió el compuesto (3) (3,47 g, 8,4 mmoles) en ferc-BuOH (25 ml). A esta solución se añadió azidotrimetilsilano (1,81 ml, 13,63 mmoles). La mezcla completa se agitó a 80-82 °C bajo argón durante 24 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (100 ml), luego se agitó con 0,9 g de NaNO2 en 25 mL de agua y se ajustó a pH 2 con HCl 5N durante un período de 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de dos fases se separó, la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (50 ml). Los extractos orgánicos se combinaron y lavaron sucesivamente con agua (25 mL x 2), solución de NaHCO3 al 6 % (25 mL), agua (25 mL x 3), luego se secó sobre Na2SO4. El filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para proporcionar el Compuesto (4) 3,17 g (6,95 mmoles, 82,7% rend.) como una sustancia oleosa. MS 457(M+1), 479(M+Na), 925(2M+Na).
Etapa D) Se disolvió el compuesto (4) (3,15 g, 6,91 mmoles) en metanol (100 ml) y tolueno (70 ml). La solución se puso al vacío para eliminar el aire (oxígeno), luego se rellenó con argón. A esta mezcla se le añadió Pd/C (al 10 %) (616 mg), luego se puso al vacío para evacuar el argón que posteriormente se reemplazó con hidrógeno (H2). La hidrogenación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2 horas y el catalizador se retiró posteriormente por filtración. El filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para proporcionar el compuesto (5) 2,82 g (6,55 mmoles, 94,7 % rend.) como un sólido blanquecino. MS 431 (M+1).
Etapa E) Se disolvió el compuesto (5) (2,80 g, 6,51 mmoles) en acetonitrilo anhidro (15 ml). A esta solución se añadió N,N'-Di-Boc-1H-pirazol-1-carboxamidina [Bis(Boc)PCH] (3,03 g, 9,76 mmoles). La mezcla completa se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante 40 horas. La mezcla de reacción se evaporó al vacío hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de etilo (4 mL), luego se diluyó con hexano (4 mL), se aplicó en cromatografía en columna ultrarrápida, se lavó con hexano (150 mL), luego con disolvente (acetato de etilo:hexano 1:1) (150 mL), finalmente se eluyó con disolvente (acetato de etilo:hexano 1:1) La evaporación al vacío de las fracciones recogidas dio el producto Compuesto (6), 3,23 g (4,8 mmoles, 73,7 % rend.) como un sólido blanco. MS 673 (M+1).
Etapa F) Se disolvió el compuesto (6) (2,8715 g, 4,273 mmoles) en metanol anhidro (22 ml). A esta solución se añadió NaOCH3 (4,9134 mg, 0,2136 mmoles) bajo argón. La mezcla completa se agitó bajo argón a R.T. durante 2,5 h, luego se ajustó a pH 6,5 con resina Dowex50 x 8 (H+), que posteriormente se retiró por filtración. El filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para proporcionar el compuesto (7) 2,2024 g (4,0337 mmoles, 94,4 % rend.) como un sólido blanco. MS 547 (M+1).
Etapa G) Se disolvió el compuesto (7) (2 g, 3,66 mmoles) en acetonitrilo anhidro. A esta solución se añadió 1,1'-carbonildiimidazol (714 mg, 4,403 mmoles). La mezcla completa se agitó bajo argón a 20-30 °C durante 18 horas. Se evaporó al vacío hasta sequedad, luego el residuo se sometió a cromatografía en columna ultrarrápida, primero se lavó con hexano (150 mL), luego se reveló con disolvente (acetato de etilo:hexano 2:1). Las fracciones con un valor Rf de 0,5 (acetato de etilo:hexano 2:1) se combinaron y se evaporaron al vacío hasta sequedad para proporcionar el Compuesto (8) 1,35 g (2,36 mmoles, 64,5 % rend.) como un sólido blanco. MS 573 (M+1).
Etapa H) Se disolvió el compuesto (8) (1,3 g, 2,27 mmoles) en piridina anhidra (12,5 ml). A esta solución se añadieron cloroformato de p-nitrofenilo (503,3 mg, 2,497 mmoles), 4-dimetilamino-piridina (808,5 mg, 6,62 mmoles). La mezcla completa se agitó a 30 °C bajo argón durante 7 horas. A esta mezcla de reacción se añadió una solución de N-Boc-1,9-diaminononano (690 mg, 2,67 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (166 mg, 1,36 mmoles) en piridina anhidra (4 ml). La mezcla de reacción se agitó bajo argón a 30 °C durante 16 horas, luego se evaporó al vacío para eliminar la piridina. El residuo se repartió entre acetato de etilo (300 ml) y agua (50 ml) que contenía 2,45 ml de HCl 5 N, se lavó sucesivamente con agua (50 ml x 2), solución de NaHCO3 al 2 % (50 mL x 6), agua (50 mL x 2), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró. El filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para dar 2,25 g de una sustancia oleosa. Se sometió a cromatografía en columna ultrarrápida (acetato de etilo:hexano 1,5:1 como eluyente). Las fracciones (a un valor Rf de 0,27 en TLC, acetato de etilo:hexano 1,5:1 como disolvente de revelado) se combinaron y se evaporaron al vacío hasta sequedad para proporcionar el compuesto (9) 1,057 g (1,234 mmoles, 54,4 % rend.) como un sólido blanco. MS 857(M+1), 879(M+Na). 1RMN-H (DMSO-ds) 5(ppm) 11,42 (1H, s, guanidina NHBoc), 8,25 (1H, d, NH-4), 7,95 (1H, d, AcNH), 7,16 (1H, t, OCONH), 6,75 (1H, t, nonil NHBoc), 5,80 (1H, s, H-3), 4,92 (2H, m,H-7, H-8), 4,75 (1H, m, H-4), 4,31-4,62 (4H, m, H-5, H-6, H-9, H-9'), 3,74 (3H, s, COOCH3), 2,90 (4H, m, NHCH2(CH2)/ CH2NH), 1,86 (3H, s, NHCOCH3), 1,49 (9H, s, Boc), 1,38 (18H, s, Boc), 1,2-1,6 (14H, m, NHCH2(CH2)/ CH2NH).
Etapa I) Se disolvió el compuesto (9) (1 g, 1,168 mmoles) en una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA) (36 ml) y éter metilfenílico (Anisol) (3,9 ml) en diclorometano (CH2CD (36 ml). La mezcla completa se agitó a 25 °C durante 2 horas y 40 minutos, luego se evaporó al vacío a 35 °C durante 2 horas. El residuo se agitó en hexano (100 ml) a R.T. durante la noche, se decantó el hexano y se añadió hexano fresco (60 ml), y se continuó agitando durante 4 horas a R.T. A continuación, se eliminó el hexano. El residuo se disolvió en CH2CL (10 ml) y se evaporó hasta sequedad a 35-40 °C. El residuo se disolvió en agua (25 ml). La solución acuosa se liofilizó para proporcionar el compuesto (10) 1,026 g (1,143 mmoles, 97,8 % rend.) como una espuma blanca de sal TFAaZn'. m S 557 (M+1) [PM de Zn' = 556, TFAaZn' = 898].
Figure imgf000081_0001
La síntesis se detalla en el Esquema 3 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 3.
A una solución de dianhídrido piromelítico (11) (27,25 mg, 0,125 mmoles) en DMF anhidro (2 ml) se añadieron Zn' (10) (224,5 mg. 0,25 mmoles) y diisopropiletilamina (DIPEA) (130,64 gl, 0,75 mmoles) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción completa se dejó en agitación bajo argón a 25 °C durante 36 horas, luego se trató con éter:éter de petróleo 1:1 (100 ml). El precipitado se filtró, se lavó con éter y se secó al aire para proporcionar un sólido blanquecino (197 mg), que luego se sometió a separación y purificación por HPLC.
HPLC Analítica: gradiente pepl
Columna: columna Gemini C18 100A 5 |um 150 x 3,00 mm. Longitud de onda: 220/280 nm. Caudal: 0,7 ml/min. Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1 %. Disolvente B = Acetonitrilo al 100%. Temperatura: 30 °C. Gradiente: 0­ 50 % B, 15 minutos. Tiempo de retención: PK1 PYR(Zn')2 (12) a 14,35 minutos, PK2PYR(Zn')2 (13) a 14,53 minutos.
HPLC Preparativa:
Columna: Columna Water Xterra C18 prep MS 19 x 50 mm, 5 |um. Longitud de onda: 220/280 nm. Caudal: 8 ml/min. Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1 %. Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %. Temperatura: 30 °C. Gradiente: 10-100 % B, 80 minutos. Se recogieron fracciones puras de PK1PYR(Zn)2 y PK2PYR(Zn)2 (13) y se liofilizaron por separado para producir PK1PYR (Zn)2 (12) 49 mg y PK2PYR(Zn)2 (13) 42 mg, respectivamente.
PK1PYR(Zn')2 (12) MS indicó ESI vo 10V 1.331,5 ion. 1RMN-H (D2O) 5 (ppm): 8,00 (2H, s, para aromático H x 2), 6,00 (2H, d, H-3 x 2), 5,20-5,50 (4H, m, H-7 x 2, H-8 x 2), 4,35-4,90 (8H, m, H-4 x 2, H-5 x 2, H-6 x 2, H-9 x 2), 4,15 (2H, dd, H-9' x 2), 3,80 (6H, s, COOCH3 x 2), 3,25-3,45 (4H, m, OCONHCH2 x 2), 2,90-3,20 (4H, m, NHCH2 x 2), 1,95 (6H, s, CH3C0 x 2), 1,20-1,70 (28H, m, (CH2)7 x 2).
PK2PYR(Zn')2 (13) MS indicó ESI vo 10V 1.331,5 ion. 1RMN-H (D2O) 5 (ppm) 8,35 (1H, s, aromático H x 1), 7,50 (1H, s, aromático H x 1), 6,00 (2H, d, H-3 x 2), 5,20-5,50 (4H, m, H-7 x 2, H-8 x 2), 4,35-4,90 (8H, m, H-4 x 2, H-5 x 2, H-6 x 2, H-9 x 2), 4,15 (2H, dd, H-9' x 2), 3,80 (6H, s, COOCH3 x 2),3.25-3.45 (4H, m, OCONHCH2 x 2), 2,90-3,20 (4H, m, NHCH2 x 2), 1,95 (6H, CH3CO x 2), 1,20-1,70 (28H, m, (CH2V x 2).
Esquema 3: Preparación de Compuestos Centrales de Anclaje P Y R (X i ,')j
Figure imgf000082_0001
Ejemplo 13: Preparación de Grupo Ácido/Aniónico D-Asp (NHCH2SÜ3H)2
La síntesis se detalla en el Esquema 4 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 4.
Se disolvieron ácido boc-D-aspártico (14) (233 mg, 1 mmol) y HBTU [hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N,N-bis(tetrametileno)uronio] (758 mg, 2 mmoles) en DMF (10 ml). A esta solución se añadió DIPEA (diisopropiletilamina) (349 gl, 2 mmoles). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se combinó con una solución de aminometanosulfonato de sodio (332 mg, 2,5 mmoles) en DMF (3 ml). La solución resultante se dejó con agitación a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío para proporcionar un sólido de color naranja pálido. Se disolvió en agua (20 ml), se lavó con acetato de etilo (20 ml x 3), la fase acuosa se evaporó al vacío para eliminar el disolvente orgánico, luego se liofilizó para producir el producto crudo (15) 310 mg como un sólido blanco que se sometido a separación y purificación por HPLC.
HPLC Analítica: gradiente pepl
Columna: columna Gemini C18 100A 5 gm 150 x 30 min. Longitud de onda: 220 nm. Caudal: 0,7 ml/min. Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1 %. Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %. Temperatura: 30 °C. Gradiente: 0-50 % B, 15 minutos. Tiempo de retención: Compuesto (15) como ácido libre a 4,669 minutos MS ESI -vo 418(M-1), pico de disolvente a 1,658 minutos, ácido aminometanosulfónico a 2,722 minutos, sustancia HBTU a 5,520 minutos, mono Boc-D-Asp-NHCH2SO3 H a 5,802 minutos.
HPLC Preparativa
Columna: columna Germini AXIA C18, 5 gm 50 x 21,2 mm Longitud de onda: 220 min. Caudal: 8 ml/min; Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1 %. Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Temperatura: 30 °C. Gradiente: 0-100 % B, 100 minutos.
Se recogieron las fracciones que contenían (15) y se combinaron entre sí, luego se liofilizaron para proporcionar el producto puro (15) como ácido libre. MS ESl-vo 418 (M-1). Se disolvió el compuesto (15) como ácido libre (200 mg, 0,477 mmoles) en ácido trifluoroacético (10 ml) que contenía Anisol (1 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante una hora y luego se evaporó al vacío hasta sequedad. El residuo se trituró en éter (20 ml x 2) y se retiró por filtración. El sólido se secó al aire, luego se redisolvió en agua, se liofilizó para proporcionar 106 mg del producto (16) como un sólido blanco. MS ESl-vo 318 (M-1). El producto se disolvió en agua (10 ml), luego se neutralizó con dos equivalentes de hidróxido de sodio, se secó por liofilización para dar la sal disódica de (16) como un sólido blanco.
Figure imgf000083_0001
La síntesis se detalla en el Esquema 5 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 5.
A una solución de PK2PYR(Zn)2 (13) (30 mg, 22,56 gmoles) en DMF seco (5 ml) se añadieron HATU [hexafluorofosfato de O-(7-Aza benzotriazol-1-il)-W,W,W',W'-bis(tetrametileno)uronio] (17,14 mg, 45,11 gmoles) y DIPEA (7,9 gl, 45,31 gmoles). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió sal disódica de (16) [D-Asp(NHCH2SO3Na)2] (33 mg, 91,16 gmoles) en DMF (5 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, luego se sometió a separación y purificación por HPLC.
HPLC Analítica: gradiente pep 1
Columna: columna Gemini C18 100A 5 gm 150 x 3,00 mm; Longitud de onda: 220/280 nm; Caudal: 0,7 ml/min; Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Temperatura: 30 °C; Gradiente: 0­ 50 % B, 15 minutos; Tiempo de retención: El producto (17) como ácido libre a 14,270 minutos. MS ESI vo 30V 967,5, MS ESI -vo, -25v 965,4. Los otros picos fueron los siguientes: el material de partida PK2PYR(Zn) (13) a 11,7 minutos, PK2PYR(Zn')2-D-Asp(NHCH2SO3H)2 a 13,6 minutos.
HPLC Preparativa
Columna: columna Water Xterra prep MS C18 19 x 50 mm 5 gm; Longitud de onda: 220/280 nm; Caudal: 8ml/min; Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Temperatura: 30 °C; Gradiente: 0­ 100 % B 100 minutos
El producto eluye en perfil inverso a Gemini analítico. Perfil de elución entre acetonitrilo al 25-35 %. Las fracciones muestreadas y los tubos con una pureza superior al 90 % se agruparon y el resto del material se separó en la columna Gemini AXIA.
El producto (17) se liofilizó para proporcionar un polvo blanco esponjoso. MS ESI -vo -25v 965,4, indicado el PM de 1.932. Se disolvió el compuesto (17) PK2 PYR(Zn)2[D-Asp(NHCH2SO3H2]2 (8 mg, 4,14 gmoles) en una solución acuosa de metanol al 50 % (2 ml), luego se añadió trietilamina (40 gl, 287,5 gmoles). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente. La reacción se controló mediante HPLC analítica para determinar el pico a los 10,848 minutos. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se acidificó con ácido acético (60 gl, 1.049 gmoles) y se diluyó hasta 10 ml con agua. La solución se purificó en la columna Kinetex. Las fracciones puras se combinaron y se liofilizaron para producir el producto (18) p K2 PYR(Zn)2[D-Asp(NHCH2SO3H)2]26mg como polvo blanco.
Tiempo de retención de HPLC 10,695 min. MS ESI -vo -30V 925,6.
Para eliminar el residuo de TFA en el compuesto, el material puro se disolvió en 60 ml de HCl 4 mM y se liofilizó, luego se disolvió en 60 ml de HCl 1 mM y se liofilizó, finalmente se liofilizó de 60 ml de agua. Rendimiento 5,6 mg (18) MD185 PM1.852.
Esquema 5: Preparación del Compuesto MDIKs, PK2PY k (am) 2 |<D-
V s p K N H C H ’SO .i)’ ) ’
Figure imgf000084_0001
Ejemplo 15: Preparación de Compuestos de Anclaje Zo•
La síntesis se detalla en el Esquema 6 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos y referencias de etapas sintéticas se relacionan con el Esquema 6.
De acuerdo con el procedimiento (H) e (I) descritos en el Ejemplo 11, la reacción del compuesto (8 ) con cloroformato de p-nitrofenilo, luego con N-Boc-1,8-diaminooctano, después de la cromatografía, proporcionó el compuesto (19) como un blanco sólido MS 843 (M+1) El compuesto (19) se trató con ácido trifluoroacético (TFA), después del procesamiento para dar el compuesto (20) Zo' como una espuma blanca de sal TFA3Z0' MS 543 (M+1) [PM de Zo' = 542, TFA3Z0' = 884].
Figure imgf000085_0001
La síntesis se detalla en el Esquema 7 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 7.
A una solución de TCA (21) (3,085 mg, 17,52 gmoles) en DMF (309 gl) se añadieron HATU (13,32 mg, 35,03 gmoles) y DIPEA (6,5 gl, 37,32 gmoles). La mezcla completa se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió gota a gota una solución de Zo', (20) (30,97 mg, 35,03 gmoles) y DIPEA (18,44 gl, 105,9 gmoles) en DMF (600 gl). La mezcla de reacción se dejó con agitación durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla resultante se sometió a separación y purificación por HPLC.
HPLC Analítica: gradiente pepl
Columna: Phenomenex C185 gl 110A 150 x 3 mm Longitud de onda: 220/280 nm; Caudal: 0,7 ml/min; Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Temperatura: 30 °C; Gradiente: 100-50 %B 15 minutos Tiempo de retención: PK1 TCA(Zo)2 (22) 11,100 min y PK2 TCA(Zo)2 (23) 11,156 mín.
PK1 TCA(Zo)2 (22) 1RMN-H (D2O) ppm a 2,5 ppm (AB simétrico dd, 4H, CaH2= CbH2) indicada su estructura simétrica. MS 1.225,4 (PM 1.224).
PK2 TCA(Zo')2 (23) 1RMN-H (D2O) 5 ppm a 2,35-2,75 ppm (asimétrico, dd, 4H, (CaH2 ^CbH2) indicada su estructura asimétrica. MS 1.225,4 (PM 1.224).
HPLC preparativa
La solución se acidificó con una pequeña cantidad de ácido acético 1 M y se diluyó hasta 25 ml en agua. Esto se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm y se bombeó en una columna Water Xterra prep MS C18 de 19 x 50 mm al 20 % al 80 % de tampón A. Caudal 8 ml/min gradiente 0-100 % B 100 minutos, longitud de onda 210/280 nm. Perfil de Elución Vacío DMF/DIPEA/HATU
El PK1 TCA(Zo)2 y PK2 TCA(Zo)2 se purificaron adicionalmente y se separaron en la columna Phenomenex Gemini 5 gm C18 110A Axia de 50 x 21,2 mm en tampón TFA al 0,1 %.
La relación PK1/PK2 es de aproximadamente 1:2, ambos MS ESI 30 V 1.225,4.
Figure imgf000086_0001
La síntesis se detalla en el Esquema 8 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 8.
Como se detalla en el Esquema 8, se aplicó la síntesis en fase sólida para preparar [D-Cys-SH]7-OH (33), luego la oxidación de la policisteína (33) proporcionó [D-CyaSO3H]7-OH (34).
Se disolvió Fmoc-D-Cys(Trt)-OH (24) (2,93 g, 5 mmoles) en diclorometano seco (DCM) (35 ml) en un tubo Falcon de 50 ml, luego se añadió resina de cloruro de 2-clorotritilo (25) (5 g), se agitó vigorosamente, se añadió diisopropiletilamina (DIPEA) (3,5 ml, 20 mmoles). Después de 5 min, se añadió otra porción de DIPEA (1,3 ml, 7,5 mmoles). La mezcla completa se agitó durante 4 horas más. Para rematar cualquier resto de cloruro de 2-clorotritilo reactivo, se añadió metanol (4 ml). La mezcla se agitó durante 30 minutos más. La resina se lavó sucesivamente con DMF (20 ml x 3), DCM (20 ml x 3), metanol (20 ml x 3), luego se secó al vacío durante la noche. El rendimiento indicó una carga de 0,57 mM/g (26).
Para eliminar el grupo Fmoc de la resina, la resina (26) se hinchó previamente en DCM (35 ml), luego se añadió piperidina al 50 % en DMF (30 ml). La mezcla completa se puso en un rotador durante 30 minutos. Esto se repitió con una solución fresca de piperidina al 50 % en DMF (30 ml) durante 60 minutos. A continuación, la resina se lavó sucesivamente con DMF (20 ml x 2), DCM (20 ml x 2), DMF (20 ml x 3). Se presentó un ensayo de ninhidrina positivo. La resina (27) estaba lista para el acoplamiento.
A una solución de Fmoc-D-Cys(Trt)-OH (24) (1.758 mg, 3 mmoles) en DMF (6 ml) se añadieron HBTU [hexafluorofosfato de O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N'-N'-bis(tetrametileno)uronio] (1.140 mg, 3 mmoles) y DIPEA (523 pl, 3 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se añadió resina (27) (2,5 g, 0,57 mM/g, 1,5 mmoles). La mezcla de reacción se dejó agitar durante 24 horas. Con el ensayo de ninhidrina negativo, la resina se lavó con DMF (20 ml x 3), luego se trató con anhídrido acético al 5 %, DIPEA al 1 % en DMF (20 ml) durante 30 minutos. A continuación, la resina (28) se lavó con DMF (20 ml x 3), DCM (20 ml x 3), metanol (20 ml x 3). La resina (28) se hinchó previamente en DCM y se añadió piperidina al 30 %/N-metilpirrolidona en DMF (20 ml). La mezcla completa se puso en un rotador durante 30 minutos, luego con solución fresca de piperidina al 30 % y N-metilpirrolidona durante 60 minutos más, después se lavó con DMF (20 ml x 2), DCM (20 ml x 2), DMF (20 ml x 2) para producir la resina (29).
La resina (29) se acopló adicionalmente durante 24 horas con (24) (1.758 mg, 3 mmoles) en DMF (6 ml) preactivado durante 10 minutos con HBTU (1.140 mg, 3 mmoles) y DIPEA (523 pl, 3 mmoles), después del procesamiento para obtener la resina (30). La mitad de la cual se sometió entonces al procedimiento: desprotegida por piperidina/metilpirrolidona, reacoplada con (24) preactivada con HBTU/DIPEA, para repetir este procedimiento 4 veces para producir resina (31).
La resina (31) se lavó con DCM (20 ml x 5), luego se puso en un tubo Falcon de 50 ml, se añadió ácido acético al 40 % en DCM (35 ml), se agitó en un rotador a temperatura ambiente durante 6 horas. La suspensión de resina se filtró, el filtrado se evaporó al vacío hasta una espuma de color amarillo pálido. El residuo se lavó con agua (100 ml x 3), después se secó para producir un sólido blanco (32) [D-Cys(Trt)]7-OH.
Se agitó (32) en una solución de TFA (20 ml), triisopropilsilano (1 ml) y agua (0,5 ml) durante 3 horas. La suspensión resultante se filtró. El filtrado se evaporó hasta una sustancia oleosa que luego se trituró con éter (20 ml x 4) para dar un sólido blanco. Se agitó en una solución acuosa de acetonitrilo al 50 % (100 ml). El material se sonicó para formar una suspensión blanca, que se liofilizó para obtener un producto bruto de (33) [D-Cys-SH]7-OH (380 mg).
HPLC analítica
Columna: Phenomenex Gemini 5 pm C18 110A 150 x 3,00 mm Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1 %, Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %, Caudal: 0,7 ml/min, Longitud de onda: 210/280 nm, Temperatura: 30 °C, Gradiente: 0-50 % B 15 minutos, Tiempo de retención: 9,356 minutos.
Cono MS 25V Pico principal 740 Cono -25V Pico principal 738 El PM indicado de (33) es 739 [D-Cys-SH]7-OH
Se añadió el compuesto (33) (10 mg, 13,53 pmoles) a una solución de ácido perfórmico (1 ml) preenfriada en un baño de hielo y sal. La mezcla completa se agitó en un baño de hielo durante 1 hora, luego se diluyó con 100 ml de agua fría, se liofilizó para proporcionar una forma de color amarillo pálido (34). Este material se purificó en una columna Phenomenex Kinetex 5 pm XB-C18 100A utilizando TFA isocrático al 0,1 % como eluyente para proporcionar el compuesto (34) [D-Cyst-So3H]7-OH PM 1.075, Cono MS 50V 1.076 (M+1) como un polvo incoloro.:
El ácido perfórmico se preparó mezclando ácido fórmico (8,74 ml), agua (0,96 ml) y peróxido de hidrógeno al 30 % (1 ml), y dejando reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos en un matraz tapado. Este peróxido debe estar recién hecho antes de su uso.
Esquema 8: Preparación de Grupo Ácido/Aniónico tD-Cyst-SO&ítlTOH
Figure imgf000088_0002
resina
FnnooO-Cys(Trt)-OH
m Trt=Tritil&l Ph=Fenrlo Ph C t=2-C I oro f e ni fo
Figure imgf000088_0003
Figure imgf000088_0004
? o
Iresinal
Figure imgf000088_0001
T
(29 ) Iresmal
(30 )
Figure imgf000089_0001
La síntesis se detalla en el Esquema 9 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 9.
A una solución de PK2 TCA(Zo)2 (23) (4 mg, 3,268 gmoles) en DMF anhidro (2 ml) se añadieron HATU (1,242 mg, 3,268 gmoles) y DIPEA al 2 % en DMF (30 gl, 3,44 gmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se combinó con una solución de (34), [D-Cyst-SÜ3H]7-OH (7,03 mg, 6,54 gmoles) y DIPEA (9,11 gl, 52,32 gmoles), en DMF (3 ml). La mezcla de reacción completa se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se diluyó hasta 15 ml con agua/metanol 1/1, luego se sometió a separación y purificación por HPLC.
HPLC Preparativa:
Columna: Phenomenex Kinetex 5 gm XB-C18 50 x 21,2 mm; Longitud de onda: 220/280 nm; Caudal: 8 ml/min; Disolvente A = Ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Temperatura: 30 °C; Gradiente: 0-100 % B, 80 minutos. Las fracciones que contenían (35) ácido libre (B=H) se combinaron y se liofilizaron para proporcionar compuesto (35) ácido libre (B=H) 4 mg en forma de un polvo blanco. MS ESI vo Cono 35V 1.142,1 2 ion.
Se disolvió el compuesto (35) ácido libre (B=H), PK2 TCA(Zü')2-[D-Cyst-SO3H]7-OH (4 mg, 1,754 pmoles) en solución acuosa de metanol al 50 % (800 gl) que contenía trietilamina (TEA) (20 |ul, 146 gmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente y se controló por HPLC. Se procesó después de 3 horas. La solución se purificó en la columna Kinetex. Las fracciones puras con un tiempo de retención de 11,254 min se combinaron y se liofilizaron para proporcionar compuesto (36) 2 mg como un polvo blanco. MS ESI vo Cono 40V 1.102,22 ion.
Para eliminar el residuo de TFA del compuesto, se disolvió el compuesto (36) en HCl 4 mM (30 ml) y se liofilizó. Luego se disolvió en HCl 1 mM (30 ml) y se liofilizó. Finalmente, se liofilizó de agua (30 ml) para obtener el producto (36) 1,1 mg, MD345 PK2 TCA(Z0)2[D-Cyst-SOaH]7-OH PM2.201 [MS 2.202 (M+1)].
Esquema 9: Preparación del Compuesto MD345, PK2 TCA(Zol2-|I)-Cyst-SOiH|7-OH MW2201
Ejemplo 19: Preparación del Compuesto de anclaje Z
La síntesis se detalla en el Esquema 10 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos y referencias de etapas sintéticas se relacionan con el Esquema 10.
De acuerdo con el procedimiento (H) e (I) descritos en el Ejemplo 11, la reacción del compuesto (8) con cloroformato de p-nitrofenilo, luego con N-Boc-1,6-diaminohexano, después de la cromatografía, para producir el compuesto (37) como un sólido blanco, MS 815 (M+1). El compuesto (37) se trató con ácido trifluoroacético (TFA) y anisol, después del procesamiento para dar el compuesto (38) Z como una forma blanca de sal de TFA. MS 515 (M+1). [PM de Z = 514, TFAaZ' = 856].
Esquema 10: Preparación del Compuesto de anclaje Z'
Figure imgf000091_0001
1.38) T
Ejemplo 20: Preparación del Compuesto central de anclaje CHTCA(Z ’)2
La síntesis se detalla en el Esquema 11 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 11.
A una solución de CHTCA (39) (4,4 mg, 20 gmoles) en DMF (300 gl) se añadió HATU (15,2 mg, 40 gmoles) y DIPEA (7,4 gl, 42,4 gmoles). La mezcla completa se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió gota a gota una solución de Z' (38) (34,24 mg, 40 gmoles) y DlPEA (21,06 gl, 120,9 gmoles) en DMF (700 gl). La mezcla de reacción se dejó con agitación durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla resultante se diluyó con HAc 1 M (50 gl) y agua (25 ml). Esto se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm. El filtrado se sometió a separación y purificación por HPLC.
Columna: columna Water Xterra prep MS C18 19 x 50 mm; Longitud de onda: 210/280 nm; Caudal: 8 ml/min, Disolvente A = TFA al 0,1 % Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Temperatura: 30 °C; Gradiente: 0-100 % B 100 minutos; Perfil de Elución Vacío DMF/DIPEA/HATU.
Las fracciones que contenían el compuesto (40) se purificaron adicionalmente en la columna Phenomenex Gemini 5 gm C18 110A AXIA 50 x 21,2 mm en tampón TFA al 0,1 %. La fracción se liofilizó para producir el compuesto (40) CHTCA(Z')2 , 15 mg como una espuma blanca. MS ESI vo, 30v, 1.209 indicó el PM de 1.208.
E s q u e m a 11: P re p a ra c ió n de l C o m p u e s to c e n tra l d e a n c la je (_ H r t i ( Z rh
a
(
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000092_0002
CHTCAfZ),
Ejemplo 20: Preparación del Compuesto de anclaje S6
La síntesis se detalla en el Esquema 12 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos y referencias de etapas sintéticas se relacionan con el Esquema 12.
Etapa A) El compuesto (1) se agitó en metanol anhidro (100 ml) a temperatura ambiente durante 48 horas, la mezcla se retiró por filtración. El filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para producir el compuesto (41), 1,25 g (6,037 mmoles, 93 % Rend.) como un sólido blanco. MS 324 (M+1).
Etapa B) El compuesto (41) (1,95 g, 6,037 mmoles) se agitó en cloruro de acetilo (20 ml, 281 mmoles) a temperatura ambiente durante 3 días, luego se evaporó al vacío hasta sequedad para producir el compuesto (42) 3,06 g (6,01 mmoles, 99 % Rend.). MS 510,5 (M+1).
Etapa C) El residuo (42) (3,06 g, 6,01 mmoles) se agitó en diclorometano (DCM) (35 ml), luego se añadió KSAc (3,57 g, 31,26 mmoles). La mezcla de reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante 40 horas, se diluyó con diclorometano (50 ml) y luego se repartió entre diclorometano y agua (50 ml). La capa orgánica se lavó con una solución de NaCl al 5 % (22 ml x 2) y se secó sobre Na2SO4 anhidro durante la noche, se retiró por filtración. El filtrado se evaporó a sequedad para producir (43) 2,93 g (5,34 mmol, 88,8 % Rend.) como una espuma blanquecina. MS 550 (M+1).
Etapa D) Se agitaron el compuesto (43) (200 mg, 0,364 mmoles) y bromuro de boc-aminohexano (107,4 mg, 0,385 mmoles) en DMF (2 ml), a la que se añadió dietilamina (0,81 ml, 7,83 mmoles). La mezcla completa se agitó bajo argón a 25 °C durante 2,5 horas. La mezcla de reacción se repartió entre acetato de etilo (EA) (80 ml) y solución saturada de NaCl. La capa orgánica se lavó con solución saturada de NaCl (15 ml x 3), agua (10 ml x 3). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 , filtrado, el filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad. El residuo se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (Tolueno:Acetona = 2:1). Las fracciones que contenían el compuesto (44) se combinaron y se evaporaron al vacío hasta sequedad para proporcionar el compuesto (44) 98 mg (0,139 mmoles, 38 % Rend.) como una espuma blanca. MS 706 (M+1).
Etapa E) Se disolvió el compuesto (44) (95 mg, 0,135 mmoles) en metanol anhidro (1 ml). A esta solución se le añadió metóxido de sodio (0,16 mg, 6,94 gmoles) bajo argón, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas y luego se ajustó con resina Dowex 50 x 8(H+) a pH 6,0-6,5, se retiró por filtración. El filtrado se evaporó al vacío hasta sequedad para proporcionar el compuesto (45) 71 mg (0,132 mmoles, 97,9 % Rend.) como una espuma blanca. MS 538(M+1)
Etapa F) El compuesto (45) (60 mg, 0,109 mmoles) se agitó bajo argón en NaOH 0,2 N (2 ml, 0,4 mmoles) a temperatura ambiente durante 2,5 horas. La solución se ajustó a pH 3-4 con resina Dowex50 x 8(H+) y se retiró por filtración. El filtrado se liofilizó para proporcionar el compuesto (46) 56 mg (0,107 mmoles, 98 % Rend.) como una espuma blanca. MS 524 (M+1).
Etapa G) Se disolvió el compuesto (46) (50 mg, 0,0956 mmoles) en una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA) (2 ml, 25,96 mmoles) y metilfeniléter (anisol) (0,2 ml, 1,84 mmoles) en diclorometano (2 ml). La mezcla completa se agitó a 25 °C durante 2,5 horas, luego se evaporó al vacío a 35 °C durante 2 horas. El residuo se lavó en hexano (10 ml x 2) a temperatura ambiente durante la noche y el hexano se decantó. El residuo se agitó en éter (10 ml x 2) a temperatura ambiente y luego se eliminó el éter. El residuo se disolvió en agua (1 ml) y se liofilizó para producir el compuesto (47), como una espuma blanca de sal S6^TFA, 51 mg (0,0949 mmoles, 99 % Rend.). MS 424(M+I) [El PM de S6 = 423, sal S6^TFA = 537].
Esquema 12: Preparación del Compuesto de anclaje Sr.
Figure imgf000093_0001
Ejemplo 21: Preparación del Compuesto MD012, CHTCA(Z)2 (S6)
La síntesis se detalla en el Esquema 13 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos y referencias de etapas sintéticas se relacionan con el Esquema 13.
A una solución de CHTCA(Z' )2 (40) (4 mg, 3,3 gmoles) en DMF (100 gl) se añadió HATU (1,254 mg, 3,3 gmoles) y DIPEA (0,6 gl, 3,44 gmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió una solución de sal S6^TFA (47) (1,8 mg, 3,35 gmoles) y DIPEA (1,20 gl, 6,89 gmoles) en DMF (100 gl). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla resultante se diluyó con HAc 1 M (5 gl) y agua (2 ml), luego se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm. El filtrado se sometió a separación y purificación por HPLC.
Columna: Phenomenex Gemini AXIA 5 gm, C18110A 50 x 21,2 mm; Longitud de onda: 210/280 nm; Caudal: 8 ml/min; Disolvente A= Ácido trifluoroacético al 0,1% en agua Milliq; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Gradiente: 0-100 % B, 100 minutos, lineal; Temperatura: 30 °C.
Las fracciones que contenían el compuesto (48) se recogieron y se liofilizaron para producir el compuesto (48) CHTCA(Z')2(S6) 2,4 mg, como una espuma blanca. MS ESI 30v 1,615 PM indicado de 1.614.
El compuesto (48) (2,4 mg, 1,486 gmoles) se agitó en solución acuosa de metanol al 50 % (90 gl) que contenía trietilamina (6,6 gl) a temperatura ambiente durante 5 horas, luego se evaporó al vacío hasta sequedad. El residuo se volvió a disolver en agua (100 gl), se liofilizó para dar el producto (49) CHTCA(Z)2(S6), 2 mg (1,303 mmoles, 87,7 % Rend.) como una espuma blanca. MS ESI 30v 1.535,7, indicado el PM de 1.534,7
E s q u e m a 13: P re p a ra c ió n de l C o m p u e s to MD012, C H T C A ( Z > i( f e )
Figure imgf000095_0001
Ejemplo 22: Preparación del Compuesto central de anclaje CHTCA(Zo)2
La síntesis se detalla en el Esquema 14 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 14.
La preparación del compuesto de anclaje (20) Z0' se detalla en el Ejemplo 15. El compuesto central de anclaje (50) CHTCA(Zü)2 se preparó de acuerdo con el procedimiento detallado en el Ejemplo 20. El compuesto central de anclaje (50) CHTc A(Zü' )2 se obtuvo como un sólido blanco. MS ESI vo, 30v 1.265 indicó el PM de 1.264
E s q u e m a 14: P re p a ra c ió n de l C o m p u e s to c e n tra l d e a n c la je C H T C A fZ s j i
Figure imgf000096_0001
(20) Z„-acido c¡3-1 ,3 ,5-cklohe)tano-tr¡carboj(il¡co
(CHTCA)
Figure imgf000096_0002
CHTCA{Zs,)j
Ejemplo 23: Preparación de Grupo Ácido/Amónico D-Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya)-OH
La síntesis se detalla en el Esquema 15 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos (A) a (I) y referencias de etapas sintéticas se relacionan con el Esquema 15.
Se disolvió el éster metílico de Boc-D-cisteína (Acm), [Boc-D-Cys(Acm)-OMe] (1,532 g, 5 mmoles) en ácido trifluoroacético (TFA) (10 ml) que contenía anisol (1 ml), y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, la mezcla de reacción se evaporó al vacío para eliminar el TFA y proporcionar una sustancia oleosa, que se trituró en éter (100 ml x 2), luego se volvió a disolver en una solución acuosa de acetonitrilo al 20 % (100 ml) y se liofilizó durante 72 horas para dar el compuesto. TFA^D-Cys(Acm)-OMe, 1,60 g. La HPLC/MS indicó el PM de 206,35 (como base libre).
Se activó el Fmoc-D-aspártico-a-ácido-p-O-t-butil éster, [Fmoc-D-Asp-Obut], (1,646 g, 4 mmoles) con HBTU (PM 379,25) (1,517 g, 4 mmoles) y DIPEA (PM 129,25) (0,517 g, 4 mmoles) en DMf (20 ml) a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se combinó con una solución de TFA^D-Cys(Acm)-OMe (1,47 g, 4,2 mmoles) y DIPEA (0,542 g, 4,2 mmoles) en DMF (10 ml). La mezcla de reacción completa se dejó con agitación durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción se controló por HPLC. La mezcla se evaporó al vacío para eliminar la DMF. Luego, se añadió agua (5 x 70 ml) al residuo para eliminar por lavado el DMF residual y D-Cys(Acm)OMe para dar un sólido blanquecino, que luego se secó al vacío para producir el compuesto (A), Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-O-But como un sólido blanco. La HPLC/MS indicó un PM de 599,7.
El compuesto (A) (1,2 g, 2 mmoles) se trató con piperidina al 20 % en acetonitrilo (20 ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se retiró por filtración. El filtrado se evaporó al vacío para producir el compuesto (B), D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut. La HPLC/MS indicó un PM de 377,4.
El compuesto (A) (599,7 mg, 1 mmol) se trató con TFA (6 ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se evaporó al vacío hasta sequedad. El residuo se trituró en éter (50 ml x 3), luego se disolvió en una solución acuosa de acetonitrilo al 30 % (100 ml) y se liofilizó para producir el compuesto (C), Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH como un sólido blanco. La HPLC/MS indicó un PM de 542,7.
El compuesto (C), Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH (434 mg, 0,8 mmoles) se activó con HBTU (303,4 mg, 0,8 mmoles) y DIPEA (103,4 mg, 0,8 mmoles) en DMF (8 ml) a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió el compuesto (B), D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut (9.332 mg, 0,88 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El DMF se evaporó al vacío y el DMF residual se eliminó lavando cuidadosamente con agua el material sólido blanco. Luego, el sólido blanco se secó al vacío durante 24 horas para producir el compuesto (D), Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut, como un sólido blanco. La HPLC/MS indicó el Pm de 902,19. El compuesto (D) se trató con t Fa (16 ml) a temperatura ambiente durante 1 hora para eliminar el éster t-butílico. El TFA se evaporó al vacío hasta sequedad. El residuo se lavó con agua para eliminar el TFA residual y el sólido se secó al vacío durante 72 horas para producir Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH. La HPLC/MS indicó el PM de 846.
Se activó Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH (423 mg, 0,5 mmoles) con HBTU (189,5 mg, 0,5 mmoles) y DIPEA (64,63 mg, 0,5 mmoles) en DMF (5 ml) a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió el compuesto (B), D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut (317 mg, 0,84 mmoles). La mezcla completa se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La reacción se comprobó mediante HPLC para determinar la compleción, y el DMF se eliminó al vacío. El sólido blanco obtenido se lavó cuidadosamente con agua fría y luego se secó al vacío durante 48 horas para producir el Compuesto (E), Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut, PM 1.206, que se purificó adicionalmente por HPLC.
La HPLC analítica de este material indicó una pureza del 70 %. El material se disolvió en metanol/agua al 50 % y se filtró a través de un filtro de 0,2 gm para HPLC preparativa.
HPLC Preparativa
Columna: columna Waters Xterra C18 5 gm 19 x 50 mm en lotes de 40 mg; Longitud de onda: 220/280nm; Caudal: 8ml/min; Disolvente A = Ácido trifluoroacético al 0,1%; Disolvente B = Acetonitrilo al 100%; Gradiente: 10-100 % B, 100 minutos; Temperatura: 30 °C.
A continuación, se trató el compuesto (E), Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OBut con TFA (10 ml) durante 1 hora a temperatura ambiente y se evaporó al vacío hasta sequedad. El residuo se disolvió en solución acuosa de acetonitrilo al 40 % (100 ml) y se liofilizó para producir el compuesto (F), Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-0H, como un sólido blanco. La HPLC/MS indicó el PM de 1.150,27.
Se trató el compuesto (F), Fmoc-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OMe]-OH (200 mg, 0,1738 mmoles) con piperidina al 20 % en acetonitrilo (10 ml) durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente y posteriormente se retiró por filtración. El filtrado se evaporó al vacío. El residuo se agitó en agua/metanol al 50 % (20 ml) que contenía trietilamina (500 gl) a temperatura ambiente durante 6 horas, se controló mediante HPLC para indicar la compleción de la reacción. Esta mezcla se evaporó al vacío hasta sequedad para producir el compuesto (G), D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-OH. La HPLC/MS indicó el PM de 885,9.
La HPLC analítica indicó una pureza del 50 %.
El compuesto (G) se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa.
Columna: columna de HPLC C18 Phenomenex Gemini Axia 110A 5 gm 50 x 21,2 mm Longitud de onda: 210/280 nm; Caudal: 8 ml/min; Disolvente A = TFA al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100%; Gradiente: 0-100 % B, 100 minutos; Temperatura: 30 °C
La muestra (100 mg) se disolvió en una solución acuosa de metanol al 10 %, se sonicó y se filtró a través de un filtro de 0,2 gm. Se bombearon 20 mg/lotes a la columna con un proceso de gradiente. Las fracciones se controlaron mediante RF-HPLC analítica utilizando una columna Phenomenex Gemini C18 de 5 gm. Caudal 0,7 ml/min; Longitud de onda 210/280nm; Gradiente 0-50 % B 15 minutos; Disolvente A = TFA al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %.
Las fracciones con la MS correcta superior al 90 % de pureza se agruparon y se liofilizaron para proporcionar el compuesto (G) purificado.
Se disolvió el compuesto (G), D-Asp [D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp-[D-Cys(Acm)-OH]-D-Asp[D-Cys(Acm)-OH]-OH, (21,8 mg, 0,0246 mmoles) en TFA (10 ml) que contenía anisol (200 gl), luego se añadió trifluorometanosulfonato de plata (504 mg, 1,96 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, se evaporó al vacío hasta sequedad. El residuo se trituró en éter (40 ml x 2), los lavados de éter se decantaron. El residuo se agitó en ácido acético 1 M (20 ml) que contenía ditiotreitol (403 mg, 2,62 mmoles) a 25 °C durante 3 horas. La suspensión se centrifugó en tubos falcon de 50 ml durante 10 minutos a 4.000 rpm. El sobrenadante se recogió cuidadosamente, luego se purificó por HPLC y se liofilizó para producir el compuesto (H), D-Asp(D-Cys-SH,-OH)-D-Asp(D-Cys-SH,-OH)-D- Asp(D-Cys-SH,-OH)-OH, la HPLC/MS indicó el PM de 672,3.
Una mezcla de ácido fórmico al 95 % (7,36 ml), H2O2 al 30 % (0,8 ml) y H2O (0,368 ml) se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego se agitó en un baño de hielo a -5 °C, al que se le añadió el compuesto (H) (8 mg, 0,0119 mmoles) y se agitó durante 1 hora, luego al vacío. durante 10 minutos. A continuación, la solución restante se diluyó con agua hasta 200 ml y se liofilizó para obtener el compuesto (I) 9,5 mg, D-Asp[D-Cya-SO3H,-OH]-D-Asp[D-Cya-SO3H,-OH]-D-Asp[D-Cya-SO3H,-OH]-0H como un sólido blanco, la HPLC/MS indicó el PM de 816,78.
Este compuesto se purificó por desalinización en las siguientes condiciones.
Columna: columna de HPLC C18 Phenomenex Gemini Axia 110A de 5 gm, 50 x 21,2 mm; Longitud de onda: 210/280nm; Caudal: 8 ml/min; Disolvente A = TFA al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Gradiente: 0-100 % B, 100 minutos Temperatura: 30 °C. El compuesto (I) eluye cerca del vacío.
A continuación, este material se liofilizó para producir un polvo blanco como compuesto (I) puro. El compuesto (I) se neutralizó con trietilamina (TEA) para formar una sal de TEA (51) como sigue:
Figure imgf000098_0001
B =b aseta l com o TEA
(Si)
* HBTU: Hexafluorofosfato de O-1H-Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametil-uranio PM379,24
TFA: Ácido trifluoroacético PM114,02
DIPEA: Diisopropiletilamina PM 129,25
TEA; Trietilamina PM 101,19
Acm: S-Acetamidometilo como grupo protector de tio
OBut: Éster t-butílico
E s q u e m a 15: P re p a ra c ió n de G ru p o A c id o /A n ió n ic e D - A s p C D - C j^ ^ D - A s p íD -O V J it l -D -AsiKu-t ystj-OH
Fmoc -
Figure imgf000099_0001
)
FmúoD-Asp-OBut
D-CysfAFnn} (Al
pipenda OMe
Figure imgf000099_0003
Figure imgf000099_0002
D-Asp-OBut Fmoc -D-Asp-OH
D-Cys(Apm) (qj
D-Cys(Aím) (B)
OMe
OMe
Figure imgf000099_0004
Figure imgf000100_0001
Ejemplo 24: Preparación del Compuesto MD348, CHTCA(Zo)2 -[D-Asp(D-Cyst)-D-Asp(D-Cyst)-D-Asp(D-Cyst)]-OH
La síntesis se detalla en el Esquema 16 a continuación. Los siguientes números de referencia de compuestos se relacionan con el Esquema 16.
Se agitó el compuesto (50), CHTCA(Zo)2 del Ejemplo 22 (10,744 mg, 8,5 gmoles) con HATU (3,23 mg, 8,5 gmoles) y DIPEA (1,496 gl, 8,56 gmoles) en DMF (5 ml) a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se combinó con el compuesto (51), D-Asp(D-Cya-SO3B,-OB)-D-Asp-(D-Cya-SO3B,-OB)-D-Asp(D-Cya-SO3B,-OB)-OB, del Ejemplo 23 (13,2 mg, 8,67 gmoles) en DMF (5 ml). La mezcla completa se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla resultante se controló mediante HPLC/MS analítica en el tiempo de retención Pico 1, 12,903 min. 44 % MS ESI vo, 20v 1.032,3 2+ion, ESI -vo, -40v 1.030,72+ion, indicó el PM de 2.062 como compuesto (52) sin base, es decir, CHTCA(Zü)2[D-Asp(D-Cya-SO3H,-OH)-D-Asp(D-Cya-SO3H,-OH)-D-Asp-(D-Cyst-SO3H,-OH)]-OH.
HPLC Analítica:
Columna: Phenomenex Kinetex EVO 5 pm C18100A 150 x 4,6 mm; Longitud de onda: 210/280nm; Caudal: 0,7 ml/min; Disolvente A = TFA al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Gradiente: 0-50 % B, 15 minutos, lineal; Temperatura: 30 °C.
La mezcla resultante se acidificó con ácido cítrico, se diluyó hasta 20 ml con agua y se filtró a través de un filtro de 0,2 pm, luego se sometió a HPLC preparativa para la separación y purificación.
HPLC Preparativa
Columna: Phenomenex Gemini AXIA 5 pm C18110A 50 x 21,2 mm; Longitud de onda: 210/280 nm; Caudal: 8 ml/min; Disolvente A = TFA al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Gradiente: 0-100 % B, 100 minutos, lineal; Temperatura: 30 °C.
El pico principal con un tiempo de retención de 31,087 min fue el producto (52). Las fracciones que contenían el producto se recogieron y se volvieron a purificar mediante HPLC adicional como sigue.
Columna: Phenomenex Kinetex x B 5 pm C18 100A 50 x 21,2 mm; Longitud de onda: 210/280nm; Caudal: 8 ml/min; Disolvente A = TFA al 0,1 %; Disolvente B = Acetonitrilo al 100 %; Gradiente: 5 %-100 %B, 80 min, lineal; Temperatura 30 °C.
El compuesto purificado (52) con un tiempo de retención de 19,597 min se separó completamente del material de partida con un tiempo de retención de 21,714 min.
El compuesto (52) (3,5 mg, 1,697 pmoles) se disolvió en metanol al 50 %/agua (5 ml) que contenía trietilamina (TEA) (18 pl, 129 pmoles). Se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La HPLC indicó que la reacción no se había completado, por lo que se añadieron 11 pl adicionales de TEA. La mezcla se agitó durante otros 60 minutos y luego la HPLC indicó la compleción de la reacción. A continuación, la solución de reacción se neutralizó a pH 6 con ácido acético 1M. A continuación, la solución se diluyó hasta 20 ml con agua. La mezcla se sometió a HPLC.
HPLC Analítica
Columna: Phenomenex Kinetex Evo 5 pm C18 100A 150 x 3 mm; Longitud de onda: 210/280nm Caudal: 0,7 ml/min; Disolvente A = tampón NaHPO420 mM pH 7,0; Disolvente B = tampón NaHPO410 mM pH 7,0 Acetonitrilo al 50 %; Gradiente: 0-100 % B, 30 minutos, lineal; Temperatura: 30 °C
HPLC Preparativa
Columna: Phenomenex Kinetex XB 5 pm C18 100A 50 x 21,2 mm; Longitud de onda: 210/280nm Caudal: 8ml/min; Disolvente A = TFA al 0,1 % Disolvente B = Acetonitrilo al 100 % Gradiente: 0-100 % B, 80 min, lineal; Temperatura: 30 °C.
El producto (53) se eluyó con un tiempo de retención de 16,431 min.
Las fracciones puras se combinaron y se liofilizaron, luego se usó intercambio de HCl para eliminar el TFA residual. La liofilización proporcionó el producto (53) CHTCA(Z0)2[D-Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya)-D-Asp(D-Cya)-OH con una pureza > 99 % como un sólido blanco MS ESI cono -20v, 990,52+ ion indicó el PM de 1.982.
E s q u e m a 16: a c ió n de l C o m p u e s to M D 348 , Í ’ H T C A ( / « | j * f n - A s | iU > - C y s l ) - [ )
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Claims (16)

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. Un compuesto de Fórmula (I):
Figure imgf000105_0001
o una de sus sales, solvatos, ésteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables, en donde:
A en cada aparición es un grupo de anclaje seleccionado del grupo que consiste en zanamivir, laninamivir, oseltamivir, peramivir y ácidos 2,3-difluorosiálicos o un dominio de unión de anticuerpo que se une específicamente a la neuraminidasa;
B es un grupo central multivalente seleccionado del grupo que consiste en propano-1,2,3-tricarboxilato, prop-1-eno-1,2,3-tricarboxilato, ciclopropano-1,2,3-tricarboxilato, ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato, benceno-1,3,5-tricarboxilato, tetracarboxilato de metano, tetracarboxilato de 1,2,3,4-butano, etileno-1,1,2,2-tetracarboxilato, ciclohexano-1,2,4,5-tetracarboxilato y benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato;
C en cada aparición es un grupo aniónico de fórmula VIII:
Figure imgf000105_0002
en donde
R4 en cada aparición se selecciona independientemente del grupo que consiste en - COOH, -SO3H, -NHCH2SO3H, -CONH-Cya, -CONH-Asp, -CONH-Asp(-NHCH2SO3H)w, y -CONH-Asp(-NHCH2PO3H)w, en donde w es un número entero 1 o 2;
R5 se selecciona del grupo que consiste en -OH y -NHCH2SO3H
u es un número entero de 0 a 3;
t es un número entero de 0 a 3;
r es un número entero de 0 a 6;
v es un número entero de 1 a 12;
L1 y L2 en cada aparición son conectores divalentes;
n es 2 o 3; y
p es un número entero de 1 a 3.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el grupo de anclaje se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo (Ab) o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo de cadena única (scFV) y un anticuerpo de dominio único (dAb).
3. El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde L1 y L2 en cada aparición se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno C1-C12, -C(O)-NR-, -O-C(O)O-NR-, -C=N-O-, -C=N-NR-, -SO2-NR-, disulfuro, -C(O)-NR-(CH2)x-NR-, -(CH2)x-NR-, -(CH2)x-(O-(CH2)y-)z-, -C=N-O-, -C=N-NR-alquileno, sulfonamida de alquileno, un disulfuro de alquileno, en donde R es independientemente H o alquilo C1-C6 alquilo y en donde x, y y z son cada uno números enteros seleccionados independientemente de 0, 1,2, 3 y 4.
4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde B se selecciona del grupo que consiste en propano-1,2,3-tricarboxilato, ciclohexano-1,3,5-tricarboxilato y benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato.
5. El compuesto de la reivindicación 1 seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000107_0001
Figure imgf000108_0001
Figure imgf000109_0001
Figure imgf000110_0001
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000112_0001
Figure imgf000113_0001
Figure imgf000114_0001
Figure imgf000115_0001
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000117_0001
en donde:
Zo es
Figure imgf000117_0002
Z es
Figure imgf000117_0003
Zn es
Figure imgf000118_0001
o una de sus sales, solvatos, ásteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables.
6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde A es zanamivir.
7. El compuesto de la reivindicación 1, en donde B es benceno-1,2,4,5-tetracarboxilato.
8. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R4 en cada aparición es COOH.
9. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R5 es -OH.
10. El compuesto de la reivindicación 1, en donde L2 en cada aparición, es un enlace.
11. El compuesto de la reivindicación 1, en donde [A-L1] en cada aparición, está representado por un grupo de fórmula Zx que tiene la estructura:
Figure imgf000118_0002
en donde x es un número entero de 0-12.
12. Un compuesto de la reivindicación 1 que es:
Figure imgf000119_0001
en donde
Zn es
Figure imgf000119_0002
o una de sus sales, solvatos, ésteres o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables.
13. El compuesto de la reivindicación 12, en donde el compuesto es un éster farmacéuticamente aceptable derivado de ácido carboxílico.
14. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en el tratamiento o la prevención de infecciones virales de influenza seleccionadas de influenza A, influenza B, gripe aviar o una cepa de influenza resistente a fármacos.
16. Un compuesto para el uso de la reivindicación 15, en donde la infección es una infección del tracto respiratorio o una infección sistémica.
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