CN108220370A - 褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括：提取、酶解、复配，将干燥褐藻粉经液氮、水浴冻融，然后经超声破碎、离心后制得褐藻蛋白质粉，将褐藻蛋白粉经木瓜蛋白酶酶解并超滤后得到褐藻蛋白酶酶解肽，将褐藻蛋白酶酶解肽与氯化亚铁震荡合成后制得得到褐藻蛋白酶解肽复配物。有益效果为：褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。

Description

褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法
技术领域
本发明涉及褐藻肽复配物领域，尤其是涉及褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法。
技术背景
褐藻门(Phaeophyta)成员，一群较高级的藻类，约1500种，分布大陆沿岸的冷水水体，淡水中罕见。其颜色取决於褐色素（墨角藻黄素）与绿色素（叶绿素）的比例，从暗褐到橄榄绿。充气的气囊使叶状体的光合部分浮於或接近水表。
褐藻没有单细胞，全为多细胞植物，最简单的是由单列细胞组成的分枝丝状体，如外子藻目（Ectocarpales）；进化的种类，有类似根、茎、叶的分化，有的甚至具有气囊构造，如海带目（Laminariales）可协助藻体漂浮在海面上，内部组织则有表皮、皮层及髓部之分化，体型普遍较为粗大，可长至60多公尺长，大量繁殖时形成海洋森林或藻海，吸引无数海洋生物汇集，带来丰富的海洋资源。褐藻中除海带、鹿角菜外，昆布(Ecklonia hornem)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、羊栖菜(Sargassum fusiforme)等均可食用和药用；马尾藻属(Sargassum)植物可作饲料或肥料。此外，还可从马尾藻等褐藻中提取褐藻胶、甘露醇、碘、氯化钾、褐藻淀粉等食品或医药工业原料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，本制备方法简单易行，褐藻蛋白质酶解效率、褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高，易于被机体吸收。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括：提取、酶解、复配，具体包括以下步骤：
提取：取经喷雾干燥获得的褐藻粉20-30份均匀悬浮在160-200份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、25-30℃水浴法冻融5-6次，再用暂停1-2秒、超声2-4秒的超声波破碎3-5分钟，超声频率为30-35kHz、超声密度为0.40-0.50W/cm2，在2-4℃下以6000-8000r/min的速率离心30-45分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；反复冻融多次后，细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎，后经超声波破碎，褐藻细胞中的蛋白质会游离出来；
酶解：在120-150份底物浓度为2-3%的褐藻蛋白液中加入终浓度为2.0-2.2mmol/L的乙二胺四乙酸、5.0-6.0mmol/L的 L-半胱氨酸、0.3-0.5mol/L的氯化钠、0.3-0.5mmol/L的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、4000-5000U/g的木瓜蛋白酶，在温度为55-60℃、pH为6.8-7.0的条件下水解2-3小时；将水解液在2-4℃、6000-7000r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于木瓜蛋白酶的金属原子活性中心，能够降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大蛋白酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，褐藻蛋白质的酶解率可达75%以上，褐藻蛋白酶解肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性，同时具有较高的降血压、降血脂活性，在功能保健和医药制剂方面具有潜在的发展前景；
复配：将褐藻蛋白酶解肽复溶成22-25%的肽液，调节pH值至7.5-7.8，取80-100份肽液，加入100-120份1.2-1.5mol/L的FeCl2溶液，再加入5-8mg的抗坏血酸，在25-28℃温度下震荡合成30-45分钟，将合成液于2-4℃温度下以8000-8500r/min转速离心浓缩20-45分钟，取上清液于旋转蒸发器38-40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物；褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于木瓜蛋白酶的金属原子活性中心，能够降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大蛋白酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，褐藻蛋白质的酶解率可达75%以上；2）褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括以下步骤：
1）取经喷雾干燥获得的褐藻粉20份均匀悬浮在160份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、25℃水浴法冻融5次，再用暂停1秒、超声2秒的超声波破碎3分钟，超声频率为30kHz、超声密度为0.40W/cm2，在2℃下以6000r/min的速率离心30分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；2）在120份底物浓度为2%的褐藻蛋白液中加入终浓度为2.0mmol/L的乙二胺四乙酸、5.0mmol/L的 L-半胱氨酸、0.3mol/L的氯化钠、0.3mmol/L的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、4000U/g的木瓜蛋白酶，在温度为55℃、pH为6.8的条件下水解2小时；将水解液在2℃、6000r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；3）将褐藻蛋白酶解肽复溶成22%的肽液，调节pH值至7.5，取80份肽液，加入100份1.2mol/L的FeCl2溶液，再加入5mg的抗坏血酸，在25℃温度下震荡合成30分钟，于2℃温度下以8000r/min转速离心浓缩20分钟，取上清液于旋转蒸发器38℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物。
实施例2：
褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括以下步骤：
1）提取：取经喷雾干燥获得的褐藻粉30份均匀悬浮在200份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、30℃水浴法冻融6次，再用暂停2秒、超声4秒的超声波破碎5分钟，超声频率为35kHz、超声密度为0.50W/cm2，在4℃下以8000r/min的速率离心45分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；反复冻融多次后，细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎，后经超声波破碎，褐藻细胞中的蛋白质会游离出来；
2）酶解：在150份底物浓度为3%的褐藻蛋白液中加入终浓度为2.2mmol/L的乙二胺四乙酸、6.0mmol/L的 L-半胱氨酸、0.5mol/L的氯化钠、0.5mmol/L的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、5000U/g的木瓜蛋白酶，在温度为60℃、pH为7.0的条件下水解3小时；将水解液在4℃、7000r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于木瓜蛋白酶的金属原子活性中心，能够降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大蛋白酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，褐藻蛋白质的酶解率可达75%以上，褐藻蛋白酶解肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性，同时具有较高的降血压、降血脂活性，在功能保健和医药制剂方面具有潜在的发展前景；
3）复配：将褐藻蛋白酶解肽复溶成25%的肽液，调节pH值至7.8，取100份肽液，加入120份1.5mol/L的FeCl2溶液，再加入8mg的抗坏血酸，在28℃温度下震荡合成45分钟，于4℃温度下以8500r/min转速离心浓缩45分钟，取上清液于旋转蒸发器40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物；褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。
实施例3：
褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括：提取、酶解、复配，具体包括以下步骤：
提取：取经喷雾干燥获得的褐藻粉30份均匀悬浮在200份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、26℃水浴法冻融6次，再用暂停2秒、超声3秒的超声波破碎4分钟，超声频率为32kHz、超声密度为0.45W/cm2，在3℃下以6500r/min的速率离心35分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；反复冻融多次后，细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎，后经超声波破碎，褐藻细胞中的蛋白质会游离出来；
酶解：在130份底物浓度为2.2%的褐藻蛋白液中加入终浓度为2.1mmol/L的乙二胺四乙酸、5.5mmol/L的 L-半胱氨酸、0.4mol/L的氯化钠、0.4mmol/L的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、4500U/g的木瓜蛋白酶，在温度为58℃、pH为6.8的条件下水解2.5小时；将水解液在3℃、6800r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于木瓜蛋白酶的金属原子活性中心，能够降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大蛋白酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，褐藻蛋白质的酶解率可达75%以上，褐藻蛋白酶解肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性，同时具有较高的降血压、降血脂活性，在功能保健和医药制剂方面具有潜在的发展前景；
复配：将褐藻蛋白酶解肽复溶成24%的肽液，调节pH值至7.6，取90份肽液，加入100份1.4mol/L的FeCl2溶液，再加入7mg的抗坏血酸，在26℃温度下震荡合成45分钟，于2℃温度下以8000r/min转速离心浓缩30分钟，取上清液于旋转蒸发器38℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物；褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括：
提取：取经喷雾干燥获得的褐藻粉20-30份均匀悬浮在160-200份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、25-30℃水浴法冻融5-6次，超声波破碎后在2-4℃下以6000-8000r/min的速率离心30-45分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；
酶解：在120-150份底物浓度为2-3%的褐藻蛋白液中加入乙二胺四乙酸、L-半胱氨酸、氯化钠、（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、木瓜蛋白酶酶解；将酶解液在2-4℃、6000-7000r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；
复配：将褐藻蛋白酶解肽复溶成22-25%的肽液，调节pH值至7.5-7.8，取80-100份肽液，加入FeCl2溶液、抗坏血酸震荡合成，将合成液于2-4℃温度下以8000-8500r/min转速离心浓缩20-45分钟，取上清液于旋转蒸发器38-40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物。
2.根据权利要求1所述的褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，其特征在于：所述提取步骤中，超声波破碎时间为3-5分钟，超声波破碎方式为暂停1-2秒、超声2-4秒。
3.根据权利要求1所述的褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，其特征在于：所述提取步骤中，超声频率为30-35kHz、超声密度为0.40-0.50W/cm2。
4.根据权利要求1所述的褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤中，褐藻蛋白液中的乙二胺四乙酸添加量为2.0-2.2mmol/L，L-半胱氨酸为5.0-6.0mmol/L，氯化钠为0.3-0.5mol/L，（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛为0.3-0.5mmol/L，木瓜蛋白酶为4000-5000U/g。
5.根据权利要求1所述的褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤中，酶解温度为55-60℃，酶解pH为6.8-7.0，酶解时间为2-3小时。
6.根据权利要求1所述的褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，其特征在于：所述复配步骤中FeCl2溶液的浓度为1.2-1.5mol/L，添加重量份为100-120，抗坏血酸的添加量为5-8mg。
7.根据权利要求1所述的褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，其特征在于：所述复配步骤中，震荡合成的温度为25-28℃，合成时间为30-45分钟。
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