CN110200981A

CN110200981A - 五环三萜皂苷的医药用途及其药物组合物

Info

Publication number: CN110200981A
Application number: CN201910495350.2A
Authority: CN
Inventors: 孙宏斌; 刘柳; 戴量; 柳军
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2019-09-06
Also published as: EP3973965A1; WO2020244454A1; US20220331348A1; EP3973965A4

Abstract

本发明公开了式(I)～(XIII)所示的五环三萜皂苷在制备预防或治疗AMPK介导的疾病包括脂肪性肝病、炎症性肠病、呼吸系统疾病、糖尿病并发症和多囊肾病等的药物中的用途。式(I)～(XIII)化合物尤其对于非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性阻塞性肺病、哮喘、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病溃疡和常染色体显性多囊肾病等疾病有效。本发明预防和治疗AMPK介导的疾病的药物组合物含有治疗有效量的式(I)～(XIII)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成份和药学上可接受的辅料；

Description

五环三萜皂苷的医药用途及其药物组合物

技术领域

本发明属于医药范畴，具体涉及五环三萜皂苷在制备预防或治疗AMPK介导的疾病的药物中的用途及一种药物组合物，该药物组合物对于AMPK介导的疾病非常有效，其包含五环三萜皂苷或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成分。所述AMPK介导的疾病包括脂肪性肝病、炎症性肠病、呼吸系统疾病、糖尿病并发症和多囊肾病等，尤其是非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性阻塞性肺病、哮喘、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病溃疡和常染色体显性多囊肾病等。

背景技术

AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)是调控机体能量代谢及炎症反应的关键激酶，其磷酸化激活可克服胰岛素抵抗、降血糖、降血脂(通过抑制脂肪酸及胆固醇的合成)、抗炎、抗凋亡、抗纤维化、促进线粒体合成、增强线粒体的氧化代谢、抗衰老和抗肿瘤等(Physiol.Rev.2009,89,1025)。近年来，AMPK的抗炎及抗纤维化作用已越发受到关注(Nature 2013,493,346)，其可能的机制是AMPK通过增强雌激素相关受体α(ERRα)的转录功能而发挥抗炎和抗纤维化作用(Immunity 2015,43,80)。

越来越多的证据表明，AMPK功能异常与多种疾病的发生发展密切相关。AMPK介导的疾病包括代谢性疾病和心脑血管疾病，如胰岛素抵抗、代谢综合征、1型或2型糖尿病、高脂血症、肥胖症、动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌梗死、心律失常、冠心病、高血压、心衰、心肌肥大、心肌炎、糖尿病并发症(包括糖尿病心肌病、糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变和糖尿病溃疡等)、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝、肝硬化、痛风、中风或脑梗死等；AMPK介导的疾病还包括炎症疾病、自身免疫性疾病、器官纤维化疾病、神经损伤性疾病或病原体感染所致的继发性疾病，如肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、肺气肿、闭塞性细支气管炎、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、多囊肾病、多囊卵巢综合征(PCOS)、白塞氏病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、脊椎关节炎、骨关节炎、滑膜炎、肌腱炎、血栓闭塞性脉管炎、静脉炎、间歇性跛行、瘢痕瘤、银屑病、鱼鳞癣、大疱性类天疱疮、皮炎、接触性皮炎、胰腺炎、慢性肾炎、膀胱炎、脑膜炎、胃炎、败血症、坏疽性脓皮症、葡萄膜炎、帕金森病、阿尔茨海默病、α-共核蛋白病、抑郁症、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化病、纤维肌痛综合症、神经痛、唐氏综合征、哈勒沃登-施帕病、亨廷顿舞蹈病或威尔逊病等。

文献报道AMPK激动剂可预防和治疗多种AMPK介导的疾病(J.Med.Chem.,2015,582；Nature 2013,493,346；Experimental Neurology 2017,298,31；BiochemicalPharmacology 2010,80,1708；Current Drug Targets,2016,17,908)。例如，临床上广泛使用的二甲双胍和小檗碱被认为主要是通过激活AMPK而发挥多种临床功效(J.Clin.Invest.2001,108,1167)。尽管AMPK激动剂具有广泛的临床应用前景，然而，迄今为止，研制新型安全、有效的AMPK激动剂尚未取得实质性进展。由于安全性或有效性的原因，在研的AMPK激动剂进入临床研究阶段的寥寥无几。例如，广谱AMPK-β亚基激动剂MK-8722尽管可以降血糖，但在大鼠和猴子实验中发现动物心脏发生不可逆性心肌肥厚副作用(Science 2017,357,507)。此外，AICAR作为最被广泛研究的AMPK激动剂之一，也因其较大的毒副作用而被终止了临床实验(J Clin Pharmacol 1991,31:342–347)。总之，临床上亟需开发活性高、毒副作用小的新型AMPK激动剂。

脂肪性肝病是由酒精或非酒精因素引起的脂肪性肝脏病变。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及NASH诱发的肝硬化(Science 2011，332,1519)。目前，NAFLD已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，尤其严重的是，NASH患者肝脏的重度炎症和纤维化是原发性肝癌和终末期肝病的常见原因，是需要肝移植手术的第三最常见适应症。公认的NASH的病理机制是“二次打击”假说(J.Gastroenterol.Hepatol.2013,28(SI 1),68)：“第一次打击”是肝脏脂肪堆积；“第二次打击”是肝脏脂肪堆积引发的氧化应激和炎性细胞因子的过度释放，导致肝脏炎症和肝纤维化，进而导致肝硬化和肝癌。需要特别指出的是，可降低血清中脂质水平的药物并不一定能降低肝脏脂质水平(如非诺贝特)，并且会有影响肝功能的风险；另一方面，可降低肝脏脂质水平的药物也不一定能降低血清中脂质水平(如乙酰辅酶A羧化酶抑制剂)，甚至可能会升高血清脂质水平，具体的分子机制目前尚不清楚。目前，临床上尚无有效的NASH治疗药物，尤其缺乏同时针对“两次打击”的药物。越来越多的研究表明，非酒精性脂肪性肝病(尤其是NASH)的病理机制与AMPK功能异常密切相关(Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.2016,311:E730)。临床上广泛使用的二甲双胍和小檗碱被认为主要是通过激活AMPK而发挥抗非酒精性脂肪性肝病(特别是NASH)的功效(Diabetes Frontier 2013,24(4),418；Experimental and Therapeutic Medicine 2017,14(5),4134)，但这两个药物都是线粒体复合物I的抑制剂，存在乳酸中毒的风险。目前临床推荐使用的NASH治疗药物包括胰岛素增敏剂如吡格列酮等，但上述药物的临床疗效有限。一项III期临床实验结果表明，吡格列酮对肝纤维化并无改善(N.Engl.J.Med.2010,362,1675)，且其存在骨折和体重增加等副作用以及心力衰竭风险(Hepatology,2010,51,366)。临床在研的抗NASH新药包括法尼酯X受体(FXR)激动剂(如奥贝胆酸)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂(如GS-0976)和凋亡信号调节激酶-1(ASK1)抑制剂(如Selonsertib)等。然而上述抗NASH新药的疗效和安全性有待进一步验证。例如，奥贝胆酸在临床试验中显示了显著疗效，但其升高低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和瘙痒副作用可能限制其临床应用(Lancet 2015,385,956)。综上所述，临床上迫切需要安全有效的新型抗非酒精性脂肪性肝炎的药物。

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一类累及肠道的慢性非特异性炎症疾病，主要可分为溃疡性结肠炎和克罗恩病这两种疾病。炎症性肠病的发病机制不明确，可能由于多种因素导致包括环境影响污染，长期吸烟，饮酒，饮食不规律，滥用抗生素，遗传变异，感染与肠道菌群紊乱等因素。炎症性肠病在西方国家的发病率高于我国，但近年来随着我国居民生活规律的变化，其发病率呈逐年增长的态势。目前临床上对于其治疗药物包括氨基水杨酸类(5-氨基水杨酸，柳氮磺胺吡啶等)，糖皮质激素类(氢化可的松，布地奈德等)，免疫抑制剂类(硫唑嘌呤，甲氨喋呤等)及抗炎症因子单抗类(阿达木单抗，英夫利昔单抗等)等。虽然可用药物种类较为丰富，但仅能部分缓解该病的病情，很难做到完全治愈，患者往往终身伴随着疾病的困扰。二甲双胍对炎症性肠病的治疗作用被认为是通过激活AMPK来发挥抗炎作用而实现的(Clinical Science 2018,132(11),1155)。另有文献报道AMPK激动剂AICAR(Eur.J.Biochem.1995,229,558)通过抑制固有免疫和获得性免疫炎症反应对炎症性肠病有显著疗效(Biochemical Pharmacology 2010,80,1708)，但该药的副作用较大。总之，临床上迫切的需要一种可以有效对抗炎症性肠病的药物。

哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化(CF)肺病和鼻炎等呼吸系统疾病的主要病理特征是炎症和/或纤维化，而现有的针对呼吸系统疾病的抗炎药物主要是吸入型的糖皮质激素类药物(如布地奈德和丙酸氟替卡松)，这些激素类药物可导致骨质疏松、急性肺炎和口腔念珠菌感染等副作用。因此，现有的抗呼吸系统疾病药物远远不能满足临床需求，尤其是新型吸入型抗炎药物非常有限。值得注意的是，敲除AMPKα1可加重烟熏小鼠的肺部炎症反应和肺气肿(Tuberculosis andRespiratory Diseases,2015,78,8)，这提示AMPK对肺部炎症损伤的保护作用。此外，AMPK激动剂AICAR和二甲双胍可显著抑制烟熏小鼠呼吸道的炎症反应(Oncotarget 2017,8,22513)。另一方面，Yuan等报道AICAR对烟草导致的呼吸道上皮细胞凋亡具有保护作用(Biochemical and Biophysical Research Communications 2018,497,564)。

糖尿病并发症是糖尿病致残、致死的主要原因，主要包括：(1)大血管并发症，如脑血管、心血管和下肢血管的病变(可导致糖尿病溃疡，尤其是糖尿病足)等。(2)微血管并发症，如肾脏病变和眼底病变。(3)神经病变，包括负责感官的感觉神经，支配身体活动的运动神经，以及司理内脏、血管和内分泌功能的自主神经病变等等。糖尿病并发症具体包括：糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病溃疡(特别是糖尿病足)、糖尿病性脑血管病、糖尿病性视网膜病变和糖尿病神经病变等。糖尿病并发症的病理机制与AMPK功能异常也密切相关(Journal of Clinical Investigation 2013,123,4888)。有文献报道AMPK激动剂可用于防治糖尿病肾病(Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2017,361,303；PLoS One 2014,9,e113398；WO2014086104A1)。激活AMPK对防治糖尿病心肌病也有显著疗效(Cell Death&Disease 2018,9,1；Clinical Science 2017,131,187；Biochemical and Biophysical Research Communications 2017,482,665；Diabetes2013,62,1270)。此外，动物实验和临床研究表明，AMPK激动剂还可用于防治糖尿病溃疡(特别是糖尿病足)(Expert Opinion on Investigational Drugs 2014,23,1253)。

多囊肾病是肾脏先天性异常的一种遗传性疾病，包括两种类型，一种是常染色体隐性遗传型多囊肾病(ARPKD)，发病于婴儿期，临床较罕见；另一种是常染色体显性多囊肾病(ADPKD)，常于青中年时期被发现，也可在任何年龄发病，为多囊肾病的常见类型，其占全部终末肾功能衰竭病因的8％～10％。针对ADPKD目前尚无有效的抑制囊肿形成和发展的方法。主要为对症处理，预防和处理并发症，保护肾功能以及肾功能衰退时的治疗。最近，血管加压素V2受体拮抗剂Tolvaptan(托伐普坦)获美国FDA批准上市，用于存在病情快速进展风险的常染色体显性多囊肾病(ADPKD)成人患者，以延缓肾功能的下降。值得注意的是，AMPK在ADPKD的病理机制中发挥重要作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2011,108,2462；J.Am.Soc.Nephrol.2016,27,1437)。采用AMPK激动剂二甲双胍(Proc.Natl.Acad.Sci.USA2011,108,2462)或节食(J.Am.Soc.Nephrol.2016,27,1437)可有效延缓ADPKD的疾病进程，这提示AMPK激动剂有望成为ADPKD的新型治疗手段。

人参皂苷Ro(I，CAS:34367-04-9)、川续断皂苷VI(II，CAS:39524-08-8)、金盏花苷E(III，CAS:26020-14-4)、地肤子皂苷Ic(IV，CAS:96990-18-0)、积雪草苷(V，CAS:16830-15-2)、羟基积雪草苷(VI，CAS:34540-22-2)、柴胡皂苷A(VII，CAS:20736-09-8)、柴胡皂苷D(VIII，CAS:20874-52-6)和黄花倒水莲皂苷C(IX，CAS:167324-07-4)、α-常春藤皂苷(X，CAS:27013-91-8)、常春藤苷C(XI，CAS:14216-03-6)、地榆皂苷I(XII，CAS:35286-58-9)和地榆皂苷II(XIII，CAS:35286-59-0)都属于五环三萜皂苷，它们具有广泛的生物活性(Natural Product Reports 2011,28,543；Archives of Pharmaceutical Research,1995,18(3),164；)。然而，上述五环三萜皂苷对AMPK介导的疾病的预防和治疗作用尚不明确。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供如下式(I)～(XIII)所示的五环三萜皂苷或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备预防或治疗AMPK介导的疾病的药物中的用途，：本发明式(I)～(XIII)化合物对AMPK具有非常强的激动活性，可以有效预防或治疗AMPK介导的疾病，为研究五环三萜皂苷针对AMPK介导的疾病的预防和治疗作用的具有重要意义。

本发明还提供一种预防和治疗AMPK介导的疾病的药物组合物。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的式(I)～(XIII)所示的五环三萜皂苷或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备预防或治疗AMPK介导的疾病的药物中的用途：

所述五环三萜皂苷包括：人参皂苷Ro(I，CAS:34367-04-9)、川续断皂苷VI(II，CAS:39524-08-8)、金盏花苷E(III，CAS:26020-14-4)、地肤子皂苷Ic(IV，CAS:96990-18-0)、积雪草苷(V，CAS:16830-15-2)、羟基积雪草苷(VI，CAS:34540-22-2)、柴胡皂苷A(VII，CAS:20736-09-8)、柴胡皂苷D(VIII，CAS:20874-52-6)、黄花倒水莲皂苷C(IX，CAS:167324-07-4)、α-常春藤皂苷(X，CAS:27013-91-8)、常春藤苷C(XI，CAS:14216-03-6)、地榆皂苷I(XII，CAS:35286-58-9)和地榆皂苷II(XIII，CAS:35286-59-0)。

本发明意外地发现，所述式(I)～(XIII)化合物具有非常强的AMPK激动活性，且其活性显著优于公认的AMPK激动剂如二甲双胍和AICAR。因此，式(I)～(XIII)化合物可用于制备预防或治疗AMPK介导的疾病的药物。

所述AMPK介导的疾病，如代谢性疾病和心脑血管疾病，包括：胰岛素抵抗、代谢综合征、1型或2型糖尿病、高脂血症、肥胖症、动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌梗死、心律失常、冠心病、高血压、心衰、心肌肥大、心肌炎、糖尿病并发症(包括糖尿病心肌病、糖尿病肾病、糖尿病溃疡、视网膜病变和神经病变等)、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝、肝硬化、高尿酸血症、痛风、骨质疏松、多囊卵巢综合征(PCOS)、中风或脑梗死等。

所述AMPK介导的疾病，如炎症疾病、自身免疫性疾病、器官纤维化疾病、神经损伤性疾病或病原体感染所致的继发性疾病，包括：肺炎、肺结核、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、白塞氏病、哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、肺气肿、闭塞性细支气管炎、过敏性鼻炎、慢性鼻炎、鼻窦炎、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、脊椎关节炎、骨关节炎、滑膜炎、肌腱炎、血栓闭塞性脉管炎、静脉炎、间歇性跛行、瘢痕瘤、银屑病、鱼鳞癣、大疱性类天疱疮、皮炎、接触性皮炎、胰腺炎、慢性肾炎、膀胱炎、脑膜炎、胃炎、败血症、坏疽性脓皮症、葡萄膜炎、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、帕金森病、阿尔茨海默病、α-共核蛋白病、抑郁症、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化病、纤维肌痛综合症、神经痛、唐氏综合征、哈勒沃登-施帕病、亨廷顿舞蹈病或威尔逊病等。

所述AMPK介导的疾病，如线粒体功能障碍和紊乱疾病，包括：肌无力、肌阵挛、运动不耐受、卡恩斯-赛尔综合征、慢性疲乏综合征、利氏综合征、线粒体肌病-脑病-高乳酸血症、中风综合征或中风样发作。同样，本发明的化合物也可用于治疗肌肉营养不良状态，例如，杜氏肌营养不良、贝壳肌营养不良或弗立德希氏共济失调。

所述AMPK介导的疾病，如肿瘤，包括：骨癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞系白血病、慢性淋巴细胞系白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、纤维神经瘤、肉瘤、食道癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、前列腺癌、淋巴癌、睾丸癌、间质细胞癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑素瘤或基底细胞癌等。

作为优选的方案，本发明提供式(I)～(XIII)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备预防或治疗脂肪性肝病、炎症性肠病、呼吸系统疾病、糖尿病并发症或多囊肾病的药物中的用途。

作为更优选的方案，本发明提供五环三萜皂苷适用的脂肪性肝病是非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化，并且所述五环三萜皂苷不包括川续断皂苷VI。

作为更优选的方案，本发明提供五环三萜皂苷适用的炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病，并且所述五环三萜皂苷不包括积雪草苷和羟基积雪草苷。

作为更优选的方案，本发明提供五环三萜皂苷适用的呼吸系统疾病是哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎或慢性鼻炎。

作为更优选的方案，本发明提供五环三萜皂苷适用的糖尿病并发症是糖尿病肾病、糖尿病心肌病或糖尿病溃疡。

作为更优选的方案，本发明提供五环三萜皂苷适用的多囊肾病是常染色体显性多囊肾病，并且所述五环三萜皂苷不包括柴胡皂苷D。

在某些实施方案中，所述式(I)～(XIII)化合物其药学上可接受的盐为金属离子、药学上可接受的胺、铵离子或胆碱形成的盐，其中金属包括但不限于：钠、钾、钙等离子；药学上可接受的胺包括但不限于：乙二胺、氨丁三醇等。

本发明还提供一种预防和治疗AMPK介导的疾病的药物组合物，其中含有治疗有效量的式(I)～(XIII)任一化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成份和药学上可接受的辅料。

在本发明的药物组合物中可任意混合的辅料根据剂型、给药形式等可以改变。辅料包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等。所述药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜或静脉等。所述药物组合物可以是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂等制剂学上常规的制剂形式。

在本发明中，"脂肪性肝病"指的是中性脂肪沉积在肝细胞中而引发脂肪性肝脏病变的一类疾病的总称，其包括酒精性脂肪性肝病(AFLD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。"非酒精性脂肪性肝病"的疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及NASH诱发的肝硬化。非酒精性单纯性脂肪肝是非酒精性脂肪性肝病的一种情形，其以在肝细胞中仅发生脂肪沉积为特征，而不伴有肝细胞坏死、炎症和纤维化。根据美国肝病研究协会的定义，NASH是指肝脏出现脂肪变态(大脂肪泡性>小脂肪泡性，主要出现在小叶中心部分)、小叶内炎症、肝细胞的气球样变性(主要出现在脂肪化周边和小叶中心部分)(Hepatology 2003,37,1202)。此外，根据纤维化程度将NASH的发展分成4个阶段：1)小叶中心部；2)小叶中心部+门静脉区域；3)交联形成；4)肝硬化(Am.J.Gastroenterol.1999,94,2467)。可适用于本发明的脂肪性肝病的例子优选非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，更优选非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或NASH诱导的肝硬化，最优选非酒精性脂肪性肝炎。在预防或治疗非酒精性脂肪性肝病时，可选择与本发明的式(I)～(IX)化合物联合使用的药物可以是一种或多种抗非酒精性脂肪性肝病药物，包括：AMPK激动剂(如二甲双胍)、法尼酯X受体(FXR)激动剂(如奥贝胆酸、GS-9674、EDP-305和LJN452等)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂(如GS-0976等)、凋亡信号调节激酶-1(ASK1)抑制剂(如Selonsertib等)、PPAR激动剂(如Elafibranor、Saroglitazar、IVA337和MSDC-0602K等)、半胱天冬酶(caspase)抑制剂(如Emricasan等)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)抑制剂(如Aramchol等)、长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂(如Semaglutide等)、顶端钠依赖性胆盐转运体(ASBT)抑制剂(如Volixibat等)、血管粘附蛋白1(VAP-1)抑制剂(如BI 1467335等)、CCR5R阻断剂(如Cenicriviroc等)和甲状腺激素受体β(THR-β)激动剂(如MGL-3196等)等。

在本发明中，“炎症性肠病”用来指一类累及肠道的慢性非特异性炎症性疾病，其包括但不限于克罗恩病及溃疡性结肠炎。其中克罗恩病的临床症状可以包括但不限于腹痛、腹泻、便血、腹块、全身发热，伴随阿弗他性口炎、肛周瘘管，脓肿，溃疡，肛裂，肛周狭窄，肛周皮赘，肛周痔疮，内镜表现节段性纵行溃疡，卵石征和肠管狭窄。溃疡性结肠炎的临床症状可以包括但不限于腹泻，便血，发热，贫血，营养不良，水电解质平衡紊乱，低蛋白血症，骨关节病变，皮肤粘膜病变，出现结节性红斑，坏疽性脓皮病等，内镜活检中观察到组织样本中出现炎症渗出，糜烂及溃疡，中性粒细胞浸润，出现隐窝变形，粘液缺失，潘氏细胞化生等。在预防或治疗炎症性肠病时，本发明的药物组合物可以单独给药，或者与其他药物联合使用，如与目前常用药物5-氨基水杨酸进行联合用药。当联合给药时，治疗剂可以顺序给药或同时给药。

在本发明中，可适用于本发明的呼吸系统疾病的例子优选哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎或慢性鼻炎。在预防或治疗呼吸系统疾病时，本发明的药物组合物可以是吸入气雾剂、吸入粉雾剂或供雾化器用的液体制剂等制剂学上常规的吸入制剂。如果需要，本发明的可吸入的药物组合物可与一种或多种其他类型的预防或治疗呼吸系统疾病的药物联合使用。所述的其他类型预防或治疗呼吸系统疾病的药物优选自抗炎药、支气管扩张药、抗组胺药、解充血药、镇咳药和呼吸道润滑祛痰药，这些药物适合通过吸入给药。所述的其他类型预防或治疗呼吸系统疾病的药物最优选自β2-肾上腺素受体激动剂、抗毒蕈碱剂、甾体抗炎药、PDE4抑制剂、A_2a激动剂、钙阻断剂和呼吸道润滑祛痰药。适宜的β2-肾上腺素受体激动剂包括沙丁胺醇(舒喘灵)、奥西那林、特布他林、沙美特罗、非诺特罗、茚达特罗、丙卡特罗、福莫特罗、卡莫特罗、维兰特罗、TA-2005、GSK159797及其可药用盐等。适宜的支气管扩张药包括抗胆碱能药或抗毒蕈碱剂，特别是异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托溴铵、阿地溴铵、格隆溴铵等。适宜的甾体抗炎药包括糖皮质激素，例如布地奈德、倍氯米松、丙酸氟替卡松、环索奈德或莫米松。适宜的PDE4抑制剂包括西洛司特和罗氟司特等。适宜的钙通道阻滞剂包括地尔硫卓、维拉帕米、氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、拉西地平、乐卡地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平和尼索地平。适宜的呼吸道润滑祛痰药包括氨溴索等。

在本发明中，可适用于本发明的糖尿病并发症的例子优选糖尿病肾病、糖尿病心肌病或糖尿病溃疡。所述糖尿病溃疡包括糖尿病病人的各种表皮损伤，具体包括糖尿病足、糖尿病口腔溃疡和各种糖尿病皮肤病变。

在本发明中，可适用于本发明的多囊肾病的例子优选常染色体显性多囊肾病。

在防治脂肪性肝病(特别是NASH)的作用机制方面，式(I)～(XIII)化合物可通过激活AMPK来抑制肝脏脂肪酸和胆固醇的合成而降低肝脏甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)的含量，进而可改善作为脂肪性肝病(特别是NASH)主要病理特征之一的肝脏脂肪堆积症状(“第一次打击”)。此外，式(I)～(XIII)化合物通过激活AMPK可提高ERRα的蛋白水平及转录功能，进而发挥抗肝脏炎症和抗肝脏纤维化作用，因而可对抗NASH的“第二次打击”(肝脏炎症及纤维化)。据此，式(I)～(XIII)化合物可通过激活AMPK来防治非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化等脂肪性肝病。

在防治炎症性肠病的作用机制方面，有文献(Clinical Science 2018,132,1155；Biochemical Pharmacology 2010,80,1708)报道AMPK激动剂除了可抑制肠道炎症反应外，还可通过改善肠道紧密连接及肠道上皮细胞屏障功能来发挥抗炎症性肠病功效(Frontiers in Pharmacology 2018,DOI:10.3389/fphar.2018.00761；Tissue Barriers2018,6,1；Journal of Gastroenterology and Hepatology 2019,34,186)。据此，式(I)～(XIII)化合物可通过激活AMPK一方面可抑制肠道炎症反应，另一方面还可改善肠道紧密连接及肠道上皮细胞屏障功能，进而发挥抗炎症性肠病(特别是溃疡性结肠炎或克罗恩病)功效。

在防治呼吸系统疾病的作用机制方面，有研究表明，AMPK能通过调节氧化应激、抗炎和抗纤维化等途径减轻哮喘、慢性阻塞性肺病、肺部感染性疾病和肺纤维化的肺组织损伤(药学学报2014,49,1089)。例如，在OVA诱导的小鼠哮喘模型，AMPK激动剂二甲双胍可显著缓解气道炎症、嗜酸性粒细胞浸润和气道重塑,并且可降低哮喘小鼠肺组织氧化应激水平(Biochemical Pharmacology 2012,84,1660)。据此，式(I)～(XIII)化合物可通过激活AMPK来防治慢性阻塞性肺病、哮喘、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病和过敏性鼻炎等呼吸系统疾病。

在防治糖尿病并发症的作用机制方面，有文献报道AMPK激动剂通过抗炎、抗纤维化及抗凋亡等机制而发挥抗糖尿病肾病和糖尿病心肌病功效(Journal of Pharmacologyand Experimental Therapeutics 2017,361,303；PLoS One 2014,9,e113398；WO2014086104A1；Cell Death&Disease 2018,9,1；Clinical Science 2017,131,187；Biochemical and Biophysical Research Communications 2017,482,665；Diabetes2013,62,1270)。此外，AMPK激动剂的促再生等功能(Human Molecular Genetics 2016,25,3178)可能有利于促进表皮伤口愈合(Aging Cell 2017,16,1083)，进而可防治糖尿病溃疡(特别是糖尿病足)(Expert Opinion on Investigational Drugs 2014,23(9),1253)。综上所述，式(I)～(XIII)化合物可通过激活AMPK来防治糖尿病肾病、糖尿病心肌病和糖尿病溃疡等糖尿病并发症。

在防治多囊肾病的作用机制方面，有文献报道囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的过度活化在多囊肾病(特别是常染色体显性多囊肾病)的病理机制中发挥关键作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2011,108,2462；J.Am.Soc.Nephrol.2009,20,2493)，AMPK激动剂二甲双胍通过磷酸化作用抑制CFTR和mTOR，从而可延缓肾囊肿的生成(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2011,108,2462)。进一步研究发现，多囊肾上皮细胞与肿瘤细胞类似，主要通过糖酵解产生ATP，且细胞中ATP/AMP比值升高，能量感受器AMPK活性下降，mTOR活性增加，细胞增殖显著增强(Nat.Med.2013,19(4):488)。据此，式(I)～(XIII)化合物可通过激活AMPK而抑制CFTR和mTOR，进而可防治多囊肾病(特别是常染色体显性多囊肾病)。

综上所述，式(I)～(XIII)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可用于制备预防或治疗AMPK介导的疾病的药物，特别是用于制备预防或治疗非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性阻塞性肺病、哮喘、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病溃疡和常染色体显性多囊肾病的药物。

在本发明的预防或治疗AMPK介导的疾病的药物中，式(I)～(XIII)任一化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的量可根据患者年龄、体重、症状和给药途径等而适当改变。当给成人(约60kg)口服给药时，式(I)～(XIII)任一化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的给药剂量优选是1mg～500mg/次，更优选5mg～60mg/次，每天给药1～3次。也可根据疾病程度的不同和剂型的不同而偏离此剂量范围。

本发明中的式(I)～(XIII)化合物的制备可参照文献方法从人参、川续断、金盏花、地肤子、积雪草、柴胡、黄花倒水莲、常春藤和地榆等中草药中进行提取、分离和纯化(中国专利CN102125570B；Natural Product Reports 2011,28,543)；也可参照文献方法进行半合成制备(Synlett 2004,2,259；Natural Product Reports 2011,28,543)；也可进行商业化购买。所有化合物的纯度在95％以上。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)安全性高：式(I)～(XIII)化合物是人参、川续断、金盏花、地肤子、积雪草、柴胡、黄花倒水莲、常春藤和地榆等常用中草药的有效成分，具有非常高的安全性。

(2)疗效确切：式(I)～(XIII)化合物对AMPK介导的疾病，特别是非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性阻塞性肺病、哮喘、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病溃疡和常染色体显性多囊肾病等疾病具有非常好的疗效，且与现有治疗药物相比疗效相当甚至更优。

(3)作用机制明确：式(I)～(XIII)化合物对AMPK具有非常强的激动活性，且活性显著优于公认的AMPK激动剂如二甲双胍和AICAR。众所周知，AMPK对于糖脂代谢、炎症反应、凋亡和纤维化是一个关键的调控因子。一方面，激活AMPK可通过磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和HMG-CoA还原酶(HMG-CR)而抑制脂质合成，从而发挥降血脂作用(包括降低肝脏脂肪)；另一方面，激活AMPK可通过多种途径(如AMPK-ERRα轴和AMPK-mTOR轴等)发挥抗凋亡、抗炎、抗纤维化和促进伤口愈合等作用。此外，激活AMPK还可通过抑制CFTR和mTOR进而对多囊肾病有效。因此，式(I)～(XIII)化合物作为强效AMPK激动剂可用于预防或治疗非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性阻塞性肺病、哮喘、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病溃疡和常染色体显性多囊肾病等AMPK介导的疾病。

附图说明

图1为五环三萜皂苷对Huh-7细胞AMPK的激动活性效应图(Western Blot检测)；

图2为五环三萜皂苷对Huh-7细胞AMPK的激动活性效应图(Western Blot检测)；

图3为五环三萜皂苷对AMPK下游信号通路的影响图(Western Blot检测)；

图4为人参皂苷Ro对高脂饮食(HFD)诱导NASH模型大鼠血清脂质(TG、TC、LDL-c和HDL-c)水平的影响图(n＝8，与HFD模型组相比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与CHOW对照组相比^###p<0.001)；

图5为人参皂苷Ro对高脂饮食(HFD)诱导NASH模型大鼠肝脏脂质(TG、和TC)水平的影响图(n＝8，与HFD模型组相比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与CHOW对照组相比^###p<0.001)；

图6为人参皂苷Ro对高脂饮食(HFD)诱导NASH模型大鼠肝脏中炎症因子(TNFα、IL-6和IL-1β)mRNA表达水平的影响图(n＝8，与HFD模型组相比**p<0.01，***p<0.001；与CHOW对照组相比^###p<0.001)；

图7为人参皂苷Ro对高脂饮食(HFD)诱导NASH模型大鼠肝脏中纤维化相关细胞因子(TGF β和α-SMA)mRNA表达水平的影响图(n＝8，与HFD模型组相比**p<0.01，***p<0.001；与CHOW对照组相比^###p<0.001)；

图8为人参皂苷Ro对CCl₄诱导肝纤维化模型小鼠血清中肝酶(ALT和AST)水平的影响图(n＝8，与CCl₄模型组相比*p<0.05，**p<0.01；与对照组相比^###p<0.001)；

图9为人参皂苷Ro对CCl₄诱导肝纤维化模型小鼠肝脏中纤维化相关细胞因子(TGFβ、α-SMA、MMP2和collagen 1)mRNA表达水平的影响图(n＝8，与CCl₄模型组相比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与对照组相比^###p<0.001)；

图10为地榆皂苷II对葡聚糖硫酸钠(DSS)造模的溃疡性结肠炎模型小鼠的疾病活动指数(DAI)及结肠长度的影响图(与模型组比，**P<0.01，***P<0.001)；

图11为地榆皂苷II对葡聚糖硫酸钠(DSS)造模的溃疡性结肠炎模型小鼠的结肠组织病理学的影响图；

图12为地榆皂苷II对葡聚糖硫酸钠(DSS)造模的溃疡性结肠炎模型小鼠的结肠组织中炎症因子(TNF-α和IL-1β)、活性氧(ROS)及紧密连接相关蛋白(ZO-1、Claudin-1和Occludin)的影响图(与模型组比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；

图13为地榆皂苷II对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)造模的克罗恩病模型小鼠的体重及结肠长度的影响图(与模型组比，*P<0.05，***P<0.001)；

图14为地榆皂苷II对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)造模的克罗恩病模型小鼠的结肠组织中炎症因子(TNF-α和IL-1β)及髓过氧化物酶(MPO)的影响图(与模型组比，**P<0.01，***P<0.001)；

图15为川续断皂苷VI对多囊肾上皮细胞增殖的抑制效应图(CCK-8法检测)；

图16为川续断皂苷VI对多囊肾上皮细胞AMPK及增殖相关信号分子的影响图(Western Blot检测)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明不受到这些实施例的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

实施例1

五环三萜皂苷对Huh-7细胞AMPK的激动活性

采用Western Blot方法检测化合物对Huh-7细胞AMPK的激动活性。

细胞培养条件：Huh-7细胞：DMEM完全培养基(含10％胎牛血清和1％streptomycin/penicillin)在5％CO₂的37℃培养箱中培养。

抗体：anti-AMPK(CST,2532S)；anti-pAMPK(CST,2535S)。

Western Blot实验：检测化合物对Huh-7细胞AMPK磷酸化水平的影响：取活细胞比例90％以上的细胞进行实验。在12孔板中，将Huh-7细胞按照25万每孔铺板，置于含5％CO₂的37℃培养箱中培养，12小时后，弃去原先培养基，加入含有五环三萜皂苷的完全培养基，受试的五环三萜皂苷的终浓度均设置为10μM，给药时间为12小时。阳性对照化合物采用AICAR(100μM)、二甲双胍(70μM)或A-769662(100μM)。随后提取蛋白进行Western Blot检测。

实验结果：对Western Blot实验结果(见图1和图2)进行灰度扫描，将阴性对照DMSO的p-AMPK/AMPK比值定义为1，受试化合物p-AMPK/AMPK比值为阴性对照组的相对比值，该数值越大，表明化合物的AMPK激动活性越强，活性数据结果如表1所示。

表1、五环三萜皂苷的AMPK激动活性(五环三萜皂苷的终浓度均设置为10μM)

实验结果(表1)表明，五环三萜皂苷(I)～(XIII)具有非常强的AMPK激动活性，且其活性显著优于公认的AMPK激动剂如二甲双胍、AICAR和A-769662。

实施例2

五环三萜皂苷对Huh-7细胞AMPK下游信号通路的影响

采用Western Blot方法检测化合物对Huh-7细胞AMPK下游信号通路的影响。

抗体：anti-ACC(CST,3676S)；anti-pACC(CST,11818S)；anti-mTOR(CST,2983S)；anti-pmTOR(CST,5536S)；anti-PGC1α(Abcam,ab54481)；anti-ERRα(Abcam,ab76228)。

Western Blot实验：检测化合物对Huh-7细胞AMPK下游信号通路的影响：

取活细胞比例90％以上的细胞进行实验。在12孔板中，将Huh-7细胞按照25万每孔铺板，置于含5％CO₂的37℃培养箱中培养，12小时后，弃去原先培养基，加入含有五环三萜皂苷的完全培养基，受试的五环三萜皂苷的终浓度均设置为10μM，给药时间为12小时。阳性对照化合物采用AICAR(100μM)。随后提取蛋白进行Western Blot检测，检测pACC/ACC，pmTOR/mTOR，PGC-1α和ERRα的蛋白变化情况。

实验结果(图3)表明，五环三萜皂苷(I)～(XIII)均能有效地引起AMPK下游蛋白的变化，且其变化趋势与AMPK激动相关。尤其值得注意的是，五环三萜皂苷(I)～(XIII)均能抑制mTOR信号通路，并同时增加PGC1α和ERRα的蛋白水平，因而可促进线粒体合成及氧化代谢，诱导保护性自噬，进而可发挥降血脂、抗炎、抗凋亡及抗纤维化等功效。

实施例3

人参皂苷Ro(式(I)化合物)对高脂饮食(HFD)诱导NASH大鼠模型的保护作用。

动物：雄性SD大鼠32只，SPF级，6周龄，体重220g,购于北京维通利华。所有动物保持12小时交替的昼夜节律，自由饮食。

仪器：动物体重秤；切片机；全自动生化分析仪；倒置显微镜

试剂：人参皂苷Ro(I)购自上海柏卡化学技术有限公司；奥贝胆酸(OCA)购自江苏维凯尔医药科技有限公司；高脂饲料购自Research Diets(D12492,60kcal％)；标准饲料购自Research Diets(D12450B,10kcal％)。

实验过程：

1.动物分组及造模

大鼠按照体重随机分成4组：对照组(CHOW)、高脂饲料模型组(HFD)、阳性药奥贝胆酸(OCA，5mg/Kg)组(HFD+OCA)和人参皂苷Ro(简称Ro，5mg/kg)组(HFD+Ro)。对照组喂以标准饲料，正常饮水；其余各组给予高脂饲料同时饮水改为10％的蔗糖水溶液，造模20周。

2.给药

20周之后，对照组及高脂饮食模型组每日灌胃给予体积分数为0.5％CMC-Na溶液,HFD+OCA组每日灌胃予以奥贝胆酸(5mg/Kg)，HFD+Ro组每日灌胃予以人参皂苷Ro(5mg/Kg)。给药8周，这期间对照组给予标准饲料和正常饮水，其余三组给予高脂饲料和10％的蔗糖饮水。每日对各组大鼠称重，仔细观察并记录其体重、毛发、粪便及活动情况。

3.取材

提前12小时禁食不禁水，次日上午眼眶取血，处死取肝脏。肝脏右小叶组织用4％多聚甲醛固定，用于HE染色切片。部分肝组织分成3份，液氮速冻，以备后续其他指标检测。

4.生化指标的测定

将全血室温静置2小时，3000rpm离心15分钟，收集血清。取肝脏组织100mg，用0.9mL预冷的生理盐水匀浆，匀浆液4℃,3000rpm离心15分钟，取上清。将两者送江苏省中西医结合医院病理科全自动生化分析仪测定血清中甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的水平，测定肝脏组织匀浆上清中TG和TC水平。

5.肝脏组织切片

将预处理好的组织送谷歌生物技术有限公司制作HE染色切片、油红染色切片。

6.肝脏组织蛋白的提取及Western Blot(WB)检测

取出保存在-80℃的肝组织，放于液氮中，快速切下约10mg的肝组织，加入预冷的组织裂解液约500μL，组织匀浆机匀浆，然后冰上裂解30min；4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上清170μL至干净EP管中，取出10μL用于BCA蛋白定量，其余的蛋白上清中加入40μL的5*loading buffer煮沸变性，后续进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转印到PVDF膜上，再进行相关抗体的孵育和洗脱，最后采用化学发光仪进行成像分析。

7.肝脏组织RNA的提取及q-PCR检测

取出保存在-80℃的肝组织，放于液氮中，快速切下约10mg的肝组织，加入预冷的Trizol试剂约500μL，组织匀浆机匀浆，然后冰上裂解15min，加入100μL氯仿后剧烈震摇15s，在冰上放置10min后4℃，12000rpm离心15min。转移上层水相至干净的1.5mL EP管中，加入200μL异丙醇沉淀RNA，冰上放置10min后，4℃，12000rpm离心10min。弃去上清液，将沉淀用75％乙醇洗涤一遍，离心后去除上清，用40μL DEPC处理水溶解RNA沉淀。用Nano进行RNA浓度定量，并按说明书加入Takara公司的逆转录试剂，使用普通PCR仪将mRNA逆转录成cDNA。最后，在q-PCR专用96孔板中加入目的基因的上下游引物、q-PCR试剂(SYBR Green)以及cDNA，使用q-PCR仪进行扩增和定量。选用ΔΔCt值来表征基因表达的差异，并采用GraphPad Prism 7软件进行数据处理以及统计学检验。

8.实验结果

图4和图5的结果表明，OCA和人参皂苷Ro均能显著下降血清和肝脏中TG的水平，且人参皂苷Ro的疗效和OCA相当。值得注意的是，人参皂苷Ro可以有效地降低高脂喂养大鼠血清中TC、LDL-c和HDL-c的水平，而OCA无法降低甚至略有上调高脂喂养大鼠血清中TC和LDL-c的水平。在HFD组中，肝脏TC的含量增加至与对照组相比约3倍，在给予人参皂苷Ro治疗后，肝脏TC的含量显著下降。

为进一步检测人参皂苷Ro降低NASH动物肝脏炎症和纤维化的效应，测定了肝脏组织中相关炎症因子和纤维化相关细胞因子的mRNA表达情况。图6的结果表明，人参皂苷Ro可以显著抑制由于高脂喂养导致的TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平的升高，因此认为人参皂苷Ro能够有效地抵抗高脂喂养诱导的肝脏炎症反应。图7的结果表明，人参皂苷Ro可以显著抑制由于高脂喂养导致的TGFβ和α-SMA的mRNA表达水平的升高，因此认为人参皂苷Ro能够有效地抵抗高脂喂养诱导的肝脏纤维化。

以上结果表明，人参皂苷Ro可以有效地降低高脂饮食导致的大鼠肝脏的脂质堆积，抑制炎症反应及肝脏纤维化，且疗效与阳性对照药奥贝胆酸(OCA)相当。值得注意的是，临床研究和动物实验发现OCA虽然降低肝脏脂质堆积，但是可升高血清中LDL-c的水平，而人参皂苷Ro在动物实验中则不具有此类副作用。这提示人参皂苷Ro在临床应用中有可能避免OCA升高血清LDL-c的副作用，因此可用于预防和治疗脂肪性肝病(尤其是非酒精性脂肪性肝炎)、慢性肝炎和肝纤维化等慢性肝脏疾病。

本发明中的其他五环三萜皂苷也都显示了与人参皂苷Ro相似的抗脂肪性肝病(尤其是非酒精性脂肪性肝炎)活性。例如，积雪草苷(V)、羟基积雪草苷(VI)、柴胡皂苷A(VII)、柴胡皂苷D(VIII)、地榆皂苷I(XII)和地榆皂苷II(XIII)均能有效地降低高脂饮食导致的大鼠肝脏的脂质堆积(结果见表2)，并抑制肝脏炎症反应(结果见表3)。这提示本发明提供的五环三萜皂苷可用于预防和治疗脂肪性肝病(尤其是非酒精性脂肪性肝炎)和慢性肝炎等慢性肝脏疾病。

表2.五环三萜皂苷对高脂饮食诱导NASH模型大鼠血清及肝脏脂质水平的影响

(n＝8，与对照组相比^###p<0.001；与模型组比较^*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)

表3.五环三萜皂苷对高脂饮食诱导NASH模型大鼠血清ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)及MDA(丙二醛)水平的影响

(n＝8，与对照组相比*p<0.05，**p<0.01；与模型组比较^#p<0.05，^##p<0.01)

实施例4

人参皂苷Ro(式(I)化合物)对CCl₄诱导肝纤维化小鼠的保护作用。

动物：雄性C57BL/6J小鼠32只，SPF级，体重25g，购于北京维通利华。所有动物保持12小时交替的昼夜节律，自由饮食。

仪器：动物体重秤；切片机；全自动生化分析仪；倒置显微镜。

试剂：人参皂苷Ro购自上海柏卡化学技术有限公司；CCl₄购自sigma公司；葵花籽油购自南京源叶生物科技有限公司。

实验过程：

1.动物分组

小鼠按照体重随机分成4组：空白对照组(CTL)、模型组(CCl₄)、人参皂苷Ro低剂量组(Low)(5mg/kg)和人参皂苷Ro高剂量组(High)(10mg/kg)，共4个组(每组8只小鼠)。

2.造模及给药

造模方式为小鼠按照2mL/kg的剂量腹腔注射CCl₄的葵花籽油溶液(CCl₄含量25％，v/v)，对照组小鼠注射相应剂量的葵花籽油溶液，每周两次。从实验第1天开始，对照组小鼠每天灌胃质量分数为0.5％的CMC-Na溶液，每周腹腔注射两次葵花籽油；模型组小鼠每天灌胃质量分数为0.5％的CMC-Na溶液，每周腹腔注射两次CCl₄的葵花籽油溶液；人参皂苷Ro低剂量组(Low)每天灌胃给予人参皂苷Ro 5mg/kg，每周腹腔注射两次CCl₄溶液；人参皂苷Ro高剂量组(High)每天灌胃给予人参皂苷Ro 10mg/kg，每周腹腔注射两次CCl₄的葵花籽油溶液。共计给药4周。

3.取材

提前12小时禁食不禁水，次日上午眼球取血，处死取肝脏。肝脏右小叶组织用4％多聚甲醛固定，用于HE染色切片。剩余肝组织分成3份，液氮速冻，以备后续其他指标检测。

4.生化指标的测定

将全血室温静置2小时，3000rpm离心15分钟，收集血清送江苏省中西医结合医院病理科全自动生化分析仪测定血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的水平。

5.肝脏组织切片

将预处理好的组织送谷歌生物技术有限公司制作HE染色切片。

6.肝脏组织RNA的提取及q-PCR检测

取出保存在-80℃的肝组织，放于液氮中，快速切下约10mg的肝组织，加入预冷的Trizol试剂约500μL，组织匀浆机匀浆，然后冰上裂解15min，加入100μL氯仿后剧烈震摇15s，在冰上放置10min后4℃，12000rpm离心15min。转移上层水相至干净的1.5mL EP管中，加入200μL异丙醇沉淀RNA，冰上放置10min后，4℃，12000rpm离心10min。弃去上清液，将沉淀用75％乙醇洗涤一遍，离心后去除上清，用40μL DEPC处理水溶解RNA沉淀。用Nano进行RNA浓度定量，并按说明书加入Takara公司的逆转录试剂，使用普通PCR仪将mRNA逆转录成cDNA。最后，在q-PCR专用96孔板中加入目的基因的上下游引物、q-PCR试剂(SYBR Green)以及cDNA，使用q-PCR仪进行扩增和定量。选用ΔΔCt值来表征基因表达的差异，并采用GraphPad Prism 7软件进行数据处理以及统计学检验。。

7.实验结果

如图8所示，与空白对照组(CTL)比较，模型组(CCl₄)血清ALT和AST水平显著升高；经过人参皂苷Ro低剂量组(5mg/kg)和高剂量组(10mg/kg)治疗后，血清ALT和AST水平均显著下降。以上结果提示人参皂苷Ro可通过降低血清转氨酶ALT和AST水平而对肝脏炎症及纤维化发挥一定有益作用。

如图9所示，与空白对照组(CTL)比较，模型组(CCl₄)肝脏纤维化相关细胞因子(TGFβ、α-SMA、MMP2和collagen 1)的mRNA表达水平均显著升高；经过人参皂苷Ro低剂量组(5mg/kg)和高剂量组(10mg/kg)治疗后，肝脏纤维化相关细胞因子(TGFβ、α-SMA、MMP2和collagen 1)的mRNA表达水平均显著下降。以上结果提示人参皂苷Ro可通过降低肝脏纤维化相关细胞因子(TGFβ、α-SMA、MMP2和collagen 1)的表达而抑制肝纤维化。

以上结果表明，人参皂苷Ro可显著抑制肝纤维化动物模型的炎症反应及肝纤维化，改善肝功能。因此认为人参皂苷Ro可以用于预防和治疗肝纤维化和其他纤维化相关的疾病。

本发明中的其他五环三萜皂苷在抑制肝纤维化动物模型的炎症反应及肝纤维化方面也都显示了与人参皂苷Ro相似的活性。例如，α-常春藤皂苷(X)、常春藤苷C(XI)、地榆皂苷I(XII)和地榆皂苷II(XIII)均能有效地抑制CCl₄诱导的小鼠肝纤维化(见表4)。这提示本发明提供的五环三萜皂苷可用于预防和治疗肝纤维化和其他纤维化相关的疾病。

表4.五环三萜皂苷对CCl₄诱导肝纤维化小鼠肝脏纤维化相关基因表达的影响

组别	n	剂量	TGF-β	collagen 1	MMP2
						对照组	8	-	1.00±0.45	1.00±0.37	1.00±0.27
模型组	8	-	4.42±1.53<sup>###</sup>	12.35±3.30<sup>###</sup>	14.36±4.39<sup>###</sup>
						地榆皂苷I	8	5mg/Kg	2.91±1.10*	7.65±2.43**	8.38±3.86*
地榆皂苷II	8	5mg/Kg	3.03±0.76*	8.16±3.37*	7.38±3.48**
						α-常春藤皂苷	8	5mg/Kg	2.75±0.99**	7.93±2.28**	6.37±5.73**
常春藤苷C	8	5mg/Kg	2.96±1.01*	8.07±3.27*	7.65±4.03**

(n＝8，表中数据是与对照组相比的诱导倍数。与对照组相比^###p<0.01；与模型组比较*p<0.05，**p<0.01)

实施例5

地榆皂苷II(式(XIII)化合物)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗作用

选取6-8周雄性C57BL/6小鼠，对照组喂养纯净水，模型组、治疗组及阳性对照组喂养含2％葡聚糖硫酸钠(DSS)(36000-50000M.Wt)的纯净水七天，随后喂养纯净水三天，同时进行药物干预。对照组和模型组小鼠口服安慰剂羟甲基纤维素钠，治疗组小鼠口服地榆皂苷II(购自上海柏卡化学技术有限公司)(剂量为5mg/kg)，阳性对照组小鼠口服临床用药5-氨基水杨酸(5-ASA，购自上海生工生物工程有限公司)(剂量为100mg/kg)。给药过程中每天观察记录小鼠的体重变化，粪便性状和便血情况，进行打分，计算出疾病活动指数(Diseaseactivity index,DAI)。

打分规则和计算方法如下：DAI＝(体重评分+腹泻评分+隐血评分)/3。其中体重打分：0(体重上升或不变)，1(体重下降1-5％)，2(体重下降6-10％)，3(体重下降11-15％)，4(体重下降15％以上)；腹泻评分：0(粪便正常)，2(粪便松软)，4(粪便黏肛或腹泻)；隐血评分：0(隐血阴性)，2(隐血阳性)，4(可见出血)。

对比各组DAI的差异，可以得知地榆皂苷II对葡聚糖硫酸钠(DSS)造模的小鼠溃疡性结肠炎有显著的预防和治疗作用。如图10A所示，给予地榆皂苷II(5mg/kg)治疗后，其DAI打分明显低于模型组，且地榆皂苷II治疗组的疗效显著优于阳性药组。

将上述小鼠在第十一天脱颈椎处死，取结肠组织，量取其长度，统计汇总，对比各组结肠长度的差异，可以得知地榆皂苷II对溃疡性结肠炎模型小鼠有显著的预防和治疗作用。如图10B所示，地榆皂苷II治疗组结肠长度显著长于模型组，且优于阳性药组。令人惊讶的是，地榆皂苷II治疗组小鼠的结肠长度与对照组几乎没有差异。

选取上述小鼠的结肠组织的中段，组织长度约1cm，浸泡在福尔马林溶液中固定过夜，石蜡包埋后切片，HE染色。如图11所示，模型组肠道粘膜层形态紊乱，大量炎性细胞浸润，而治疗组肠道粘膜层形态完整，炎症细胞浸润减少，有明显的治疗作用。尤其是与阳性药组相比，地榆皂苷II具有维持肌层厚度的优势。

选取上述小鼠的结肠组织的近直肠段10mg，加入PBS匀浆，离心取上清。对上清进行ELISA检测，对炎症因子TNF-α和IL-1β进行蛋白定量。如图12A所示，地榆皂苷II治疗组炎症因子TNF-α和IL-1β的表达水平显著低于模型组，且效应优于阳性药组。

在溃疡结肠炎的病理状态下，结肠中活性氧(ROS)的含量会持续增高，过量的ROS会加剧结肠组织的破坏。选取上述小鼠的结肠组织10mg，对其中的ROS进行检测。如图12B所示，给予地榆皂苷II(5mg/kg)可以显著降低组织中ROS的量，且效应优于阳性药组。

溃疡结肠炎发生时，炎症因子会破坏肠道间的紧密连接，紧密连接的破坏使得黏膜屏障失去功能，加重了疾病的发展。选取上述小鼠的结肠组织5mg，进行qPCR分析。如图12C所示，给予地榆皂苷II(5mg/kg)后，与紧密连接相关的三种主要蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的表达较模型组增高且具有显著性。提示地榆皂苷II还具有增加紧密连接表达进而保护结肠结构的功效。

以上结果表明，地榆皂苷II对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有显著的保护和治疗作用，且总体疗效显著优于临床一线药物5-氨基水杨酸，因而有望用于制备预防或治疗溃疡性结肠炎等炎症性肠病的药物。

本发明中的其他五环三萜皂苷对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型也都显示了与地榆皂苷II相似的保护作用。例如，经过柴胡皂苷A(VII)、柴胡皂苷D(VIII)、地榆皂苷I(XII)、地榆皂苷II(XIII)、人参皂苷Ro(I)、川续断皂苷VI(II)、黄花倒水莲皂苷C(IX)、α-常春藤皂苷(X)或常春藤苷C(XI)治疗后，治疗组DAI打分均明显低于模型组，且都显著优于阳性药组。

实施例6

地榆皂苷II对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的克罗恩病模型小鼠的治疗作用

选取6-8周雄性C57BL/6小鼠，小鼠随机分为对照组、模型组、治疗组和阳性对照组。除对照组外，其余各组小鼠用异氟烷麻醉后，将软管自肛门小心插入至小鼠结肠中，缓慢注射1.5％的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)100μL。拔出软管前，将小鼠倒立放置1分钟。灌肠处理当天进行第一次灌胃给药，对照组和模型组小鼠口服安慰剂羟甲基纤维素钠，治疗组小鼠口服地榆皂苷II(购自上海柏卡化学技术有限公司)(剂量为5mg/kg)，阳性药组小鼠口服临床用药5-氨基水杨酸(5-ASA，购自上海生工生物工程有限公司)(剂量为100mg/kg)。连续给药7天。给药过程中每天观察小鼠状态，记录小鼠的体重变化。

对比各组小鼠的体重变化的差异，可以得知地榆皂苷II对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)造模的克罗恩病模型小鼠有治疗作用。如图13A所示，给予地榆皂苷II(5mg/kg)后，小鼠体重下降幅度明显低于模型组，且地榆皂苷II治疗组的疗效显著优于阳性药组。

将上述小鼠在第八天脱颈椎处死，取结肠组织，量取其长度，统计汇总，对比各组结肠长度的差异，可以得地榆皂苷II对克罗恩病模型小鼠具有显著的治疗作用。如图13B所示，地榆皂苷II治疗组结肠长度显著长于模型组，且优于阳性药组。令人惊讶的是，地榆皂苷II治疗组小鼠的结肠长度与对照组几乎没有差异。

选取上述小鼠的结肠组织的近直肠段10mg，加入PBS匀浆，离心取上清。对上清进行ELISA检测，对炎症因子TNF-α和IL-1β进行蛋白定量。如图14A所示，地榆皂苷II治疗组炎症因子TNF-α和IL-1β的表达显著低于模型组，且优于阳性药组。

髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细胞所特有的酶，通过检测MPO水平可以反应出肠道内中性粒细胞的数目。选取上述小鼠的结肠组织的近直肠段5mg，加入PBS匀浆，使用MPO试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)检测其中的MPO含量。如图14B所示，给予地榆皂苷II(5mg/kg)可以显著降低组织中MPO的量，且效应优于阳性药组。

以上结果表明，地榆皂苷II对TNBS诱导的克罗恩病模型小鼠具有显著的保护和治疗作用，且总体疗效优于临床药物5-氨基水杨酸，因而有望用于制备预防或治疗克罗恩病等炎症性肠病的药物。

本发明中的其他五环三萜皂苷对TNBS诱导的克罗恩病模型小鼠也都显示了与地榆皂苷II相似的保护与治疗作用。例如，经过柴胡皂苷A(VII)、柴胡皂苷D(VIII)、地榆皂苷I(XII)、地榆皂苷II(XIII)、人参皂苷Ro(I)、川续断皂苷VI(II)、黄花倒水莲皂苷C(IX)、α-常春藤皂苷(X)或常春藤苷C(XI)治疗后，治疗组小鼠结肠长度与对照组几乎没有差异。此外，治疗组炎症因子TNF-α和IL-1β的表达也均显著低于模型组，且优于阳性药组。

实施例7

川续断皂苷VI(式(II)化合物)对人多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖的影响

细胞与试剂：人ADPKD囊肿衬里上皮细胞系WT9-12与DMEM完全培养基购自ATCC公司；胎牛血清购自Gibco公司；Cell Counting Kit-8购自DOJINDO公司；Click-EdUImaging Kits购自Invitrogen^TM Thermo Fisher Scientific公司；Caspase-3/CPP32Colorimetric Assay Kit购自BioVision公司；Annexin V/PI双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自Bender公司；抗Phospho-(AMPKα、mTOR、p70S6K、4E-BP1)抗体购自CellSignaling Technology公司。

CCK-8法检测2-DG对多囊肾上皮细胞增殖的影响：配制含10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基。多囊肾上皮细胞复苏后，在37℃5％CO₂的孵箱中培养，隔天换液，每2～3天传代，细胞呈贴壁生长状态。经胰酶消化后，采用完全培养基重悬细胞，将多囊肾上皮细胞悬液浓度调整为3×10⁷/L，每孔100μL接种于96孔板，培养24h，换液为含0.1％FBS的培养基同步化24h。将川续断皂苷VI溶解于DMSO中配置为20mM的母液，培养基稀释药液，给药浓度为0.234，0.469，0.938，1.875，3.75，7.5，15，30，60μM，每个浓度设6个复孔，之后每组给予不同浓度川续断皂苷VI(空白组无细胞只加培养基不加药；对照组为溶剂对照，加入与给药组一致的含DMSO培养基)培养48h后，每孔加入10μL Cell Counting Kit-8试剂，在37℃孵箱中孵育4h，使用酶标仪读取450nm波长下每孔的吸光度值(A)。增殖抑制率(％)＝(A对照-A实验)/(A对照-A空白)×100％。实验结果见图15。

Western blot检测蛋白表达：收集对照组与处理组(10μM川续断皂苷VI干预48h的多囊肾上皮细胞)的细胞，用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取50μg样本蛋白按顺序加样，SDS-PAGE电泳后，I＝250mA恒流转移至PVDF膜，5％BSA封闭1h，分别予以不同的一抗孵育24h，TBST洗膜四遍后，采用HRP标记的二抗(1∶10000)常温孵育1.5h，TBST洗膜四遍后，ECL显影，Image-J凝胶图像分析软件对各组蛋白条带进行灰度分析。实验结果见图16。

实验结果

CCK-8实验结果(图15)显示，随着川续断皂苷VI浓度的增加，存活细胞数逐渐减少，提示川续断皂苷VI对多囊肾上皮细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性，计算得到半数抑制浓度(IC₅₀)为3.2μM。

Western blot检测结果显示，经川续断皂苷VI处理后，多囊肾上皮细胞内AMPKα的磷酸化水平升高(图16)，这表明川续断皂苷VI激活了多囊肾上皮细胞内的AMPK；同时，增殖相关信号通路活化型分子mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平降低(图16)，这表明川续断皂苷VI通过激活AMPK抑制了mTOR信号通路，进而抑制了多囊肾上皮细胞的增殖。

以上结果表明，川续断皂苷VI可抑制多囊肾上皮细胞的增殖，进而可防治多囊肾病(特别是常染色体显性多囊肾病)。

本发明中的其他五环三萜皂苷对多囊肾上皮细胞也都显示了与川续断皂苷VI相似的增殖抑制作用(表5)。

表5.五环三萜皂苷对多囊肾上皮细胞的增殖抑制作用

组别	n	抑制率(％)
			对照组	6	6.8±2.3
人参皂苷Ro	6	74.4±2.3***
			地榆皂苷I	6	69.2±1.7***
地榆皂苷II	6	72.1±2.0***
			积雪草苷	6	68.5±1.8***
羟基积雪草苷	6	76.3±2.3***
			α-常春藤皂苷	6	80.5±3.2***
常春藤苷C	6	64.4±2.6***

(给予10μM五环三萜皂苷处理多囊肾上皮细胞48h后，采用CCK-8法检测多囊肾上皮细胞的增殖抑制率，与对照组比较，***P＜0.001)

实施例8

将式(I)～(XIII)任意一种化合物(50g)、羟丙甲基纤维素E(150g)、淀粉(200g)、聚维酮K30适量和硬脂酸镁(1g)混合，制粒，压片，制成片剂。

同时可以根据药典2015版四部口服溶液剂常规制法，胶囊剂软胶囊常规制法等制成口服液、胶囊剂；或者结合不同的载体赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等，制成不同剂型如散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、吸入剂、软膏剂、栓剂和贴剂等制剂学上常规的制剂形式；式(I)～(XIII)任意一种化合物各种剂型可以用于预防和治疗脂肪性肝病包括非酒精性脂肪性肝病，特别是非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化。

式(I)～(XIII)任意一种化合物其药学上可接受的盐，金属离子(如钠、钾、钙等)或药学上可接受的胺(如乙二胺、氨丁三醇等)或铵离子形成的盐，也可以用于预防和治疗脂肪性肝病包括非酒精性脂肪性肝病，特别是非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化。

式(I)～(XIII)任意一种化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可与一种或多种抗非酒精性脂肪性肝病的药物联合使用用于预防和治疗脂肪性肝病包括非酒精性脂肪性肝病，特别是非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化效果显著，这些药物包括AMPK激动剂、法尼酯X受体(FXR)激动剂(如奥贝胆酸、GS-9674、EDP-305和LJN452等)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂(如GS-0976等)、凋亡信号调节激酶-1(ASK1)抑制剂(如Selonsertib等)、PPAR激动剂(如Elafibranor、Saroglitazar、IVA337和MSDC-0602K等)、半胱天冬酶(caspase)抑制剂(如Emricasan等)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)抑制剂(如Aramchol等)、长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂(如Semaglutide等)、顶端钠依赖性胆盐转运体(ASBT)抑制剂(如Volixibat等)、血管粘附蛋白1(VAP-1)抑制剂(如BI 1467335等)、CCR5R阻断剂(如Cenicriviroc等)和甲状腺激素受体β(THR-β)激动剂(如MGL-3196等)等。

Claims

1.如式(I)～(XIII)所示的五环三萜皂苷或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备预防或治疗AMPK介导的疾病的药物中的用途：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述AMPK介导的疾病是脂肪性肝病、炎症性肠病、呼吸系统疾病、糖尿病并发症或多囊肾病。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述脂肪性肝病是非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎诱发的肝硬化。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述呼吸系统疾病是哮喘、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、过敏性鼻炎或慢性鼻炎。

6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述糖尿病并发症是糖尿病肾病、糖尿病心肌病或糖尿病溃疡。

7.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述多囊肾病是常染色体显性多囊肾病。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式(I)～(XIII)化合物其药学上可接受的盐为金属离子或药学上可接受的胺、铵离子或胆碱形成的盐。

9.一种预防和治疗AMPK介导的疾病的药物组合物，其特征在于，其中含有治疗有效量的式(I)～(XIII)任一化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成份和药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型优选为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂。