CN115300565B - 药物组合物在治疗或预防自身免疫性肝损伤中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种药物组合物在制备药物中的用途。所述药物用于治疗或预防患有自身免疫性疾病患者的肝部损伤，所述药物组合物包括茵陈、春柴胡、苦参、大黄和大青叶。所述药物能够安全有效地缓解免疫性肝损伤症状，达到预防或治疗免疫性肝损伤的效果。

Description

药物组合物在治疗或预防自身免疫性肝损伤中的用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体地，涉及中药技术领域，更具体地，涉及药物组合物在治疗或预防自身免疫性肝损伤中的用途。

背景技术

我国是肝病大国，各种类型的肝炎病人数量巨大。免疫介导的肝损伤是临床常见疾病，如治疗不及时，预后不佳，甚至可能出现肝衰竭，危害人体健康。体内免疫反应所致的肝损伤存在于众多肝脏疾病的发生发展过程中，如病毒性肝炎、药物性肝损伤、自身免疫性肝病、酒精性和非酒精性脂肪肝等，其特征是激活的免疫细胞产生免疫应答反应，引起炎性细胞浸润、细胞因子释放、肝细胞坏死和凋亡等。刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)是一种较为常用的有丝分裂原，可以激活T淋巴细胞并促进其增殖，因其与肝窦有良好的亲和性，故肝脏成为了ConA在体内作用的靶器官。ConA诱导的肝损伤是典型的免疫性肝损伤模型，能够较好的模拟人类自身免疫性肝炎的免疫反应，并能用作筛选治疗肝损伤的有效药物。

肝病有多种类型，不同类型的肝病发病机制、治疗方式等并不相同，例如药物性肝损伤、非酒精性脂肪性肝病和自身免疫性肝炎等，在发病机制、检测方法和指标、治疗方式中均不相同：

目前，自身免疫性肝损伤(AIH)还没有一种毒副作用小、安全有效的特效治疗药物。

综上所述，开发一种有效缓解自身免疫性肝损伤症状、达到治疗目的，并且安全有效的药物非常有必要。

发明内容

发明人经过大量的研究发现，中药苦黄对自身免疫性肝损伤具有预防和治疗的功效，其成分对免疫性肝损伤的保护作用是通过抗氧化、抑制炎症介质释放、调节免疫功能等多方面、多途径、多靶点起作用。中药苦黄具有清热利湿、疏肝退黄的功效，用于因湿热内蕴引起的黄疸型肝炎患者的退黄，但目前关于苦黄对免疫性肝损伤的保护作用尚不明确。自身免疫性肝损伤与其他肝病的发病机制、病理表现、临床表现等均不相同，其可能由病毒感染、毒素、交叉抗原等可能诱导自身抗体的产生和打破自身耐受引起，进而发生针对肝的自身免疫反应。从体液免疫角度来看，AIH患者可能具有：抑制性T细胞功能缺陷，不能正常抑制对自身抗原有反应性的B细胞，后者产生针对自身抗原的自身抗体，进一步可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用破坏自身细胞；从细胞免疫角度来看：AIH发生时HLA分子、细胞黏附分子及淋巴细胞功能相关抗原异常表达，细胞因子失衡，T细胞打破耐受而识别自身抗原，导致效应T细胞与靶细胞结合复合体的形成和细胞溶解，引起肝损伤和坏死。自身免疫性肝损伤还具有遗传易感性：主要与人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类分子及Ⅱ类分子有关。其中HLA DR3及DR4是Ⅰ型AIH的危险因子，而Ⅱ型AIH可能与DR7有关。

与其他肝损伤、肝病不同，自身免疫性肝损伤具有特征性肝组织学性状，(1)界面性肝炎:汇管区和小叶间隔周围肝细胞呈碎片样坏死，伴淋巴细胞、浆细胞为主的炎性细胞浸润，也可出现汇管区一汇管区、小叶中央一汇管区的桥样坏死；(2)淋巴-浆细胞浸润:主要见于门管区和界面处，也可出现在小叶内；(3)肝细胞玫瑰花瓣样改变:指数个水样变性的肝细胞形成的假腺样结构，中心有时可见扩张的毛细胆管，形似玫瑰花环，一般见于界面炎周围；(4)淋巴细胞穿入现象和小叶中央坏死等。其他类型的肝损伤、肝病，例如药物性肝损伤，则较常引起坏死型肝炎、胆汁淤积、脂肪变、血管损伤和肿瘤等，临床多见为类急性黄疸型肝炎、胆汁淤积型肝病。

本发明的一个目的在于提出一种具有药效好、毒副作用小优点的药物组合物及其用途。

在本发明的第一方面，本发明提出了药物组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防患有自身免疫性疾病患者的肝部损伤，所述药物组合物包括茵陈、春柴胡、苦参、大黄和大青叶。根据本发明的实施例，使用上述药物可以有效缓解自身免疫性肝损伤，同时，所述药物未发现毒副作用，安全有效。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述患有自身免疫性疾病患者在肝部的炎性细胞增多。患有自身免疫性疾病的患者，即指患者的免疫系统在遗传缺陷和诱发因素的共同作用下发生过度激活，错误地攻击自身正常组织和细胞，导致全身性或部分的器官、组织损伤。患有自身免疫性疾病的患者的各组织或器官均可能会出现损伤，在肝脏的表现为肝病、肝损伤，炎性细胞增多、聚集，进而引起肝脏的器质性病变等。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防自身免疫性肝损伤。根据本发明的实施例，所述药物可以治疗或者预防自身免疫性肝损伤，患者可能具有其他自身免疫性疾病，或在其他器官、组织等具有自身免疫性损伤，也可能只具有自身免疫性肝损伤。

根据本发明的实施例，所述药物具有降低炎症因子的作用。根据本发明的实施例，本申请的药物组合物可以有效降低肝组织中的炎症因子，缓解肝组织中的淤血、眼形细胞浸润的症状等。

根据本发明的实施例，所述炎症因子包括下列至少之一：TNF-α、IFN-γ和IL-2。根据本发明的实施例，本申请的药物组合物可以显著降低肝组织中的上述三种炎症因子的表达，特别是IFN-γ，其对IFN-γ的表达抑制效果优于双环醇(对照药物)。

根据本发明的实施例，所述药物还可以显著降低血清中转氨酶的含量，特别是谷丙转氨酶、谷草转氨酶。

根据本发明的实施例，所述药物可以降低肝组织中炎性细胞聚集和/或活化，特别是CD4⁺、CD8⁺和NKT细胞(自然杀伤细胞)。

根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：700～900重量份的茵陈、700～900重量份的春柴胡、150～350重量份的苦参、250～450重量份的大黄和550～750重量份的大青叶。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：800～850重量份的茵陈、800～850重量份的春柴胡、250～300重量份的苦参、300～350重量份的大黄和600～650重量份的大青叶。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此可以得到较好的缓解症状，其他配比则不及本配比效果优异。

根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：800～850重量份的茵陈、800～850重量份的春柴胡、200～300重量份的苦参、300～400重量份的大黄和600～650重量份的大青叶。

根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：833.3重量份的茵陈，833.3重量份的春柴胡，266.7g重量份的苦参，333.3重量份的大黄，625重量份的大青叶。

根据本发明具体的实施例，所述药物组合物为苦黄。对苦黄的剂型没有特殊限制，例如，可以为口服剂型、注射剂型等。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例，所述药物联合包括：上述药物组合物；和其他用于治疗自身免疫性疾病的药物。根据本发明的实施例，所述其他用于治疗自身免疫性疾病的药物包括：阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、布洛芬、可的松、泼尼松、地塞米松、甲氨蝶呤、羟氯喹、来氟米特、硫唑嘌呤、环孢素A、6-巯基嘌呤、酶酚酸醋、多烯磷脂酞胆碱、熊去氧胆酸等。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的淋巴细胞镜下观察示意图；

图2是根据本发明实施例的各组小鼠血清AST、ALT水平；

图3是根据本发明实施例的各组小鼠肝组织病理结果，其中a-e为肉眼观察，A-E为显微镜下观察，HE染色，×10；A为空白组、B为阴性对照组、C为模型组、D为双环醇组和E为苦黄组；

图4为根据本发明实施例的各组小鼠肝组织炎症介质表达情况；

图5为根据本发明实施例的空白组和模型组的小鼠肝脏淋巴细胞比例；

图6为根据本发明实施例的双环醇组和苦黄组的小鼠肝脏淋巴细胞比例。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

制药用途

在本发明的第一方面，本发明提出了一种药物组合物在制备药物中的用途。所述药物用于治疗或预防患有自身免疫性疾病患者的肝部损伤，所述药物组合物包括茵陈、春柴胡、苦参、大黄和大青叶。

如本发明所使用的术语“治疗”任何疾病或病症，是指所有可以减缓、中断、阻止、控制或停止疾病或病症的进展，但不一定表示所有疾病或病症的症状全部消失，其也包括对所述症状的预防性治疗，尤其是在容易患有这样疾病或障碍的患者中。在其中一些实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)，如炎性细胞浸润肝组织、炎症因子升高等临床症状。在另一些实施方案中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的身体参数，如患者体内的病毒含量等。在另一些实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的发作、发生或恶化。

如本发明所使用的术语“组合物”是指包含规定量的规定成分的产物，以及规定量的规定成分的组合所直接或间接地产生的任何产物。与药物组合物相关的这种术语的含义包括包含活性成分(单个或者多个)和组成载体的惰性成分(单个或者多个)的产物，以及由任何两种或多种成分混合、复合或聚集，或者由一种或多种成分分解，或者由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用而直接或间接产生的任何产物。因此，本发明药物组合物包括通过将本发明化合物与可药用载体混合而制备的任何组合物。

实施例1：苦黄对免疫性肝损伤的治疗

1材料与仪器

1.1实验动物

8-10周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重20±2g，购自兰州大学动物房(证书编号：SCXK(甘)2018-0002)。实验动物饲养于兰州大学动物实验中心SPF级实验室(22℃，55％湿度)，光照与黑暗各12h循环，小鼠可自由获得食物和水。动物使用严格遵守兰州大学实验动物伦理规定，实验程序严格按照兰州大学实验动物管理规范条例操作。

1.2实验药品和试剂

刀豆蛋白A-IV型(北京索莱宝科技有限公司)，苦黄颗粒(常熟雷允上制药有限公司)，双环醇片(北京协和药厂)，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(德国QIAGEN有限公司)，引物合成(上海invitrogen有限公司)，流式用抗体FITC-CD3(杭州联科生物技术股份有限公司)，APC/Cyanine7-CD4，Pacific Blue-CD69，PE/Cyanine7-NK1.1，APC-TCRβ(美国BioLegend有限公司)和PE-T select CD1d tetramer(日本MBL株式会社)，胶原酶IV、percoll液、200目和300目细胞筛(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3实验仪器设备

分析天平，可见分光光度仪，高速冷冻离心机，电热恒温水浴箱，普通光学显微镜，全自动生化分析仪，全自动RNA提取仪，荧光定量PCR仪，混匀仪，病理切片机。

2方法

2.1溶液配制

ConA用生理盐水稀释成适宜浓度，以15mg/kg剂量给药。双环醇片：成人每次1-2片(按2片计)，每日3次，每片25mg，即成人每日需150mg；小鼠每日需(19.5mg/kg/日)，将所需剂量双环醇片溶解于适量生理盐水中。苦黄颗粒：成人每次1袋，每日3次，每袋6g，即成人每日需要量18g；小鼠：每日需要量为(2.34g/kg/日)，将所需剂量苦黄颗粒溶解于适量生理盐水中。实验步骤严格按照操作说明进行。(注：1.双环醇片在溶解时可先将生理盐水加热，使溶解完全，在给药前如果发现有沉淀，应当先摇匀至无沉淀再给药。

2.2造模和给药

取8至10周龄、体重18至22g雄性C57BL/6小鼠55只，适应性饲养2周，光照、黑夜各12h，能够自由获得食物和水。将小鼠随机分为空白对照组、阴性对照组、肝损伤模型组、双环醇组、苦黄组(n＝11)。空白对照组只灌胃给予生理盐水(1次/日)；阴性对照组灌胃给予生理盐水，随后尾静脉注射给予生理盐水(1次/日)；肝损伤模型组、双环醇组、苦黄组分别灌胃给予等体积生理盐水、双环醇、苦黄(1次/日)，随后均单次尾静脉注射给予ConA(15mg/kg)。

2.3血清AST和ALT检测

于造模12小时后摘眼球放血牺牲小鼠，收集血液在室温条件下凝固20min后以3300r/min离心10min，吸取上层血清，Elisa试剂盒检测AST和ALT值，实验步骤和仪器操作严格按照说明书进行。

2.4肝损伤评估

将小鼠浸泡酒精消毒，无菌取小鼠肝脏，生理盐水冲洗至不留血迹。将一部分肝脏置于4％中性甲醛溶液中固定，行脱水、石蜡包埋制成4μm厚石蜡切片，行HE染色，分别由两位经验丰富的病理科医师评估肝组织损伤程度。(评估肝炎炎症活动度分级标准：G0级——汇管区及周围、小叶内均无炎症；G1级——汇管区炎症(CPH)，小叶内细胞变性及少数坏死灶；G2级——汇管区及周围轻度碎屑样坏死(轻型CAH)，小叶内变性，点、灶状坏死或嗜酸小体；G3级——汇管区及周围中度碎屑样坏死(中型CAH)，小叶内变性、坏死重或见桥接坏死(BN)；G4级——汇管区及周围重度碎屑样坏死(重型CAH)，小叶内碎屑样坏死范围广，累及多个小叶、叶结构失常(多小叶坏死)。

2.5肝组织中TNF-α、IFN-γ和IL-2检测

另一部分新鲜肝脏组织经裂解液制成匀浆，提取RNA后行反转录，采用实时荧光定量PCR法法检测肝组织中TNF-α、IFN-γ和IL-2基因表达情况。PCR反应体系为20μL，反应条件为94℃预变性2min，94℃5s，60℃15s，40个循环。TNF-α基因上游引物序列为5'-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCAT-3'(SEQ ID NO:1)，下游引物序列为5'-CAGAGTAAAGGGGTCAGAGTGG-3'(SEQ ID NO:2)。IFN-γ基因上游引物序列为5'-ATGGCTGTTTCTGGCTGTTACT-3'(SEQ ID NO:3)，下游引物序列为5'-AATGACGCTTATGTTGTTGCTG-3'(SEQ ID NO:4)。IL-2基因上游引物序列为5'-CATTGACACTTGTGCTCCTTGT-3'(SEQ ID NO:5)，下游引物序列为5'-TCCTGTAATTCTCCATCCTGCT-3'(SEQ ID NO:6)。内参(β-actin)基因上游引物序列为5'-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3'(SEQ ID NO:6)，下游引物序列为5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'(SEQ ID NO:8)。以2－ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

2.6流式细胞术

分离肝单个核细胞(MNCs)。具体如下：摘眼球放血牺牲小鼠，放75％酒精中浸泡2-3min，在无菌条件下解剖小鼠，充分暴露肝脏和脾脏，找到下腔静脉所在，是一条深蓝色的血管，用冷PBS 10-20ml灌注肝脏，如果针头顺利进入下腔静脉，推注PBS后可见到肝脏鼓起并变土黄色，此时切断门静脉，以释放压力。待PBS推注完后，灌注结束。

完整取下肝脏和脾脏，放置于盛装1ml RPMI1640或DMEM，加入IV型胶原酶0.5mg，使浓度为0.05％。将肝脏置于皿中，充分剪碎，于水浴箱中，37℃孵育30-60min。在75mm培养皿中盛装适量RPMI1640，将200目细胞过滤筛浸于其中。将35mm培养皿中消化后的肝脏和溶液一起转移到细胞筛中，用1ml注射器柱塞轻轻研磨肝脏，边研磨边冲洗，保持肝组织湿润。研磨完后用适量RPMI1640冲洗滤网，将所得细胞悬液反复经200目细胞筛过滤，收集滤液于50ml离心管中，4℃，550-700r/min，离心1-2min。将上层液体经300目细胞过滤筛转移入新50ml离心管中，4℃，1200-1500r/min，离心5min，弃上清。1×PBS洗两次后得沉淀。

用100％percoll 9个体积与10×PBS 1个体积充分混匀制成等渗percoll。再用1xPBS(含浓度为1000u/ml的肝素百分之一体积)与等渗percoll分别配制成70％、33％percoll。非连续密度梯度离心法分离肝脏和脾脏单个核细胞：用至少3ml 33％percoll将上述沉淀重悬，用少量血清将另一15ml试管壁湿润，装入等体积70％percoll。用吸管小心将重悬液沿试管壁叠加在70％percoll上，此时可看见明显的分层,上层为细胞悬液层，下层为percoll分离液层。将离心机设置成最低的加速度与减速度，室温，2000-2500r/min，离心25-30min。离心后取出试管，可见明显的分层，由上至下依次为：稀释液层、淋巴细胞、percoll分离液层、红细胞层。

小心吸取中间层细胞至新15ml试管，加入1ml红细胞裂解液，裂解2min。补加1×PBS至10ml，4℃，1200-1500r/min，离心5min收集细胞。1×PBS重复洗涤一次后得沉淀，适量1×PBS1ml重悬细胞，取10ul细胞悬液于显微镜下观察(淋巴细胞为小而圆，且透亮)(参考附图1)。

收集细胞，调整细胞浓度为107个/ml，取100ul(约106个)细胞悬液于流式管中，按照说明书依次加入流式抗体，混匀，避光孵育15-30min。每管加入1ml流式缓冲液，混匀，1200-1500转，离心5min，洗去未结合的抗体。弃上清，每管加500ul流式缓冲液，混匀，4℃环境下避光放置，1h内检测。

2.7统计学方法

采用Graphpad 8.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差

表示，满足正态性、方差齐的多组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)；方差不齐则选用Kruskal-Wallis检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1小鼠一般情况及结局

干预前，各组小鼠在精神状态、活动和外观等方面均未出现明显差异。空白组和阴性对照组小鼠与干预前相比无明显差异。模型组小鼠在干预后出现明显的精神萎靡、活动减少、发抖和抱团现象，并且毛发蓬松粗乱，对外界刺激反应差。双环醇组和苦黄组小鼠在干预后上述表现不如模型组明显。在所有组中，只有模型组小鼠出现死亡。

3.2血清AST、ALT水平比较

与阴性对照组相比，模型组血清AST、ALT水平明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明造模成功；与模型组相比，双环醇组和苦黄组血清AST、ALT水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)(参考附图2，***表示与阴性对照组相比P<0.001，*表示与模型组相比P<0.05)。

3.3肝损伤评估

小鼠肝组织制成的病理切片由经验丰富的专业病理科医师阅片以评估肝损伤程度。空白组和阴性对照组小鼠肝小叶结构清晰，小叶中央可见中心静脉，肝细胞形态规则并围绕中心静脉呈放射状排列。与阴性对照组小鼠相比，模型组小鼠肝组织淤血、出现明显坏死灶伴炎细胞浸润，且肝细胞肿胀、排列紊乱。而双环醇组和苦黄组小鼠肝组织坏死不如模型组明显，淤血和炎细胞浸润较轻(参考附图3)。

3.4肝组织中TNF-α、IFN-γ和IL-2基因表达

如图所示，模型组TNF-α、IFN-γ和IL-2mRNA相比空白组和阴性对照组呈相对高表达，双环醇组和苦黄组TNF-α、IFN-γ和IL-2mRNA相对表达量低于模型组，差异均有统计学意义(P均＜0.05)(参考附图4，以模型组为参照，其mRNA表达水平校正为1，**P表示与空白组和阴性对照组相比P<0.01，**P表示与模型组相比P<0.01，*P表示与模型组相比P<0.05)。

3.5小鼠肝脏中淋巴细胞检测

分离小鼠肝脏单个核细胞进行荧光染料标记后流式细胞仪分析显示：与空白组相比，模型组小鼠表现为CD4+和CD8+细胞在肝脏中聚集，且NKT聚集并活化；给与双环醇和中药苦黄后能减少CD4+、CD8+和NKT细胞在肝脏中聚集，且NKT细胞的活化减少，但在双环醇组中CD8+相比模型组未见减少。以上表明在ConA所致的肝损伤中，CD4+、CD8+和NKT细胞在肝脏中过度聚集和活化可能具有致病作用(参考附图5和6)。

综上，本发明使用ConA造模，探究苦黄对ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤是否具有保护作用。ConA经尾静脉注入小鼠肝脏，12h后取血，模型组小鼠血清AST和ALT水平显著高于空白组和阴性对照组，且肝组织病理显示模型组肝组织淤血、坏死明显伴炎细胞浸润，肝小叶结构紊乱，提示刀豆蛋白A造成显著肝损伤，说明造模成功。与模型组相比，双环醇和苦黄组血清AST和ALT水平低于模型组，同时病理提示肝组织淤血和坏死减轻，表明双环醇和苦黄组成成份可减轻ConA诱导的小鼠免疫性肝损害。随后检测各组小鼠肝组织TNF-α、IFN-γ和IL-2mRNA表达水平，模型组相比空白组和阴性对照组呈高表达，表明ConA能促进炎症介质的激活；而双环醇组和苦黄组相比模型组呈低表达，表明双环醇和苦黄组成成份能抑制炎症介质表达。通过进一步流式细胞术分析小鼠肝脏中淋巴细胞群变化发现，给与ConA后可引起CD4+、CD8+和NKT向肝脏中聚集并迅速活化，而给与药物干预后T细胞亚群和NKT细胞的聚集明显减少，本申请的药物对自身免疫性肝损伤具有治疗作用。

实施例2：谷胱甘肽和苦黄颗粒对AIH模型小鼠的影响

药物性肝损伤和自身免疫性肝炎在形成机制和表现上有一定重叠，药物性肝损伤在初期是由于药物及其代谢产物引起过氧化反应，引发肝细胞炎症、变性，表现为肝酶、胆红素等的异常，主要诊断需要有排除其他肝病类型的过程，进行像样的保肝治疗；而自身免疫性肝炎是基于T淋巴细胞介导的细胞破坏、免疫调节失衡等引起的对外来抗原的免疫应答缺陷，表现为肝酶异常、肝组织病理出现界面性肝炎和肝细胞玫瑰花瓣样改变等症状，临床用药主要是联合激素和免疫抑制剂进行控制。有文献表明谷胱甘肽对Con A引起的急性肝损伤具有一定保护作用，通过改善肝酶指标、减轻肝组织炎性浸润和肝细胞肿胀坏死、下调炎症指标发挥氧化应激改善作用，减轻肝损伤；但未并无证据表明谷胱甘肽对自身免疫性肝炎有治疗作用。

1试验材料

1.1实验动物：SPF级Balb/c雄性小鼠，体重18-24g，购自北京维通利华；

1.2实验试剂：刀豆蛋白A(Sigma)、谷胱甘肽片(重庆药友制药有限责任公司)、苦黄颗粒(雷允上药业集团有限公司)。

2试验方法

选取40只SPF级BALB/c小鼠，分组给药信息见表；连续给药5天，末次给药30分钟后进行造模给药。造模给药后8h，安乐后采血，检测AST、ALT水平，并取出肝脏和脾脏称重；分离小鼠淋巴结，研磨过滤后经PBS洗涤，收集细胞后利用RPMI 1640完全培养基调整为3×109/L的细胞悬液，96孔板接种(200μl/孔)，培养48h后加入20μl的MTT，避光孵育4h后离心弃上清，加入100μl的DMSO，震荡10分钟后酶标仪检测490nm吸光值。

3试验结果

谷胱甘肽和苦黄对AIH小鼠T细胞增殖的影响

模型组细胞发生增殖，谷胱甘肽给药组与模型组的没有显著差异，而苦黄给药组对模型小时T细胞增殖有显著抑制作用。

组别	吸光值(490nm)
		空白	0.29±0.06
模型	0.54±0.04
		谷胱甘肽	0.48±0.05
苦黄	0.32±0.04*

注：*p＜0.05

综上，苦黄相对于治疗肝损伤药物的谷胱甘肽更适于治疗免疫性肝损伤。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 常熟雷允上制药有限公司

<120> 药物组合物在治疗或预防自身免疫性肝损伤中的用途

<130> BI3210581

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α基因上游引物序列

<400> 1

ggcaggtcta ctttggagtc at 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α基因下游引物序列

<400> 2

cagagtaaag gggtcagagt gg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IFN-γ基因上游引物序列

<400> 3

atggctgttt ctggctgtta ct 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IFN-γ基因下游引物序列

<400> 4

aatgacgctt atgttgttgc tg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-2基因上游引物序列

<400> 5

cattgacact tgtgctcctt gt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-2基因下游引物序列

<400> 6

tcctgtaatt ctccatcctg ct 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 内参β-actin基因上游引物序列

<400> 7

aacagtccgc ctagaagcac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 内参β-actin基因下游引物序列

<400> 8

cgttgacatc cgtaaagacc 20

Claims (2)

1.苦黄颗粒在制备治疗或预防自身免疫性肝损伤药物中的用途，其特征在于，所述苦黄颗粒药物由700~900重量份的茵陈、700~900重量份的春柴胡、150~350重量份的苦参、250~450重量份的大黄和550~750重量份的大青叶组成。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物由800~850重量份的茵陈、800~850重量份的春柴胡、200~300重量份的苦参、300~400重量份的大黄和600~650重量份的大青叶组成。

Images