CN103333830A - 猪源粪肠球菌、微生态制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪源粪肠球菌、微生态制剂及其应用，所述猪源粪肠球菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述猪源粪肠球菌的保藏编号为CGMCC No.6970。该微生态制剂包含有所述猪源粪肠球菌。本发明所述的猪源粪肠球菌耐热、耐酸、耐碱、耐干燥、抵抗力甚强、遗传性较稳定，更无任何毒性，又能抑制常见的猪牛8种致病菌。所述微生态制剂能促进猪牛精子的活力并延长其寿命，因而净化了母畜生殖道环境，改善并维持了微生态平衡，保证了正常的生理功能，从而按期发情排卵，提高受精率和产仔数，防治母畜各种繁殖障碍疾病的应用具有重大的科学意义和很好的经济效益。

Description

猪源粪肠球菌、微生态制剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种猪源粪肠球菌、包含该猪源粪肠球菌的微生态制剂及其应用。 

背景技术

母畜繁殖障碍疾病，例如不发情、不受孕、流产、死胎、木乃伊胎、产仔数少以及产弱仔等，无论在国内或国外都普遍存在和广泛流行，造成严重的经济损失。尽管应用传统的防治方法，如大量使用抗菌药物，例如抗生素，收到了良好效果；但是由于长期使用，有时甚至滥用这类药物，因而造成疗效不升反降，生殖道出现水肿病变现象等明显的恶果，此外，不为人们注意的耐药菌株的产生，更是带来严重的后果。近年全球出现的NDM-1超级细菌正引起全人类的极大关注，因此，欧盟和美国等许多国家都已经从立法上限制了抗生素的使用。在我国，由于近几年来，不断出现食品安全的严重事件，促使人们时刻警觉，更引起政府的高度重视，采取了一系列重大措施。 

应用益生菌是很有前途的抗生素代替品，其彻底从源头上保证食品安全，提高人类和动物的免疫力和健康水平。微生态疗法正是以一种崭新的手段解决了传统疗法中存在的多种问题。粪肠球菌是人及动物肠道中正常菌群之一，能抑制一些致病菌的生长繁殖，又能减少氨气的产生，提高机体抗病能力，是益生菌之一，国内外均有研究报道，但应用于生殖系统的未见提及。 

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种粪肠球菌、包含该猪源粪肠球菌的微生态制剂及其应用。 

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案： 

一种猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，所述猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的保藏编号为CGMCC No.6970。 

本发明所述的猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是从广州市登峰种猪场健康高产的母猪生殖道粘膜和分泌物中经分离培养获得。该菌培养条件为： 

1)分离培养基的具体配方为：蛋白胨10±1g/L、牛肉浸膏10±1g/L、酵母浸膏1±0.1g/L、酵母提取粉1±0.1g/L、吐温801±0.1mL/L、磷酸氢二钾2±0.2g/L、三水合乙酸钠5±0.5g/L、柠檬酸三铵2±0.2g/L、七水硫酸镁0.2±0.02g/L、硫酸锰0.05±0.01g/L。 

2)培养温度：37℃。 

本发明猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的分子分类地位的确定。 

该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。 

测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，从数据库获得相关种属的16SrDNA序列，构建系统发育树。经过菌种的细胞形态、生理生化特征、16SrDNA基因序列、pheS基因序列等实验数据综合分析得出该菌株属于肠球菌属，粪肠球菌Enterococcus faecalis。 

本发明还提供了由上述猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)配制而成的微生态制剂。 

本发明还提供了上述微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：将所述的猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)按10-15%的接种量接种于分离培养基中，发酵培养18-22h后，再加入发酵培养物的1‰-5‰的寡糖，混合均匀，即得；所述分离培养基的配方为：蛋白胨10±1g/L、牛肉浸膏10±1g/L、酵母浸膏1±0.1g/L、酵母提取粉1±0.1g/L、吐温801±0.1mL/L、磷酸氢二钾2±0.2g/L、三水合乙 酸钠5±0.5g/L、柠檬酸三铵2±0.2g/L、七水硫酸镁0.2±0.02g/L、硫酸锰0.05±0.01g/L。 

本发明还提供了上述微生态制剂在防治母畜各种繁殖障碍疾病方面的应用。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 

1、本发明所述的猪源粪肠球菌耐热、耐酸、耐碱、耐干燥、抵抗力甚强、遗传性较稳定，更无任何毒性，又能抑制常见的猪牛8种致病菌。 

2、将本发明所述的猪源粪肠球菌接种于特制的分离培养基中而制成的一种微生态制剂应用于20万头次母猪及300多头奶牛，发现该微生态制剂能促进猪牛精子的活力并延长其寿命，因而净化了母畜生殖道环境，改善并维持了微生态平衡，保证了正常的生理功能，从而按期发情排卵，提高受精率和产仔数，对防治母畜各种繁殖障碍疾病的应用具有重大的科学意义和很好的经济效益。 

本发明菌株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)已于2012年12月10日保藏于国家知识产权局指定的位于中国科学院微生物研究所的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为No.6970。 

具体实施方式

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制 

实施例1猪源粪肠球菌的分离 

从广州市登峰种猪场健康高产的母猪生殖道粘膜和分泌物中进行细菌分离，具体分离步骤如下： 

在无菌条件下，取少量母猪子宫分泌物，加入到无菌蒸馏水中，充分震荡5min，以10倍系列稀释，从10^-1～10^-6梯度，选合适的梯度，取100uL分别涂布于分离培养基的培养皿，37℃静置培养并计数。从分离培养基的培养皿中挑 取单菌落，划线纯化3代，并进行革兰氏染色试验，镜检。获得一大批各种细菌，经过毒力测定，筛选纯化，最后优选1株无任何毒性的菌株III，命名为猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，已于2012年12月10日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为No.6970。 

所述分离培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母浸膏1g、酵母提取粉1g、吐温801mL、磷酸氢二钾2g、三水合乙酸钠5g、柠檬酸三铵2g、七水硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g，配制成1000mL。 

实施例2实施例1分离得到的猪源粪肠球菌的特性研究 

1、生理生化特性

将菌种的初代次和高代次（96-100代）设置四个重复，经过试验，多项试验结果完全一致，也就是说，为革兰氏阳性，不形成芽孢，不产生接触酶和氧化酶，能产乳酸，O/F试验发酵，能利用葡萄糖、甘露糖、松三糖、果糖、核糖、苦杏仁素、海藻糖、纤维二糖、木糖、麦芽糖、乳糖、棉子糖、山梨糖、山梨醇、蜜二糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、水杨素、葡萄糖酸钠及蔗糖等20种碳水化合物产酸，而对葡萄糖酸钠还能产气，但对葡萄糖则不产气；此外不能利用七叶灵和鼠李糖，全部阴性，由此初步显示菌种其低代次和高代次未明显差异，因而其遗传特性是相对稳定的。具体见表1所示。 

表1菌种的生理生化特征以及形态特征 

2、耐酸耐碱性能

将粪肠球菌III的菌种接种于液体分离培养基(同实施例1，下同)中，经过22小时培养（菌种浓度达到248亿个/毫升），再分别接种于pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH6.5、pH7.5、pH8.5及pH9.5等7种不同pH的液体培养基中，连续22小时，然后应用倍比稀释培养法检测，结果显示菌株在pH3.0（5万个/毫升）到pH9.5（266.5亿个/毫升）均能生长，只是不同程度受到抑制，由此可见其耐酸耐碱性甚强，只是最适宜的是pH7.5，此时生长最旺盛，活菌数最多(318亿个/毫升)。 

3、耐高温性能

将菌种接到培养基试管中，另一支培养基作为对照管，同时放入80℃、85℃及90℃恒温培养箱中，等对照试管达到要求温度时，计时10分钟，然后将含菌试管放入冷水中，冷却至室温时，分别吸取100uL菌液均匀分散于平皿上，然后置于37℃培养24小时，再观察活菌数，结果菌株在80℃时尚有活菌1560个 /毫升，85℃时还存活663个/毫升，90℃时还活着1580个/毫升。由此可见粪肠球菌在90℃作用10分钟的高温情况下尚有部分存活。 

4、抗干燥、缺营养特性

将粪肠球菌S接种于石腊油半固体琼脂中，置普通冰箱（4℃）存放，菌株经过13年又103天后，此时培养基已十分干燥，但重新培养时，发现菌株仍然存活，因此该菌株具有抗干燥、缺营养特性很强。 

5、毒性性能

将菌种分别通过皮下、肌肉、腹腔和子宫内等多种方法途径，接种于猪兔及各种年龄的小白鼠（包括2天龄乳鼠及怀孕母鼠）总数在500头（只）以上，结果所有试验动物均未见不良反应，孕鼠未发现流产，所有试验动物的注射部位不产生炎症变化，后来还将兔的子宫粘膜经组织切片镜检亦未见任何异常，更没有引起试验动物死亡的情况，甚至在小白鼠体内连续传代6次，亦未发现任何毒性。 

6、产性激素类物质的性能

将稀释好的猪精液分装于4支试管中，每管2mL，其中2管加入菌液0.2mL，另2管加入精子稀释液以作对照，各取1管分别分别置于室温及4℃冰箱中，每隔6-24小时检查一次，观察精子活力情况。检查时将各管稀释液滴于血球计数板上，看其活动强弱及死亡情况。详见表2：（表中分母为每个视野精子总数、分子为活精子数） 

表2 

7、抑致病菌性能

将菌种分别与等量不同菌株的致病菌，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、沙门氏杆菌、克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌、变形杆菌及绿脓杆菌等，同时混合培养于相应适宜的肉汤培养基中，或将菌种在分离培养基培养一定时间后，再将等量致病菌混合后同时培养于相应适宜的肉汤培养基中，采取两种方法，该菌种能在24小时内抑制致病菌生长。 

当加大致病菌用量时，抑制时间随着致病菌数量加大则有所推迟，直至48-72小时能完全抑制。 

该菌种能抑制猪牛常见的8种致病菌，抑菌作用机理主要有两点：一为产酸，所有培养液在接种细菌后，其pH发生很大改变，由最初的pH7.6迅速下降至pH3.5-pH4.0，故而受到抑制；其二为产生了细菌素，这为本发明申请人的科研成果中被证实。 

8、耐药性性能

将菌株应用常规的药物敏感试验方法对常见的12种抗生素进行了检测，结果对头孢吡肟、环丙沙星、阿莫西林、四环素、诺氟沙星、氨苄西林及氧氟沙星等7种均在中敏到高敏之间，而对氯霉素则属低敏；但对苯唑西林、红霉素、庆大霉素及阿米卡星等4种却有很强的耐药性。具体结果见表3所示。 

表3 

实施例3实施例1分离得到的猪源粪肠球菌的在防治母畜繁殖障碍疾病方面的应用 

将实施例1分离得到的猪源粪肠球菌接种于分离培养基中(接种量是10-15%，发酵培养时间为18-22h)，经发酵的培养物混合均匀，再加入1‰-5‰的寡糖配制成一种微生态制剂，定名为宫康宝（素）、并进行了下列试验： 

1、对东莞市食出公司某一猪场的300多头产后母猪用宫康宝（素）(用量为10-20mL/头)作预防试验，结果对产道炎症发病率从原来的35%下降到5%左右，母猪的各项繁殖性能有了较大的提高，平均产仔数达到10.37-10.95头，产仔合格数达9.19-9.70头，两者均比原来提高0.5头。 

2、对东莞市食出公司另一猪场的430头母猪产后应用宫康宝（素）(用量为10-20mL/头)，有96.74%能有效防止子宫炎，促进母猪及时发情并提早1-1.5天发情；第一情期发情率达97.7%，受胎率达92.6%。 

3、在广州某一种猪场进行试验，对流产的母猪31头，在流产后第一天全部注射青霉素和链霉素，于第三天分成2组，1组21头，每头灌注宫康宝（素）20毫升，另1组10头则灌注生理盐水20毫升，以作对照。两组母猪均于流产后第二个情期进行配种，结果治疗组的分娩率为95.23%，产仔数平均每胎10.65头，明显高于对照组的70%和7.71头仔猪。 

4、东莞市一出口猪场，在选择胎龄相近，饲养管理基本相同的条件下，将620头母猪分为二组，Ⅰ组320头，在每次分娩后都使用宫康宝（素）(用量为10-20mL/头)一次，Ⅱ组300头留作对照。经过一年时间的观察，Ⅰ组的受胎率（92.6%）比Ⅱ组（90.3%）高2.3个百分点，分娩率（分别为87.8%、83.2%）高4.6个百分点，胎产总仔数（分别为10.8头/胎、10.28头/胎）高0.52头/窝；头母猪年产仔数（分别为21.9头/年、20.45头/年）多1.45头/年。 

5、根据深圳市某原种猪场一年时间的试验观察，对500头纯种母猪在产后24小时内使用宫康宝（素）(用量为10-20mL/头)的统计结果，在离奶后第一个发情期，其发情率就达90%以上；而复发情只占0.2%，因子宫炎和不发情而淘汰的亦仅为2%。 

6、广州市某研究所使用宫康宝（素）(用量为50mL/头)治疗患子宫内膜炎的奶牛45头，进行一个疗程，治愈36头，好转9头，治愈率80%，总有效率100%。愈后36头均能按期发情配种受胎，而对照的5头都能分离出致病菌，其中4头还见浓性分泌物排出。 

因此，本发明的申请人在20万多头次母猪和300多头奶牛的子宫中应用本发明的微生态制剂，结果表明，本发明的微生态制剂对防治母畜繁殖障碍疾病，净化生殖道环境、保持菌体生态平衡，改善生理功能，促进正常发情排卵、提高受精率和产仔数都起了很好的作用。 

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

Claims (4)

1.一种猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其特征在于，所述猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的保藏编号为CGMCC No.6970。

2.一种由权利要求1所述的猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)配制而成的微生态制剂。

3.一种如权利要求2所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的猪源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)按10-15%的接种量接种于分离培养基中，发酵培养18-22h后，再加入发酵培养物的1‰-5‰的寡糖，混合均匀，即得；所述分离培养基的配方为：蛋白胨10±1g/L、牛肉浸膏10±1g/L、酵母浸膏1±0.1g/L、酵母提取粉1±0.1g/L、吐温801±0.1mL/L、磷酸氢二钾2±0.2g/L、三水合乙酸钠5±0.5g/L、柠檬酸三铵2±0.2g/L、七水硫酸镁0.2±0.02g/L、硫酸锰0.05±0.01g/L。

4.权利要求2所述的微生态制剂在防治母畜各种繁殖障碍疾病方面的应用。