CN108135985A - 癌症中的“免疫检查点干预” - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者的方法，并涉及治疗此类受试者的方法。本发明还涉及用于预测或测定患有癌症的受试者的预后的方法。

Description

癌症中的“免疫检查点干预”
发明领域
本发明涉及用于鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者的方法，并涉及治疗此类受试者的方法。本发明还涉及用于预测或测定患有癌症的受试者的预后的方法。
发明背景
激活治疗性抗肿瘤免疫的最有前途的方法之一是阻断免疫检查点。免疫检查点是免疫系统中的抑制途径，其对维持自身耐受性和调节外周组织中生理性免疫应答的持续时间和幅度以使附带组织损伤最小化至关重要。现在清楚的是，肿瘤将某些免疫检查点途径增补为免疫抗性的主要机制，特别是针对肿瘤抗原特异性的T细胞。因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用启动的，所以它们可以容易地被抗体阻断或被配体或受体的重组形式调控。
目前用于癌症中免疫检查点调控的方法涉及一定程度的猜测和偶然发现，主要基于这些化合物变得可用的顺序。CTLA4、PD-1和PDL1按照此顺序发现和生成，并且那是迄今为止施用它们的方式。最初的试验用CTLA-4进行，因为这是得到FDA批准的第一种。随后，批准并使用PD-1/PDL1治疗。
WO2015/103037提供了用于将受试者鉴定可能响应用免疫检查点调节剂治疗的方法，其基于癌症细胞可能携带导致新表位的体细胞突变的发现，所述新表位可被患者的免疫系统识别为非自身。癌症样品中一种或多种新表位的鉴定可用于测定哪些癌症患者可能有利地响应用免疫检查点调节剂的治疗。
发明概述
本发明人已经做出重要且令人惊讶的测定：具有更高的克隆新抗原数目、和/或更高的克隆:亚克隆新抗原比率、或较低的亚克隆新抗原分数(fraction)的癌症患者更有可能响应用免疫检查点干预的治疗。
如本实施例中证明，具有较高的克隆新抗原负荷和/或较低的亚克隆新抗原负荷的肿瘤患者对检查点阻断(例如抗PD1疗法)具有较好的响应。这代表了对现有技术的重要贡献，因为它打开了用于治疗和预防癌症的改善且更定向的治疗和预防形式的潜力。就这点而言，治疗和预防性干预可以靶向个体以及癌症的特定背景。
此外，本发明人发现了，令人惊讶地，具有较高的克隆新抗原数目的肿瘤细胞表现出免疫检查点分子的相似表达谱，也就是说它们表现出免疫检查点分子的共同表达谱。这是对现有技术的重要贡献，因为先前尚未证明特定类型的癌症表现出免疫检查点分子的特定表达谱。本发明人第一次显示了这点，并且此发现促进了治疗或预防特定癌症的更定向方法。
令人惊讶地，本发明人还发现了具有较高的克隆突变数目和较高的克隆:亚克隆突变比率的患者具有改善的预后。
因此，本发明解决了现有技术中对治疗和预防癌症的新的、备选的和/或更有效的方式的需要。
因此，本发明提供了用于鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
(i)测定来自所述受试者的一种或多种癌细胞中的克隆新抗原的数目；和/或
(ii)测定来自所述受试者的超过一种癌细胞中的克隆:亚克隆新抗原的比率和/或亚克隆新抗原分数；和/或
(iii)测定来自所述受试者的癌细胞和/或肿瘤浸润性免疫细胞，或肿瘤类型中的免疫检查点分子的表达谱，
其中与参照样品相比，更高的克隆新抗原数目、和/或更高的克隆:亚克隆新抗原比率、或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数，和/或差异免疫检查点分子表达指示对免疫检查点干预的响应。
在另一个方面，本发明提供了用于预测或测定患有癌症的受试者的预后的方法，所述方法包括：
(i)测定来自所述受试者的一种或多种癌细胞中的克隆新抗原的数目；和/或
(ii)测定来自所述受试者的超过一种癌细胞中的克隆:亚克隆新抗原的比率和/或亚克隆新抗原分数，
其中更高的克隆新抗原数目和/或更高的克隆:亚克隆新抗原比率或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数指示改善的预后。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)根据本发明的方法鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者；并且
ii)用免疫检查点干预治疗所述受试者。
在又一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，其包括用免疫检查点干预治疗患有癌症的受试者，其中已经确定所述受试者具有与参照样品相比：
(i)更高的克隆新抗原数目；和/或
(ii)更高的克隆:亚克隆新抗原比率，或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数；和/或
(iii)差异免疫检查点分子表达。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的癌症的方法中的免疫检查点干预，所述方法包括：
i)根据本发明的方法鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者；并且
ii)用免疫检查点干预治疗所述受试者。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者中的癌症的免疫检查点干预，其中所述受试者具有与参照样品相比：
(i)更高的克隆新抗原数目；和/或
(ii)更高的克隆:亚克隆新抗原比率，或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数；和/或
(iii)差异免疫检查点分子表达。
附图简述
图1：(A)TCGA LUAD(肺腺癌)肿瘤分组(cohort)中总推定新抗原负荷。显示了源自克隆(蓝色)或亚克隆(红色)突变的新抗原或未测定(灰色)克隆性的新抗原的比率。(B)肿瘤患者的总体存活曲线，所述肿瘤表现出高的新抗原负荷，定义为与分组的剩余部分(n＝86)相比分组的上部四分位数(n＝30)(时序P＝0.0111)，(C)高克隆新抗原负荷，定义为与分组的剩余部分(n＝87)相比分组的上部四分位数(n＝29)(时序P＝0.0077)，和(D)高亚克隆新抗原负荷，定义为与分组的剩余部分(n＝86)相比分组的上部四分位数(n＝30)(时序P＝0.12)。(E)具有高克隆新抗原负荷和低克隆新抗原负荷的肿瘤之间的差异表达基因，定义为共表达上聚集的分组的底部四分位数。框示了文中突出显示的免疫基因簇。
图2：A)L011和L012的系统树，主干和分枝长度与非沉默突变的数目成比率。B)对L011中的所有错义突变预测的推定新抗原。突出显示MTFR2D326Y新抗原(FAFQEYDSF)。C)对L012中的所有错义突变预测的推定新抗原。标示了CHTF18 L769V新抗原(LLLDIVAPK)和MYADMR30W新抗原(SPMIVGSPW)。D，E)对于L011(D)和L012(E)，源自三个肿瘤区域和正常组织的的体外扩增的CD8+T淋巴细胞的MHC多聚体分析。在这两种情况下，都标示了与突变体肽反应性的CD3+CD8+T淋巴细胞的频率。
图3：A)来自患者L011(上图)和L012(下图)的肿瘤区域1-3、相邻正常肺组织和PBMC的未扩增CD8+T细胞的MHC多聚体分析。标示了CD3+CD8+区室中的MHC多聚体阳性细胞的频率。B)来自患者L011的肿瘤浸润性CD8+ T细胞的免疫表型，比较了相同肿瘤区域、正常组织和PBMC中MTFR2反应性CD8+T细胞(MTFR2+)与MHC多聚体阴性CD8+T细胞(MTFR2-)。显示的数据来自肿瘤区域3并且代表所有区域。显示了表达CTLA-4、PD-1、LAG-3、Ki-67和GzmB的细胞的百分比。C)在MTFR2反应性(MTFR2+)和非反应性CD8+T细胞(MTFR2-)上PD-1、Ki67和GzmB的共表达。D)上图：来自L011和L012的原发性肿瘤的多色IHC。显示了CD8(红色)、粒酶B(蓝色)和LAG-3(棕色)。下图：L011区域3相对于相邻的正常组织的PD-L1染色。
图4：对于发现(A-C)和验证分组(D-F)，对具有可持续临床益处(durableclinical benefit,DCB)或非可持续益处(non-durable benefit,NDB)的患者显示克隆新抗原的数目和亚克隆新抗原的分数。对于发现(C)和验证(F)分组，显示与具有较少的新抗原数目或高亚克隆分数的那些相比，具有较高的新抗原数目和较低亚克隆分数的肿瘤中的无进展存活。G)每个测序肿瘤的克隆构造。在条形图下报告了PFS，并且用+标记具有进行中的无进展存活的那些患者。在条形图下面显示了PD-L1：强(+)50％膜染色；弱(+/-)，1-49％膜染色；阴性(-)，<1％膜染色；未知(？)。(H)组合肿瘤分组中的无进展存活，将具有较高的新抗原数目和低亚克隆部分的肿瘤与具有较低的新抗原数目或高亚克隆部分的肿瘤进行比较。I)CA9903肿瘤样品的克隆构造，突出显示HERC1突变并且标示亚克隆。J)对CA9903中的所有错义突变预测的推定新抗原。突出显示了HERC1P3278S新抗原(ASNASSAAK)。
图5：LUAD存活的四分位数分解。总体存活曲线，显示所有四个四分位数，在总新抗原负荷(A)、克隆新抗原负荷(B)、和亚克隆新抗原负荷(C)上比较患者。在图的右边给出了每个四分位数之间的关联时序p值。
图6：根据LUAD中SNV数目的存活。(B)与分组的剩余部分(n＝86)相比携带具有高SNV负荷的肿瘤的患者(n＝30)的总体存活曲线(时序P＝0.01)，(C)与分组的剩余部分(n＝86)相比高克隆SNV负荷(n＝30)(时序P＝0.014)和(D)与分组的剩余部分(n＝86)相比高亚克隆SNV负荷(n＝30)。
图7：LUSC(肺鳞状细胞癌)分组汇总。(A)TCGA LUSC患者的总推定的新抗原负荷。柱经着色而显示源自克隆(蓝色)或亚克隆(红色)突变或源自未测定(灰色)克隆性突变的新抗原的比例。(B)与具有低新抗原负荷的那些患者(n＝91)相比，具有高新抗原负荷的患者(n＝30)的总体存活曲线(时序P＝0.84)，(C)与具有低克隆新抗原负荷的那些患者(n＝92)相比高克隆新抗原负荷(n＝29)(时序P＝0.99)，和(D)与具有低亚克隆新抗原负荷的那些患者(n＝91)相比高亚克隆新抗原负荷(n＝30)。(E)与分组的剩余部分(n＝90)相比具有高SNV负荷的患者(n＝30)的总体存活曲线(时序P＝0.52)，(F)与分组的剩余部分(n＝91)相比高克隆SNV负荷(n＝30)(时序P＝0.89)和(G)与分组的剩余部分(n＝92)相比高亚克隆SNV负荷(n＝30)(时序P＝0.28)。
图8：差异基因表达分析。高克隆新抗原负荷患者与分组的剩余部分之间差异表达的基因，在共表达上聚簇。
图9：来自患者L012的肿瘤浸润性CD8+T细胞的免疫表型。A)肿瘤浸润性CD8+CHTF18反应性(CHTF18+)和MYADM反应性(MYADM+)T细胞相对于肿瘤中MHC多聚体阴性CD8+T细胞(多聚体-)、正常组织和PBMC的活化和功能表型。显示了表达CTLA-4、PD-1、LAG-3、Ki-67和GzmB的细胞的百分比。柱状图由L012、区域2和代表所有肿瘤区域的发现产生。B)与肿瘤浸润性MHC多聚体阴性CD8+T细胞(多聚体-)相比，在肿瘤浸润性CD8+CHTF18反应性(CHTF18+)和MYADM反应性(MYADM+)T细胞上共表达PD-1、Ki67和粒酶B。C)体外扩增的肿瘤浸润性CD8+T细胞用加载有突变体或野生型肽的MHC多聚体染色并通过流式细胞术分析。显示了CD3+CD8+门的MHC多聚体阳性细胞的百分比。L011(上图)：来自肿瘤区域1的扩增CD8+T细胞识别突变体而非野生型MTFR2。L012(中图)：来自肿瘤区域2的扩增CD8+T细胞识别突变体而非野生型CHTF18。L012(下图)：来自肿瘤区域2的扩增CD8+T细胞识别突变体和野生型MYADM两者。MYADM中的突变位于锚定残基上，主要影响HLA结合而不是T细胞识别。虽然数据表明该患者中的T细胞可以识别突变体和野生型肽两者(当在我们的MHC多聚体系统中稳定化时)，但野生型肽的非常低的亲和力将阻止足够的体内呈递。(D)验证BV150和PE-Cy7MHC多聚体与来自L011和L012的扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的结合。为了验证用于表征非扩增肿瘤样品中MTFR2、MYADM和CHTF18反应性T细胞的试剂的质量，我们使用相同的试剂染色较大数目的扩增的TIL。来自L011(左图)和L012(右图)的数据显示扩增的TIL中MTFR2、MYADM和CHTF18反应性T细胞的清楚且限定的群体。
图10：(A)发现和(B)验证分组肿瘤的突变负荷和克隆构造。
图11：两组肿瘤的PD-L1表达。与携带低克隆新抗原负荷或高亚克隆新抗原分数的肿瘤相比，PD-L1在携带高克隆新抗原负荷和低亚克隆新抗原分数的肿瘤中表现出显著更强的表达。
图12：A)来自具有可持续临床益处(DCB)或具有非可持久益处(NDB)的患者的发现分组肿瘤中预测的克隆突变的数目。B)来自具有DCB或NDB的患者的肿瘤中的亚克隆分数。C)与具有较低克隆突变数目或较高亚克隆分数的那些发现肿瘤相比具有较高的克隆突变数目和低亚克隆分数的发现肿瘤中的无进展存活。D)来自具有DCB或具有NDB的患者的验证分组肿瘤中预测的克隆突变的数目。E)来自具有DCB或NDB的验证患者的肿瘤中的亚克隆分数。F)与具有较低的克隆突变数目或高亚克隆分数的验证肿瘤相比具有较高的克隆突变数目和低亚克隆分数的验证肿瘤中的无进展存活。G)每个测序肿瘤的克隆和亚克隆突变的数目，在条形图中显示克隆(阴影)和亚克隆(浅阴影)。柱形加阴影以指示临床益处状态：DCB，绿色；NDB，红色。在条形图下报告PFS，并且用+标记具有进行中的无进展存活的患者。在条形图下显示PD-L1：强(+)50％膜染色；弱(+/-)，1-49％膜染色；阴性(-)，1％膜染色；未知(？)，无法评估。H)组合肿瘤分组中的无进展存活，将具有较高克隆突变数目和较低亚克隆分数的肿瘤与具有较低克隆突变数目或较高亚克隆分数的肿瘤进行比较。
发明详述
“新抗原”是由于癌细胞内的突变而出现的肿瘤特异性抗原。因此，受试者中的健康细胞不表达新抗原。
本文所述的新抗原可由任何非沉默突变引起，与野生型健康细胞表达的非突变蛋白质相比所述非沉默突变改变由癌细胞表达的蛋白质。例如，突变蛋白可以是易位或融合。
“突变”是指与来自相同个体的健康细胞相比，肿瘤细胞中核苷酸序列(例如DNA或RNA)的差异。核苷酸序列的差异可导致来自同一个体的健康细胞不表达的蛋白质的表达。
例如，突变可以是导致氨基酸序列改变的单核苷酸变体(SNV)、多核苷酸变体、缺失突变、插入突变、易位、错义突变或剪接位点突变(编码突变)。
可以通过外显子组测序、RNA-seq、全基因组测序和/或靶向基因测序组(targetedgene panel sequencing)和或单一基因的常规Sanger测序来鉴定突变。合适的方法在本领域中是已知的。
Boa et al.(Cancer Informatics.2014；13(Suppl 2):67-82.)和Ares et al.(Cold Spring Harb Protoc.2014 Nov 3；2014(11):1139-48)分别提供了外显子组测序和RNA-seq的描述。靶向基因测序组的描述可以参见例如Kammermeier et al.(J MedGenet.2014 Nov；51(11):748-55)和Yap KL et al.(Clin Cancer Res.2014.20:6605)。还可见Meyerson et al.,Nat.Rev.Genetics,2010和Mardis,Annu Rev Anal Chem,2013。靶向基因测序组也是商品化的(例如，如通过Biocompare(http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting-Tools/)汇总)。
可以使用本领域已知的方法进行序列比对以鉴定与来自非肿瘤样品的DNA和/或RNA相比来自肿瘤样品的DNA和/或RNA的核苷酸差异(例如SNV)。例如，可以使用Koboldt etal.(Genome Res.2012；22:568-576)描述的方法进行与参照样品相比的核苷酸差异。参照样品可以是种系DNA和/或RNA序列。
克隆新抗原
本发明人已测定肿瘤内异质性(ITH)可引起肿瘤的不同区域中表达的新抗原之间和肿瘤中不同细胞之间的变异。具体而言，发明人已经确定在肿瘤内，某些新抗原在所有区域和肿瘤的基本上所有细胞中表达，而其他新抗原仅在肿瘤区域和细胞的子集中表达。
因此，“克隆”或“躯干”新抗原是在整个肿瘤中有效表达并且基本上在每个肿瘤细胞内编码的新抗原。“亚克隆”或“分支”新抗原是在肿瘤中细胞或区域的某个亚组或比例中表达的新抗原。
本文中提及“基本上所有”旨在涵盖受试者中的大多数肿瘤细胞。例如，这可以包含60-100％的细胞，例如，60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79 80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100％的肿瘤细胞。
“在整个肿瘤中存在”、“在整个肿瘤中有效表达”和“基本上在每个肿瘤细胞内编码”可以表示克隆新抗原在分析的样品起源的肿瘤的所有区域中表达。
应该理解，确定突变“基本上在每个肿瘤细胞内编码”是指统计计算并因此服从统计分析和阈值。
同样，确定克隆新抗原“在整个肿瘤中有效表达”是指统计计算并因此服从统计分析和阈值。
“基本上在每种肿瘤细胞或基本上所有的肿瘤细胞中有效表达”可以指突变存在于样品中分析的所有肿瘤细胞中，如使用适当的统计方法所测定。
举例来说，描述含有突变的癌细胞比例的癌细胞分数(CCF)可用于测定突变是克隆的还是分支的。例如，可以通过将变体等位基因频率与拷贝数和纯度估计值整合来测定癌细胞分数，如由Landau et al.(Cell.2013 Feb 14；152(4):714-26)所述。
简言之，对分析的每个肿瘤区域内鉴定的所有突变计算CCF值。如果仅仅使用一个区域(即仅单一样品)，则仅获得一组CCF值。这将提供关于在所述肿瘤区域内的所有肿瘤细胞中存在哪些突变的信息，并且因此将提供突变是克隆还是分支的指示。将肿瘤区域中的所有亚克隆突变(即CCF<1)测定为分支的，而将具有CCF＝1的克隆突变测定为克隆的。
如所述，测定克隆突变服从统计分析和阈值。如此，如果测定突变具有>＝0.60的CCF 95％置信区间，例如0.65,0.70,0.75,0.80,0.85,0.90,0.95,1.00或>1.00，则可以将该突变鉴定为克隆的。相反，如果在分析的任何样品中，测定突变具有<＝0.60的CCF 95％置信区间，例如0.55,0.50,0.45,0.40,0.35,0.30,0.25,0.20,0.15,0.10.0.05或0.01，则可以将该突变鉴定为分支的。
可以理解，通过鉴定从肿瘤分离的超过一个样品的克隆突变增加鉴定克隆突变的方法的准确性。
肿瘤样品
从肿瘤中分离活组织检查和样品是本领域中的常见实践，并且可以根据任何合适的方法进行，并且此类方法对于本领域技术人员是已知的。
该方面的方法可以包括例如测定来自从肿瘤分离的一个或多个肿瘤区域的癌细胞中存在的突变。例如，可以测定存在于从肿瘤分离的单一活组织检查中，或者可选地，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个或更多个活组织检查中的突变。
可以从位于原发部位内或原发和转移之间或转移内或转移之间的整个肿瘤中的不同区域分离单独的肿瘤样品。例如，测定已知在不同区域中显示形态不同组织学的肿瘤中存在的突变可涉及测定从形态上不同的区域分离的多个单独样品中存在的突变。
样品可以是血液样品。例如，血液样品可以包含循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞或包含肿瘤DNA的外来体。
适合于治疗的受试者
本发明提供了用于鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的一种或多种癌细胞中的克隆新抗原的数目，其中较高的克隆新抗原数目指示对免疫检查点干预的响应。
如本文所使用，术语“适合于治疗”可以指更可能响应用免疫检查点干预的治疗，或者作为用免疫检查点干预治疗的候选者的受试者。与使用本发明测定为不合适的受试者相比，适合于治疗的受试者更可能响应所述治疗。根据本发明测定为适合于治疗的受试者可以表明响应用免疫检查点干预治疗而可持续临床益处(DCB)，其可以被定义为持续至少6个月的部分响应或稳定疾病。
可以将从受试者获得的癌细胞中鉴定或预测的克隆新抗原的数目与一个或多个预定阈值进行比较。使用此类阈值，可以将受试者分层成指示对治疗的响应程度的类别。
可以相对于癌症患者的参照分组测定阈值。该分组可包含10,25,50,75,100,150,200,250,500或更多的癌症患者。分组可以是任何癌症分组。或者，患者可以都有所讨论的受试者的相关或特定癌症类型。
在一个实施方案中，“高”的克隆新抗原数目指大于在癌症患者的参照分组中预测的克隆新抗原的中值数目的数目，如预测在参照分组的上部四分位数中的克隆新抗原的最小数目。
在另一个实施方案中，“高”的克隆新抗原数目可以定义为10,20,30,40,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190或200或更多个克隆新抗原。
技术人员将会理解，提及“高”或“更高”的克隆新抗原数目可以是背景特异性的，并且可以相应地进行适当的分析。
本发明进一步提供了用于鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括测定超过一个癌细胞受试者中的克隆:亚克隆新抗原的比率和/或亚克隆新抗原分数，其中克隆:亚克隆新抗原的高比率或更低/较低的亚克隆新抗原分数指示对免疫检查点干预的响应。
如上，克隆:亚克隆比率可以在具有任何癌症或者具有相关/特定的癌症的受试者分组的背景下。因此，可通过将上述讨论的方法应用于参照分组来测定克隆:亚克隆新抗原比率。因此，“高”或“更高”克隆:亚克隆比率可以对应于大于在癌症患者的参照分组中预测的中值克隆:亚克隆比率的数目，例如预测在参照分组的上部四分位数中的最小克隆:亚克隆比率。
在另一个实施方案中，“高”或“更高”克隆:亚克隆比率是指在3:1至100:1的范围内的比率，例如至少3:1,5:1,10:1,15:1,20:1,25:1,50:1,75:1或100:1的比率。本领域技术人员将会理解，数值可以取决于所讨论的分组。
如上所讨论，亚克隆新抗原的分数也可以相对于参照分组定义。例如，亚克隆新抗原的“较低”或“低”分数可对应于小于癌症患者的参照分组中预测的亚克隆新抗原的中值分数的分数，例如预测在分组的底部四分位数中的最大数目。
或者，本领域技术人员将会理解，可以通过将亚克隆新抗原的数目(例如在来自所述受试者的一个或多个癌细胞中预测)除以总新抗原的数目(例如在来自所述受试者的一种或多种癌细胞中预测)测定亚克隆新抗原分数(例如对于每名受试者)。
在一个实施方案中，亚克隆新抗原的“较低”或“低”分数可以指25％或更少的分数，例如20,15,10,5,3,2或1％或更少的分数。
在一个优选的实施方案中，方法可以包括测定克隆新抗原的数目和克隆:亚克隆新抗原的比率或亚克隆新抗原的分数两者。如实施例中所示，组合新抗原负荷和新抗原亚克隆分数两者的测量能够比单独的测量更好地预测对派姆单抗的敏感性(参见图4C)，并且可以在几乎所有情况下预测结果(图4G-H)。
根据本发明，提供了用于鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
(i)测定来自所述受试者的一种或多种癌细胞中的克隆新抗原的数目；并且
(ii)测定来自所述受试者的超过一种癌细胞中的克隆:亚克隆新抗原的比率和/或亚克隆新抗原分数；
其中更高的克隆新抗原数目和更高的克隆:亚克隆新抗原比率或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数指示对免疫检查点干预的响应。
此外，本发明人已经发现，令人惊讶的是，具有大量克隆新抗原的肿瘤细胞表现出免疫检查点分子的相似表达谱，即它们表现出免疫检查点分子的共同表达谱。因此，鉴定特定免疫检查点分子的方法也可用于鉴定可能响应检查点阻断疗法的患者，所述特定免疫检查点分子的表达相对于非癌性细胞增加或减少。
因此，在一方面，本发明提供了用于鉴定更可能响应免疫检查点干预的具有癌症的受试者的方法，包括测定来自所述受试者的癌细胞或肿瘤类型中的免疫检查点分子的表达谱。
在一方面，方法包括测定肿瘤中免疫检查点分子的表达谱，例如通过鉴定差异表达的基因，例如，相对于合适的参照样品。关于差异免疫检查点分子表达的参照样品可以是非癌性细胞或肿瘤(例如具有低克隆新抗原负荷)或外周血淋巴细胞。
例如，免疫检查点分子的表达谱可以通过以下测定：
(i)测定从肿瘤分离的样品的RNA序列；和/或
(ii)进行全转录物组(transcriptome-wide)差异基因表达分析以鉴定免疫检查点相关基因的差异表达(例如调节至p<0.05)。非癌细胞数据可用作比较，例如来自同一患者或来自标准参照。
本发明进一步提供了用于测定特定癌症类型中的免疫检查点分子的表达谱的方法，其包括以下步骤：
(i)从癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas，TCGA)数据入口获得针对感兴趣癌症患者分组的RNA测序数据；
(ii)从每个患者获得Level_3基因水平的数据；
(iii)将原始读取计数输入到包DESeq2中以供分析；并且
(iv)进行全转录物组差异基因表达分析以鉴定显著差异表达(调节的p<0.05)免疫检查点相关基因。
因此，本发明提供了用于鉴定更可能响应免疫检查点干预的具有癌症的受试者的方法，包括使用所述方法测定来自所述患者的癌细胞或肿瘤类型中的免疫检查点分子的表达谱。
在优选的方面，鉴定具有高克隆新抗原负荷和低克隆新抗原负荷的肿瘤之间的差异表达基因(参见例如图1E)。因此，有关克隆新抗原数目的信息是提供信息的，并且促进两种方法的组合，即鉴定和靶向具有大量克隆新抗原的受试者/肿瘤，并进一步研究那些具有高水平克隆新抗原的受试者/肿瘤中免疫检验点分子的基因表达。这促进“双管齐下”的治疗攻击。
在一个方面，所述差异免疫表达与合适的参照样品相比是作为抑制性受体或共刺激受体的免疫检查点分子的上调或高表达，其中所述上调或高表达指示响应免疫检查点干预，其靶向已被上调或显示高表达的分子。
例如，可以通过如本实施例1中描述的方法测定基因表达谱。
在一个优选实施方案中，免疫检查点分子是PD-1和/或LAG-3。在一个特别优选的实施方案中，受试者患有肺癌，优选非小细胞肺癌。
在另一个实施方案中，免疫检查点分子是CTLA4。
在一个优选的实施方案中，癌症是肺癌或黑素瘤，优选非小细胞肺癌或黑素瘤。
该方法还可以与用于鉴定可能响应用免疫检查点干预的治疗的具有癌症的受试者的先前描述的方法组合使用。
因此，本发明提供了用于鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的具有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
(i)测定来自所述受试者的一种或多种癌细胞中的克隆新抗原的数目；并且
(ii)测定来自所述受试者的癌细胞和/或肿瘤浸润性免疫细胞或肿瘤类型中的免疫检查点分子的表达谱，
其中与参照样品相比，更高的克隆新抗原数目和差异免疫检查点分子表达指示对免疫检验点干预的响应。
预测方法
本发明人已经做出了重要的和令人惊讶的测定，即具有更高的克隆新抗原数目和/或更高的克隆:亚克隆新抗原比率或低亚克隆新抗原分数的癌症患者具有改善的预后。
本领域技术人员将会理解，在本发明的背景下，具有高或更高的克隆新抗原数目的受试者(例如在受试者分组内或使用多个不同受试者或分组鉴定的范围内)相对于具有较低的克隆性新抗原数目的受试者可以具有改善的存活。
可以使用以下方法测定克隆新抗原数目的参照值，其中“高数目”或“更高数目”是高于所述参照值的任何事。
所述方法可以涉及测定在癌症受试者分组中预测的克隆新抗原的数目，以及：
(i)测定该分组中预测的克隆新抗原的中值；其中该中值数是参照值；或(ii)测定预测在该分组的上部四分位数中的克隆新抗原的最小数目，其中该最小数目是参照值。(参见例如本实施例中的TCGA数据分析)。
可以在任何癌症分组本身中或备选在相关/特定癌症类型中测定此类“中值”或“在上部四分位数中的最小数目”。
或者，可以将“高”或“更高”的克隆新抗原数目定义为50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190或200或更多个克隆新抗原。
本领域技术人员将会理解，提及“高”或“更高”的克隆新抗原数目可以是背景特异性的，并且可以相应地进行适当的分析。
如此，本发明还提供了用于预测或测定具有癌症的受试者的预后的方法，包括测定来自受试者的一种或多种癌细胞中的克隆新抗原的数目，其中更高的克隆新抗原数目，例如相对于如上讨论的分组而言，指示改善的预后。在一个优选的实施方案中，癌症是肺癌或黑素瘤，优选非小细胞肺癌或黑素瘤。
在另一个实施方案中，本发明包括用于预测或测定具有癌症的受试者的预后的方法，所述方法包括测定来自所述受试者的超过一种癌细胞中的克隆:亚克隆比率和/或亚克隆新抗原分数，其中例如相对于如上讨论的分组，更高的克隆:亚克隆比率和/或更低/低的亚克隆新抗原分数指示改善的预后。在一个优选的实施方案中，癌症是黑素瘤或肺癌，优选黑素瘤或非小细胞肺癌。
治疗癌症
本发明还提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)根据本发明的方法鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的具有癌症的受试者；并且
ii)用免疫检查点干预治疗所述受试者。
如本文所定义，“治疗”是指相对于治疗前的症状，减轻、缓解或消除正在治疗的疾病、病症或感染的一种或多种症状。
“预防”(或防范)是指延迟或预防疾病、病症或感染症状的发作。预防可以是绝对的(如不发生疾病)，或者可以仅对某些个体或对于有限的时间量有效。
术语“免疫检查点干预”在本文中用于指与免疫检查点分子相互作用或调节免疫检查点分子的任何疗法。例如，免疫检查点干预在本文中也可以称为“检查点阻断疗法”、“检查点调节剂”或“检查点抑制剂”。
“抑制剂”意指防止这些途径抑制T细胞活性的任何手段。这可以通过阻断受体配体相互作用的抗体或分子、细胞内信号传导途径的抑制剂和阻止T细胞表面上免疫检查点分子表达的化合物来实现。
例如，检查点抑制剂包括但不限于CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、Lag-3抑制剂、Tim-3抑制剂、TIGIT抑制剂和BTLA抑制剂。共刺激性抗体通过免疫调节受体递送阳性信号，所述免疫调节受体包括但不限于ICOS、CD137、CD27OX-40和GITR。
合适的免疫检查点干预的实例包括派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)或伊匹单抗(ipilimumab)。
如实施例1所示(见图5和7)，具有大量克隆新抗原的肺肿瘤表达高水平的PD-1和Lag-3，并且一致地与肺癌受试者中的克隆新抗原反应性的T细胞也表达高水平的PD-1和LAG-3。在具有高克隆新抗原负荷相对于低克隆负荷的肿瘤中的PD-1和Lag-3共表达表明同时靶向这两种途径可以产生最大益处。
因此，在一方面，本发明涉及例如在肺癌中共靶向PD-1和Lag-3途径，其通过共施用靶向每种途径的抑制剂或通过施用靶向这两种途径的单一试剂进行。作为后者的实例，双特异性抗体能够与PD-1和Lag-3或PD-L1和Lag-3结合。
在本发明的一个优选实施方案中，受试者是哺乳动物，优选猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最优选受试者是人。
在一方面，根据本发明的治疗或预防癌症的方法包括鉴定需要所述治疗或疗法的患者的步骤。
癌症可以选自例如膀胱癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌(小细胞、非小细胞癌细胞和间皮瘤)、脑癌(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、黑素瘤、淋巴瘤、小肠癌(十二指肠和空肠)、白血病、胰腺癌、肝胆肿瘤、生殖细胞癌(germ cell cancer)、前列腺癌，头颈癌(head and neckcancer)、甲状腺癌和肉瘤。
在本发明的优选实施方案中，癌症是肺癌。在特别优选的实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。
在本发明的一个实施方案中，癌症是黑素瘤。
在本发明的一方面，受试者具有侵入前疾病，或者是可能需要或受益于辅助治疗(如由本发明提供)且已经切除其原发性疾病的受试者。
使用本发明方法的治疗还可以包括靶向循环肿瘤细胞和/或源自肿瘤的转移。
根据本发明的用于治疗癌症的方法和用途可以与另外的癌症疗法组合进行。特别地，根据本发明的免疫检查点干预可以与共刺激性抗体、化学疗法和/或放射疗法、靶向疗法或单克隆抗体疗法组合施用。
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在用来帮助本领域的普通技术人员实施本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
研究了NSCLC ITH背景下新抗原和免疫调节的临床相关性以及新抗原反应性肿瘤浸润性T细胞的身份。
材料和方法
患者分组描述
测序样品(L011和L012)获自诊断患有非小细胞肺癌(NSCLC)的患者，其在接受任何形式的辅助治疗(如化学疗法或放射疗法)之前经历明确的手术切除。已获得允许进行基因组测序的知情同意书。这两个样品均从伦敦的伦敦大学伦敦医院(UCLHRTB 10/H1306/42)收集并进行病理学审查以建立组织学亚型：将一个肿瘤分类为CK7+/TTF1+腺癌(L011)以及一个肿瘤(L012)为鳞状细胞癌组织学。表S1中提供了详细的临床特征。
从(1)中获得的样品反映IV期NSCLC的患者分组，并且该患者分组的详细描述(包括肿瘤处理)可以在(1)的补充材料中找到。表S3中提供了该分组的详细临床特征。
临床效力分析
如(1)中进行临床效力分析。简言之，研究放射学专家通过研究者评估的免疫相关应答标准(irRC)评估对派姆单抗的客观响应。正如方案中所概述，每9周进行CT扫描。通过在响应的初始鉴定后至少4周发生的重复成像来确认部分和完全响应；根据第二次CT扫描的结果，认为未经证实的响应是稳定或进行性疾病。可持续的临床益处(DCB)定义为持续长于6个月(第27周，第三次方案计划响应评估的时间)的稳定疾病或部分响应。无可持续的益处(NDB)定义为疾病进展≤开始疗法的6个月。对于具有进行中的对研究疗法的响应的患者，在最近的成像评估日期时检查无进展存活。对于活着的患者，在最后一次已知接触日期时检查总体存活。在表S2中可以找到关于每个患者的响应的详情。
TCGA外显子组数据集
对于肺腺癌(LUAD，n＝124)和肺鳞状细胞癌(LUSC，n＝124)的分组，从癌症基因组图谱(TCGA)获得具有下文所述的突变调用和HLA分型的肿瘤样品。对于LUAD和LUSC TCGA分组，从肿瘤门户(TumourPortal)(2)获得SNV数据(http://www.tumourportal.org/tumour_types？ttype＝LUAD|LUSC)。排除一名LUAD患者TCGA-05-4396，因为具有主要在C[C>G]G背景下调用的超过7000个低质量突变。排除LUSC患者TCGA-18-3409，因为具有强的UV标签，LUSC肿瘤不典型的。
肿瘤加工
对于L011和L012两者，由病理学家选择来自单一肿瘤块的以1cm间隔分隔的4个原发肿瘤区域和邻近的正常组织，通过摄影术记录，并快速冷冻。对于L011中的脑转移，病理学家以福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织块的形式选择如通过苏木精和曙红(H&E)染色测定的四个肿瘤区域。手术时从所有患者收集外周血并快速冷冻。根据制造商的方案，使用DNeasy试剂盒(Qiagen)将约5x5x5mm快速冷冻的肿瘤组织和500μl血液用于基因组DNA提取。对于FFPE组织，使用手动刀片大剥离(macrodissection)从10-40μm未染色的载玻片上取出组织的富含肿瘤的区域，并且使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从中提取DNA。通过Qubit(Invitrogen)定量DNA并且通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA完整性。可以在(1)的补充材料中找到关于验证和发现分组加工的详情。
多区域全外显子组测序和变异调用
L012
对于来自患者L012的每个肿瘤区域和匹配的种系，使用Illumina Nextera试剂盒根据制造商的方案(Illumina)对1-2μg DNA进行外显子组捕获。如前所述(3,4)，在LRI的高级测序房(Advanced Sequencing Facility)的Illumina HiSeq 2500上对样品进行配对末端多重测序。将每个捕获的文库加载在Illumina平台上，并且进行配对末端测序至期望的平均测序深度(外显子组间的平均值＝392.75)。使用bwa mem(bwa-0.7.7)(6)将从Illumina管线生成的FastQ格式的原始配对末端读段(100bp)与从GATK束2.8(5)获得的完整hg19基因组组装(包括未知重叠群)比对。使用皮卡(Picard)工具v1.107来清理、分类和合并来自同一患者区域的文件，并除去一式两份读取(http://broadinstitute.github.io/picard)。使用皮卡工具(1.107)、GATK(2.8.1)和FastQC(0.10.1)的组合(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)获得质量控制矩阵。
使用SAMtools mpileup(0.1.16)(7)来定位肿瘤和种系样品中的非参照位置。跳过具有phred分数<20的碱基或具有定位质量<20的读段。禁用BAQ计算，并且降级定位质量的系数设置为50。利用来自SAMtools mpileup的输出使用VarScan2体细胞(v2.3.6)(8)测定肿瘤与匹配的种系之间的体细胞变体。使用默认参数，只是种系样品的最小覆盖设置为10，将最小变体频率改变为0.01，并且肿瘤纯度设置为0.5。使用VarScan2 processSomatic来提取体细胞变体。使用Varscan2的相关fpfilter.pl脚本对所得的SNV调用过滤假阳性，首先通过bam-readcount(0.5.1)运行数据。仅保留通过VarScan2 processSomatic分类为“高置信度”的INDEL调用，用于进一步分析。
使用Integrated Genomics Viewer(IGV)(9)手动检查所有变体，并且除去显示Illumina特异性误差概貌的那些(10)。在Ion Torrent PGM测序仪(Life Technologies)上对剩余的变体进行测序到中值深度1513。为此，使用在线设计器(www.ampliseq.com)设计了Ion AmpliSeqTM定制组(Life Technologies)。根据制造商的方案对来自每个区域的DNA进行多重PCR。对加条形码的测序文库进行TM构建，其在Ion Torrent PGM测序仪(LifeTechnologies)上以200bp读段长度测序。使用lonTorrent TorrentSuiteTM软件进行与来自hg19基因组的靶区域的序列比对。选择至少一个区域中的覆盖为50的变体。如果变体频率对于SNV≥0.01且对于INDELS≥0.02，则认为变体存在于区域中。再次进行IGV中的手动审查，并使用通过此阶段的变体进行后续分析。使用ANNOVAR(11)对所有变体进行注释，并如(12)中所述定义潜在的驱动突变。
L011
先前在(13)中描述了种系和原发性肿瘤区域的测序和分析。遵循(13)中描述的方案，由BGI Tech进行转移性区域的测序。使用上文对L012所述的方法进行转移区域的计算处理，样品间的平均中值深度为93.7。对于L012，使用IGV手动审查非沉默变体。
从Rizvi数据的变体调用
获得代表来自(i)代表发现分组的16个样品和代表验证分组的18个样品的种系和肿瘤区域的BAM文件(Rizvi数据)，并使用皮卡工具(1.107)转化为FASTQ格式。SamToFastq比对和变体调用如上文对L012所述进行。
克隆分析
对于TCGA样品，通过整合野生型和突变体等位基因计数、绝对主要和次要拷贝数和肿瘤纯度估计来评估每个突变的克隆状态(14)。对于L011和L012，基于多区域测序分析评估每个突变的克隆状态。简言之，如果在肿瘤内测序的每个肿瘤区域中鉴定并存在，则将每个突变分类为克隆的。相反，将任何不遍在存在于每个肿瘤区域中的突变分类为亚克隆的。
对于发现和验证分组肿瘤，涵盖从(1)获得的数据，通过整合局部拷贝数(获自ASCAT，见下文)、肿瘤纯度(也获自ASCAT)和变体等位基因频率评估每个突变的癌细胞分数。简言之，对于给定的突变，我们首先计算观察到的突变拷贝数nmut，其使用以下公式描述携带给定突变的肿瘤细胞的分数乘以该基因座处的染色体拷贝数：
nmut＝VAF1[pCNt+CNn(1-p)]
p
其中VAF对应于突变碱基处的变体等位基因频率，并且p、CNt、CNn分别是肿瘤纯度、肿瘤基因座特异性拷贝数、和正常基因座特异性拷贝数。然后，我们使用VAF并且使用最大似然性将突变归入可能的拷贝数之一来计算预期的突变拷贝数nchr。我们还评估适用时是否可以通过亚克隆拷贝数更好地解释突变拷贝数。最终，这让我们获得每个突变的修饰变体和参照计数，校正了拷贝数和肿瘤纯度两者。然后，使用PyClone Dirichlet进程聚簇(15)将所有突变聚簇。鉴于已经校正拷贝数和纯度，我们将整数拷贝数设置为1以及纯度设置为1；允许聚簇以简单分组克隆和亚克隆突变。我们以10,000次迭代和1000的老化(burn-in)和默认参数运行PyClone。值得注意的是，为了评估突变克隆状态，首先进一步过滤突变以确保可靠的聚簇。简言之，仅使用在种系和肿瘤两者中读取深度为至少10的突变，Varscan2体细胞p值阈值为0.01。每个变体需要5个交替读段的最小值，以及1％的最小肿瘤变体等位基因频率。还过滤突变，使得允许2个种系读段的最大值和2％种系变体等位基因频率。
对于两个肿瘤ZA6965和GR0134，不能提取可靠的拷贝数、突变和纯度估计，使得克隆构造分析难以处理，并且从分析中省略了这些肿瘤。
拷贝数分析
对于从(1)获得的数据，使用VarScan2(v2.3.6)产生来自配对肿瘤-正常的加工样品外显子组SNP和拷贝数数据。除最小覆盖(21221095)和数据比率以外使用默认参数运行Varscan2拷贝数。如(22300766)中所述，基于每个样品计算数据比率。使用ASCAT v2.3(20837533)处理来自Varscan的输出，以基于外显子组序列数据为所有样品提供分段拷贝数数据和细胞性和倍性估计。以下设置从其默认值更改：将ACF设置为1的阈值从0.2调整为0.15，并且包以伽马设置1运行。
对于TCGA样品，处理SNP6.0数据以产生拷贝数信息，如在McGranahan，2015年描述。
系统树构建
如(12)中所述，使用由肿瘤内变体的区域分布构建的二元存在/缺乏矩阵构建系统树。对于肿瘤L011，使用针对L012和L011转移区域描述的方法重新分析原发性肿瘤数据，允许特征在于原发性和转移性区域两者的组合树。
患者样品的HLA分型
对于所有TCGA患者，使用POLYSOLVER(POLYmorphic loci reSOLVER)(16)测定4位HLA类型。使用Optitype(17)对患者L011和L012进行血清型分型并同时进行基因型分型，这产生了一致的结果。
鉴定推定的新抗原
使用鉴定的非沉默突变来产生全面的一批长度为9-11个氨基酸的肽，其具有每个可能的位置中表示的突变氨基酸。使用netMHCpan-2.8(18,19)预测每个突变体肽和其相应的野生型肽对患者的种系HLA等位基因的结合亲和力。候选新抗原鉴定为具有<500nM的预测结合强度的抗原。
TCGA存活分析
通过TCGA数据门户访问TCGA患者的临床数据并从https://tcgadata.nci.nih.gov/tcgafiles/ftp_auth/distro_ftpusers/anonymous/tumour/CANCER.TYPE/bcr/biotab/clin/下载。使用存活包在R中进行存活分析。
差异基因表达分析
从TCGA数据门户下载RNA测序数据。对于每个LUAD患者，获得所有可用的“Level_3”基因水平数据。原始读取计数用作R包DESeq2的输入以进行分析。进行全转录物组差异基因表达分析并鉴定显著差异表达(调整的p<0.05)免疫相关基因(列于表S1)。使用度量1-r2将这些基因在它们的共表达上聚簇。
分离L011和L012的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)
从手术室直接采集肿瘤到病理科，在那里将样品分成各区域。随后，将样品在无菌条件下切碎，随后在37℃酶促消化(具有Liberase TL研究级(Roche)和DNA酶I(Roche)的RPMI-1640(Sigma))30分钟，之后使用温和的MACS(Miltenyi Biotech)进行机械解离。通过Ficoll-paque(GE Healthcare)梯度使得到的单细胞悬浮液富集白细胞。计数活细胞并在转移至液氮前在-80℃用10％二甲基亚砜在人AB血清(Sigma)中冷冻。
MHC多聚体生成和组合编码-流式细胞术分析
在内部生成保持预测新表位的MHC多聚体(Technical University of Denmark,SRH实验室)。合成肽购自Pepscan Presto，NL。用UV敏感性肽重折叠匹配L011(HLA-A1101、A2402、和B3501)和L012(HLA-A1101、A2402、和B0702)的HLA表达的HLA分子，并且在UV暴露后交换成感兴趣的肽(20-23)。简言之，在384孔板中在候选新抗原肽的存在下在4℃使加载有UV敏感肽的HLA复合物经历366-nm紫外光(CAMAG)达1小时。使用总共9种不同的荧光链霉亲合素(SA)缀合物产生肽-MHC多聚体：PE、APC、PE-Cy7、PE-CF594、Brilliant Violet(BV)421、BV510、BV605、BV650、Brilliant Ultraviolet(BUV)395(BioLegend)。用对于每种肽是特异性的两种不同的链霉亲合素缀合物产生MHC多聚体，以允许每种抗原应答T细胞的组合编码，从而能够平行分析针对多达36种不同肽的反应性(24,25)。
新抗原反应性CD8+T细胞的鉴定
对从区域特异性肺癌样品和相邻正常肺组织分离的体外扩增的CD8+T淋巴细胞进行MHC多聚体分析。合成290和355个候选突变体肽(具有预测的HLA结合亲和力<500nM，包括来自相同错义突变的多个潜在肽变异)并分别用于筛选扩增的L011和L012TIL。对于扩增的CD8+T淋巴细胞的染色，将样品解冻，用DNA酶处理10分钟，清洗，并在37℃用MHC多聚体组染色15分钟。随后，用用于633或635nm激发的可固定近-IR死亡细胞染色试剂盒(Invitrogen，Life Technologies)、CD8-PerCP(Invitrogen，Life Technologies)和针对CD4、CD14、CD16、CD19(均来自BD Pharmingen)和CD40(AbD Serotec)组的偶联有FITC的抗体将细胞4℃再染色20分钟。使用FACSDiva 6软件在LSR II流式细胞仪(BectonDickinson)上进行数据采集。定义阳性响应的截留值是总CD8+细胞的≥0.005％和≥10个事件。
对于患者L011，发现HLA-B3501MTFR2衍生的多聚体结合突变序列FAFQEYDSF(netMHC结合评分：22)，但不结合野生型序列FAFQEDDSF(netMHC结合评分：10)(图11B和D，图9C)。未发现针对重叠肽AFQEYDSFEK和KFAFQEYDSF的响应。对于患者L012，HLA-A1 101CHTF18衍生的多聚体结合突变序列LLLDIVAPK(netMHC结合评分：37)而不结合野生型序列：LLLDILAPK(netMHC结合评分：41)(图11C和E，图9C)。未发现针对重叠肽CLLLDIVAPK和IVAPKLRPV的响应。最后，HLA-B0702MYADM衍生的多聚体结合突变序列SPMIVGSPW(netMHC结合评分：15)以及野生型序列SPMIVGSPR(netMHC结合评分：1329)。未发现针对重叠肽SPMIVGSPWA、SPMIVGSPWAL、SPWALTQPLGL和SPWALTQPL的响应。
L011和L012的基线未扩增肿瘤样品的MHC多聚体分析和多参数流式细胞基因型分 型
将肿瘤样品解冻，清洗，并首先用定制的MHC多聚物于37℃在黑暗中染色10-15分钟。随后，将细胞转移到湿冰上并在黑暗中用一组以制造商推荐的稀释度使用的表面抗体染色30分钟：CD8-V500、SK1克隆(BD Biosciences)、PD-1BV605、EH12.2H7克隆(Biolegend)、CD3-BV785、OKT3克隆(Biolegend)、LAG-3-PE、3DS223H克隆(eBioscience)。使用来自eBioscience的胞内固定和透化缓冲液组使细胞透化20分钟。在黑暗中在冰上将胞内染色组应用30分钟，并且胞内染色组由以制造商推荐的稀释度使用的以下抗体组成：粒酶B-V450、GB11克隆(BD Biosciences)、FoxP3-PerCP-Cy5.5、PCH 101克隆(eBioscience)、Ki67-FITC、克隆B56(BD Biosciences)和CTLA-4-APC、L3D10克隆(Biolegend)。在BD FACSAria III流式细胞仪(BD Biosciences)上进行数据采集并在Flowjo第10.0.8版(Tree Star Inc.)中分析。
L011和L012的免疫组织化学
根据常规组织学方案将来自患者L011和L012以及反应性人扁桃体的样品固定在缓冲的福尔马林中并包埋在石蜡中。切下来自石蜡块的2-5微米组织切片并转移到带电载玻片上进行免疫组织化学。下表中列出了主要使用的抗体的详情。为了建立最佳染色条件(即抗体稀释和温育时间、抗原恢复方案、合适的色原体)，测试每种抗体，并且使用自动化平台BenchMark Ultra(Ventana/Roche)和Bond-III Autostainer(Leica Microsystems)根据别处描述的方案(26,27)通过常规单一免疫组织化学对人反应性扁桃体切片进行优化。
在可用的情况下，在扁桃体中分析针对相同蛋白制备的至少两种不同抗体以确认其染色模式的特异性。对于多重染色，进行先前描述的方案(28)。为了评估细胞质或细胞膜中的蛋白质共表达，注意到色原体的单一颜色的变化，即蓝色和红色产生了紫色，并且棕色和蓝色产生了几乎黑色的标记。通过TM评估免疫组织化学和蛋白质反应性模式。多次免疫染色的评分与AF一起进行。该研究的批准获自国家研究伦理服务研究伦理委员会4(National Research Ethics Service,Research Ethics Committee 4)(REC参照编号09/H0715/64)。
结果
较大的肿瘤新抗原负荷可以增加T细胞对肿瘤的识别，减少免疫逃逸的可能性(12)。为了支持肿瘤新抗原的临床相关性(7)，发现当与剩余的四分位素中的肿瘤相比时，高的新抗原负荷(定义为在分组中预测的新抗原数目的顶部四分位数)与具有匹配临床数据的LUAD样品(n＝117)中更长的总体存活时间相关(图1B，时序p＝0.011；图5A)。
为了测定新抗原克隆状态(与肿瘤细胞子集(亚克隆)相比所有肿瘤中新抗原的存在(克隆))是否可以影响与存活结果的关系，计算癌细胞分数(含有每个突变的癌细胞的比例)并且将每个推定的新抗原分类为克隆的或亚克隆的(13)。与分组中所有其他肿瘤相比，携带大量预测的克隆性新抗原(定义为分组的顶部四分位数)的肿瘤与更长的总体存活相关(图1C，时序p＝0.0077；图5B)。相反，预测的亚克隆新抗原的数目与总体存活不显著相关(图1D，时序p＝0.12；图5C)。虽然新抗原负荷与突变负荷有关，但我们观察到与突变数目相比总体存活和新抗原数目之间的更强关系(图6)。这些数据表明LUAD中克隆性新抗原的高数量的存在可以有利于有效的免疫监视。LUSC分组具有较窄的假定新抗原范围(图7A)，中值绝对偏差为50以及四分位数间范围(interquartile range)为71，并且在该分组中没有观察到总体存活和新抗原负荷之间的统计学显著关联(图7B-G)。这可以反映剖析来自单一样品的肿瘤的克隆构造的困难(14)。
基因表达分析揭示了在低(定义为分组中预测的克隆新抗原数目的下部四分位数)和高克隆新抗原分组之间差异表达的27个免疫相关基因(表S1)。CD8A(p＝0.005)和与抗原呈递(TAP-1 p＝0.003，STAT-1 p<0.001)，T细胞浸润(CXCL-10 p＝0.005，CXCL-9 p＝p<0.001)和效应T细胞功能(IFN-γp<0.001，粒酶B p<0.001和H p＝0.008)相关的基因在高克隆新抗原分组中上调并聚簇在一起(图1E)。在该簇中也鉴定出PD-1(p＝0.02)和淋巴细胞活化基因3(LAG-3，p<0.001)、T细胞功能的负调节物(15)。PD-L1在高克隆分组中也显著上调(p<0.001)，与PD-L2聚簇。当我们比较高克隆新抗原肿瘤与分组中的所有其他肿瘤时，将PD-L1鉴定为最显著差异表达的免疫基因(图8，p<0.001)。
这些数据表明高克隆新抗原负荷与受特定免疫检查点蛋白(PD-1、LAG-3、PD-L1/2)表达潜在调节的活化效应T细胞的存在相关。
接下来，解决了在原发性NSCLC肿瘤中是否可以鉴定对克隆性新抗原反应性的CD8+T细胞。两个早期阶段肿瘤L011和L012进行多区域外显子组测序(13)，允许对每个原发性肿瘤区域内的新抗原进行系统发育分析和预测(图2A)。L011包括脑转移，在初次手术后14个月切除，进行多区域测序。虽然这两个肿瘤均源自女性吸烟者(>40包-年)，但其突变负荷和异质性程度不同(图2A)。L011(一种腺癌)表现出同质的原发性肿瘤和对脑的转移性传播(M1-M4)，可能源自肿瘤区域R3(图2A)。在原发肿瘤内预测总共313个新抗原，其中88％为克隆的，且在原发性肿瘤的每个区域中鉴定(图2B)。相反，L012(一种鳞状细胞癌)表现出低突变负荷和广泛的异质性，其中75％的预测新抗原是亚克隆的(图2A，C)。
使用加载有预测的新抗原的MHC多聚体来筛选从不同肿瘤区域和相邻正常肺组织扩增的CD8+T细胞(13)。在L011中，在所有肿瘤区域(2.8-4.4％)中并且在正常区域中以较低的频率(0.1％)鉴定与突变体MTFR2D326Y(FAFQEYDSF)(在野生型(10nM)和突变型(22nM)形式中具有高预测HLA结合的克隆突变(图2B))反应性的CD8+ T细胞(图2D)。在L012中，在所有肿瘤区域中并且在正常组织中以较低频率鉴定对突变体CHTF18L769V(LLDIVAPK)和MYADMR30W(SPMIVGSPW)反应性的CD8+T细胞(图2E)。两者都是克隆突变，在突变体和野生型形式中具有高预测HLA结合(<50nM)的CHTF18，和与突变体形式(<50nM)相比在野生型中具有更低的预测结合(>1000nM)的MYADM(图2C)。
在L011中，也可以在来自所有原发性肿瘤区域(0.79-1.35％)的非扩增TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)(图3A)中，并且在正常组织(0.16％)和外周血单个核细胞(PBMC)(0.02％)中以更低的频率检出MTFR2反应性CD8+ T细胞。类似地，在来自L012中的所有肿瘤区域的非扩增样品(CHTF18 0.16-0.58％,MYADM 2.25-2.31％)中，并且在正常肺组织(CHTF18 0.02％,MYADM 0.17％)和PBMC(CHTF18 0.02％,MYADM 0.01％)中以更低的频率鉴定CHTF18反应性和MYADM反应性CD8+ T细胞(图3A)。
通过流式细胞术进行未扩增样品中新抗原反应性T细胞的进一步表征。尽管在低水平，对于L011和L012两者，CTLA-4表达限于肿瘤浸润性CD8+T细胞，在MTFR2、CHTF18和MYADM反应性T细胞上鉴定出最高水平(图3B，图9A)。>99％的MTFR2、CHTF18和MYADM反应性肿瘤浸润性CD8+T细胞表达高水平的PD-1(图3B，图9A)，而在肿瘤、正常组织和PBMC中的CD8+MHC多聚体阴性T细胞上观察到较低水平。在L011中，相对于正常组织和PBMC，所有肿瘤浸润性CD8+T细胞(包括MTFR2反应性细胞)上的LAG-3表达较高(图3B)。在L012中也观察到LAG-3表达，尽管处于较低水平(图9A)。IHC研究进一步支持这些发现，鉴定在L011和L012原发性肿瘤两者中共表达LAG-3的CD8+T细胞(图3D)。Ki67在肿瘤浸润性CD8+T细胞中的表达水平高于在正常组织或PBMC中(图3B，图9A)，然而，增殖细胞的分数对于新抗原反应性和MHC多聚体阴性细胞两者都是较低的(<25％)。相反，粒酶B(GzmB)在所有研究的CD8+T细胞亚组上以高水平表达。重要的是，尽管肿瘤中大部分新抗原反应性T细胞似乎高度活化，表达GzmB，但这些细胞的大部分共表达PD-1(>60％)并且基于Ki67水平看起来处于增殖控制下(图3C，图9B)。
与克隆性新抗原反应性的T细胞上的LAG-3和PD-1表达以及肿瘤PD-L1表达(图3D)强烈支持在高克隆肺肿瘤中鉴定的免疫标签(图1E)。这些数据支持这些特定检查点在限制识别克隆新抗原的T细胞活性上的潜在作用，以及靶向具有高克隆新抗原负荷的NSCLC中的这些检查点的未来研究。
接下来，探讨推定的新抗原的克隆状态是否可能与NSCLC中对PD-1阻断的敏感性改变有关。获得了来自最近的研究的外显子组测序数据，其中用派姆单抗治疗两个独立的NSCLC分组(2)(表S2)，并且通过估计每个突变的癌细胞分数剖析每个肿瘤的克隆构造(13)(图13)。如先前(2)报道，新抗原负荷与发现和验证分组中的派姆单抗的临床功效相关，其中较高的新抗原全集与改善的结果相关(数据未显示)。
关系也视每种肿瘤的克隆结构而定(图4A-H)。在发现分组中，每个表现出可持续临床益处的肿瘤(DCB，如(2)中定义为部分响应或稳定疾病持续>6个月)具有高克隆新抗原负荷(定义为高于或等于发现组中的克隆新抗原的中值数目，91)和低于5％的新抗原亚克隆分数(图4A-B)。相反，表现出非可持续的益处(NDB)的每种肿瘤都含有低克隆新抗原全集(<91)或高新抗原亚克隆分数(>5％)。因此，在发现分组中，组合新抗原全集和新抗原异质性(即克隆:亚克隆新抗原或突变的比率)两者能够预测对派姆单抗的敏感性，优于单独的任一测量(图4C)。
类似地，在验证分组中，6个具有高克隆新抗原负荷(定义为大于或等于验证分组的中值，69)和低亚克隆新抗原分数(<5％)的肿瘤中的5个与DCB有关(图4D-F)。相反，10个具有低克隆新抗原负荷或高新抗原异质性的肿瘤中的8个与NDB有关。例如，尽管新抗原负荷较大，但ZA6505表现出非可持续的临床响应，2个月后复发。ZA6505是分组内最异质的肿瘤之一，超过80％的突变分类为亚克隆的。
总之，当将新抗原异质性的程度和克隆新抗原负荷一起考虑时，可以在几乎所有情况下预测结果(图4G-H)。
此外，与TCGA分析(图1E)一致，我们还观察到与具有低新抗原负荷或高新抗原异质性的那些肿瘤相比，在含有大的克隆新抗原负荷和低新抗原异质性的肿瘤中更大的PD-L1表达(P＝0.0017,χ2-检验，图11)。这些结果在考虑所有突变而非I类限制性推定新抗原时保持一致(图12)，支持未鉴定的MHC II类限制性新抗原也可以在免疫反应性中起重要作用的观点(6)和改进响应抗PD-1疗法的新抗原预测算法的需要(16)。先前对来自CA9903(对于派姆单抗具有特殊响应的肿瘤)的外周血淋巴细胞(PBL)的分析鉴定识别由HERC1P3278S突变(ASNASSAAK)引起的预测的新抗原的自体PBL中的CD8+T细胞群体(2)。与克隆新抗原的相关性一致，这种突变可能存在于测序肿瘤内100％的癌细胞中(图4I-J)。
补充表S1：高和低克隆新抗原患者组间差异表达的免疫基因
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Claims (15)

1.用于鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
(i)测定来自所述受试者的一种或多种癌细胞中的克隆新抗原的数目；和/或
(ii)测定来自所述受试者的超过一种癌细胞中的克隆:亚克隆新抗原的比率和/或亚克隆新抗原分数；和/或
(iii)测定来自所述受试者的癌细胞和/或肿瘤浸润性免疫细胞，或肿瘤类型中的免疫检查点分子的表达谱，
其中与参照样品相比，更高的克隆新抗原数目、和/或更高的克隆:亚克隆新抗原比率、或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数，和/或差异免疫检查点分子表达指示对免疫检查点干预的响应。
2.根据权利要求1(iii)的方法，其中测定免疫检查点分子的表达谱通过全转录物组差异基因表达分析进行，以鉴定差异表达的免疫检查点相关基因。
3.用于预测或测定患有癌症的受试者的预后的方法，所述方法包括：
(i)测定来自所述受试者的一种或多种癌细胞中的克隆新抗原的数目；和/或
(ii)测定来自所述受试者的超过一种癌细胞中的克隆:亚克隆新抗原的比率和/或亚克隆新抗原分数，
其中更高的克隆新抗原数目和/或更高的克隆:亚克隆新抗原比率或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数指示改善的预后。
4.治疗或预防受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)根据权利要求1或2的方法鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者；并且
ii)用免疫检查点干预治疗所述受试者。
5.治疗或预防受试者中的癌症的方法，其包括用免疫检查点干预治疗患有癌症的受试者，其中已经确定所述受试者具有与参照样品相比：
(i)更高的克隆新抗原数目；和/或
(ii)更高的克隆:亚克隆新抗原比率，或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数；和/或
(iii)差异免疫检查点分子表达。
6.免疫检查点干预，其用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，所述方法包括：
i)根据权利要求1或2的方法鉴定适合于用免疫检查点干预治疗的患有癌症的受试者；并且
ii)用免疫检查点干预治疗所述受试者。
7.免疫检查点干预，其用于治疗或预防受试者中的癌症，其中所述受试者具有与参照样品相比：
(i)更高的克隆新抗原数目；和/或
(ii)更高的克隆:亚克隆新抗原比率，或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数；和/或
(iii)差异免疫检查点分子表达。
8.免疫检查点干预用于治疗或预防受试者中的癌症的用途，其中所述受试者具有与参照样品相比：
(i)更高的克隆新抗原数目；和/或
(ii)更高的克隆:亚克隆新抗原比率，或更低(或较低)的亚克隆新抗原分数；和/或
(iii)差异免疫检查点分子表达。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法、免疫检查点干预或用途，其中所述免疫检查点干预与CTLA4、PD-1、PD-L1、Lag-3、Tim-3、TIGIT或BTLA相互作用。
10.根据权利要求9所述的方法、免疫检查点干预或用途，其中所述免疫检查点干预是派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)，阿特珠单抗(atezolizumab)或伊匹单抗(ipilimumab)。
11.根据前述权利要求中任一项的方法、免疫检查点干预或用途，其中所述癌症选自以下：膀胱癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌(小细胞、非小细胞和间皮瘤)、脑癌(神经胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、黑素瘤、淋巴瘤、小肠癌(十二指肠和空肠)、白血病、胰腺癌、肝胆肿瘤、生殖细胞癌、前列腺癌、头颈癌(head and neck cancer)、甲状腺癌和肉瘤。
12.根据权利要求11所述的方法、免疫检查点干预或用途，其中所述癌症是肺癌或黑素瘤。
13.根据权利要求12所述的方法、免疫检查点干预或用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。
14.根据前述权利要求中任一项的方法、免疫检查点干预或用途，其中所述受试者是哺乳动物，优选人、猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠。
15.根据权利要求14所述的方法、免疫检查点干预或用途，其中所述受试者是人。
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