CN108159034B

CN108159034B - 异甜菊醇在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用

Info

Publication number: CN108159034B
Application number: CN201810145347.3A
Authority: CN
Inventors: 易宏伟; 许德义
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN108159034A

Abstract

本发明公开了异甜菊醇在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。相对于现有技术，本发明发现了异甜菊醇能改善高脂饮食导致的大鼠非酒精性脂肪肝病，减少脂质在肝细胞内的累积，抑制游离脂肪酸导致的肝细胞内氧化应激，线粒体功能受损以及肝细胞凋亡，保护肝细胞。整体动物水平上表现为降低血清转氨酶水平，减少血清中游离脂肪酸，改善血脂紊乱。这些作用表明异甜菊醇可用于非酒精脂肪性肝病的治疗，具有开发药物的前景。

Description

异甜菊醇在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用

技术领域：

本发明公开了异甜菊醇在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，属于异甜菊醇新用途技术领域。

背景内容：

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，由各种原因引起的干细胞内脂肪堆积，以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征。其病理变化随病程的进展而表现有单纯性脂肪肝、高脂血症、高血压，并被认为是代谢综合征在肝脏的一种病理表现。是一种与胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括单纯性脂肪肝(NAFL)、脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌。目前尚无药物被批准用于治疗非酒精性肝病。临床治疗非酒精性脂肪性肝病的方法有限，主要包括调整能量摄入以及饮食结构、增加中等量有氧运动、纠正不良生活方式和行为；控制体重、减少腰围。对于合并2型糖尿病、糖耐量损害、空腹血糖增高以及内脏性肥胖者可以增加噻唑烷二酮类胰岛素增敏药物；对于血脂紊乱者可以使用贝特类、他汀类或普罗布考等降血脂药物；或者使用抗氧化药物如维生素E等。上述药物对NAFLD的治疗效果有限，仅能改善NAFLD患者的某些症状。

发明内容：

发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了异甜菊醇在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，为开发治疗非酒精性脂肪肝病的药物提供依据。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明技术方案如下：

异甜菊醇在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。

所述异甜菊醇，分子式为C₂₀H₃₀O₃，其化学结构式如下所示：

所述异甜菊醇能够保护高脂饮食导致的肝损伤。

所述异甜菊醇能够抑制肝细胞凋亡及脂质累积。

所述异甜菊醇能够保护肝细胞线粒体功能，抑制细胞内氧化应激。

所述药物是以异甜菊醇作为单一成分所制成的药物。

或者，所述药物是以异甜菊醇作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

本发明所述异甜菊醇在治疗非酒精性脂肪性肝病时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到治疗非酒精性脂肪性肝病的目的。

本发明发现异甜菊醇具有保护高脂饮食导致的肝细胞损伤，降低血清转氨酶水平，血清总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平，降低血清游离脂肪酸水平。异甜菊醇能够减少肝细胞内脂质沉积，抑制游离脂肪酸导致的肝细胞凋亡。因此，异甜菊醇可以用于治疗非酒精性脂肪性肝病。

技术效果：相对于现有技术，本发明发现了异甜菊醇能改善高脂饮食导致的大鼠非酒精性脂肪肝病，减少脂质在肝细胞内的累积，抑制游离脂肪酸导致的肝细胞内氧化应激，线粒体功能受损以及肝细胞凋亡，保护肝细胞。整体动物水平上表现为降低血清转氨酶水平，减少血清中游离脂肪酸，改善血脂紊乱。这些作用表明异甜菊醇可用于非酒精性脂肪性肝病的治疗，具有开发药物的前景。

附图说明

图1.异甜菊醇保护高脂饮食导致的大鼠肝损伤。高脂饲料饲养大鼠4周后，应用10mg/kg/d及20mg/kg/d的异甜菊醇给大鼠灌胃，再4周后收集大鼠血清及肝组织。肝组织HE染色分析肝细胞内组织病理学改变(A)。测定大鼠血清中转氨酶(B)，血脂包括甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的水平(C)，游离脂肪酸水平(D)。并检测了肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(E)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)(F)的水平。数值用均值±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(Student’s two-tailed t-test)。缩写：HFD，高脂饲料；ISV，异甜菊醇(Isosteviol)。

图2.异甜菊醇抑制棕榈酸诱导的原代大鼠肝细胞凋亡及脂质累积。用1mM的棕榈酸处理原代培养的大鼠肝细胞24小时，同时加入不同浓度的异甜菊醇共同孵育。收集细胞后用流式细胞仪检测细胞凋亡(A)，流式细胞仪图代表了三次独立实验结果。原代培养的大鼠肝细胞LDH泄露(B)和Caspase 3活性(C)分别用试剂盒检测。数值用均值±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01，(Student’s two-tailed t-test)。原代培养的大鼠肝细胞用棕榈酸及不同浓度的异甜菊醇处理24小时后，用尼罗红染色，再用流式细胞仪检测细胞内荧光强度(D)。尼罗红荧光强度反映了肝细胞内脂质的水平。缩写：PA，棕榈酸(palmitic acid)；ISV，异甜菊醇(Isosteviol)。

图3.异甜菊醇保护肝细胞线粒体功能抑制细胞内氧化应激。用1mM的棕榈酸处理原代培养的大鼠肝细胞24小时，同时加入不同浓度的异甜菊醇共同孵育。收集细胞后用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位(A)及细胞内活性氧(B)水平，流式细胞仪图代表了三次独立实验结果。收集细胞分别检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)(C)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)(D)的水平。数值用均值±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01，(Student’s two-tailed t-test)。缩写：PA，棕榈酸(palmitic acid)；ISV，异甜菊醇(Isosteviol)；DCF，(2,7-dichlorofluorescein)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例

一、试验方法

1.高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型

用正常饲料或者高脂饲料(含有88％的普通饲料，10％的猪油和2％的胆固醇)分别喂养雄性SD(Sprague Dawley)大鼠8周，高脂饲料喂养4周后给予异甜菊醇治疗，并继续给予高脂饲料饲养。饲养期间不限饮食，并维持12h昼/夜节律。实验结束前，大鼠禁食12h，收集实验动物血清及组织样本。用全自动生化分析仪测定(BeckmanCoulter,IndianapolisIN)测定血清转氨酶ALT(alanine aminotransferase)，AST(aspartatetransaminase)，总胆固醇(total-cholesterol,TC)，TG，高密度脂蛋白(high densitylipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)。血清FFAs，肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)用试剂盒测定(南京建成生物工程公司)。

2.异甜菊醇对游离脂肪酸诱导的大鼠原代培养肝细胞损伤保护作用

2.1原代培养的SD大鼠肝细胞。简述如下，使用87mg/kg氯胺酮加上13mg/kg赛拉嗪麻醉大鼠。在大鼠肝门静脉插入插管，并连接上恒流泵。初始的灌流速度为10ml/min，灌注预热(37℃)的灌流液I(含有0.9mM MgCl₂,0.5mM EDTA和25mM HEPES的HBSS)。一旦套管插入成功后，在下腔静脉剪口使灌流液流出。增加灌流速度至25ml/min。更换灌流液II(含有25mM HEPES和3.3U/ml胶原酶II的HBSS)，灌注6min。剪下肝脏并用William's完全培养基分散肝细胞。用100μm孔径的筛网过滤以去除结缔组织和未消化的肝组织。用40ml William's完全培养基重悬肝细胞并于4℃，50×g离心3min。弃上清，并用预冷的40ml William's完全培养基洗涤肝细胞，并再次离心。用预热的William's完全培养基将细胞稀释至所需的浓度。

2.2制备PA-白蛋白复合物。营养皂化反应技术制备PA-白蛋白复合物，使用PA(C16:0)及不含游离脂肪酸的BSA进行制备。用乙醇溶解PA，与氢氧化钠进行皂化反应，干燥生成的钠盐，再用盐水重悬并于70℃加热5min。趁热加入25％(w/v)BSA并在室温条件下搅拌4h，使PA结合到BSA上。将PA-牛血清白蛋白复合物(6.4mmol/l脂肪酸:0.9mmol/l BSA,分子比为7:1)过滤除菌，分装冻存备用。

2.3细胞凋亡检测。收集PA及药物处理过的肝细胞，PBS洗涤两遍，用400μl结合缓冲液(10mM of 4-[2-hydroxyethyl]-1-piperazine ethanesulfonic acid,140mM ofNaCl,2.5mM of CaCl₂,pH 7.4)重悬肝细胞，使用Annexin V-FITC(fluoresceinisothiocyanate)和PI(propidium iodide)染色后用流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测。

2.4测定细胞毒性。通过检测细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)来检测细胞毒性。使用细胞毒性测定试剂盒(Roche AppliedScience,Indianapolis IN)。在该测试中，细胞释放的LDH可以氧化乳酸产生NADH作为辅助因子参与酶diaphorase还原黄色的tetrazoliumsalt为红色的formazan dye的反应。在实验中收集细胞培养上清，这些含有LDH的上清作为LDH-medium用于测定细胞毒性。细胞则用PBS洗涤2遍，用含有1％Triton-X 100的PBS溶液于37℃裂解24h，涡旋15s，5000×g离心3min收集上清作为LDH-triton。释放到培养基中的LDH比例计算公式如下：LDH release(％)＝LDH-medium/(LDH-medium+LDH-triton)×100。

2.5Caspase 3活性测定。使用Caspase 3活性测定试剂盒，参照说明书，应用比色法测定肝细胞裂解液中Caspase 3的活性。PA及药物处理的肝细胞24h后，收集细胞并用裂解液裂解肝细胞，收集离心后上清。等量的蛋白溶液(200-400μg)与含有10mM DTT的反应缓冲液共孵育，加入Caspase 3底物DEVD-Pna(4mM)，将反应液于37℃孵育2-4h。用酶标仪于405nm波长处测定吸光度。

2.6尼罗红染色。使用尼罗红对细胞内脂质进行特异性染色。PA及药物处理细胞后，将100ng/mL尼罗红的PBS溶液与肝细胞共孵育5min。PBS洗涤细胞，再用PBS重悬细胞，并用流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测，激发波长为488nm，发射波长为525nm。

3.异甜菊醇保护肝细胞线粒体功能并抑制肝细胞内氧化应激

3.1线粒体膜电位测定。收集PA及异甜菊醇处理过的肝细胞，PBS洗涤两遍，用荧光探针JC-1(5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineiodide)及染色后用流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测线粒体膜电位。

3.2测定细胞内ROS。收集PA及异甜菊醇处理过的肝细胞，PBS洗涤两遍，加入荧光染料DCFH-DA(2,7-dichlorofluorescein diacetate)染色后用流式细胞仪(BDFACSCalibur)检测细胞内荧光强度。

二、试验结果

1、异甜菊醇保护高脂饮食导致的大鼠肝损伤

高脂饲料喂养SD大鼠4周后再用异甜菊醇处理4周，收集大鼠血清及肝组织。与普通饲料饲养组对比，高脂饲料喂养组大鼠出现典型的脂肪变性和门静脉及小叶炎症。大量的脂质累积导致肝细胞内出现空洞，10mg/kg/d和20mg/kg/d异甜菊醇能降低HFD诱导的肝细胞内的空洞并减轻炎症和肝细胞损伤(图1A)。HFD导致大鼠血清转氨酶ALT和AST水平上升，而异甜菊醇能显著降低血清ALT和AST水平(图1B)。异甜菊醇能缓解HFD诱导的大鼠血脂水平紊乱，抑制血清TG，TC和LDL水平升高，轻度升高HDL水平(图1C)。异甜菊醇也能阻止HFD引起的血清FFAs水平升高(图1D)。HFD诱导肝细胞氧化应激，降低肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，并升高丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平。20mg/kg的异甜菊醇能显著抑制肝组织中的氧化应激(图1E和1F)。

2、异甜菊醇抑制棕榈酸诱导的原代大鼠肝细胞凋亡及脂质累积

分离培养大鼠肝原代细胞，用1mM PA和不同浓度的异甜菊醇共同孵育24小时，用流式细胞仪检测细胞凋亡。1,3及10μM的异甜菊醇减少Annexin V和PI阳性的细胞数目，表明异甜菊醇能抑制PA诱导的肝细胞凋亡(图2A)；同时异甜菊醇能减少PA引起的LDH释放(图2B)和Caspase-3活性升高(图2C)。3及10μM的异甜菊醇显著抑制LDH释放及Caspase-3活性升高，但是1μM的异甜菊醇仅具有轻度的抑制作用。流式细胞仪(图2D)显示PA作用24h后，原代培养的大鼠肝细胞中脂质沉积增多，荧光强度增加；异甜菊醇减少细胞内脂质沉积。

3、异甜菊醇保护肝细胞线粒体功能抑制细胞内氧化应激

为了了解异甜菊醇的肝细胞保护作用机制，测定了PA处理后肝细胞线粒体膜电位。PA能诱导肝细胞线粒体膜电位倒塌，而异甜菊醇能剂量依赖性地抑制1mM PA对原代培养的大鼠肝细胞(图3A)的作用。PA可增加肝细胞内的ROS水平并能导致线粒体功能障碍和细胞凋亡。1mM PA处理后细胞内的DCF荧光强度，表明大鼠肝细胞内ROS水平升高；异甜菊醇能降低升高了的肝细胞内ROS水平(图3B)。此外异甜菊醇也可以剂量依赖性地抑制SOD水平降低(图3C)及MDA水平升高(图3D)。

Claims

1.异甜菊醇在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异甜菊醇能够保护高脂饮食导致的肝损伤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异甜菊醇能够抑制肝细胞凋亡及脂质累积。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异甜菊醇能够保护肝细胞线粒体功能，抑制细胞内氧化应激。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是以异甜菊醇作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。