CN113143895B - 奇任醇在早产儿脑损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供奇任醇在早产儿脑损伤中的应用，属于生药医药技术领域。本发明首次证实奇任醇可以通过减少炎症因子IL‑6、TNF‑α和IL‑1β的表达从而减轻小鼠感染所导致的白质损伤。同时通过行为学实验验证奇任醇还可对小鼠远期的运动具有一定的治疗作用，因此可以被认为是早产儿脑损伤特别是脑白质损伤的潜在候选药物，因此具有重要的临床应用价值。本发明为奇任醇开辟了新的药物用途，也为开发高效的早产儿脑损伤特别是早产儿脑白质损伤相关药物奠定实验基础并提供新的视野。

Description

奇任醇在早产儿脑损伤中的应用

技术领域

本发明属于生药医药技术领域，具体涉及奇任醇在早产儿脑损伤中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

据世界卫生组织(WHO)报道，早产儿的发生率在逐年上升。虽然先前早产儿的预后有了很大的改善，但早产儿脑损伤所带来的后遗症等仍然是影响早产儿远期的生存质量的严重问题。早产儿脑损伤涉及复杂的发病机制，如缺氧过多，自身脑血管调节力差等，大量研究表明感染可引起早产儿脑损伤，并且是早产儿脑损伤发生的独立危险因素之一，但具体机制尚不明确。在所有早产儿脑损伤的预后中，以脑白质损伤预后的结果最为不理想，可导致早产儿远期的认知、运动发育落后，甚至造成脑瘫。目前早产儿脑白质损伤尚无可靠的治疗方法，早产儿脑损伤仍以预防为主，应尽力避免早产，生后应稳定血压，减少脑血流变化，减少缺氧发生，避免感染，采用合适的呼吸支持等。儿童因为机体发育尚未成熟，药物在体内代谢有其特殊性和复杂性,致使一些药物不适用于12岁以下儿童。在临床工作中,多年来儿童用药剂量的确定均采用年龄、体重或体表面积来折算，但影响儿童用药剂量的因素是多方面的，儿童的合理用药应引起医生和家长的关注。

我国药用植物约11,146种，是世界上药用植物资源最丰富的国家之一。中药单体是指从中药中经过提取分离的单一有效成分，兼有中药与化药的双重优势。中国传统中药与中药单体在早产儿脑病治疗方面积累了大量经验，在白质损伤保护方面具有独特优势，可供研发的空间很大。因此，寻找安全有效，副作用低的绿色天然植物药治疗早产儿脑损伤，减少脑部过度发炎，防止侵入性感染变得极为重要。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供奇任醇在早产儿脑损伤中的应用，本发明首次证实奇任醇可以通过减少炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达从而减轻小鼠感染所导致的白质损伤。同时通过行为学实验验证奇任醇还可对小鼠远期的运动具有一定的治疗作用，因此可以被认为是早产儿脑损伤特别是脑白质损伤的潜在候选药物，因此具有重要的临床应用价值。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供奇任醇在制备治疗早产儿脑损伤药物中的应用。

根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗早产儿脑损伤的相关措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。

更具体的，所述早产儿脑损伤为早产儿脑白质损伤。

所述治疗早产儿脑白质损伤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：

a)改善早产儿脑白质损伤导致的体重降低；

b)改善早产儿脑白质损伤后短期神经反射；

c)降低早产儿脑白质损伤后炎症因子的表达；

d)促进早产儿脑白质损伤后白质损伤部位的恢复；

e)改善早产儿脑白质损伤后长期运动能力。

所述b)中，改善早产儿脑白质损伤后短期神经反射具体表现在改善早产儿脑白质损伤导致的翻正反射障碍和/或降低早产儿脑白质损伤导致的趋地性反射时间的延长；

所述c)中，促炎因子包括，但不限于IL-6、TNF-α和IL-1β，本发明通过试验证明，脑白质损伤后小鼠病变部位中IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA水平增加，而应用奇任醇治疗后病变部位中IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA水平均降低，且表达差异具有统计学意义。

所述d)中，促进早产儿脑白质损伤后白质损伤部位的恢复具体表现为促进白质损伤部位组织结构和细胞形态的恢复。

所述e)中，改善早产儿脑白质损伤后长期运动能力具体表现为提高运动协调性。

根据本发明，不仅公开了奇任醇在制备治疗早产儿脑损伤药物中的应用，而且还公开了，施用奇任醇与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，奇任醇还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的第二个方面，提供一种治疗早产儿脑损伤的药物组合物，所述药物组合物由奇任醇与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的奇任醇对早产儿脑损伤具有明显治疗作用。

本发明的第三个方面，提供奇任醇在制备炎症因子抑制剂中的应用：

其中，炎症因子包括，但不限于IL-6、TNF-α和IL-1β。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次发现奇任醇可以通过减少促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达从而减轻小鼠感染所导致的白质损伤。同时通过行为学实验验证奇任醇还可对小鼠远期的运动具有一定的治疗作用，因此可以被认为是早产儿脑损伤特别是脑白质损伤的潜在候选药物，因此具有重要的临床应用价值。

综上，上述技术方案为奇任醇开辟了新的药物用途，也为开发高效的早产儿脑损伤特别是早产儿脑白质损伤相关药物奠定实验基础，同时也提供新的视野。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中奇任醇改善脂多糖诱导的体重降低和短期神经反射。A.第4.5.6天时，对照组，脂多糖处理组，治疗组三组的体重增长率。B.负地轴。C.反正反射。数据结果表示为均数±标准差。与对照组相比*P＜0.05；脂多糖组与治疗组相比^#P＜0.05，NS无意义。

图2为本发明实施例中奇任醇降低脂多糖诱导的炎症因子增加以及促进白质损伤部位的恢复。

A.在第7天，通过HE染色检测不同组中白质损伤情况。比例尺，100μm。

B.给药第11天，通过Real time PCR检测脑组织促炎因子的表达水平。独立实验重复三次，数据结果表示为均数±标准差，^#*P＜0.05，NS无意义。

图3为本发明实施例中奇任醇治疗改善脂多糖诱导的长期的运动功能受损A.第14天，通过免疫荧光染色检测不同组MBP表达情况。

B.脂多糖处理后4周,通过旋转棒测检测小鼠运动功能。独立实验重复三次，数据结果表示为均数±标准差，独立实验重复三次，数据结果表示为均数±标准差，^#*P＜0.05，NS无意义。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

如前所述，中国传统中药与中药单体在早产儿脑病治疗方面积累了大量经验,在白质损伤保护方面具有独特优势,可供研发的空间很大。因此，寻找安全有效，副作用低的绿色天然植物药治疗早产儿脑损伤，减少脑部过度发炎，防止侵入性感染变得极为重要。

奇任醇(CAS：52659-56-0)是从中草药腺梗豨莶提取的主要活性二萜类成分。胃肠吸收实验能在一定程度上反应药物的吸收程度与速率，对制剂开发具有重要的指导意义，奇任醇的吸收实验表明奇壬醇的吸收良好，奇任醇在大鼠体内吸收迅速，在25分钟内血药浓度快速上升高达峰后又迅速消除，8h后在血浆中基本检测不到奇任醇。已有文献报道，其在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)中具有抗炎作用。奇任醇还具有免疫调节作用，在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，奇任醇可以抑制增殖并诱导炎性淋巴细胞凋亡。此外奇任醇还具有抗肿瘤和抗紫外线的光老化特性。奇壬醇可下调的关键脂肪生成转录因子的表达水平和3T3-L1脂肪细胞在体外的脂肪生成抑制。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供奇任醇在制备治疗早产儿脑损伤药物中的应用。

根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗早产儿脑损伤的相关措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。

本发明的又一具体实施方式中，所述早产儿脑损伤为早产儿脑白质损伤。

本发明的又一具体实施方式中，所述治疗早产儿脑白质损伤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：

a)改善早产儿脑白质损伤导致的体重降低；

b)改善早产儿脑白质损伤后短期神经反射；

c)降低早产儿脑白质损伤后炎症因子的表达；

d)促进早产儿脑白质损伤后白质损伤部位的恢复；

e)改善早产儿脑白质损伤后长期运动能力。

所述b)中，改善早产儿脑白质损伤后短期神经反射具体表现在改善早产儿脑白质损伤导致的翻正反射障碍和/或降低早产儿脑白质损伤导致的趋地性反射时间的延长；

所述c)中，促炎因子包括，但不限于IL-6、TNF-α和IL-1β，本发明通过试验证明，脑白质损伤后小鼠病变部位中IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA水平增加，而应用奇任醇治疗后病变部位中IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA水平均降低，且表达差异具有统计学意义。

所述d)中，促进早产儿脑白质损伤后白质损伤部位的恢复具体表现为促进白质损伤部位组织结构和细胞形态的恢复。

所述e)中，改善早产儿脑白质损伤后长期运动能力具体表现为提高运动协调性。

根据本发明，不仅公开了奇任醇在制备治疗早产儿脑损伤药物中的应用，而且还公开了，施用奇任醇与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，奇任醇还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗早产儿脑损伤的药物组合物，所述药物组合物由奇任醇与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的奇任醇对早产儿脑损伤具有明显治疗作用。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

本发明的又一具体实施方式中，提供奇任醇在制备炎症因子抑制剂中的应用：

其中，炎症因子包括，但不限于IL-6、TNF-α和IL-1β。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

一、材料与方法

1.动物模型制备

根据国际医学组织理事会(CIOMS)提供的《动物研究国际指导原则》进行动物实验，程序已得到山东大学动物伦理与福利委员会的批准。将新生鼠随机分为对照组与实验组,实验组于生后3d至5d分别腹腔注射脂多糖0.5mg/(kg·d)，0.8mg/(kg·d)，1.0mg/(kg·d)一次,建立新生大鼠脑白质损伤模型,对照组注射等量的生理盐水；放回母鼠身边自由哺乳,室温22.0～25.9℃,室内氧浓度21％,避免强光和噪音刺激,12h光照与黑暗交替。

2.小鼠腹腔注射及药物处理

根据制造商的说明书制备奇任醇(德思特，中国成都)工作溶液和阴性对照溶液。(奇任醇溶于含有1％DMSO的生理盐水)。小鼠随机分为三组对照组，脂多糖+奇任醇组，脂多糖+生理盐水组。简而言之，在小鼠脂多糖处理之前24小时进行腹腔注射奇任醇(2mg/kg)，每天一次，持续4天。脂多糖+生理盐水组中的小鼠腹腔注射含有1％DMSO的生理盐水(2mg/kg)。

3.组织学染色

脂多糖处理后24小时，对小鼠进行异氟烷深度麻醉以使其安乐死，并用10ml生理盐水进行心脏灌注，然后用10mL 4％PFA灌注，将小鼠脑在4％PFA中固定24小时。使用二甲苯和乙醇进行梯度脱水，将大脑包埋在石蜡中，切成4μm厚的冠状切片，以进行后续染色。苏木精曙红(HE)(KeyGEN BioTECH,中国江苏)根据制造商说明进行染色以观察组织病理学变化。图像是用光学显微镜(OLYMPUS-BX51)获得。

4.RNA分离和实时定量PCR

脂多糖处理后24小时，收集小鼠脑组织，并在TRIZOL溶液(Invitrogen)中匀浆。提取总RNA，然后通过分光光度计测量其浓度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNASynthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)将RNA转化为cDNA，并通过SYBR GreenRealtime PCR Master Mix(TOYOBO)进行实时PCR。β肌动蛋白基因为内参，使用2^-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。检测炎症因子(IL-6，TNF-α，IL-1β)mRNA的表达。

TNF-α基因上游引物为5’-TCTCATTCCTGCTTGTGGC-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物为5'-CACTTGGTGGTTTGCTACG-3'(SEQ ID NO.2)；

IL-6基因上游引物为5'-TCCATCCAGTTGCCTTCTTG-3’(SEQ ID NO.3)；下游引物为5'-AAGCCTCCGACTTGTGAAGTG-3'(SEQ ID NO.4)；

IL-1β基因上游引物为5'-AGCATCCAGCTTCAAATC-3’(SEQ ID NO.5)；下游引物为5'-CTTCTCCACAGCCACAAT-3'(SEQ ID NO.6)；

5.翻正反射

将小鼠固定于仰卧位置，记录小鼠翻转至俯卧位置所花费的时间。(以秒为单位)。对每只小鼠进行3次测试，并计算3次测试的平均值。

6.负趋地性测试

将小鼠放置在30厘米长的倾斜板上(45度)，其头朝下。在60秒的测试中，记录了动物转身180°所需的时间(以秒为单位)。对每只小鼠进行3次测试，并计算3次测试的平均值。

7.旋转棒测试

为了评估小鼠HIE后运动协调性，在HIE损伤后4周使用旋转棒疲劳仪(赛昂斯，中国江苏)进行旋转棒测试。在正式实验开始前，每只小鼠以10rpm的固定速度适应训练10s。训练后，将棒的转速从10rpm逐渐加速到40rpm，持续120s，并通过设备记录小鼠运动时间。直到动物从旋转棒上坠落，时间记录停止。此段时间称为小鼠在棒时间。如果动物持续奔跑超过120s，则终止测试，并将小鼠在棒时间视为120s。

8.荧光染色

实验动物用10％的水合氯醛麻醉，然后用4％的多聚甲醛灌流取脑后固定，30％的蔗糖沉糖后冰冻切片，进行免疫荧光染色。详细如下：用PBST洗三遍，每次10分钟；透化与封闭1小时；一抗孵育，4℃过夜；PBS洗涤；荧光二抗避光孵育1小时；PBS洗涤，荧光二抗室温孵育1小时；PBST洗涤；防荧光淬灭剂封片。荧光显微镜下拍照并分析。

9.统计分析

使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。值表示为平均值±标准差。使用单向方差分析(ANOVA)进行统计分析，然后采用Tukey检验对均值进行多次比较，显着性设定为P<0.05.

二、实验结果

1.奇任醇改善脂多糖诱导的体重降低和短期神经反射

首先，我们对小鼠体重和短期的神经反射进行观察。图1A的实验结果表明在第3、4、5天，奇任醇处理组较对照组而言，显著改善脂多糖处理导致的体重降低。图1B实验结果表明，与对照组组相比，脂多糖处理组翻正反射时间延长(P＜0.05)，应用奇任醇治疗后，与脂多糖处理组相比，小鼠翻正反射时间缩短(P﹤0.05)，表明奇任醇可以改善新生小鼠脂多糖处理后翻正反射障碍；图1C脂多糖处理后24小时，小鼠进行趋地性反射测试，结果表明，与对照组相比，脂多糖处理组小鼠趋地性反射时间延长(P＜0.05)，应用奇任醇治疗后，小鼠趋地性反射时间下降(P﹤0.05)。

2.奇任醇降低脂多糖诱导的炎症因子增加以及促进白质损伤部位的恢复

接下来对小鼠进行形态学及炎症因子表达情况进行检测。如图2A所示，在第7天取鼠脑固定进行HE染色检测白质部位损伤恢复情况。结果所示，对照组，脑组织结构清晰，排列紧密，结构形态正常，细胞结构形态基本正常，无显著的病理学变化。脂多糖处理组可见白质部位组织排列紊乱疏松，结构欠清，细胞结构肿胀。在应用奇任醇治疗后，白质部位组织结构及细胞形态恢复明显。同时我们进一步通过Real time PCR在基因水平检测了炎症相关因子IL-6和TNF-α，IL-1β的表达，如图2B所示，与脂多糖处理组相比，给药处理组促炎因子IL-6和TNF-α，IL-1β均降低(P＜0.05)，表达差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3.奇任醇治疗改善脂多糖诱导的长期运动功能受损

最后，对小鼠进行长期形态学及运动能力的观察。如图3A结果所示，脂多糖处理后降低了MBP免疫荧光的表达，经奇任醇治疗后，MBP的荧光表达明显增高。脂多糖处理后4周,小鼠进行了旋转棒测试。图3B结果表明,与对照组相比，脂多糖处理后小鼠在试验期间会从旋转棒上快速掉落，表现出较差的运动协调性，而奇任醇治疗组的小鼠在旋转棒上停留时间增加，表现为其较强的运动协调性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 奇任醇在早产儿脑损伤中的应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctcattcct gcttgtggc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacttggtgg tttgctacg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccatccagt tgccttcttg 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 18

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<213> 人工序列

<400> 5

agcatccagc ttcaaatc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttctccaca gccacaat 18

Claims (7)

1.奇任醇在制备治疗早产儿脑损伤药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述早产儿脑损伤为早产儿脑白质损伤。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗早产儿脑白质损伤至少表现在具有如下任意一种或多种用途：

a)改善早产儿脑白质损伤导致的体重降低；

b)改善早产儿脑白质损伤后短期神经反射；

c)降低早产儿脑白质损伤后炎症因子的表达；

d)促进早产儿脑白质损伤后白质损伤部位的恢复；

e)改善早产儿脑白质损伤后长期运动能力。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述b)中，改善早产儿脑白质损伤后短期神经反射具体表现在改善早产儿脑白质损伤导致的翻正反射障碍和/或降低早产儿脑白质损伤导致的趋地性反射时间的延长。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述c)中，促炎因子包括IL-6、TNF-α和IL-1β。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述d)中，促进早产儿脑白质损伤后白质损伤部位的恢复具体表现为促进白质损伤部位组织结构和细胞形态的恢复。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述e)中，改善早产儿脑白质损伤后长期运动能力具体表现为提高运动协调性。

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