CN108207791A - 新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法，该方法包括初级产道菌液的制备、接种用产道菌液的制备、产道菌群的移植新生仔猪、初级粪菌液的制备、接种用肠道菌液的制备及肠道菌液移植新生仔猪。本发明能够迅速建立新生仔猪肠道正常健康微生态环境，刺激新生仔猪免疫系统的发育，有效预防仔猪腹泻的发生，可以将仔猪腹泻的发病率控制在3％以内，并能有效抑制肠道内致病性病原微生物的生长繁殖，高效、彻底的防治仔猪腹泻的发生；同时早期建立肠道正常健康的菌群可以促进新生的肠道生长发育及功能发挥，缩短哺乳期，可以使新生仔猪的断奶从以前的28日龄提前到21日龄或更早，实习仔猪的早期断奶。

Description

新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法

技术领域

本发明涉及畜牧兽医技术领域，特别涉及一种新生仔猪肠道正常健康功 能菌群早期建立方法。

背景技术

仔猪肠道中存在着大量的微生物，包括细菌和真核微生物等，其中细菌 数量高达一千多种，主要是厌氧细菌。据以往研究报道，猪肠道中低GC含量 的革兰氏阳性细菌约占81％左右，主要是硬壁菌门、真杆菌类及亲属、梭菌 属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属和链球菌属。革兰氏阴性菌约占11.2％，主要是 拟杆菌门、噬纤维菌属。其中拟杆菌门和硬壁菌门占猪肠道细菌的90％以上。 肠道微生物的动态平衡是动物肠道健康的标志，肠道健康则是动物健康生长 的基础。众多研究表明，肠道微生物优势菌群的组成明显影响着猪体的健康，猪肠道中有益菌群的含量越高，猪只越健康。目前猪日粮中普遍使用抗生素， 特别是仔猪日粮中大多采用添加抗生素方法来预防仔猪腹泻，抗生素的使用 则增加了病原菌的耐药性，导致了生态环境污染和食品安全问题。健康动物 体内，正常微生物的定植和生态平衡对维持身体健康具有非常重要的作用， 而且据相关研究报道，动物有超过90％的疾病都是和肠道菌群失衡有关。

菌群移植是将健康动物的菌群移植到患病动物消化道内，帮助纠正失衡 的肠道菌群，重建具有正常功能的肠道微生态。目前主要是采取饲料添加益 生菌的方式或采取粪菌移植的方式来治疗动物肠道紊乱导致的功能失调。但 是对于新生幼龄动物的肠道建立还没有理想的方法。特别是有关菌群移植供 体的选择和筛检仍无统一的标准，甚至还存在诸多争议，供体的年龄、健康 评价、菌群的免疫排斥和安全性等影响还需要长期深入探讨。

传统的肠道菌群建立技术往往开始于一个月或四周龄之后，多采用饲料 添加的方式，添加的益生菌比较单一；或采用粪菌移植的方式，但操作复杂， 效率低下，影响因素较多，易受病原侵袭或发生应激反应。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立 方法，旨在防治仔猪腹泻的发生，实现仔猪的早期断奶。

为实现上述目的，本发明提出的一种新生仔猪肠道正常健康功能菌群早 期建立方法，包括如下步骤：

收集健康母猪分娩时的羊水及产道分泌物，与等体积的无菌生理盐水混 合后过滤，将滤液混合物离心收集菌体，溶于无菌生理盐水，得初级产道菌 液；

将所述初级产道菌液加入液体富集培养基中，在28-35℃条件富集培养， 进行富集培养时，先进行1-3天的静置培养，然后进行2-5天的摇床培养，得 到产道菌液；

收集健康母猪粪便，与1-10倍体积的无菌生理盐水混合制成粪水，将粪 水静置沉淀或离心收集上清液，将上清液过滤，得到初级粪菌液；

将所述初级粪菌液加入液体富集培养基中，在28-35℃条件下富集培养， 进行富集培养，进行富集培养时，先进行1-3天的静置培养，然后进行2-5天 的摇床培养，得到肠道菌液；

出生当天新生仔猪按10²cfu的接种剂量接种产道菌液，然后依次递增接 种，共接种N₁天，其中N₁∈[3，7]，每天早晚各接种一次；

将所述肠道菌液按照每两天一个剂量递增的方式接种N₂日龄仔猪,其中 N₂∈[3，7]，共接种N₃天N₃∈[10，18]。也就是出生后第N₂天的猪仔按照10²cfu 的接种剂量接种，然后每两天依次递增接种，每天早晚各接种一次，共接种 N₃天；其中，N₂＜N₁。

优选地，接种产道菌液按照10³cfu、10⁴cfu、10⁵cfu、10⁶cfu……的剂量递 增。

优选地，接种肠道菌液按照10³cfu、10⁴cfu、10⁵cfu、10⁶cfu、10⁷cfu…… 的剂量递增。

优选地，N₁＝5，N₂＝4，N₃＝12。

优选地，所述初级产道菌液由来自所接种仔猪的亲生母猪羊水及产道分 泌物，以及与其同栏至少一头母猪羊水及产道分泌物混合得到；

所述初级粪菌液由来自所接种仔猪的亲生母猪的粪便，以及与其同栏至 少一头母猪的粪便混合得到。

本发明能够迅速建立新生仔猪肠道正常健康微生态环境，刺激新生仔猪 免疫系统的发育，有效预防仔猪腹泻的发生，可以将仔猪腹泻的发病率控制 在3％以内，并能有效抑制肠道内致病性病原微生物的生长繁殖，高效、彻底 的防治仔猪腹泻的发生；同时早期建立肠道正常健康的菌群可以促进新生的 肠道生长发育及功能发挥，缩短哺乳期，可以使新生仔猪的断奶从以前的28 日龄提前到21日龄或更早，实习仔猪的早期断奶。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全 部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出一种新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法，其方法 步骤如下：

步骤一、健康母猪产道菌群移植，具体实施方案如下：

1、初级产道菌液的制备

收集健康母猪分娩时的羊水及产道分泌物，与等体积的无菌生理盐水混 合后过滤，将滤液将混合物离心收集菌体，溶于无菌生理盐水(0.9％)，即 得含有所述功能菌群的初级产道菌液。

2、接种用产道菌液的制备

将来自产道的初级菌液，加入液体富集培养基中，在28-35℃条件富集培 养，进行富集培养时，先进行1-3天的静置培养，然后进行2-5天的摇床培养。 所培养的菌液即为接种所备的产道菌液。

3、产道菌群的移植新生仔猪

将所制备的产道菌液按照逐日递增的方式接种新生仔猪，共接种N₁天， N₁∈[3，7]天(例如N₁＝4、5或6)，出生当天按10²cfu的接种剂量接种，然后 依次递增接种。当然，对于递增的梯度，可以有多种方式，例如按照首日的1 倍递增、两倍递增，或者按照首日的三倍递增。在此，优选按照10³cfu,10⁴cfu, 10⁵cfu,10⁶cfu的剂量接种，每天早晚各接种一次。需要说明的是，在此所指代 的接种是至口服接种。

步骤二、健康母猪肠道菌群移植，具体实施方案如下：

1、初级粪菌液的制备

收集健康母猪粪便，与1-10倍体积的无菌生理盐水混合制成粪水(依据母 猪粪便的干稀程度而定。对于稀的粪便，可以用1倍至5倍的生理盐水稀释， 例如3倍、4倍；对于干的粪便，可以用6-10倍的生理盐水稀释，例如7倍、8 倍)。将粪水静置沉淀或离心收集上清液，将上清液过滤，收集滤过液既得 含有所述功能菌群的初级粪菌液。

2、接种用肠道菌液的制备

将所述初级粪菌液加入液体富集培养基中，在28-35℃条件下富集培养， 进行富集培养，进行富集培养时，先进行1-3天的静置培养，然后进行2-5天的 摇床培养。所培养的菌液即为接种所备的肠道菌液。

3、肠道菌液移植新生仔猪

将所制备的产道菌液按照每两天一个剂量递增的方式接种N₂天的仔猪， N₂∈[3,7]，共接种N₃天，N₃[10,18]。接种当天按10²cfu的接种剂量接种，然后 依次递增接种。当然，对于递增的梯度，可以有多种方式，例如按照首日的1 倍递增、两倍递增，或者按照首日的三倍递增等。在此，优选按照10³cfu,10⁴cfu, 10⁵cfu,10⁶cfu的剂量接种，每天早晚各接种一次。其中，N₂＜N₁。例如，N₂＝3， N₁＝4或5；N₂＝4，N₁＝5或6；N₂＝5，N₁＝6或7等。

通过以上两步将母猪的产道菌群和肠道菌群移植到新生仔猪消化道内， 实现新生仔猪消化道正常健康功能菌群的早期建立。采用该菌群移植的方法， 可以达到防治仔猪腹泻的发生，实现仔猪的早期断奶。

效果验证，具体实施方式如下

1、选取刚分娩的杜长大三元杂交仔猪6窝，每一窝至少有十头新生仔猪， 按照平均体重相近的原则，随机将新生仔猪每两窝分为一组，共三组，其中 一组为菌群移植组，一组为非菌群移植组，一组为母乳组，其中菌群移植组 采用人工代乳粉喂养。

所有仔猪在15日龄左右开始添加同一类型的固体颗粒饲料，在21日龄统 一断奶。在整个试验期间记录腹泻发生情况，统计腹泻率，以粪便液体、不 成形、粪水分离为腹泻标准，以组为单位每天记录腹泻头数。

腹泻率计算公式为：腹泻率(％)＝试验期内每组总的腹泻头次/(每组仔 猪头数×试验天数)×100％。

同时在第21天和第60天对所有仔猪进行称重，计算平均日增重。通过腹 泻率评判早期建立新生仔猪肠道正常功能菌群防治腹泻发生的效果，通过平 均日增重评判早期断奶的效果。

表1.新生仔猪经过菌群移植后，在断奶前后生长情况及腹泻发生情况的统计表

从表1可以看出：在断奶前(1-21天)，母乳组新生仔猪的平均日增重比 菌群移植组略高，但是差异不显著，这两个组的仔猪平均日增重显著高于非 菌群移植组仔猪；菌群移植组仔猪的腹泻率比母乳组略低，但差异不显著， 这两组仔猪的腹泻率显著低于非菌群移植组仔猪。

在断奶后(22-60天)，菌群移植组仔猪的平均日增重显著高于母乳组仔 猪，母乳组仔猪平均日增重显著高于非菌群移植组，三个组之间差异显著； 菌群移植组仔猪的腹泻率显著低于母乳组，母乳组仔猪的腹泻率低于非菌群 移植组。从以上的平均日增重的结果可以看出母乳组和菌群移植组仔猪在断 奶前差异不显著，但是均高于非菌群移植组仔猪，但是在断奶后，菌群移植 组仔猪的平均日增重要高于母乳组和非菌群移植组。

以上结果表明，通过菌群移植早期建立仔猪肠道正常功能菌群，可以实 现仔猪早期断奶。从以上腹泻率的结果可以看出断奶前，给新生仔猪早期建 立肠道正常功能菌群，可以显著减少仔猪腹泻的发生，可以达到母乳组一样 的效果。而断奶后，早期建立的肠道正常功能菌群的新生仔猪的腹泻率显著 低于母乳组和非菌群移植组，起到防治仔猪腹泻的发生的效果。

所述的新生仔猪肠道正常功能菌群早期建立技术中步骤一中所述产道菌 群和肠道菌群供体猪，可以为受体仔猪的健康的亲生母猪或与其同栏非亲生 母猪。因为所选供体母猪与受体新生仔猪具有直接的血缘关系，肠道内环境 也最为接近，故受体仔猪的亲生母猪作为供体猪移植效果最好。而与受体仔 猪亲生母猪同栏的其他健康母猪与亲生母猪的产道环境和肠道环境较为接 近，也可以作为合适的移植菌群的供体母猪。相比其他方法，本发明所选供 体母猪产道和肠道内的功能菌能够快速、高效地在受体仔猪肠道内适应，并生长繁殖，早期建立受体仔猪自身的正常肠道功能菌群，达到防治腹泻，实 现仔猪早期断奶的效果。

本发明所述的利用菌群移植的技术早前建立仔猪肠道正常功能菌群的方 法中，步骤一中产道菌群的获得方法，可利用与受体仔猪的亲生母猪同栏的 其他母猪的产道菌群的混合物；步骤二中肠道菌群的获得方法，可以利用与 受体仔猪的亲生母猪同栏的其他母猪的肠道菌群混合物。采集同栏的多头供 体猪的产道分泌物或肠道粪便，混合后的功能菌群，能够增加功能菌的种类， 避免个体供体猪的菌群单一性，因此效果更加显著。

为了验证其效果，实验如下：

另外选取刚分娩的杜长大三元杂交仔猪6窝，每一窝至少有十头新生仔 猪，按照平均体重相近的原则，随机将新生仔猪每两窝分为一组，共三组， 其中一组为菌群移植组，一组为非菌群移植组，一组为母乳组，其中菌群移 植组采用人工代乳粉喂养。

与上述实验不同的是，初级产道菌液由来自所接种仔猪的亲生母猪羊水 及产道分泌物，以及与其同栏至少一头母猪羊水及产道分泌物混合得到；所 述初级粪菌液由来自所接种仔猪的亲生母猪的粪便，以及与其同栏至少一头 母猪的粪便混合得到；其他实验步骤相同。

表2.新生仔猪经过菌群移植后，在断奶前后生长情况及腹泻发生情况的统计表

从表2可以看出：在断奶前(1-21天)，菌群移植组新生仔猪的平均日增 重比母乳组略高，但是差异不显著，这两个组的仔猪平均日增重显著高于非 菌群移植组仔猪；菌群移植组仔猪的腹泻率比母乳组略低，差异比较显著， 这两组仔猪的腹泻率显著低于非菌群移植组仔猪。

在断奶后(22-60天)，菌群移植组仔猪的平均日增重显著高于母乳组仔 猪，母乳组仔猪平均日增重显著高于非菌群移植组，三个组之间差异显著； 菌群移植组仔猪的腹泻率显著低于母乳组，母乳组仔猪的腹泻率低于非菌群 移植组。从以上的平均日增重的结果可以看出母乳组和菌群移植组仔猪在断 奶前差异不显著，但是均高于非菌群移植组仔猪，但是在断奶后，菌群移植 组仔猪的平均日增重要显著高于母乳组和非菌群移植组。

本发明所述的利用菌群移植的技术早期建立仔猪肠道正常功能菌群的方 法中，步骤一和步骤二中菌群移植的方法均是采用接种剂量逐日递增的方式， 避免新生仔猪初次接种剂量过大，导致的肠道的不适，单日单次最大接种量 不应高于10⁷cfu。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围， 凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书作的等效变换，或直接/间接 运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

收集健康母猪分娩时的羊水及产道分泌物，与等体积的无菌生理盐水混合后过滤，将滤液混合物离心收集菌体，溶于无菌生理盐水，得初级产道菌液；

将所述初级产道菌液加入液体富集培养基中，在28-35℃条件富集培养，进行富集培养时，先进行1-3天的静置培养，然后进行2-5天的摇床培养，得到产道菌液；

收集健康母猪粪便，与1-10倍体积的无菌生理盐水混合制成粪水，将粪水静置沉淀或离心收集上清液，将上清液过滤，得到初级粪菌液；

将所述初级粪菌液加入液体富集培养基中，在28-35℃条件下富集培养，进行富集培养，进行富集培养时，先进行1-3天的静置培养，然后进行2-5天的摇床培养，得到肠道菌液；

出生当天新生仔猪按10²cfu的接种剂量接种产道菌液，然后依次递增接种，共接种N₁天，其中N₁∈[3,7]，每天早晚各接种一次；

将所述肠道菌液按照每两天一个剂量递增的方式接种N₂日龄仔猪,其中N₂∈[3,7]，共接种N₃天N₃∈[10,18]，出生后第N₂天的猪仔按照10²cfu的接种剂量接种，然后每两天依次递增接种，每天早晚各接种一次，共接种10-18天；其中，N₂＜N₁。

2.如权利要求1所述的新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法，其特征在于，接种产道菌液按照10³cfu、10⁴cfu、10⁵cfu、10⁶cfu……的剂量递增。

3.如权利要求1所述的新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法，其特征在于，接种肠道菌液按照10³cfu、10⁴cfu、10⁵cfu、10⁶cfu、10⁷cfu……的剂量递增。

4.如权利要求1所述的新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法，其特征在于，N₁＝5，N₂＝4，N₃＝12。

5.如权利要求1所述的新生仔猪肠道正常健康功能菌群早期建立方法，其特征在于，所述初级产道菌液由来自所接种仔猪的亲生母猪羊水及产道分泌物，以及与其同栏至少一头母猪羊水及产道分泌物混合得到；

所述初级粪菌液由来自所接种仔猪的亲生母猪的粪便，以及与其同栏至少一头母猪的粪便混合得到。