CN114557989B

CN114557989B - 异甜菊醇在制备治疗自身免疫性肝炎药物中的应用

Info

Publication number: CN114557989B
Application number: CN202210371615.XA
Authority: CN
Inventors: 易宏伟; 余露; 王子慧; 夏维昱
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2022-04-11
Filing date: 2022-04-11
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2042-04-11
Also published as: CN114557989A

Abstract

本发明公开了异甜菊醇在制备治疗自身免疫性肝炎药物中的应用。相对于现有技术，本发明发现异甜菊醇改善伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)诱导的小鼠免疫性肝损伤。异甜菊醇能减轻伴刀豆球蛋白A诱导的小鼠肝细胞肿胀和坏死。异甜菊醇抑制血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶水平升高；降低血清炎症因子白细胞介素6(IL‑6)、肿瘤坏死因子α(TNF‑α)以及白细胞介素1β(IL‑1β)水平。减少小鼠肝脏组织中IL‑6、TNF‑α、IL‑1β、巨噬细胞炎症蛋白1α、细胞间黏附分子1和C‑X‑C基序趋化因子10的表达。这些作用表明异甜菊醇可用于自身免疫性肝炎的治疗，具有开发药物的前景。

Description

异甜菊醇在制备治疗自身免疫性肝炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及异甜菊醇新用途领域，具体涉及异甜菊醇在制备治疗自身免疫性肝炎药物中的应用。

背景技术

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一种针对肝脏组织异常免疫反应所致的肝脏炎症性疾病。是遗传易感个体中T细胞介导的自身免疫反应。与所有其他自身免疫性疾病类似，AIH的确切发病机制尚不清楚，可能与遗传、环境及偶然因素相关。编码主要组织相容性复合蛋白的几种HLA基因型会增加发生AIH的风险。AIH可表现为从非常轻微的亚临床疾病到暴发性急性肝衰竭，其临床特点包括血清氨基转移酶水平升高、高免疫球蛋白G血症、血清自身抗体阳性，肝组织学上存在中重度界面性肝炎等。AIH可影响各年龄段的人群，75％～80％的患者为女性。并可发生在所有民族和地理区域中，在西方国家的发病率为15～25/10万。AIH患者如不进行临床干预，可迅速进展为肝硬化或终末期肝病。目前主要采用的治疗方案为非特异性免疫抑制剂糖皮质激素联合硫唑嘌呤；对硫唑嘌呤不耐受和对标准治疗反应不充分的患者可能需要替代疗法，包括霉酚酸酯。标准治疗能显著改善大多数中重度AIH患者的肝生化指标并延长生存期，但至少有10％～15％的患者对标准治疗方案应答不佳。另有部分患者因不能耐受药物副作用或停药造成复发。AIH患者通常需要终生服用药物。长期使用过程中不良反应增多。糖皮质激素的不良反应有“Cushing体征”、加重骨质疏松、高血糖、白内障、高血压病、感染以及精神疾病等；硫唑嘌呤最常见的不良反应是骨髓抑制。目前尚无不良反应少且治疗效果好的AIH治疗药物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了异甜菊醇(isosteviol)在制备治疗自身免疫性肝炎药物中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

异甜菊醇在制备治疗自身免疫性肝炎的药物中的应用。

可选地，所述药物是

以异甜菊醇作为单一成分所制成；或者

以异甜菊醇作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成。

可选地，所述的药学上可接受的辅料为淀粉、乳糖、微晶纤维素、β环糊精、羧甲基淀粉钠中的一种或多种。

一种治疗自身免疫性肝炎的药物，有效成分包括异甜菊醇。

可选地，还包括药学上可接受的辅料。

可选地，所述药物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液。

可选地，所述药物能够减轻肝细胞肿胀和坏死。

可选地，所述药物能够降低血清转氨酶和/或血清乳酸脱氢酶水平。

可选地，所述药物能够降低炎症因子与趋化因子的mRNA水平。

本发明的有益效果：

相对于现有技术，本发明发现了异甜菊醇能改善伴刀豆球蛋白A导致的小鼠免疫性肝损伤，减少肝组织的破坏，抑制炎症细胞浸润。抑制血清转氨酶升高及炎症因子水平上升。这些作用表明异甜菊醇可用于自身免疫性肝炎的治疗，具有开发药物的前景。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1.异甜菊醇的化学结构式

图2.异甜菊醇抑制伴刀豆球蛋白A诱导的小鼠肝损伤。Balb/c小鼠尾静脉注射20mg/kg伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,Con A)后，分别使用50mg/kg或100mg/kg的异甜菊醇给小鼠灌胃。注射伴刀豆球蛋白A 8h后，收集小鼠血清及肝脏组织。肝组织H&E染色分析肝细胞内组织病理学改变(A)，检测肝脏指数(B)，测定小鼠血清丙氨酸转氨酶以及天冬氨酸转氨酶(C)，乳酸脱氢酶(D)，碱性磷酸酶(E)，总蛋白(F)，血清甘油三酯和总胆固醇(G)。数值用SD±SEM表示，先用单因素方差进行统计分析，再以Student's t-test来检验各组间的差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns，没有显著性差异。缩写：Con A，伴刀豆球蛋白A；ISV，异甜菊醇；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；LDH，乳酸脱氢酶；ALP,碱性磷酸酶；TP，总蛋白；TG，甘油三酯；TC，总胆固醇。

图3.异甜菊醇抑制伴刀豆球蛋白A诱导的小鼠血清炎症因子水平升高。Balb/c小鼠尾静脉注射20mg/kg注射伴刀豆球蛋白A，再分别给小鼠灌胃50mg/kg或100mg/kg的异甜菊醇(isosteviol)。8h后收集小鼠血清。按照ELISA试剂盒说明书测定小鼠血清中的炎症因子IL-6(A)、TNF-α(B)和IL-1β(C)的水平。数值用SD±SEM表示，先用单因素方差进行统计分析，再以Student's t-test来检验各组间的差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns，没有显著性差异。缩写：Con A，伴刀豆球蛋白A；IL-6，白细胞介素6；TNF-α肿瘤坏死因子α；IL-1β，白细胞介素1β。

图4.异甜菊醇抑制伴刀豆球蛋白A诱导的小鼠肝脏组织炎症因子及趋化因子mRNA水平升高。Balb/c小鼠尾静脉注射20mg/kg注射伴刀豆球蛋白A，再分别给小鼠灌胃50mg/kg或100mg/kg的异甜菊醇(isosteviol)。8h后收集小鼠肝脏组织。采用荧光实时定量PCR分别测定肝脏组织中炎症因子IL-6(A)、TNF-α(B)和IL-1β(C)的mRNA水平以及MIP-1α(D)、ICAM-1(E)和CXCR 10(F)的mRNA水平。数值用SD±SEM表示，先用单因素方差进行统计分析，再以Student's t-test来检验各组间的差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns，没有显著性差异。缩写：Con A，伴刀豆球蛋白A；IL-6，白细胞介素6；TNF-α肿瘤坏死因子α；IL-1β，白细胞介素1β；MIP-1α，巨噬细胞炎症蛋白1α；ICAM-1，细胞间黏附分子1；CXCR 10，C-X-C基序趋化因子10。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一、试验方法

1.伴刀豆球蛋白A诱导小鼠免疫性肝损伤模型

小鼠尾静脉注射伴刀豆球蛋白A造成的肝损伤模型是模拟人类自身免疫性肝炎的公认的经典动物模型。Balb/c小鼠，雄性，体重18～22g。饲养期间不限饮食，并维持12h昼/夜节律。Balb/c小鼠按照体重随机分成4组，每组15只。4组分别为对照组、刀豆蛋白诱导的免疫性肝损伤模型组、异甜菊醇50mg/kg剂量治疗组及异甜菊醇100mg/kg剂量治疗组。对照组小鼠尾静脉注射无菌生理盐水；模型组小鼠及异甜菊醇治疗组小鼠尾静脉注射伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,Con A)生理盐水溶液，剂量为20mg/kg。随后，用生理盐水给模型组小鼠灌胃，分别用50mg/kg异甜菊醇或者100mg/kg异甜菊醇给治疗组小鼠灌胃。在注射伴刀豆球蛋白A 8h后，用戊巴比妥钠麻醉小鼠致死，采集实验小鼠血液样本及肝脏组织样本。

2.异甜菊醇对伴刀豆球蛋白A诱导的肝组织损伤保护作用

将采集的小鼠血液样本，放置于室温30min，使其充分凝血。6,000×g离心10min，收集上层血清。用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)，天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)，乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)，总蛋白(total protein,TP)，甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)的水平。

称重肝脏样本，测定肝脏指数(liver index)。肝脏指数＝小鼠肝脏重量/小鼠体重×100％。部分肝脏组织用4％的多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，H&E染色，在光学显微镜下阅片，检查小鼠肝脏损伤情况。

3.异甜菊醇对伴刀豆球蛋白A诱导的血清炎症因子水平升高的影响

用ELISA法按照试剂盒说明测定血清中的炎症因子白细胞介素6(interleukin6,IL-6)，白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)的水平。

4.异甜菊醇对伴刀豆球蛋白A诱导的肝脏组织炎症相关因子水平的影响

部分肝脏组织用于提取总RNA。在适量的肝脏组织中加入1ml Trizol，用匀浆器匀浆，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，用力震摇15s，室温静置2～15min，4℃，12,000×g离心15min。转移上层水相至另一个去除RNase的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀。室温静置5～10min，4℃，12,000×g离心10min。弃上清，RNA沉淀用75％的乙醇洗涤，旋涡振荡器混匀，4℃，7,500×g离心5min。室温条件下吹干，用30μl DEPC处理过的水溶解沉淀，55℃水浴10min使RNA沉淀充分溶解。用核酸蛋白测定仪测定总RNA A₂₆₀/A₂₈₀比值，计算总RNA浓度。总RNA样本立即进行逆转录反应或者保存于-80℃待用。

按照逆转录试剂盒说明将定量的总RNA逆转录为cDNA。随后用AppliedBiosystems ABI 7300型定量PCR仪测定小鼠肝脏组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、巨噬细胞炎症蛋白1(MIP-1α)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和C-X-C基序趋化因子10(CXCR 10)的mRNA水平。引物序列分别为：IL-6，5’-CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC-3’和5’-CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT-3’；TNF-α，5’-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3’和5’-TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG-3’；IL-1β，5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’和5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；MIP-1α，5’-TTCTCTGTACCATGACACTCTGC-3’和5’-CGTGGAATCTTCCGGCTGTAG-3’；ICAM-1，5’-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3’和5’-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3’；CXCR 10，5’-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3’和5’-GGCTCGCAGGGATGATTTCAA-3’；GAPDH，5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’和5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。按照SYBR GreenER^TMqPCRSuperMix试剂盒说明加入cDNA模板，引物及SYBR Green预混液。反应步骤为：50℃，2min；95℃ 10min激活DNA多聚酶。95℃，15s，60℃,60s，循环40次。

二、试验结果

1.异甜菊醇抑制伴刀豆球蛋白A诱导的小鼠肝损伤

20mg/kg的伴刀豆球蛋白A能在8h内诱导Balb/c小鼠出现显著的肝脏组织损伤。对照组小鼠肝组织着色均匀，肝索排列整齐，肝小叶结构清晰，肝细胞形态完好，未见明显异常变化；伴刀豆球蛋白A模型组小鼠肝组织着色深，肝细胞排列紊乱，界限模糊，肝血窦充血，部分肝细胞肿胀并有少量肝细胞坏死，局部区域出现炎性细胞浸润；异甜菊醇治疗组小鼠肝细胞排列整齐，界限清晰，肝细胞肿胀和坏死程度减轻，炎症细胞浸润减少(图2.A)。从组织切片的H&E染色中，可以看到异甜菊醇能够减少肝脏组织的损伤面积及损伤程度，对伴刀豆球蛋白A诱导的肝损伤具有显著的抑制作用(图2.A)。小鼠的肝脏指数结果也显示了刀豆蛋白可能导致肝脏肿大，肝组织受损，而异甜菊醇能够减轻肝脏组织肿大(图2.B)。血生化指标也显示了伴刀豆球蛋白A对小鼠肝脏的损伤作用，表现为血清转氨酶ALT、AST以及LDH水平的升高；而50mg/kg及100mg/kg的异甜菊醇能够显著地抑制伴刀豆球蛋白A诱导的血清转氨酶及LDH水平上升(图2.C和D)，表明异甜菊醇对免疫性肝损伤具有保护作用。

鉴于异甜菊醇是在伴刀豆球蛋白A诱导损伤开始后给予的治疗给药方式，表明异甜菊醇在治疗自身免疫性肝炎中具有更强的药理作用，以及更好的应用价值。

20mg/kg的伴刀豆球蛋白A对小鼠血清中的碱性磷酸酶、总蛋白没有显著影响，异甜菊醇对这些指标也无作用(图2.E和F)。伴刀豆球蛋白A能够略微升高血清甘油三酯水平，而异甜菊醇对刀豆蛋白引起的血脂水平改变没有影响(图2.G)。

2.异甜菊醇抑制伴刀豆球蛋白A诱导的血清炎症因子水平升高

伴刀豆球蛋白A能够激活机体的免疫系统，导致大量的炎症因子释放，诱发并加重肝脏组织损伤。20mg/kg的伴刀豆球蛋白A升高小鼠血清IL-6、TNF-α及IL-1β的水平，而异甜菊醇能够剂量依赖性地降低这些炎症因子的水平(图3)。表明异甜菊醇可能通过抑制炎症反应而发挥治疗免疫性肝损伤的作用。

3.异甜菊醇抑制伴刀豆球蛋白A诱导的肝脏组织炎症相关因子表达

伴刀豆球蛋白A激活免疫系统后导致肝脏组织损伤严重，与大量的炎症因子释放及趋化因子表达上调有关。20mg/kg的伴刀豆球蛋白A上调小鼠肝脏中IL-6、TNF-α、IL-1β、MIP-1α、ICAM-1和CXCR 10的mRNA水平(图4)。异甜菊醇能够显著地下调这些细胞因子的mRNA水平，进而减少肝细胞损伤及免疫细胞的浸润，起到保护肝细胞的作用。异甜菊醇抑制肝脏组织炎症相关因子的表达呈现出剂量依赖性。

通过上述的试验，反映出异甜菊醇能改善伴刀豆球蛋白A导致的小鼠免疫性肝损伤，减少肝组织的破坏，抑制炎症细胞浸润。抑制血清转氨酶升高及炎症因子水平上升。这些作用表明异甜菊醇可用于自身免疫性肝炎的治疗，能够作为药物使用。

在本发明的一些示例中，所述的药物，既可以是以异甜菊醇作为单一成分所制成的，也可以是以异甜菊醇作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的。

在本发明的一些示例中，所述的药物可以是但不限于注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液。

在本发明的一些示例中，所述的药学上可接受的辅料可以是，淀粉、乳糖、微晶纤维素、β环糊精、羧甲基淀粉钠等。

在本发明的示例中，治疗目的是预防或减慢(减轻)自免疫性肝炎及其相关病症，或获得有益的或期望的临床结果。本发明中，有益的或期望的临床结果包括但不限于，减轻症状；减小/缩小该情况、病症或疾病的程度；稳定(即非恶化)该情况、病症或疾病。在发明的示例中，治疗还可以包括引发临床有效响应而没有过度水平的副作用。

在本发明的示例中，治疗也包括与如果不接受治疗的预期的存活期相比延长存活期。治疗还可以指给药药物或对患者执行医疗程度。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims

1.异甜菊醇在制备治疗自身免疫性肝炎的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是

以异甜菊醇作为单一成分所制成；或者

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药学上可接受的辅料为淀粉、乳糖、微晶纤维素、β环糊精、羧甲基淀粉钠中的一种或多种。