CN114634900B - 一株屎肠球菌ld-nxy01及其在海马养殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一株屎肠球菌LD‑NXY01及其在海马养殖中的应用。所述屎肠球菌LD‑NXY01分离自未患肠炎的海马肠道，于2021年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.24041，分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium。该屎肠球菌对迟钝爱德华氏菌YT1具有抗性，可以预防和治疗海马由迟钝爱德华氏菌YT1诱发的肠炎；可以调节海马肠道内菌群平衡和提高肠道内消化酶活性，进而可以促进海马生长和发育。

Description

一株屎肠球菌LD-NXY01及其在海马养殖中的应用
技术领域
本发明涉及一株屎肠球菌及其应用，具体涉及一株从海马肠道中分离得到的屎肠球菌LD-NXY01及其在海马养殖中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
海马与其他硬骨鱼类相比，在生殖方式、生活习性、器官的组织结构和功能等方面都存在巨大差异，例如：“雄性卵胎生”并且具有长期稳定的“一雌一雄”繁殖单元；游泳能力弱，运动范围小，种群密度低；体表被覆坚硬骨片，头部与躯体呈直角，直立游泳；消化系统缺少胃，肠道短且盘曲少；缺少胸腺和脾脏等鱼类中的中枢免疫器官以及肠道相关淋巴组织（GALT），因此其免疫系统被认为存在一定缺陷。
在工厂化养殖中，疾病是制约海马人工繁育快速发展的主要原因之一。在众多疾病中，细菌性疾病的占比最高且危害最为严重，尤其是细菌感染诱发的肠炎具有范围广、危害强、季节性、区域性和复杂性的特点，严重影响海马养殖的效益。目前，已经发现了近20种海马的细菌病原，绝大部分能够诱发海马细菌性肠炎的发生。近期，我们从患细菌性肠炎的海马的肠道中分离出一种新的肠炎致病菌——迟钝爱德华氏菌YT1（Edwardsiella tardaYT1）。被该迟钝爱德华氏菌YT1感染后，海马会出现游泳能力减弱，摄食量下降，肛门发白、突出，肠道积液变多，肠壁充血，腹部肿胀等现象，导致海马大量死亡。通过肠道微生物测序分析发现，海马被迟钝爱德华氏菌YT1感染后，迟钝爱德华氏菌YT1在海马肠道中的丰度显著升高，而其它肠道固有的益生菌属的丰度则显著降低，进而诱发肠道菌群和功能的严重失衡，导致细菌性肠炎发生。因此，探究如何调控和维持海马肠道微生物的健康和平衡，抑制病原菌生长，对于提升海马工厂化养殖的效益具有重要意义。
益生菌能通过重塑肠道微生物平衡，提高养殖动物的生长速率和免疫力。作为肠道固有菌群的典型代表之一，屎肠球菌的益生作用已在多种动物中被证实。研究发现，屎肠球菌（HDRsEf1）在人体肠道中可上调 TLR1、TLR2 和 TLR6的mRNA 水平，尤其是 TLR2，屎肠球菌（HDRsEf1）可以独立于MyD88的模式激活TLR2 通路，并显著下调 TLR4、TLR5、TLR7和TLR8的mRNA水平，可以调节人类肠细胞样 HT-29 细胞的炎症反应。在仔猪养殖中，饲粮添加屎肠球菌B13能提高仔猪生产性能、粗蛋白及钙的消化率，增强仔猪免疫力的同时，还能维持仔猪消化道菌群稳态，遏制致病微生物的生长。随着水产养殖的快速发展，有学者发现鱼类饲料中添加屎肠球菌能显著提高养殖鱼的各项生长指标，例如：鲤鱼饲料中添加不同浓度的屎肠球菌可使鲤鱼血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力显著上升，溶菌酶（LZM）、碱性磷酸酶（AKP）和过氧化物酶（POD）的活力呈上升趋势，免疫球蛋白M（IgM）的质量浓度也呈上升趋势。因此，屎肠球菌在水产养殖中具有很好的应用前景。
在水产养殖行业中，益生菌通常被用做饲料添加剂，但饲料在高温制粒时，高温可能会造成益生菌的失活，从而影响益生菌的使用效果。目前，海马养殖主要以活体动物和冰冻糠虾为饵料，尚无可用商品化饲料。因此，将活化的益生菌剂直接投于养殖水体中，是最直接、简便且有效的方法，益生菌剂在改善水质的同时，通过海马摄食进入海马肠道，逐渐对海马产生益生作用。
目前，益生菌在海马养殖中的应用还处于初步阶段。近期，商品化乳酸菌冻干粉首次成功在海马养殖中用于预防和治疗弧菌引起的海马肠炎；另有研究表明，添加复合益生菌能够提高幼年海马的存活率、生长率以及肠道乳酸菌的丰度。综上，目前海马中益生菌的应用报道十分有限，多是经验性使用已有水产用益生菌剂，缺乏针对由迟钝爱德华氏菌YT1诱发的海马肠炎使用益生菌的相关研究和报道；此外，复合益生菌的使用无法探究具体益生菌作用的明确机制，不利于用法、用量的优化，以及具有复合抗菌效果益生菌剂的开发。
本发明率先从海马自身肠道中筛选、纯化得到益生菌菌株，针对迟钝爱德华氏菌YT1，通过在海马体外和体内进行验证，明确分离得到的益生菌菌株对病原的抗性，并系统研究其对海马生长、发育、肠道消化酶和菌群的影响。
发明内容
本发明的目的在于：提供一株海马肠道益生菌——屎肠球菌LD-NXY01及其应用，该屎肠球菌LD-NXY01既可以预防和治疗海马由迟钝爱德华氏菌YT1诱发的肠炎，又可以促进海马生长和发育，其应用包括：在制备预防和治疗海马由迟钝爱德华氏菌YT1诱发的肠炎的菌剂中的应用，以及在制备促进海马生长和发育的菌剂中的应用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株屎肠球菌LD-NXY01，其特征在于，所述屎肠球菌LD-NXY01分离自未患肠炎的海马的肠道，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏日期为：2021年12月06日，保藏编号为：CGMCC No. 24041，分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium。
前述的屎肠球菌LD-NXY01的应用，其特征在于，所述应用包括：在制备预防和治疗海马由迟钝爱德华氏菌YT1诱发的肠炎的菌剂中的应用，以及在制备促进海马生长和发育的菌剂中的应用。
前述的应用，其特征在于，所述菌剂的制备方法如下：在无菌环境中将冻存的屎肠球菌LD-NXY01菌液融化，然后接种于MRS液体培养基中，在37℃、150rpm摇床中培养13h，之后将菌液离心，除去上清，用灭菌海水冲起沉淀并将菌液浓度调至1011 cfu/ml。
前述的应用，其特征在于，每1L养殖水中添加0.1ml所述浓度为1011 cfu/ml的屎肠球菌LD-NXY01菌液，养殖水中屎肠球菌LD-NXY01的终浓度为107 cfu/ml。
前述的应用，其特征在于，每4天向养殖水中添加一次所述浓度为1011 cfu/ml的屎肠球菌LD-NXY01菌液。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明分离得到的屎肠球菌LD-NXY01，通过体外抑菌实验和体内病原胁迫实验可知，对迟钝爱德华氏菌YT1具有抗性，所以可以预防和治疗海马由迟钝爱德华氏菌YT1诱发的肠炎；
（2）本发明分离得到的屎肠球菌LD-NXY01，通过迟钝爱德华氏菌YT1病原胁迫实验和屎肠球菌不同投喂策略益生菌饲养实验可知，可以调节海马肠道内菌群平衡和提高肠道内消化酶活性，所以可以促进海马生长和发育；
（3）本发明针对海马自身的特点和养殖业的特点，为海马工厂化健康养殖提供了简便、高效的益生菌使用方案，对海马养殖产业的健康发展意义重大。
附图说明
图1是实验组海马和对照组海马的生存曲线图；
图2是不同益生菌处理对雌海马和雄海马体重的影响图；
图3是不同益生菌处理对海马发育的影响图，其中，（a）是不同益生菌处理对海马卵巢发育的影响图；（b）是不同益生菌处理对海马精巢发育的影响图；（c）是不同益生菌处理对海马育儿袋/体长的影响图；
图4 是益生菌对海马生长活跃指数的影响图；
图5是益生菌处理对海马肠道消化酶的影响图，其中，（a）是益生菌处理对海马肠道脂肪酶的影响图；（b）是益生菌处理对海马肠道淀粉酶的影响图；（c）是益生菌处理对海马肠道胰蛋白酶的影响图；
图6是益生菌处理对海马肠道微生物的影响图；
图7是益生菌处理对海马肠道微生物功能的影响图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、菌株的分离
1、样品
膨腹海马：采集于鲁东大学海马养殖基地。
2、培养基
MRS固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，酵母粉5 g，吐温-80 lml，磷酸二氢钾2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.15 g，蒸馏水1000ml，pH 6.5-7.8，加入1.5 %的琼脂以配制固体培养基，115 ℃灭菌20 min。
3、益生菌培养
取未患肠炎的膨腹海马，用无菌 PSS 缓冲液冲洗 5-6 次，用灭菌的手术剪刀从膨腹海马的肛门处剪开，沿切口向上将躯干前端完全剪开，转向至躯干后端，向下剪至切口处，直至将单侧体壁完全解离。取大小适中的肠道组织到经过灭菌处理的研钵中，加入少量PSS 缓冲液，充分研磨，离心，取上清液以10倍系列稀释。取原液、10-1、10-2三个稀释度的样品各100μl，进行MRS平板涂布，每个稀释梯度设置3个平行，37℃恒温培养24h。挑取生长良好的多个单菌落，通过多次划线纯化后，进行群落形态观察。
4、菌落生物学特性
经观察，菌落呈乳白色，圆形、完整、光滑、隆起、不透明。
二、菌株的筛选和鉴定
1、培养基
MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐温-80 l ml，磷酸二氢钾2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.15 g，蒸馏水1000 ml，pH 6.5-7.8，高压蒸汽121℃灭菌20 min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入1.5 %的琼脂，高压蒸汽121℃灭菌20min，冷却至 50℃左右后倒平板，待平板冷却后封口4℃保存。
35‰ NaCl MRS固体培养基：在MRS固体培养基中加入35 ‰的 NaCl试剂，高压蒸汽121℃灭菌20 min，冷却至50℃左右后倒平板，待平板冷却后封口4℃保存。
LB液体培养基：称取蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，加800 ml去离子水溶解，待溶解完全后，用10M NaOH调节pH值至7.0，然后定容至1000 ml，高压蒸汽121℃灭菌20 min。
LB固体培养基：向LB液体培养基中加入1.5%的琼脂，高压蒸汽121℃灭菌20 min，冷却至 50℃左右后倒平板，待平板冷却后封口 4℃保存。
2、益生菌16S rDNA鉴定
挑取18个纯化后的单菌落，分别接种于MRS液体培养基中，编号LD-NXY01、LD-NXY02、LD-NXY03、…、LD-NXY18，37℃静置培养16h-24h，然后进行16SrDNA测序和菌株冻存，之后根据16SrDNA测序结果鉴定每个菌株所属的类别。鉴定结果见表1。
表1 菌株16S rDNA鉴定结果
菌株编号 16S rDNA鉴定结果 菌株编号 16S rDNA鉴定结果
LD-NXY01 屎肠球菌 LD-NXY10 粪肠球菌
LD-NXY02 副干酪乳杆菌 LD-NXY11 屎肠球菌
LD-NXY03 植物乳杆菌 LD-NXY12 芽孢杆菌
LD-NXY04 足黄芽孢杆菌 LD-NXY13 枯草芽孢杆菌
LD-NXY05 植物乳杆菌 LD-NXY14 枯草芽孢杆菌
LD-NXY06 植物乳杆菌 LD-NXY15 屎肠球菌
LD-NXY07 植物乳杆菌 LD-NXY16 屎肠球菌
LD-NXY08 植物乳杆菌 LD-NXY17 枯草芽孢杆菌
LD-NXY09 植物乳杆菌 LD-NXY18 屎肠球菌
由表1可知，18个不同菌落主要集中于屎肠球菌、芽孢杆菌和植物乳杆菌。
3、耐盐性实验
取出冻存的益生菌，按2%的接种量接种于5 ml MRS液体培养基中，在37℃培养摇床中培养13h，将活化后的益生菌进行梯度稀释至10-6，在MRS固体培养基中和35‰ NaClMRS固体培养基中分别接入200μl活化后的菌种并进行涂布，在37℃培养箱中静置培养16h-24h，最后计数每个平板中的菌落数，并根据如下的对应关系确定菌株的耐盐能力：
35‰ NaCl MRS平板与MRS平板相比：
（1）若菌落数相差≤99，则菌株的耐盐能力为+++；
（2）若菌落数相差100～149，则菌株的耐盐能力为++；
（3）若菌落数相差≥150，则菌株的耐盐能力为+。
平板计数结果和菌株耐盐能力鉴定结果见表2。
表2 菌株的耐盐能力
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注：+数量与耐盐能力成正比
由表2可知，屎肠球菌LD-NXY01、植物乳杆菌LD-NXY03、植物乳杆菌LD-NXY06、芽孢杆菌LD-NXY12、屎肠球菌LD-NXY15和枯草芽孢杆菌LD-NXY17这6株益生菌株的耐盐能力均为+++，耐盐能力均较强。
4、抑菌性实验
取出冻存的屎肠球菌LD-NXY01、植物乳杆菌LD-NXY03、植物乳杆菌LD-NXY06、芽孢杆菌LD-NXY12、屎肠球菌LD-NXY15和枯草芽孢杆菌LD-NXY17这6株益生菌株，按2%的接种量接种于5ml MRS液体培养基中，其中，屎肠球菌LD-NXY01、芽孢杆菌LD-NXY12、屎肠球菌LD-NXY15和枯草芽孢杆菌LD-NXY17这4株益生菌株在37℃、150rpm摇床中培养13h，植物乳杆菌LD-NXY03和植物乳杆菌LD-NXY06这2株益生菌株在37℃恒温培养箱中静置培养13h，培养结束后将菌液4000rpm离心8min后收集上清；取出冻存的从患肠炎海马肠道分离的迟钝爱德华氏菌YT1，按2%的接种量接种于5ml LB液体培养基中，28℃、200rpm培养过夜，将菌液进行梯度稀释，稀释到10-4，取稀释后的菌液200μl加入到LB平板上并进行涂布，将涂布好的LB平板于28℃培养箱中正置培养至菌液干燥；将牛津杯插入LB平板上，取150μl益生菌的上清液于牛津杯中，于28℃培养箱中正置培养18h，如果牛津杯处有抑菌圈生成，则说明该益生菌对迟钝爱德华氏菌YT1具有抑制作用，并且抑菌圈越大，对迟钝爱德华氏菌YT1的抑制作用越强，根据抑菌圈大小（mm，取整数）划分抑菌能力等级，具体的：
（1）若抑菌圈直径≤9mm，则菌株的抑菌能力为+；
（2）若抑菌圈直径为10mm～13mm，则菌株的抑菌能力为++；
（3）若抑菌圈直径≥14mm，则菌株的抑菌能力为+++。
抑菌圈的测量结果和抑菌能力的划分结果见表3。
表3 菌株的抑菌能力
菌株编号 菌株类别 抑菌圈直径（mm，取整数） 抑菌能力
LD-NXY01 屎肠球菌 16 +++
LD-NXY03 植物乳杆菌 15 +++
LD-NXY06 植物乳杆菌 15 +++
LD-NXY12 芽孢杆菌 16 +++
LD-NXY15 屎肠球菌 12 ++
LD-NXY17 枯草芽孢杆菌 17 +++
注：+数量与抑菌能力成正比
由表3可知，除屎肠球菌LD-NXY15这1株益生菌株外， 屎肠球菌LD-NXY01、植物乳杆菌LD-NXY03、植物乳杆菌LD-NXY06、芽孢杆菌LD-NXY12和枯草芽孢杆菌LD-NXY17这5株益生菌株的抑菌能力均为+++，抑菌能力均较强。
根据耐盐性实验的结果和抑菌性实验的结果可知，肠球菌LD-NXY01、植物乳杆菌LD-NXY03、植物乳杆菌LD-NXY06、芽孢杆菌LD-NXY12和枯草芽孢杆菌LD-NXY17这5株益生菌株的耐盐能力和抑菌能力都较强。由于屎肠球菌相较于其他益生菌研究较少且在海马中尚未有报道，所以选择对屎肠球菌LD-NXY01进行进一步研究。
三、迟钝爱德华氏菌胁迫实验
1、实验方法
制备浓度为1011 cfu/ml的屎肠球菌LD-NXY01菌液，制备过程具体如下：
在超净台中将冻存的屎肠球菌LD-NXY01菌液融化，按2%的接种量接种于50 mlMRS液体培养基中，在37℃、150 rpm摇床中培养13h，将菌液4000rpm离心8min后除去上清，用灭菌海水冲起沉淀并将菌液浓度调至1011 cfu/ml。
实验设置实验组和对照组，每组3个平行，每个平行30只海马，共180只，其中：
（1）对照组：以不间断循环海水养殖，在养殖期间不添加任何菌剂；
（2）实验组：在饲养期间每2天添加一次屎肠球菌LD-NXY01菌液，具体的，每1L养殖水中添加0.1 ml浓度为1011 cfu/ml的屎肠球菌LD-NXY01菌液，养殖水中屎肠球菌LD-NXY01的终浓度为107 cfu/ml。
养殖48天后进行病原胁迫实验，具体的：将冻存的迟钝爱德华氏菌YT1活化，4000rpm离心8min后取沉淀，用鱼类专业缓冲液PSS稀释至浓度为109cfu/ml，根据半致死量，对实验组和对照组的海马腹腔注迟钝爱德华氏菌YT1菌液，每只海马注射100μl。病原胁迫养殖期间不添加益生菌液，饲养7天，每天计算累计死亡率。
2、实验结果
以饲养时间为横坐标，以生存率（生存率=1-累计死亡率）为纵坐标，绘制实验组海马和对照组海马的生存曲线，绘制结果见图1。
由图1可知，添加屎肠球菌LD-NXY01可显著提高海马被病原（迟钝爱德华氏菌YT1）侵染后的生存率，在对照组中，海马在第2天开始死亡，7天实验结束后海马的生存率仅为20%，而在实验组中，海马在第5天才开始死亡，7天实验结束后海马的生存率高达70%。
四、饲养实验
1、实验方法
实验共设5组，分别为C组、H2组、H4组、L2组和L4组，每组分别设置三个平行，每个平行30只海马，共450只，其中：
（1）C组为对照组，以不间断循环海水养殖，在养殖期间不添加任何菌剂；
（2）H2组、H4组、L2组和L4组为益生菌处理组，在早晨喂食前添加屎肠球菌LD-NXY01菌液至养殖水体，同时关闭循环水，待喂食2小时后打开循环水，此后至下一次添加屎肠球菌LD-NXY01菌液之前一直为不间断循环水养殖，各组添加屎肠球菌LD-NXY01菌液的间隔天数、每次添加的屎肠球菌LD-NXY01菌液的浓度和添加量分别如下：
（i）H2组和H4组在养殖期间分别每2天、每4天添加一次屎肠球菌LD-NXY01菌液，养殖水中屎肠球菌LD-NXY01的终浓度均为107 cfu/ml；
（ii）L2组和L4组在养殖期间分别每2天、每4天添加一次屎肠球菌LD-NXY01菌液，养殖水中屎肠球菌LD-NXY01的终浓度均为105 cfu/ml。
养殖时间为48天，每8天进行一次生长评估。养殖结束后进行终体重、体长、育儿袋测量，解剖后称量性腺重量，最后进行数据整理。
2、实验结果
数据的整理结果见表4、表5以及图2、图3和图4。
表4 屎肠球菌LD-NXY01对海马生长的影响
C H2 H4 L2 L4
初始体重(g) 1.199±0.069<sup>a</sup> 1.149±0.08<sup>a</sup> 1.171±0.076<sup>a</sup> 1.126±0.06<sup>a</sup> 1.145±0.094<sup>a</sup>
初始体长(cm) 8.94±0.514<sup>a</sup> 8.853±0.622<sup>a</sup> 8.933±0.646<sup>a</sup> 8.907±0.438<sup>a</sup> 8.953±0.501<sup>a</sup>
最终体重(g) 4.097±0.865<sup>a</sup> 4.135±0.644<sup>a</sup> 4.671±0.517<sup>b</sup> 4.401±0.417<sup>ab</sup> 4.499±0.64<sup>ab</sup>
最终体长(cm) 12.987±0.814<sup>ab</sup> 12.867±1.09<sup>a</sup> 13.66±0.62<sup>b</sup> 13.353±0.605<sup>ab</sup> 13.093±1.255<sup>ab</sup>
特定生长率(%) 2.494±0.48<sup>a</sup> 2.627±0.38<sup>ab</sup> 2.811±0.256<sup>b</sup> 2.769±0.222<sup>b</sup> 2.819±0.323<sup>b</sup>
绝对生长率(%) 6.1±0.018<sup>a</sup> 6.3±0.014<sup>a</sup> 7.4±0.01<sup>b</sup> 6.9±0.009<sup>ab</sup> 7.1±0.013<sup>ab</sup>
体重增量(g) 2.943±0.875<sup>a</sup> 3.034±0.669<sup>a</sup> 3.567±0.467<sup>b</sup> 3.302±0.43<sup>ab</sup> 3.407±0.644<sup>ab</sup>
体长增量(cm) 4.29±1.108<sup>a</sup> 4.33±1.265<sup>a</sup> 4.69±1.083<sup>a</sup> 4.54±0.817<sup>a</sup> 4.43±1.6<sup>a</sup>
条件因子 0.194±0.060<sup>a</sup> 0.205±0.068<sup>a</sup> 0.184±0.021<sup>a</sup> 0.187±0.030<sup>a</sup> 0.217±0.095<sup>a</sup>
肝重比(g) 0.03±0.005<sup>a</sup> 0.035±0.009<sup>a</sup> 0.029±0.007<sup>a</sup> 0.035±0.009<sup>a</sup> 0.031±0.007<sup>a</sup>
饲料转化率(%) 5.628±1.825<sup>a</sup> 5.392±1.057<sup>ab</sup> 4.742±0.654<sup>b</sup> 4.775±0.481<sup>b</sup> 4.932±0.813<sup>ab</sup>
成活率 (%) 100 100 100 100 100
注：不同的字母表示差异显著（P＜0.05）
表5 海马生长指标评分体系
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表4、表5以及图2、图3和图4可知：
（1）添加屎肠球菌LD-NXY01饲养后，与C组相比，H4组海马的最终体重、最终体长、绝对生长率和增重量具有显著性差异；H4、L2和L4组特定生长率显著增加；H4和L2组饲料转化率比值显著降低（表4）；
（2）与C组相比，H4组雌雄海马的体重均显著高于对照组（图2）；
（3）当每4天添加一次屎肠球菌LD-NXY01菌液，养殖水中屎肠球菌LD-NXY01的终浓度为107 cfu/ml时（即H4组），能明显促进雌海马的发育，但对雄海马的发育影响不显著，因为屎肠球菌LD-NXY01使雌海马的卵巢重量显著增加（图3中（a）部分），而雄海马的精巢重量和育儿袋/体长结果与对照组差异不显著（图3中（b）部分、图3中（c）部分）；
（4）根据生长和发育指标评分体系做出活跃指数图，评分从高到低依次为H4、L2、L4、H2和C，处理组中只有H4组的生长活跃指数与C组相比显著性提高（P<0.05）（图4）。
在与营养和饲料相关的研究中，研究人员最常用体重增加、特定生长率和饲料转化率作为评估动物生长的基础。然而，体重只是评价养殖动物是否健康生长的一个方面，体重的快速增长与体长和肌肉量增加无关时，将被认为是健康受损的指标。为了水产养殖的进一步可持续发展，有人呼吁采用一个更加平衡、全面的增长指标体系进行生长评价。为此，我们首次从质量、空间、器官3个不同维度构建了一个海马生长评价指标体系，该体系能综合、全面、准确的评估海马的生长状况。
五、消化酶检测
1、实验方法
饲养实验结束后，分别取C组（对照组）和H4组（实验组）海马各3只进行解剖，取肠道组织，分别编号C1、C2、C3、T1、T2、T3，将肠道组织与PBS缓冲液按照1：9的体积比混合并进行匀浆，然后利用市售的试剂盒对脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶进行检测。
2、检测结果
各海马肠道中的消化酶的检测结果见图5。
由图5可知，与对照组相比，添加屎肠球菌LD-NXY01对海马肠道中脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶的丰度虽然没有显著性影响（P>0.05），但均有增加的趋势。
六、肠道微生物检测
1、实验方法
饲养实验结束后，分别取C组（对照组）和H4组（实验组）海马各6只进行解剖，取肠道组织，通过16S rDNA测序后进行菌群结构和功能分析。
2、实验结果
16S rDNA测序的分析结果见图6和图7。
由图6可知，添加屎肠球菌LD-NXY01后，明显改变了海马肠道中的菌群结构。
由图7（KEGG 功能预测分析图）可知，添加屎肠球菌LD-NXY01后，p53信号通路相关的功能基因上调，同时提高了缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、酮体代谢和脂肪酸合成途径的活性，此外还降低了细菌趋化性和霍乱弧菌感染途径的活性。可见，屎肠球菌LD-NXY01提高了海马对病菌的抵抗力和氨基酸的代谢能力。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一株屎肠球菌LD-NXY01，其特征在于，所述屎肠球菌LD-NXY01分离自未患肠炎的海马的肠道，分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏日期为2021年12月06日，保藏编号为CGMCC No.24041。
2.权利要求1所述的屎肠球菌LD-NXY01的应用，其特征在于，所述应用包括：在制备促进海马生长和发育的菌剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌剂的制备方法如下：在无菌环境中将冻存的屎肠球菌LD-NXY01菌液融化，然后接种于MRS液体培养基中，在37℃、150rpm摇床中培养13h，之后将菌液离心，除去上清，用灭菌海水冲起沉淀并将菌液浓度调至1011cfu/ml。
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