BR112018004878B1 - Intervenção de ponto de verificação imune no câncer - Google Patents

Intervenção de ponto de verificação imune no câncer Download PDF

Info

Publication number
BR112018004878B1
BR112018004878B1 BR112018004878-0A BR112018004878A BR112018004878B1 BR 112018004878 B1 BR112018004878 B1 BR 112018004878B1 BR 112018004878 A BR112018004878 A BR 112018004878A BR 112018004878 B1 BR112018004878 B1 BR 112018004878B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cancer
clonal
tumor
cells
neo
Prior art date
Application number
BR112018004878-0A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112018004878A2 (pt
Inventor
Nicholas Mcgranahan
Rachel Rosenthal
Charles Swanton
Karl Peggs
Sergio Quezada
Original Assignee
Cancer Research Technology Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cancer Research Technology Limited filed Critical Cancer Research Technology Limited
Publication of BR112018004878A2 publication Critical patent/BR112018004878A2/pt
Publication of BR112018004878B1 publication Critical patent/BR112018004878B1/pt

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)

Abstract

A presente invenção se refere a métodos para identificar um sujeito com câncer que seja adequado para o tratamento com uma intervenção de ponto de verificação imune e a métodos de tratamento de tais sujeitos. A invenção se refere ainda a um método para prever ou determinar o prognóstico de um indivíduo com câncer.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a métodos para a identificação de um indivíduo com câncer que é adequado para o tratamento com uma intervenção de ponto de verificação imune, e a métodos de tratamento de tais indivíduos. A invenção se refere ainda a um método para prever ou determinar o prognóstico de um indivíduo com câncer.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Entre as abordagens mais promissoras para ativar imunidade antitumoral terapêutica é o bloqueio dos pontos de verificação do sistema imunológico. Os pontos de verificação imunes são vias inibitórias do sistema imune que são cruciais para a manutenção da auto-tolerância e modulação da duração e amplitude das respostas imunes fisiológicas em tecidos periféricos, a fim de minimizar os danos colaterais do tecido. É agora claro que os certos tumores co-opt vias ponto de verificação-imuno como um importante mecanismo de resistência imune, particularmente, contra as células T que são específicas para antígenos tumorais. Porque muitos dos pontos de verificação do sistema imunológico são iniciados através de interações ligante-receptor, as quais pode ser facilmente bloqueada por anticorpos ou modulada por formas recombinantes de ligantes ou receptores.
[003] As abordagens atuais para a regulação ponto de verificação imunológico em cânceres envolvem um nível de conjeturas e o acaso baseado principalmente na ordem que foram disponibilizados estes compostos. CTLA-4, PD-1 e PDL1 foram descobertos e produzidos por esta ordem, e, é, assim, que eles foram administrados até agora. Experimentos iniciais foram realizados com CTLA-4, como esta foi a primeira a ser aprovada pela FDA. Subsequentemente, os tratamentos de DP-1 / PDL1 foram aprovados e utilizados.
[004] O documento WO 2015/103037 fornece um método para a identificação de um sujeito como probabilidade de responder ao tratamento com um modulador do ponto de verificação imunológico, com base na descoberta de que as células cancerosas podem abrigar mutações somáticas que resultam em neoepítopos que são reconhecidos pelo sistema imunológico de um paciente como não-próprio. A identificação de um ou mais neoepítopos em uma amostra de câncer pode ser útil para determinar quais pacientes de câncer são propensos a responder favoravelmente ao tratamento com um modulador do ponto de verificação imune. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] Os presentes invençãores fizeram a determinação importante e surpreendente de que os pacientes de câncer com os números mais elevados de neoantígenos clonais, e / ou uma maior razão de neoantígenos clonal:sub- clonal ou uma fração de neo-antígeno baixo sub-clonal, são mais propensos a responder aos tratamentos com uma intervenção do ponto de verificação imune.
[006] Tal como demonstrado nos exemplos presentes, os pacientes com tumores com uma elevada carga clonal neo- antígeno e / ou uma baixa carga subclonal neo-antígeno têm uma melhor resposta à imunoterapia com bloqueio do ponto de verificação (por exemplo, a terapia anti-PD1). Isto representa uma importante contribuição para o estado da técnica, na medida em que abre o potencial para tratamentos melhores e mais dirigidos e modalidades preventivas para o tratamento e prevenção do câncer. A este respeito, as intervenções preventivas e terapêuticas podem ser direcionada para o indivíduo e para o contexto particular do câncer.
[007] Além disso, os presentes invençãores descobriram que, surpreendentemente, as células de tumor com um elevado número de neo-antígenos clonais exibem perfis de expressão similares de moléculas de ponto de verificação imunes, que é que elas exibem um perfil de expressão de moléculas de ponto de verificação comum imunes. Esta é uma contribuição importante para o estado da técnica, uma vez que não foi anteriormente demonstrado que os cânceres de tipos específicos exibem perfis de expressão particulares de moléculas de ponto de verificação imunes. Os presentes invençãores demonstraram isto pela primeira vez, e esta descoberta facilita mais abordagens direcionadas para o tratamento ou a prevenção de cânceres particulares.
[008] Os presentes invençãores também verificaram, surpreendentemente, que os pacientes com maior número de mutações clonais, e uma maior proporção de mutações clonal:sub-clonal melhoraram prognóstico.
[009] A presente invenção dirige-se, por conseguinte, uma necessidade no estado da técnica para novos modos, alternativas e / ou mais eficazes para tratar e prevenir o câncer.
[0010] Por conseguinte, a presente invenção proporciona um método para a identificação de um indivíduo com câncer que é adequado para o tratamento com uma intervenção de ponto de verificação imune, compreendendo o referido método: (i) a determinação do número de neo-antígenos clonais em uma ou mais células cancerosas do referido sujeito; e / ou (ii) determinação da proporção de neo-antígenos clonal: neo-antígenos sub-clones e / ou fração de neo- antígeno sub-clonal, em mais do que uma célula de câncer do referido sujeito; e / ou (iii) determinar o perfil de expressão de moléculas de ponto de verificação imune em células cancerígenas e / ou células do sistema imunológico se infiltram no tumor a partir do referido sujeito, ou tipo de tumor, em que um maior número de neo-antígenos clonais, e / ou uma maior razão de neo-antígenos clonal:sub-clonal, ou fração de neo-antígeno sub-clonal inferior (ou baixa), e / ou diferencial da molécula de expressao de ponto de verificação imune em comparação com um amostra de referência é indicativo de resposta a um intervenção de ponto de verificação imune.
[0011] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para prever ou determinar o prognóstico de um indivíduo com câncer, o método compreendendo: (i) determinar o número de neo-antígenos clonais em uma ou mais células cancerosas do referido sujeito; e / ou (ii) determinar a proporção de neo-antígenos clonais: sub-clones e / ou fração de neo-antígeno sub-clonal em mais do que uma célula de câncer do referido indivíduo, em que um maior número de neo-antígenos clonais e / ou uma maior razão de neo-antígenos clonal:sub-clonal, ou fração inferior (ou baixa) de neo-antígeno sub-clonal, é indicativo de um melhor prognóstico.
[0012] Em um aspecto adicional, a invenção proporciona um método de tratamento ou prevenção de câncer em um sujeito, em que o referido método compreende as seguintes etapas: i) identificar um sujeito com câncer que seja adequado para o tratamento com um intervenção de ponto de verificação imune de acordo com o método da invenção; e ii) tratar o referido sujeito com uma intervenção ponto de verificação imune.
[0013] Em um aspecto ainda adicional, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de câncer em um sujeito, que compreende o tratamento de um sujeito com câncer com uma intervenção de ponto de verificação imune, em que o sujeito foi determinado para ter (i) um maior número de neo-antígenos clonais; e / ou (ii) uma maior razão de neo-antígenos clonal:sub- clonal, ou fração de neo-antígeno sub-clonal inferior (ou baixa); e / ou (iii) uma expressão molecular de ponto de verificação imune em comparação com uma amostra de referência.
[0014] A invenção também fornece uma intervenção de ponto de verificação imune, para utilização em um método de tratamento ou prevenção de câncer em um sujeito, o método compreendendo: i) identificar um indivíduo com câncer que seja adequado para o tratamento com um intervenção de ponto de verificação imune de acordo com o método da invenção; e ii) tratar o referido sujeito com uma intervenção ponto de verificação imune.
[0015] A invenção proporciona ainda uma intervenção do ponto de verificação imunológica para utilização no tratamento ou prevenção de câncer em um sujeito, em que o sujeito tem (i) um maior número de neo-antígenos clonais; e / ou (ii) uma maior razão de neo-antígenos clonal:sub- clonal, ou fração de neo-antígeno inferior (ou baixa) sub- clonal; e / ou (iii) uma expressão molecular do ponto de verificação imune diferencial em comparação com uma amostra de referência.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0016] A Figura 1 mostra (A) carga neo-antígeno putativo total na coorte de tumores TCGA LUAD (adenocarcinoma do pulmão). Proporção de neo-antígenos resultantes de mutações clonal (azul) ou subclonal (vermelho) ou aqueles de clonalidade indeterminada (cinzento) é mostrado. (B) as curvas de sobrevida global para pacientes com tumores exibindo elevada carga neo- antígeno, definido como o quartil superior da coorte, (n = 30) em relação ao resto do grupo (n = 86) (rank-log P = 0,01 1) , (C) elevada carga neo-antígeno clonal, definido como o quartil superior da coorte, (n = 29) em relação ao resto do grupo (n = 87) (rank-log P = 0,0077), e (D) de alta subclonal fardo neo-antígeno, como definido no quartil superior da coorte (n = 30) em relação ao resto do grupo (n = 86) (log-rank P = 0,12). (E) expresso diferencialmente entre os genes de tumores com elevada carga clonal neo- antígeno e baixa carga neo-antígeno clonal, definido como o quartil inferior da coorte, agrupado na co-expressão. Aglomerados de genes imunológicos destacadas no texto são delimitados.
[0017] A Figura 2 mostra A) árvores filogenéticas para L01 e L012, com o tronco e ramo comprimentos proporcionais ao número de mutações não silenciosas. B) neo-antígenos putativos prevista para todas as mutações de sentido trocado em L01 1. O neo-antígeno MTFR2D326Y (FAFQEYDSF) é realçado. C) neo-antígenos putativos previstos para todas as mutações de sentido trocado em L012. O neo-antígeno CHTF18 L769V (LLLDIVAPK) e neo- antígeno MYADMR30W (SPMIVGSPW) são indicadas. D, E) análise de MHC-multímero de linfócitos T CD8 + expandidas in vitro derivados de três regiões de tumor e tecidos normais para L01 1 (D) e L012 (E). Em ambos os casos, a frequência de células CD3 + CD8 + linfitos T reactivos são indicados para os peptídeos mutantes.
[0018] A Figura 3 mostra A) análise de MHC- multímero de células T CD8 + não-expandido a partir de regiões de tumor de 1-3, o tecido de pulmão normal adjacente e PBMC de paciente L01 1 (painel superior) e L012 (painel inferior). Frequência de células positivas para MHC-multímeros para fora do compartimento de células CD3 + CD8 + é indicado. B) Imunofenótipo de células T CD8 + se infiltram no tumor do paciente L01 1, comparando-se as células T CD8 + MTFR2-reactivos (MTFR2 +) com células de MHC-multímeros negativos T CD8 + (MTFR2-) na mesma região do tumor, em tecido normal e em PBMC. Os dados mostrados são do tumor Região 3 e representativa de todas as regiões. Percentagem de células que expressam CTLA-4, DP-1, a LAG-3, Ki-67 e GzmB é mostrado. C) Co-expressão de DP-1, Ki67 e GzmB em MTFR2- reactivo (MTFR2 +) e células T CD8 + não- reactivas (MTFR2-) D) Painel superior: multi-cor IHC de tumor primário a partir de um L01 e L012. CD8 (vermelho), granzima B (azul) e LAG-3 (castanho) são mostrados. O painel inferior: coloração PD-L1 em L01 uma região 3 contra o tecido normal adjacente.
[0019] A Figura 4 mostra para a descoberta (AC) e coorte de validação (DF), o número de neo-antígenos clonais e fração de neo-antígenos subclonal é mostrado para os pacientes com um benefício durável clínica (DCB), ou benefício não durável (NDB). A sobrevida livre de progressão de tumores com um maior número de neo-antígenos e fracção subclonal baixa em comparação com aqueles com um número inferior de neo-antígenos ou fracção subclonal alta é mostrada para a descoberta de (C) e de validação coortes (F). G) arquitetura clonal para cada tumor sequenciado. PFS são relatados sob barplot e aqueles com a sobrevivência livre de progressão contínua são marcados com +. PD-L1 é indicado abaixo barplot: Forte (+) 50% coloração membranosa; Fraca (+/-), 1-49% da coloração membranosa; Negativa (-), < 1% de coloração membranosa; Desconhecido (?). (H) Progressão sobrevivência livre na coorte do tumor combinada de tumores comparação com um maior número de neo- antígenos e baixa fracção subclonal com aqueles com um número inferior de neo-antígenos ou fracção subclonal alta. I) arquitetura clonal de amostra de tumor CA9903, com mutação HERC1 destacado e com subclones indicados. J) putativos neo-antígenos prevista para todas as mutações de sentido trocado em CA9903. O HERC1P3278S neo-antígeno (ASNASSAAK) é realçado.
[0020] A Figura 5 mostra a Discriminação de quartil LUAD sobrevivência. As curvas de sobrevivência global mostrando todos os quatro quartis comparando os pacientes sobre a carga do neo-antígeno total de (A), carga neo- antígeno clonal (B), e carga neo-antígeno subclonal (C). p- valores de log-rank associados entre cada quartil é dada à direita das parcelas.
[0021] A Figura 6 mostra sobrevivência por número de SNVS em LUAD. (B) Curvas de sobrevivência geral de pacientes com tumores com elevada carga SNV (n = 30) em relação ao resto do grupo (n = 86) (rank-log P = 0,01), (C) elevada carga SNV clonal (n = 30) em relação ao restante da coorte (n = 86) (rank-log P = 0,014), e (D) de alta carga SNV subclonal (n = 30) em relação ao resto do grupo (n = 86) (log-rank P = 0,14).
[0022] Figura 7: LUSC (carcinoma de células escamosas do pulmão) Resumo coorte. (A) carga total putativo neo-antígeno de LUSCpatients TCGA. Colunas de cor para mostrar proporção de neo-antígenos que derivam de azul clonal) ou mutações subclonal) (vermelho ou resultantes de mutações de indeterminado cinzento) clonalidade (. (B) Curvas de sobrevivência global dos pacientes com elevada carga neo-antígeno (n = 30) em comparação com aqueles com um baixo peso neo-antígeno (n = 91) (rank-log P =0,84), (C) elevada carga neo-antígeno clonal (n = 29) em comparação com aqueles com um baixo peso neo-antígeno clonal (n = 92) (rank-log P = 0,99), e (D) de alta neo subclonal fardo antigio (n = 30) em comparação com aqueles com um baixo peso subclonal neo-antígeno (n = 91) (log-rank P = 0,32). (E) curvas de sobrevivência global dos doentes com elevada carga SNV (n = 30) em relação ao resto do grupo (n = 90) (rank-log P = 0,52), (F) elevada clonal fardo SNV (n = 30) comparado a restante da coorte (n = 91) (log-rank P = 0,89), e (L) de altura subclonal fardo SNV (n = 30) em relação ao resto do grupo (n = 92) (log-rank P = 0,28).
[0023] A Figura 8 mostra a análise de Expressão Gênica Diferencial. Genes diferencialmente expressos entre os pacientes de alto clonais neo-antígeno fardo e restante da coorte, aglomerada em co-expressão.
[0024] A Figura 9 mostra o Imunofenótipo de células T CD8 + se infiltram no tumor do paciente L012 A) Activação e fenótipo funcional de células T CD8 + CHTF18-reactivo (CHTF18 + infiltrantes de tumor) e MYADM-reactivo (MYADM +) células T contra as células T CD8 + negativas MHC- multiméricas em tumoral (Multimer-), tecido normal e PBMC. Percentagem de células que expressam CTLA-4, PD- 1, a LAG- 3, Ki-67 e GzmB é mostrado. Os histogramas são gerados a partir L012, a região 2 e descobertas representativas de todas as regiões do tumor. B) Co-expressão de DP-1, Ki-67 e granzima B em culas T infiltrantes de tumor CD8 + CHTF18- reactivos (CHTF18 +) e MYADM-reactivo (MYADM +) em comparação com tumores infiltrantes células T CD8 + negativas MHC-multímeros (Multimer-). C) em células T CD8 + se infiltram no tumor expandidas in vitro foram coradas com MHC-multímeros colocado com peptídeos de tipo selvagem ou mutantes e analisadas por citometria de fluxo. Percentagem de culas positivas do portão CD3 + CD8 + de MHC de multímero é mostrado. L01 1 (Painel superior): células expandidas T CD8 + a partir de uma região de tumor, mas não reconhecem mutante tipo selvagem MTFR2. L012 (painel do meio): células T CD8 + expandido da região do tumor 2 reconhecer mutante mas não tipo CHTF18 selvagem. L012 (painel inferior): Expandido células T CD8 + a partir de região do tumor 2 reconhecer tanto o tipo selvagem e mutante MYADM. A mutação em MYADM é no resuo de ancoragem, de ligação primário que afecta HLA e não o reconhecimento pelas células T. Embora os dados sugerem que as células T neste doente pode reconhecer peptídeos tanto mutantes e de tipo selvagem (quando estabilizado no nosso sistema de MHC- multímero), a muito baixa afinidade do ptido de tipo selvagem impediria apresentação adequada in vivo. (D) Validação de BV650 e PE-Cy7 MHC-multímero de ligação para linfócitos infiltrantes de tumor L01 expandidas a partir de um e L012. Para validar a qualidade dos reagentes utilizados para caracterizar, células T e MYADM- CHTF18- reactivos MTFR2- em amostras tumorais não expandidos, foram utilizados os mesmos reagentes para tingir um número maior de TIL expandidos. Os dados de L01 1 (painel da esquerda), e L012 (painel direito) mostra populações nítidas e definidas de MTFR2-, células T e MYADM- CHTF18-reactivas na TIL expandido.
[0025] A Figura 10 mostra carga mutacional e arquitectura clonal de tumores (A) e de descoberta (B) coorte de validação.
[0026] A Figura 11 mostra expressão PD-L1 para dois grupos de tumores. As exposições de expressão PD-L1 significativamente mais forte em tumores abrigando um fardo neo-antígeno clonal elevado e uma fracção de neo-antígeno subclonal baixo em comparação com tumores que albergam um fardo neo-antígeno clonal baixo ou fracção de elevado neo- antígeno subclonal.
[0027] A Figura 12 mostra: A) Número de mutações clonais previstos nos tumores descoberta coorte de pacientes com um benefício clínico durável (DCB) ou com benefício não durável (NDB). B) fracção Subclonal em tumores de doentes com um ou DCB NDB C) Progressão sobrevivência livre em tumores descoberta com um maior número de mutações clonais e fracção subclonal baixa em comparação com aqueles com um menor número de mutações clonais ou fracção subclonal alta. D) Número de mutações clonais previstos nos tumores validação coorte de pacientes com uma DCB ou com NDB. E) fracção Subclonal em tumores de doentes de validação com um DCB ou NDB F) Progressão sobrevivência livre de tumores de validação com um maior número de mutações clonais e fracção subclonal baixa em comparação com aqueles com um menor número de mutações clonais ou fracção subclonal alta. G) Número de mutações clonais e subclonal para cada tumor sequenciado com clonal (sombreado escuro) e subclonal (sombreado claro) exibida no barplot. Bares são sombreadas para indicar o status benefício clínico: DCB, verde; NDB, vermelho. PFS estão relatados sob a barplot e aqueles com a sobrevivência livre de progressão contínua são marcados com +. PD-L1 é indicado abaixo barplot: Forte (+) 50% coloração membranosa; Fraco (+/-), 1-49% da coloração membranosa; Negativa (-), 1% da coloração membranosa; Desconhecido (?), Não acessível. H) Progressão sobrevivência livre na coorte do tumor combinada de tumores comparação com um maior número de mutações clonais e baixa fracção subclonal com aqueles com um menor número de mutações clonais ou fracção subclonal alta. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0028] Um "neo-antígeno" é um antígeno específico de tumor que surge como consequência de uma mutação no interior de uma célula de câncer. Assim, um neo-antígeno não é expresso por células saudáveis em um sujeito.
[0029] O neo-antígeno aqui descrito, pode ser causada por qualquer mutação silenciosa que não altera uma proteína expressa por uma célula cancerosa em comparação com a proteína não mutada expressa por um do tipo selvagem, células saudáveis. Por exemplo, a proteína mutada pode ser uma translocação ou de fusão.
[0030] A "mutação" refere-se a uma diferença de uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, DNA ou RNA) de uma célula de tumor em comparação com uma célula saudável do mesmo indivíduo. A diferença na sequência de nucleotídeos pode resultar na expressão de uma proteína que não é expressa por uma célula saudável do mesmo indivíduo.
[0031] Por exemplo, a mutação pode ser uma variante de um só nucleotídeo (SNV), várias variantes de nucleotídeos, uma mutação por deleção, uma mutação de inserção, uma translocação, uma mutação sem sentido ou uma mutação do local de splicing que resulte em uma alteração na sequência de aminoácidos (codificação da mutação).
[0032] As mutações podem ser identificadas por sequenciamento exome, RNA-SEQ, a sequenciamento do genoma completo e / ou alvo sequenciamento painel gene e sequenciao de Sanger ou rotina de genes individuais. Os métodos adequados são conhecidos na arte.
[0033] Descrições de sequenciamento exoma e RNA-seq são fornecidos por Boa et al. (Câncer Informatics 2014; 13 (Suppl 2):67-82.) E Ares et al. (Cold Spring Harb Protoc 2014 03 de novembro, 2014 (11):1 139-48); respectivamente. Descrições de alvo painel sequenciamento do gene pode ser encontrada em, por exemplo, Kammermeier et al. (J Med Genet nov 2014; 51 (11):748-55) e Yap KL et al. (Câncer Res Clin 2014. 20:. 6605). Ver também Meyerson et al., Nat. Rev. Genetics, 2010 e Mardis, Annu Rev Anal Chem, 2013. Os painéis de sequenciamento gene alvo estão também disponíveis comercialmente (por exemplo, como resumido por Biocompare ((http://www.biocompare.com/ Editorial-Articles / 161 194-Build- Seu-próprio-Gene-Painéis-com-Estes-Custom- NGS-Targeting-Tools /)).
[0034] O alinhamento de sequências para identificação de diferenças de nucleotídeos (por exemplo SNVS) em DNA e / ou RNA de uma amostra de tumor em comparação com o DNA e / ou RNA a partir de uma amostra não-tumor pode ser realizada utilizando métodos que são conhecidos na arte. Por exemplo, diferenças de nucleotídeos em comparação com uma amostra de referência pode ser realizado utilizando o método descrito por Koboldt et al. (Genome Res 2012; 22:568-576). A amostra de referência pode ser o DNA da linha germinal e / ou sequcia de RNA. NEO-ANTÍGENOS CLONAIS
[0035] Os presentes invençãores determinaram que intratumour heterogeneidade (ITH) podem causar variação entre os neo-antígenos expressos em diferentes regiões de um tumor e entre diferentes células em um tumor. Em particular, os invençãores determinaram que, dentro de um tumor, determinadas neo-antígenos são expressos em todas as regiões e essencialmente todas as células do tumor, enquanto outros neo-antígenos são apenas expressos em um subconjunto de regiões tumorais e células.
[0036] Como tal, um neo-antígeno "clonal" ou "troncular" é um neo-antígeno que é expresso de forma eficaz ao longo de um tumor e codificado dentro de essencialmente todas as células do tumor. Um neo-antígeno "sub-clonal" ou "ramificado" é um neo-antígeno que é expresso em um subconjunto ou uma proporção de células ou regiões de um tumor.
[0037] As referências aqui feitas a "essencialmente todos" destinam-se a abranger a maior parte das células tumorais em um sujeito. Por exemplo, este pode compreender 60-100% de células, por exemplo, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de células de tumor em um sujeito.
[0038] "Presente ao longo de um tumor", "expresso de forma eficaz ao longo de um tumor" e "codificado dentro de essencialmente todas as células de tumor" pode significar que o neo-antígeno é expresso clonal em todas as regiões do tumor a partir do qual as amostras são analisadas.
[0039] Será apreciado que uma determinação de que uma mutação é "codificado dentro de essencialmente todas as células de tumor" refere-se a um cálculo de estatística e é, por conseguinte, sujeito a análise estatística e limiares.
[0040] Do mesmo modo, uma determinação de que um neo-antígeno clonal é "expresso de forma eficaz ao longo de um tumor" refere-se a um cálculo de estatística e é, por conseguinte, sujeito a análise estatística e limiares.
[0041] "Expresso de forma eficaz em essencialmente todas as células do tumor ou essencialmente todas as células tumorais" pode significar que a mutação está presente todas as células de tumor analisadas em uma amostra, conforme determinado utilizando métodos estatísticos apropriados.
[0042] A título de exemplo, a fracção de célula de câncer (CCF), que descreve a proporção de células cancerosas que albergam a mutação podem ser utilizados para determinar se as mutações são clonais ou ramificada. Por exemplo, a fracção de célula de câncer pode ser determinada por integração frequências de alelos variantes com números de cópias e as estimativas de pureza tal como descrito por Landau et al. (. Cell 2013 14 de fevereiro; 152 (4): 71426).
[0043] Em resumo, os valores da CCF são calculados para todas as mutações identificadas em cada e todas as regiões do tumor analisadas. Se apenas uma região é utilizado (isto é, apenas uma única amostra), vai ser obtido apenas um conjunto de valores de CCF. Isso irá proporcionar informação a respeito de que as mutações estão presentes em todas as células tumorais dentro dessa região do tumor, e desse modo fornecer uma indicação se a mutação é clonal ou ramificada. Todas as mutações clonais sub CCF (isto é <1) em uma região do tumor são determinadas como ramificada, enquanto que mutações clonais com uma CCF = 1 são determinadas para ser clonal.
[0044] Como foi dito, a determinação de uma mutação clonal está sujeita à análise estatística e limiar. Como tal, uma mutação pode ser identificada como clonal se for determinado que possui uma CCF 95% de intervalo de confiança> = 0,60, por exemplo 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00 ou > 1,00. Por outro lado, uma mutação pode ser identificada como ramificada, se for determinado que possui uma CCF 95% de intervalo de confiança <= 0,60, por exemplo, 0,55, 0,50, 0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,25, 0,20, 0,15, 0,10. 0,05 ou 0,01, em qualquer amostra analisada.
[0045] Será apreciado que a precisão de um método para a identificação de mutações clonais é aumentada através da identificação de mutações de clones para mais do que uma amostra isolada a partir do tumor.
AMOSTRAS TUMORAIS
[0046] Isolamento de biópsias e amostras de tumores é prática comum na técnica e pode ser realizada de acordo com qualquer método adequado, e tais métodos serão conhecidos por um especialista na arte.
[0047] O método deste aspecto pode compreender, por exemplo, determinando as mutações presentes nas células de câncer a partir de uma ou mais regiões de tumor isoladas de um tumor. Por exemplo, as mutações presentes em uma única biópsia, ou alternativamente, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez ou mais biópsias isoladas a partir de um tumor pode ser determinada.
[0048] As amostras de tumores individuais podem ser isoladas a partir de diferentes regiões localizadas ao longo de um tumor localizado em um sítio primário ou entre o primário e metástases ou dentro de uma metástase ou entre metástases. Por exemplo, a determinação das mutações presentes nos tumores que são conhecidos por exibir histologia díspar morfológica em diferentes regiões pode envolver a determinação das mutações presentes em um número de amostras individuais isolados a partir de regiões morfologicamente distintos.
[0049] A amostra pode ser uma amostra de sangue. Por exemplo, a amostra de sangue pode compreender DNA do tumor circulantes, células tumorais ou de exossomas compreendendo DNA de tumor circulantes.
INDIVÍDUO ADEQUADO PARA O TRATAMENTO
[0050] A invenção proporciona um método para a identificação de um indivíduo com câncer que é adequado para o tratamento com uma intervenção ponto de verificação imune, compreendendo o referido método a determinação do número de neo-antígenos clonais em uma ou mais células cancerosas do referido sujeito, em que um elevado número de neo-antígenos clonais é indicativo de resposta a uma intervenção ponto de verificação imunológico.
[0051] Conforme aqui utilizado, o termo "adequado para o tratamento" pode se referir a um sujeito que é mais propenso a responder ao tratamento com uma intervenção ponto de verificação imunológico, ou que é um candidato para tratamento com uma intervenção ponto de verificação imunológico. Um sujeito adequado para o tratamento pode ser mais propenso a responder ao referido tratamento de um sujeito que é determinada a não ser apropriadas para utilização no presente invenção. Um sujeito que é determinada para ser apropriada para o tratamento de acordo com a presente invenção podem demonstrar um benefício clínico durável (DCB), que pode ser definida como uma resposta parcial ou uma doença estável com duração de pelo menos 6 meses, em resposta ao tratamento com uma imune intervenção ponto de verificação.
[0052] O número de neo-antígenos identificados clonais ou previstos nas células cancerosas obtidos a partir do sujeito pode ser comparado com um ou mais limites pré-determinados. O uso de tais limites, os sujeitos podem ser estratificados em categorias que são indicativos do grau de resposta ao tratamento.
[0053] Um limite pode ser determinado em relação a uma referência coorte de pacientes com câncer. O grupo pode compreender 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500 ou mais doentes com câncer. O grupo pode ser qualquer grupo de câncer. Em alternativa, os pacientes podem todos têm o tipo de câncer relevante ou específica do assunto em questão.
[0054] Em uma concretização, um número "elevado" de neo-antígenos clonais significa um número maior do que o número médio de neo-antígenos clonais previstos em uma coorte de referência de pacientes com câncer, tais como o número mínimo de neo-antígenos clonais previsto para ser em o quartil superior da coorte de referência.
[0055] Em outra concretização, um número "elevado" de neo-antígenos clonais pode ser definido como 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 ou mais neo- antígenos clonais.
[0056] Um perito na arte irá apreciar que as referências a "elevados" ou números "superiores" de neo- antígenos clonais podem ser contexto específico, e podia levar a cabo a análise apropriada em conformidade.
[0057] A invenção proporciona ainda um método para a identificação de um indivíduo com câncer que é adequado para o tratamento com uma intervenção ponto de verificação imune, compreendendo o referido método a determinação da razão de neo-antígenos clonal:sub-clonal e / ou fração de neo-antígeno sub-clonal em mais do que uma assunto de células de câncer, onde uma elevada proporção de neo- antígenos clonal:sub-clonal ou inferior / fração de neo- antígeno baixo sub-clonal é indicativo da resposta a um intervenção de ponto de verificação imune.
[0058] Tal como acima, a proporção clonal:sub- clonal pode estar dentro do contexto de uma coorte de indivíduos, ou com qualquer tipo de câncer ou com o câncer relevante / específico. Por conseguinte, a relação de neo- antígeno clonal:sub-clonal pode ser determinada aplicando os métodos discutidos acima, para uma coorte de referência. Um razão "alta" ou "superior" clonal:sub-clonal pode, portanto, corresponde a um número maior do que a proporção clonal:sub-clonal mediana previsto em uma coorte de referência de pacientes com câncer, tais como o rácio mínimo clonal:sub-clonal previsto para ser no quartil superior do grupo de referência.
[0059] Em outra concretização, um razão "alta" ou "superior" clonal:sub-clonal significa uma razão na faixa de 3: 1 a 100:1, tal como uma razão de pelo menos 3:1, 5: 1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 50:1, 75:1 ou 100:1. Um técnico versado no assunto vai apreciar que os valores podem depender da coorte em questão.
[0060] A fração de neo-antígenos subclonal pode também ser definida em relação a um grupo de referência, como discutido acima. Por exemplo, um "inferior" ou "de baixo" fracção de neo-antígenos subclonal pode corresponder a uma fracção mais pequena do que a fracção média de neo- antígenos subclonal previstos em uma coorte de referência de pacientes com câncer, tais como o número máximo previsto para ser em quartil inferior da coorte.
[0061] Alternativamente, um perito na arte irá apreciar que uma fracção de neo-antígeno subclonal pode ser determinada (por exemplo, para cada paciente), dividindo o número de neoantígenos subclonal (por exemplo, que são previstos na uma ou mais culas de câncer a partir do referido sujeito) pelo número de neoantígenos totais (por exemplo, que são previstos na uma ou mais células de câncer a partir do referido sujeito).
[0062] Em uma concretização, uma fração "inferior" ou "de baixo" de neo-antígenos subclonal pode significar uma fracção de 25% ou menos, tal como uma fracção de 20, 15, 10, 5, 3, 2 ou 1% ou menos.
[0063] Em uma concretização preferida, o método pode compreender a determinação do número de neo-antígenos clonais e a razão de neo-antígenos clonal:sub-clonal ou a fracção de do sub-clonal neo-antígenos. Como se mostra no Exemplo, combinando as medidas de ambos neo-antígeno carga e fracção neo-antígeno sub-clonal foi capaz de prever a sensibilidade à pembrolizumab melhor do que quer medir sozinho (ver Fig. 4C), e o resultado poderia ser previsto em quase todos os casos (figura 4G-H).
[0064] De acordo com a invenção proporciona um método método para identificar um sujeito com câncer que é adequado para o tratamento com um intervenção de ponto de verificação imune, compreendendo o referido método: (I) a determinação do número de neo-antígenos clonais em uma ou mais células cancerosas do referido sujeito; e (ii) determinação da proporção de neo-antígenos clonal: sub-clones e / ou fracção de neo-antígeno sub- clonal em mais do que uma célula de câncer do referido sujeito;
[0065] em que um maior número de neo-antígenos clonais e uma maior proporção de neo-antígenos clonal:sub- clonal, ou inferior (ou baixa) fracção de neo-antígeno sub- clonal, é indicativa de resposta a um intervenção de ponto de verificação imune.
[0066] Além disso, os presentes invençãores descobriram que, surpreendentemente, as células de tumor com um elevado número de neo-antígenos clonais exibem perfis de express similares de molulas de ponto de verificação imunes, que é que eles exibem um perfil de expressão de moléculas de ponto de verificação comum imunes. Como tal, abordagens para identificar moléculas particulares do ponto de verificação imunes cuja expressão é aumentada ou diminuída em relação a células não- cancerosas também podem ser usadas para identificar pacientes propensos a responder o ponto de verificação terapias bloqueio.
[0067] Portanto, em um aspecto, a invenção proporciona um método para a identificação de sujeitos que têm câncer, que são mais propensos a responder a intervenções ponto de verificação imunes, compreendendo a determinação do perfil de moléculas ponto de verificação imunitárias em células cancerosas expressão do referido indivíduo, ou tipo de tumor.
[0068] Em um aspecto, o método compreende a determinação do perfil de moléculas ponto de verificação imunes expressão no tumor, por exemplo, a identificação de genes expressos diferencialmente, por exemplo, relativamente a uma amostra de referência apropriado. A amostra de referência no que diz respeito diferencial imune expressão da molécula de ponto de verificação pode ser uma célula não-canceroso ou tumor, (por exemplo, com baixa carga neoantígeno clonal) ou linfócitos de sangue periférico.
[0069] Por exemplo, o perfil das moléculas de expressão do ponto de verificação imune pode ser determinado por: (I) a determinação da sequência de RNA de uma amostra isolada a partir do tumor; e / ou (ii) realizar uma análise de expressão diferencial de genes de grande transcriptoma para identificar a expressão diferencial de genes relacionados com o ponto de verificação imunes (por exemplo, ajustado para p < 0,05). Os dados de células não cancerosas, pode ser utilizado como uma comparação, por exemplo, a partir do mesmo paciente ou de um padrão de referência.
[0070] A invenção proporciona ainda um método para a determinação do perfil de moléculas ponto de verificação imunes expressão em um tipo de câncer, em particular, compreendendo as etapas de: (i) a obtenção de dados de sequenciamento de RNA a partir do genoma do câncer Atlas (TCGA) portal de dados para um grupo de pacientes com o câncer de interesse; (ii) a obtenção de dados de nível do gene nível_3 de cada paciente; (iii) introduzir a contagem de leitura em bruto para a DESeq2 pacote para análise; e (iv) realizar uma análise da expressão diferencial de genes de grande transcriptoma para identificar significativamente expresso diferencialmente (ajustado p <0,05) genes imunes relacionados com o ponto de verificação.
[0071] A invenção proporciona, assim, um método para a identificação de sujeitos que têm câncer, que são mais propensos a responder a intervenções ponto de verificação imunes, compreendendo a determinação do perfil de moléculas ponto de verificação imunitárias em células cancerosas expressão do referido indivíduo, ou tipo de tumor, utilizando o referido método.
[0072] Em um aspecto preferido, expresso diferencialmente genes entre tumores com elevada carga neoantígeno clonal e baixa carga neoantígeno clonal são identificados (ver por exemplo, Figura 1E). Assim, a informação relativa ao número de neo-antígenos clonais é informativa e facilita a combinação das duas abordagens, a saber determinar e seleccionar a indivíduos / tumores com um elevado número de neo-antígenos clonais, e investigar ainda mais a expressão do gene de moléculas ponto de verificação imunes em os sujeitos / tumores com um elevado nível de neo-antígenos clonais. Isso facilita um ataque terapêutico "double frentes".
[0073] Em um aspecto, o referido diferencial de expressão imune é a regulação positiva ou de expressão elevada de uma molécula de ponto de verificação imune que é um receptor do receptor ou co-estimulador inibidora em comparação com uma amostra de referência adequado, em que tal regulação positiva ou expressão elevada é indicativa de uma resposta a intervenções ponto de verificação imunes dirigidas a molécula ponto de verificação imune que foi regulada positivamente ou mostrado alta expressão.
[0074] Os perfis de expressão de gene podem, por exemplo, ser determinada por um método tal como descrito no Exemplo 1 presente.
[0075] Em uma concretização preferida, a molécula de ponto de verificação imune é PD-1 e / ou de LAG-3. Em uma concretização particularmente preferida, o sujeito tem o câncer do pulmão, câncer do pulmão de preferência não- pequenas células.
[0076] Em uma concretização alternativa, a molécula de ponto de verificação imune é CTLA-4.
[0077] Em uma concretização preferida, o câncer é câncer do pulmão ou de melanoma, câncer do pulmão de preferência não-pequenas células ou o melanoma.
[0078] Este método também pode ser usado em combinação com os métodos descritos anteriormente para a identificação de um sujeito com câncer que é susceptível de responder ao tratamento com uma intervenção ponto de verificação imunológico.
[0079] Em conformidade, a invenção proporciona um método para a identificação de um indivíduo com câncer que é adequado para o tratamento com uma intervenção de ponto de verificação imune, compreendendo o referido método: (I) a determinação do número de neo-antígenos clonais em uma ou mais células cancerosas do referido sujeito; e (II) a determinação do perfil de moléculas ponto de verificação imune expressão em células cancerígenas e / ou células do sistema imunológico se infiltram no tumor a partir do referido tipo de objecto, ou tumor, em que um maior número de neo-antígenos clonais e diferencial ponto de verificação imune molécula de expressão em comparação com uma amostra de referência é indicativo de resposta a um intervenção de ponto de verificação imune.
MÉTODO DE PROGNÓSTICO
[0080] Os presentes invençãores fizeram a determinação importante e surpreendente de que os pacientes de câncer com os números mais elevados de neoantígenos clonais, e / ou uma maior razão de neoantígenos clonal:sub- clonal ou uma fracção baixa de neo-antígeno sub-clonal, melhoraram prognóstico.
[0081] Um especialista na técnica iria apreciar, no contexto da presente invenção que os indivíduos com números elevados ou maiores de neo-antígenos clonais, por exemplo dentro de uma coorte de indivíduos ou dentro de um intervalo identificados utilizando um número de diferentes indivíduos ou coortes, podem ter aumento da sobrevivência em relação a indivíduos com números mais baixos de neo- antígenos clonais.
[0082] Um valor de referência para o número de neo- antígenos clonais poderia ser determinado utilizando o seguinte método, com um "número elevado" ou "número mais elevado" ser qualquer coisa acima disso.
[0083] O referido método pode envolver a determinação do número de neo-antígenos clonais previstos em uma coorte de sujeitos com câncer e ou: (I) a determinação do número médio de neo-antígenos clonais previstos em que coorte; em que o número médio é o valor de referência; ou (II) a determinação do número mínimo de neo-antígenos clonais previstos para estar no quartil superior do que coorte, em que o número mínimo é o valor de referência. (Ver por exemplo, análise de dados TCGA nos presentes Exemplos.)
[0084] Tal "número médio" ou "número mínimo para estar no quartil superior" pode ser determinada em qualquer coorte do câncer per se, ou, em alternativa, os tipos de câncer relevantes / específicas.
[0085] Alternativamente, um "elevado" ou o número de "superior" de neo-antígenos clonais pode ser definido como 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 ou mais neo- antígenos clonais.
[0086] Um técnico versado no assunto apreciará que as referências a "elevados" ou números "superiores" de neo- antígenos clonais podem ser contexto específico, e podia levar a cabo a análise apropriada em conformidade.
[0087] Como tal, o presente invenção também fornece um método para prever ou determinar o prognóstico de um indivíduo com câncer, que compreende a determinação do número de neo-antígenos clonais em uma ou mais células cancerosas do indivuo, em que um maior número de neo- antígenos clonais, por exemplo em relação a um grupo tal como discutido acima, é indicativo de um melhor prognóstico. Em uma concretização preferida, o câncer é câncer do pulmão ou de melanoma, câncer do pulmão de preferência não-pequenas células ou o melanoma.
[0088] Em uma concretização alternativa da invenção compreende um método para prever ou determinar o prognóstico de um indivíduo com câncer, compreendendo o método a determinação da relação de clonal:sub-clonal e / ou fracção de neo-antígeno sub-clonal em mais do que uma célula de câncer do referido indivíduo, em que uma maior proporção clonal:sub-clonal e / ou uma fracção inferior / baixo sub-clonal neo-antígeno, por exemplo em relação a um grupo tal como discutido acima, é indicativo de um melhor prognóstico. Em uma concretização preferida, o câncer é melanoma ou câncer do pulmão, de preferência melanoma ou câncer do pulmão de não-pequenas células. TRATAMENTO DO CÂNCER
[0089] A presente invenção também fornece um método de tratamento ou prevenção de câncer em um sujeito, em que o referido método compreende as seguintes etapas: i) identificação de um indivíduo com câncer que é adequado para o tratamento com um intervenção de ponto de verificação imune de acordo com o método da invenção; e ii) o tratamento do referido sujeito com uma intervenção ponto de verificação imunológico.
[0090] Tal como aqui definido "tratamento" refere- se a redução, alívio ou eliminação de um ou mais sintomas da doença, distúrbio ou infecção que está a ser tratado, relativamente aos sintomas antes do tratamento.
[0091] "Prevenção" (ou profilaxia) refere-se a retardar ou prevenir o aparecimento dos sintomas da doença, distúrbio ou infecção. A prevenção pode ser absoluta (de tal forma que não ocorre doença) ou pode ser eficaz apenas em alguns indivíduos, ou por um período limitado de tempo.
[0092] O termo "intervenção de ponto de verificação imune" é aqui utilizado para se referir a qualquer terapia que interage com uma molécula modula ou ponto de verificação imune. Por exemplo, uma intervenção de ponto de verificação imune também pode ser aqui referida como uma "terapia ponto de verificação bloqueio", "modulador de ponto de verificação" ou "inibidor de ponto de verificação".
[0093] Por "inibidor" significa-se qualquer meio para impedir a inibição da actividade das células T por estas vias. Isto pode ser conseguido por anticorpos ou moléculas que bloqueiam a interacção do receptor de ligando, inibidores de vias de sinalização intracelular, e compostos que impedem a expressão de moléculas do sistema imunológico do ponto de verificação na superfície da célula T.
[0094] Os inibidores de ponto de verificação incluem, mas não estão limitados a, CTLA-4, inibidores de DP-1, inibidores de DP-L1, a LAG-3, inibidores de Tim-3, inibidores de TIGIT e inibidores BTLA, por exemplo. anticorpos co-estimuladoras entregar sinais positivos através de receptores de imuno-reguladora, incluindo mas não se limitando a ICOS, CD137, CD27 OX-40 e GITR.
[0095] Exemplos de intervenções ponto de verificação imunes adequados incluem pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab e ipilimumab.
[0096] Como mostrado no Exemplo 1 (ver Figuras 5 e 7), os tumores pulmonares, com um elevado número de neoantígenos clonais expressam altos níveis de DP-1 e LAG- 3, e na manutenção, as células T reactivas a neoantígenos clonais em indivíduos com câncer do pulmão, também expressam elevados níveis de DP-1 e a LAG-3. A co-expressão de DP-1 e LAG-3 em tumores com carga neo-antígeno clonal elevada versus baixa carga clonal sugere que a segmentação simultânea de ambas as vias podem gerar o benefício máximo.
[0097] Assim, em um aspecto, a invenção refere-se a co-direccionamento DP-1 e LAG-3 vias, por exemplo, no câncer do pulmão, quer por co-administração de inibidores de segmentação cada via ou por administração de um único reagente segmentação ambas as vias. Como exemplo deste último, os anticorpos biespecíficos são capazes de ligar-se a DP-1 e LAG-3, ou PD-L1 e LAG-3.
[0098] Em uma concretização preferida da presente invenção, o indivíduo é um mamífero, preferencialmente um gato, cão, cavalo, burro, ovelha, porco, cabra, vaca, ratinho, rato, coelho ou cobaia, mas mais preferivelmente, o sujeito é um ser humano.
[0099] Em um aspecto, o método de tratamento ou prevenção de câncer de acordo com a invenção compreende o passo de identificação de um paciente em necessidade do referido tratamento ou terapia.
[00100] O câncer pode ser selecionado a partir de, por exemplo, câncer da bexiga, o câncer gástrico, o câncer esofágico, o câncer da mama, câncer colorrectal, câncer do colo do útero, câncer do ovário, câncer do endométrio, câncer do rim (células renais), câncer do pulmão (de células pequenas, não-pequenas celular e mesotelioma), câncer cerebral (por exemplo, gliomas, astrocitomas, os glioblastomas), melanoma, linfoma, pequenas os câncers do intestino (duodeno e jejuno), leucemia, câncer do pâncreas, tumores hepatobiliares, câncers de células germinais, câncer da próstata, câncers da cabeça e pescoço, da tiróide câncer e sarcomas.
[00101] Em uma concretização preferida da invenção, o câncer é câncer do pulmão. Em uma concretização particularmente preferida, o câncer do pulmão é o câncer do pulmão de células não-pequenas.
[00102] Em uma concretização da invenção, o câncer é melanoma.
[00103] Em um aspecto da invenção, o sujeito tem uma doença pré-invasiva, ou é um sujeito que tenha tido a doença primária ressecado que pode exigir ou beneficiar de terapia adjuvante, tal como o proporcionado pela presente invenção.
[00104] O tratamento utilizando os métodos da presente invenção pode também abranger segmentação células circulantes tumorais e / ou metástases derivadas de tumor.
[00105] Os métodos e usos para o tratamento do câncer, de acordo com a presente invenção pode ser realizado em combinação com terapias adicionais do câncer. Em particular, as intervenções ponto de verificação imunes de acordo com a presente invenção podem ser administrados em combinação com os anticorpos co-estimuladoras, quimioterapia e / ou radioterapia, terapia-alvo ou terapia de anticorpo monoclonal.
[00106] A invenção será agora ser adicionalmente descrita por meio de Exemplos, os quais se destinam a servir para auxiliar um técnico versado no assunto na realização da invenção e não se destinam de forma alguma a limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1
[00107] A relevância clínica de neo-antígenos e de modulação imunitária no contexto de NSCLC ITH, e a identidade das células T que se infiltram no tumor-neo- antígeno reativo foi investigada.
Materiais e métodos Descrição dos grupos de pacientes
[00108] As amostras para a sequenciamento (L01 e L012 1) foram obtidos a partir de pacientes diagnosticados com câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC) que foram submetidos a ressecção cirúrgica definitiva antes de receber qualquer forma de terapia adjuvante, tal como quimioterapia ou radioterapia tinha sido obtido o consentimento informado permitindo a sequenciamento do genoma. Ambas as amostras foram recolhidas a partir de University College London Hospital, Londres (UCLHRTB 10 / H1306 / 42) e foram sujeitas a avaliação patologia para estabelecer o tipo histológico: um tumor foi classificado com CK7 + / TTF1 + adenocarcinoma (L01 1) e um tumor (L012) com histologia carcinoma escamoso. As características clínicas detalhadas são fornecidas na tabela S1.
[00109] As amostras obtidas a partir de (7) reflecte um grupo de doentes de fase IV NSCLC, e uma descrição detalhada deste grupo de doentes, incluindo o processamento do tumor, podem ser encontrados em material suplementar de (7). Ascaracterísticas clínicas detalhadas desta coorte são fornecidos em S3 mesa.
Análise de eficácia clínica
[00110] A análise de eficácia clínica foi realizada como em (7). Em resumo, a resposta objetiva pembrolizumab foi avaliada por critérios avaliados pelo investigador immunerelated resposta (IRRC) por um radiologista estudo. Tal como descrito no protocolo, tomografias foram realizadas a cada nove semanas. As respostas parciais e completas foram confirmadas por uma repetição de imagem que ocorre um mínimo de 4 semanas após a identificação inicial de resposta; respostas foram consideradas não confirmados doença estável ou progressiva dependente de resultados da segunda tomografia computadorizada. O benefício clínico durável (DCB) foi definida como a doença estável ou uma resposta parcial com duração superior a 6 meses (semana 27, o tempo de resposta programado terceira avaliação do protocolo). Nenhum benefício durável (NDB) foi definida como a progressão da doença <6 meses após o início do tratamento. Para doentes com uma resposta em curso para estudar a terapia, de sobrevivência livre de progressão foi censurado na data da avaliação de imagem mais recente. Para pacientes vivos, a sobrevida global foi censurada na data do último contato conhecido. Os detalhes a respeito de resposta para cada paciente podem ser encontrados na tabela S2.
Conjunto de dados exoma TCGA
[00111] As amostras de tumor, com chamadas de mutação e tipagem de HLA descritos abaixo, foram obtidos a partir do genoma do câncer Atlas (TCGA) para uma coorte de adenocarcinoma de pulmão (LUAD, n = 124) e carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC, n = 124). Os dados SNV foi obtida a partir TumourPortal (2) para as coortes LUAD e LUSC TCGA (http://www.tumourportal.org/tumour_types ttype = LUAD |? LUSC). Um paciente LUAD, TCGA-05-4396, foi excluída por ter mais de 7000 mutações baixa qualidade chamados, principalmente em um contexto C [C> L] L. Um paciente LUSC, TCGA-18-3409, foi excluído para suporte de uma assinatura de UV forte, não característico de um tumor LUSC. Processamento de tumor
[00112] Para ambos L011 e L012, quatro regiões de tumor primário a partir de uma única massa de tumor, separadas por intervalos de 1 cm, e de tecido normal adjacente foram selecionados por um patologista, documentada por fotografia, e congelados rapidamente. Para a metástase cerebral em L01 um, quatro regiões de tumor tal como determinado por hematoxilina e eosina (H & E) coloração, foram seleccionados por um patologista, sob a forma de, (FFPE) blocos de tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina. O sangue periférico foi coletado no momento da cirurgia em todos os pacientes e snap-congelado. Aproximadamente 5 x 5 x 5mm congelados rapidamente tecido tumoral e 500 μl de sangue foi usada para extracção de DNA genómico, utilizando o kit DNeasy (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Para o tecido FFPE, macrodissection manual da lâmina foi utilizada para remover as áreas ricas em tumores de tecido a partir de 10-40μnn lâminas não coradas, aand O DNA foi extraído a partir deste utilizando o DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen) de DNA foi quantificado por Qubit (Invitrogen) e integridade do DNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose. Detalhes relacionados com o processamento de validação e coorte descoberta pode ser encontrada em material suplementar de (7). Sequenciamento completo-exoma Multi-Região e variante calling L012
[00113] Para cada região do tumor e combinados da linha germinal de paciente L012, captura exome foi realizada em 1 -2 μg de DNA utilizando o kit de lllumina Nextera de acordo com o protocolo do fabricante (lllumina). As amostras foram em multiplex-fim emparelhado sequenciado na HiSeq lllumina 2500 na facilidade avançada Sequenciamento no LRI, como descrito anteriormente (3, 4). Cada biblioteca foi capturada carregado na plataforma lllumina e emparelhado-final sequenciada para a profundidade média de sequenciamento desejado (média entre exomes = 392,75). Bruto final emparelhado lê-se (100 pb) em formato FastQ gerado pelo gasoduto lllumina foram alinhados para a montagem completa hg19 genómico (incluindo contigs desconhecidos) obtido a partir de GATK junte 2,8 (5), usando mem BWA (BWA-0.7.7) (6). Ferramentas Picard v1.107 foi usado para limpar, classificar e mesclar arquivos da mesma região paciente e para remover duplicado lê (http://broadinstitute.github.io/picard). As métricas de controlo de qualidade foram obtidas usando uma combinação de ferramentas Picard (1,107), GATK (2.8.1) e FastQC (0.10.1) (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) .
[00114] SAMtools mpileup (0,1 0,16) (7) foi usada para localizar as posições de referência não em amostras de tumores e de linha germinal. Bases com uma pontuação Phred de <20 ou lê com uma qualidade de mapeamento <20 foram ignorados. BAQ computação foi desactivado e o coeficiente de desclassificação de qualidade de mapeamento foi definido para 50. As variantes somáticas entre tumor e combinados da linha germinal foram determinados usando VarScan2 somática (v2.3.6) (8) utilizando a saída de SAMtools mpileup. Os parâmetros padrão foram utilizados com a excepção de cobertura mínima para a amostra da linha germinal que foi ajustado para 10, a frequência mínima variante foi alterada para 0,01 e a pureza do tumor foi ajustado para 0,5. VarScan2 processSomatic foi usado para extrair as variantes somáticos. As chamadas SNV resultantes foram filtrados para falsos positivos, usando roteiro fpfilter.pl associado do Varscan2, após ter executado os dados através bam-readcount (0.5.1). Somente chamadas INDEL classificadas como 'alta confiança' por VarScan2 processSomatic foram mantidos para análise posterior.
[00115] Todas as variantes foram analisadas manualmente usando Integrated Genomics Visitantes (IGV) (9), e aqueles que mostra um perfil de erro específica lllumina (10) foram removidos. As variantes restantes foram sequenciadas na Ion Torrent PGM sequenciador (Life Technologies) a uma profundidade média de 1513. Para este painel personalizado um Ion AmpliSeqTM (Life Technologies) foi projetado usando o designer on-line (www.ampliseq.com). As PCR multiplex foram realizadas no DNA a partir de cada região de acordo com o protocolo do fabricante. As bibliotecas de sequenciamento com código de barras foram construídos TM, que foram sequenciados com 200 pb de comprimento li no sequenciador PGM Ion Torrent (Life Technologies). O alinhamento da sequcia de alvo regiões do genoma hg19 foi realizada utilizando o software lonTorrent TorrentSuiteTM. Variantes para que a cobertura foi de 50 em pelo menos uma região foi selecionada. Uma variante foi considerada estar presente em uma região variante, se a frequência was> 0,01 para 0,02 SNVS and> para indels. Novamente avaliação manual em IGV foi realizada e variantes que passaram este estágio foram usados para análises subsequentes. Todas as variantes foram anotadas utilizando ANNOVAR (11) e do controlador de mutações potenciais foram definidos como descrito em (12). L011
[00116] A regiões de sequenciamento e análise de linhagem germinativa, e de tumor primário têm anteriormente foi descrito em (13). O sequenciamento das regiões metastáticos foi realizada por BGI tecnologia seguindo os protocolos descritos em (13). O processamento computacional das regiões metastáticos foi realizada usando os métodos descritos para o L012 acima, com uma profundidade média entre as amostras de 93,7. As variantes não-silenciosos foram analisados manualmente usando IGV como por L012. Variante calling a partir de dados Rizvi
[00117] Os arquivos BAM representando tanto as regiões de linha germinal e de tumor de (i) 16 amostras que representam a coorte descoberta e 18 amostras que representam um coorte de validação (dados Rizvi), foram obtidos e convertidos para o formato FASTQ utilizando ferramentas Picard (1,107) SamToFastq Alinhamento e variante chamada era realizada como descrito por L012 acima.
Análise clonal
[00118] Para amostras TCGA, o estado clonal de cada mutação foi estimado por meio da integração do tipo selvagem e mutantes de alelos contagens, maiores e menores números de cópias absolutos, e as estimativas de pureza de tumor tal como previamente descrito (14). Para uma L01 e L012 estado clonal de cada mutação foi estimado com base em análise multiregion sequenciamento. Resumidamente, cada mutação foi classificada como clonal se identificado e presente em todos e cada região do tumor sequenciado no interior do tumor. Por outro lado, quaisquer mutações não ubiquamente presentes em todas as regiões do tumor foi classificada como subclonal.
[00119] Para a descoberta e tumor validação coorte, que incluem dados obtidos a partir de (1), a fracção de célula de câncer de cada mutação foi estimada por meio da integração do número cópia local (obtido a partir de ASCAT, ver abaixo), a pureza do tumor (também obtido a partir de ASCAT), e variante freqüência do alelo. Em resumo, para uma dada mutação foi calculado em primeiro lugar o número de cópias mutação observada, nmut, descrevendo a fracção de células tumorais que transportam uma dada mutação multiplicado pelo número de cópias cromossômicas no locus usando seguinte fórmula: nmut = VAFl[pC/Vt + C/Vπ(1- p)] P
[00120] onde VAF corresponde à frequência do alelo variante na base mutada, e p, CNt, CNn são, respectivamente, a pureza do tumor, o número de cópias do lugar geométrico específico do tumor, e o número de cópias do lugar geométrico específico normal. Em seguida, calculou-se o número esperado de cópia mutação, nchr, utilizando o VAF e atribuindo uma mutação de um dos números de cópias possíveis usando máxima probabilidade. Foi também avaliado se o número de cópias mutação poderia ser melhor explicada por número de cópias subclonal quando aplicável. Em última análise, isso nos permitiu obter contagens variantes e modificadas de referência para cada mutação, corrigido para ambos número de cópias e a pureza do tumor. Todas as mutações foram, em seguida, agrupadas usando o processo de agrupamento PyClone Dirichlet (15). Dado que o número de cópias e pureza já tinha sido corrigida, montamos número de cópias inteiros para 1 e pureza a 1; permitindo o agrupamento de mutações clonais e subclonal simplesmente grupo. Corremos PyClone com 10.000 iterações e um burn-in de 1000, e os parâmetros predefinidos. Nomeadamente, para a avaliação do estado clonal mutação, as mutações foram primeiro filtrado ainda mais para assegurar agrupamento fiável. Em breve, foram usadas apenas as mutações com uma profundidade de leitura de, pelo menos, 10 em ambos da linha germinal e de tumor, um limiar Varscan2 p-valor somática de 0,01. Lê foi necessário um mínimo de cinco alternativo para cada variante, assim como uma frequência alelo variante do tumor mínimo de 1%. As mutações também foram filtradas de modo a que um máximo de 2 linha germinal lê, e a frequência do alelo 2% variante da linha germinal foi permitido.
[00121] Para dois tumores, ZA6965 e GR0134, no número de cópias de confiança, de mutação e de pureza estimativas não poderia ser extraída, tornando clonal análise arquitectura intratável e estes tumores foram omitidos da análise Análise do número de cópias
[00122] Para os dados obtidos a partir de dados (7) amostra processada exome SNP e no número de cópias a partir emparelhado tumor-normal foi gerado usando VarScan2 (v2.3.6). O número de cópias Varscan2 foi executado utilizando os parâmetros por defeito, com a excepção de min-cobertura (21221095) e de relação de dados. O ratio de dados foi calculado sobre uma base por exemplo, tal como descrito em (22300766). A saída do Varscan foi processada usando o v2.3 ASCAT (20837533) para fornecer dados de número de cópias segmentada e estimativas da celularidade e ploidia para todas as amostras com base nos dados de sequência exome. A configuração seguinte foi alterada a partir do seu valor por defeito: Limiar para a fixação de um ACF foi ajustado 0,2-0,15 e o pacote foi executado com configuração gama de 1. Para as amostras TCGA, dados SNP6.0 foi processado para se obter informação cópia número, tão descrito em McGranahan, 2015. Construção da Árvore Filogenética
[00123] As árvores filogenéticas foram construídas utilizando matrizes de presença / ausência binários gerados a partir da distribuição regional de variantes dentro do tumor, tal como descrito em (12). Para tumor L01 1, os dados do tumor primário foram novamente analisadas utilizando o método descrito por L012 e as regiões metastáticos L01 1, permitindo uma árvore combinada com regiões tanto primários e metastáticos. Tipagem de HLA de Amostras de pacientes
[00124] Para todos os pacientes TCGA, o tipo de HLA de 4 dígitos foi determinada utilizando POLYSOLVER (polimórficas loci resolvedor) (76). Os pacientes 1 L01 e L012 foram serotipados e simultaneamente genotipados utilizando Optitype (17), que produziu resultados concordantes. Identificação de neo-antígenos putativos
[00125] Mutações não silenciosas identificadas foram usadas para gerar uma lista exaustiva de peptídeos 9-11 aminoácidos de comprimento, com o aminoácido mutado representada em cada posição possível. A afinidade de ligação de cada peptídeo mutante e o seu correspondente peptídeo de tipo selvagem para os alelos HLA de linha germinal do paciente foi prevista utilizando netMHCpan-2,8 (18, 19). Candidatos neo-antígenos foram identificados como aqueles com uma força de ligação previsto de <500 nM. Análise de Sobrevivência TCGA
[00126] Os dados clínicos para os pacientes TCGA foi acessado através do portal de dados TCGA e baixado https://tcqadata.nci.nih.gov/tcqafiles/ftp auth ftpusers / distro / anônimo / tumor / CANCER.T YPE / BCR / biotab / clin /. As análises de sobrevida foram realizadas em R usando o pacote de sobrevivência. Análise de expressão gênica diferencial
[00127] Dados de RNA-sequenciamento foi descarregado a partir do portal de dados TCGA. Para cada paciente LUAD, obteve-se os dados de nível do gene tudo 'level_3' disponível. As contagens de leitura em bruto foram usados como entrada para o pacote DESeq2 R para análise. A análise da expressão do gene transcriptomewide diferencial foi realizada e significativamente expressos diferencialmente (ajustado p <0,05) os genes imuno-relacionadas foram identificadas (listados na Tabela S1). Estes genes foram agrupados na sua co-express com a métrica 1-r2. Isolamento de linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) para L011 e L012
[00128] Os tumores foram retirados diretamente da sala de operações para o departamento de patologia onde a amostra foi dividida em regiões. As amostras foram subsequentemente trituradas sob condições estéreis seguido de digestão enzimática (RPMI-1640 (Sigma) com grau de investigação Liberase TL (Roche) e DNAase I (Roche)) a 37 ° C durante 30 minutos antes de dissociação mecânica utilizando gentleMACS (Miltenyi Biotech). Resultantes suspensões de células isoladas foram enriquecidas em leucócitos por passagem através de um (GE Healthcare) gradiente de Ficoll-Paque. As células vivas foram contadas e congeladas em soro humano AB (Sigma) com 10% de dimetilsulfóxido a -80 ° C antes da transferência para nitrogênio líquido. Expansão in vitro de linfócitos que se infiltram no tumor para L011 e L012
[00129] TILs foram expandidas usando um protocolo de rápida expansão (REP) em frascos T25 contendo meio EX-VIVO (Lonza), suplementado com 10% de soro humano AB (Sigma), anti-CD3 (OKT3, BioXCell), 6000IU / mL humano recombinante solúvel (rhIL -2, PeproTech) e 2x10 7 PBMC irradiadas (30Gy) reunidos a partir de três doadores saudáveis alogénicas. Meios frescos contendo rhIL-2 em 3000IU / ml foi adicionado a cada três dias, conforme necessário. Seguindo 2 semanas de expansão, TILs foram contadas, fenotipadas por citometria de fluxo e congeladas em soro AB humano (Sigma) a -80 ° C antes da utilização em ensaios relevantes ou armazenagem a longo prazo em azoto líquido. Geração de MHC multímero e análise de citometria de fluxo de codificação combinatória
[00130] MHC-multímeros segurando os neoepítopos previstos foram produzidos in-house (Universidade Técnica da Dinamarca, laboratório de SRH). Os peptídeos sintéticos foram comprados em Pepscan Presto, NL. As moléculas de HLA correspondentes a HLA-expressão de L01 1 (HLA-A1 101, A2402 e B3501) e L012 (HLA-A1 101, A2402 e B0702) foram redobradas com um peptídeo sensíveis aos raios UV, e trocou-se a peptídeos de interesse seguinte exposição à radiação UV (20-23). Resumidamente, os complexos de HLA carregadas com peptídeo sensível aos UV foram submetidos a luz UV de 366 nm (CAMAG) durante uma hora a 4 ° C na presença de peptídeo neo-antígeno candidato em uma placa de 384 poços. Os multímeros de peptídeo-MHC foram gerados utilizando um total de 9 estreptavidina fluorescente (SA) conjugados diferentes: PE, APC, PE-Cy7, PE-CF594, violeta brilhante (BV) 421, BV510, BV605, BV650, Brilhante de Ultravioletas (BUV) 395 (BioLegend). MHC-multimeros foram gerados com dois diferentes estreptavidina-conjugados para cada peptídeo-especificidade para permitir uma codificação combinatória de cada antígeno responsivo células T, permitindo que as análises para a reactividade contra até 36 peptídeos diferentes em paralelo (24, 25). Identificação de células T CD8 + neo-antígeno-reativos
[00131] A análise de MHC-multímero foi realizada em in vitro expandido linfócitos T CD8 + isoladas a partir de amostras de câncer de pulmão de região específica e o tecido de pulmão normal adjacente. 290 e 355 peptídeos mutantes candidatos (com previu afinidade de ligação de HLA <500 nM, incluindo várias variantes de peptídeos potenciais da mesma mutação de sentido errado) foram sintetizados e utilizados para rastrear L01 e L012 TILs expandidos, respectivamente. Para a coloração de linfócitos T CD8 + expandidas, as amostras foram descongeladas, tratada com
DNAse durante 10 minutos, lavadas e coradas
[00132] com painéis multiméricas MHC durante 15 min a 37 ° C. Subsequentemente, as células foram coradas com DEAD® fixável região do infravermelho próximo Kit Live / Dead Cell Stain para 633 ou 635 nm de excitação (Invitrogen, Life Technologies), CD8-PerCP (Invitrogen, Life Technologies) e FITC acoplado a um painel de anticorpos de CD4, CD14, CD16, CD19 (todos a partir de BD Pharmingen) e CD40 (ABD Serotec) por um adicional de 20 min a 4 ° C. A aquisição de dados foi efectuada em um citómetro de fluxo II LSR (Becton Dickinson) com o software FACSDiva 6. Os valores de corte para a definição de respostas positivas foram >0.005% das células CD8 + totais células e >10 dos eventos.
[00133] Para paciente L011, multímeros de HLA-B3501 MTFR2 derivados foram encontrados para se ligar a FAFQEYDSF sequência mutada (pontuação de ligação netMHC: 22): (Fig 1 1 B e D, Fig mas não o FAFQEDDSF sequência de tipo selvagem (10 netMHC pontuação de ligação) 9C). Não foram obtidas respostas contra peptídeos sobrepostos AFQEYDSFEK e KFAFQEYDSF, mas não a sequência de tipo selvagem: LLLDILAPK (pontuação netMHC ligao: 41) (Figura 1 1 C e E, a Fig 9C): Para paciente L012 HLA-A1 multímeros 101 CHTF18 derivados ligados a LLLDIVAPK sequência mutada (37 netMHC pontuação de ligação). Não foram obtidas respostas contra peptídeos sobrepostos CLLLDIVAPK e IVAPKLRPV. Finalmente, multímeros derivados de MYADM HLA-B0702 ligado a (pontuação de ligação netMHC: 15) mutado SPMIVGSPW sequência, bem como a sequência de tipo selvagem SPMIVGSPR (pontuação de ligação netMHC: 1329). Não foram obtidas respostas contra peptídeos sobrepostos SPMIVGSPWA, SPMIVGSPWAL, SPWALTQPLGL e SPWALTQPL. Análise MHC-multímero e fenotipagem de citometria de fluxo multi-paramétrico de linha de base, amostras de tumor sem volume aumentado para L011 e L012
[00134] As amostras de tumor foram descongeladas, lavadas e coradas com MHCmultimers primeiro feitos por medida durante 10-15 minutos a 37 ° C no escuro. As células foram depois transferidas para gelo molhado e coradas durante 30 minutos, no escuro, com um painel de anticorpos de superfície utilizado na diluição recomendada pelo fabricante: CD8-V500, clone SK1 (BD Biosciences), PD-1- BV605, EH12.2H7 clone (BioLegend), CD3-BV785, clone OKT3 (BioLegend), a LAG-3-PE, clone 3DS223H (eBioscience). As células foram permeabilizadas durante 20 minutos, com o uso do tampão de fixação e permeabilização intracelular definido a partir eBioscience. Um painel de coloração intracelular foi aplicado durante 30 minutos, em gelo, no escuro, e consistiu nos seguintes anticorpos utilizados para os fabricantes de diluição recomendada: granzima B- V450, GB1 um clone (BD Biosciences), FoxP3-PerCP-Cy5.5, PCH 101 clone (eBioscience), Ki-67-FITC, B56 clone (BD Biosciences) e CTLA-4 - APC, clone L3D10 (BioLegend). A aquisição de dados foi realizada em um fluxo BD FACSAria III citômetro (BD Biosciences) e analisados em FlowJo versão 10.0.8 (Árvore Star Inc.). Imuno-histoquímica para L011 e L012
[00135] As amostras de pacientes L011 e L012 e amígdalas humanos reativas foram fixadas em formalina tamponada e embebidos em parafina de acordo com protocolos histológicas convencionais. 2-5 micrómetros secções de tecido a partir de blocos de parafina foram cortadas e transferidas em linas carregadas electricamente para sujeitas a imuno-histoquímica. Os detalhes dos anticorpos primários utilizados são listados na tabela abaixo. Para estabelecer as condições de coloração óptima (isto é, diluição de anticorpo e tempo de incubação, os protocolos de recuperação de antígeno, cromogénio adequado), cada anticorpo foi testado e optimizadas em secções de amígdalas reactiva humana por imuno-histoquímica único convencional utilizando as plataformas automatizadas BenchMark Ultra (Ventana / Roche) e a ligao -Ill Autostainer (Leica Microsystems), de acordo com um protocolo descrito em outro lugar (26, 27).
[00136] Onde disponível, pelo menos, dois anticorpos diferentes criados contra a mesma proteína foram analisados em amígdalas para confirmar a especificidade do seu padrão de coloração. Para a coloração de múltiplos um protocolo previamente descrito foi efectuado (28). Para a avaliação de co-expressão de proteínas na membrana do citoplasma ou de células, alteração da cor única do cromogênio é anotada, ou seja, azul e vermelho deu origem a um roxo e castanho e azul a uma rotulagem quase preto. Imuno-histoquímica e padrões de reactividade de proteína foram avaliadas por TM. Pontuação de múltiplos imuno-coloração foi realizada em conjunto com FA. Aprovação para este estudo foi obtido a partir do Serviço Nacional de Ética em Pesquisa, Comitê de Ética em Pesquisa 4 (número REC Referência 09 / H0715 / 64).
Figure img0001
Figure img0002
Resultados
[00137] Uma grande sobrecarga de tumor neo-antígeno pode aumentar o reconhecimento pelas células T de tumor, reduzindo o potencial para imuno-evasão (12). Em apoio da relevância clínica de tumores neo-antígenos (7), verificou- se que a carga de alta neo-antígeno (definido como o quartil superior do número de neo-antígenos previstos na coorte) foi associado com os tempos de sobrevivência globais mais longos em LUAD amostras com dados clínicos combinados (n = 1 17) quando comparados com os tumores nos quartis remanescentes (figura 1 B, logrank p = 0,01 1; a Fig 5A).
[00138] Para determinar se o estado clonal do neo- antígeno (a presença de um neo-antígeno em todo o tumor (clonal) em comparação com um subconjunto de células tumorais (subclonal)) pode influenciar a relação com o resultado de sobrevivência, a fracção de célula de câncer (proporção de células cancerosas albergando cada mutação) foi calculada e cada neo-antígeno putativo foi classificada como clonal ou subclonal (13). Os tumores que albergam um elevado número de neo-antígenos clonais preditos (definido como o quartil superior da coorte) foram associados com a maior sobrevivência global em comparação com todos os outros tumores na coorte (Figura 1 C, log-rank p = 0,0077; Fig 5B). Por outro lado, o número de neo-antígenos subclonal preditos não foi significativamente associado com a sobrevivência global (Figura 1D, log-rank p = 0,12; Figura 5C). Embora a sobrecarga neo-antígeno foi relacionada com a carga de mutação, observou-se uma forte relação entre a sobrevivência global e do número de neo- antígenos em relação ao número de mutações (Fig 6). Estes dados sugerem que a presença de um número elevado de neo- antígenos em clonais LUAD pode favorecer a imunovigilância eficaz. A coorte LUSC tinha uma faixa mais estreita de neo- antígenos putativos (Figura 7A), com um desvio médio absoluto de 50 e gama interquartil de 71 e uma associação estatisticamente significativa entre a sobrevivência global e carga neo-antígeno não foi observada neste coorte (Fig 7 BG). Isto poderá reflectir as dificuldades em dissecando a arquitectura clonal de tumores a partir de amostras individuais (14).
[00139] Análise da expressão de genes revelou 27 genes imuno-relacionados diferencialmente expressos entre o baixo (definido como o quartil mais baixo do número de neo- antígenos clonais previstos na coorte) e coortes neo- antígeno clonais elevadas (Tabela S1). CD8a (p = 0,005) e os genes associados com a apresentação do antígeno (TAP-1 p = 0,003, STAT-1 p <0,001), infiltração de células T (CXCL- 10 p = 0,005, CXCL-9 p = p <0,001) e efectora a função das células T (IFN-Y p <0,001, granzimas B p < 0,001 e p = 0,008 H) foram supra-regulados em alta a coorte neo- antígeno clonal e agrupados em conjunto (figura 1E). PD-1 (p = 0,02) e a activação dos linfócitos do gene 3 (LAG-3, p <0,001), reguladores negativos da função das células T (15), também foram identificados neste agrupamento. PD-L1 foi também significativamente sobre-regulada (p <0,001) no grupo de alta clonal, agrupamento com PD-L2. Quando se compararam os elevados tumores neo-antígeno clonais para todos os outros tumores da coorte, PD-L1 foi identificado como o gene mais significativamente expresso diferencialmente imune (Figura 8, p < 0,001).
[00140] Estes dados sugerem que uma carga elevada de neo-antígeno clonal está associada com células T efectoras presença ofactivated potencialmente regulados pela expressão das proteínas de controlo imunes específicas (DP- 1, a LAG-3, DP-L1 / 2).
[00141] Foi endereçado na próxima-se se as células T CD8 + reativas a neo-antígenos clonais podem ser identificadas em tumores NSCLC primária. Dois tumores da fase inicial, uma L01 e L012, submetidos a multi-região sequenciamento exome (13), permitiu a análise filogenética e predição de neo-antígenos em cada região do tumor primário (Fig 2A). L01 1 incluiu uma metástase cerebral, ressecado de 14 meses após a cirurgia primária, submetido a sequenciamento de regiões múltiplas. Embora ambos os tumores foram derivados a partir de mulheres fumadoras (> 40 maços-anos), a sua carga de mutação e a extensão da heterogeneidade foi distinta (Fig 2A). L01 1, um adenocarcinoma, exibiu um tumor primário homogénea e disseminação metastática para o cérebro (M1 M4 volumosas), provavelmente originário da região do tumor R3 (Fig 2A). Um total de 313 neo-antígenos foram previstos no interior do tumor primário, 88% dos quais eram clonais, identificada em todas as regiões do tumor primário (Fig 2B). Por outro lado, L012, um carcinoma de células escamosas, exibiu um peso mutação baixo e grande heterogeneidade, com 75% dos antígenos-neo preditos sendo subclonal (Fig 2A, C).
[00142] MHC-multímeros carregados com os neo- antígenos previstos foram utilizadas para rastrear as células CD8 + T expandidas a partir de diferentes regiões do tumor e tecido pulmonar normal adjacente (13). Em L01 1, as células T CD8 + reactivos a MTFR2D326Y mutante (FAFQE VDSF), uma mutao clonal com a ligação de elevada previu HLA no tipo selvagem (10 nM) e as formas mutantes (22 nM) (Fig 2B), foram identificados em todas as regiões do tumor (2.84,4%) e com uma frequência inferior em regiões normais (0,1%) (figura 2D). Em L012, as células T CD8 + reativo para mutante CHTF18L769V (LLDI VAPK) e MYADMR30W (SPMIVGSP I l /) foram identificados em todas as regiões do tumor e a frequências mais baixas no tecido normal (Figura 2E). Ambos eram mutações clonais, CHTF18 com alta prevista de ligação a HLA (<50 nM) em formas de mutantes e de tipo selvagem, e com MYADM inferior previsto obrigatório em tipo selvagem (> 1000 nM), em comparação com a forma mutante (<50 nM) (Fig 2C).
[00143] Em L011, células MTFR2-reactivo T CD8 + também pode ser detectado em TI Ls não expandido (linfócitos infiltrantes de tumores) (Fig 3A) a partir de todas as regiões do tumor primário (0,79-1 0,35%), e a frequências mais baixas no tecido normal (0,16%) e células mononucleares de sangue periférico (PBMC) (0,02%). Similarmente, foram identificadas as células T CD8 + CHTF18-reactivos e MYADM-reactiva em amostras não expandidos de todas as regiões do tumor em L012 (CHTF18 0,16-0,58%, MYADM 2.25- 2.31%) e a uma frequência mais baixa em tecido de pulmão normal (CHTF18 0,02%, 0,17% MYADM) e PBMC (CHTF18 0,02%, MYADM 0,01%) (Figura 3A).
[00144] A caracterização adicional de células T-neo- antígeno reactivo em amostras não-expandido foi realizada por citometria de fluxo. Embora em níveis baixos, a CTLA-4 de expressão foi confinada a células T CD8 + se infiltram no tumor para ambos L01 1 e L012, com níveis mais elevados identificados em MTFR2, CHTF18 e células T MYADM-reactiva (Fig 3B, Fig 9A). As células T negativas níveis elevados de DP-1 foram expressas por > 99% de MTFR2-, CHTF18- e células T CD8 + se infiltram no tumor MYADM-reactiva (Fig 3B, Fig 9A), enquanto que níveis mais baixos foram observados em células CD8 + de MHC-multiméricas em tumor, tecido e PBMC normais. Em L01 1, a LAG-3 foi mais elevada expressão em todo o tumor rinfiltrating células T CD8 +, incluindo as células MTFR2-reactivo, em relação ao tecido normal e PBMC (Fig 3B). A expressão de LAG-3 também foi observada em L012, embora em níveis mais baixos (Fig 9A). I HC estudos apoiados ainda mais estas descobertas, a identificação de células T CD8 + que co-expressam a LAG-3 em ambos L01 1 e L012 tumores primários (Fig 3D). Ki67 foi expresso em níveis elevados no tumor infiltrado de células T CD8 + do que no tecido mamário normal ou PBMC (Fig 3B, Fig 9A), no entanto, a fracção de células em proliferação foi baixa para células negativas tanto neo-antígeno-reactivos e MHC- multímeros (<25 %). Em contraste, a granzima B (GzmB) foi expresso em níveis elevados em todos os subconjuntos de células T CD8 + estudados. Importante, ao passo que uma grande proporção de células T reactivas neo-antígeno nos tumores apareceram altamente ativada que expressa GzmB, a maioria destas células co-expressas PD- 1 (> 60%) e pareceu estar sob controle proliferativa com base em níveis de Ki67 (Fig 3C , Fig 9B).
[00145] A expressão de DP-1 em células T reactivas a neo-antígenos clonais de LAG-3 e, em conjunto com a expressão do tumor PD-L1 (Figura 3D), apoia fortemente o sistema imune assinaturas identificadas em tumores de pulmão clonais elevadas (Figura 1E). Estes dados suportam um papel potencial para estes postos de controlo específicos em restringir a actividade de células T que reconhecem os neo-antígenos clonais e futuros estudos de segmentação destes pontos de verificação em NSCLC com elevada carga neo-antígeno clonal.
[00146] Em seguida, foi explorado se o estado clonal de neo-antígenos putativos pode ser associado com sensibilidade alterada a PD-1 bloqueio em NSCLC. Os dados exome-sequenciamento a partir de um estudo recente em que dois coortes NSCLC independentes foram tratados com pembrolizumab foi obtido (2) (Tabela S2), e a arquitectura clonal de cada tumor foi dissecado por estimativa da fracção de célula de câncer de cada mutação (13) (Fig 10). Como relatado anteriormente (2), carga neo-antígeno foi relacionada com a eficácia clínica de pembrolizumab na descoberta e validação coorte, com um repertório de alta neo-antígeno associado a um melhor resultado (dados não mostrados).
[00147] A relação foi também depende da arquitectura clonal de cada tumor (Fig. 4A-H). Na coorte de descoberta, cada tumor exibindo durável benefício clínico (DCB, definido como em (2) a resposta como parcial ou uma doença estável duradoura> 6 meses), continham uma elevada carga neo-antígeno clonal (definido como acima ou igual ao número médio de clonais neo-antígenos na coorte de descoberta, 91) e uma fracção subclonal neo-antígeno menor do que 5% (Fig. 4A-B). Por outro lado, todos os tumores que exibem um benefício não duráveis (NDB) abrigava tanto uma baixa repertório clonal neo-antígeno (<91) ou alta fracção subclonal neo-antígeno (> 5%). Assim, na coorte de descoberta, conjugando o repertório neo-antígeno e heterogeneidade neo-antígeno (isto é, a razão de neo- antígenos ou mutações clonal:sub-clonal) foi capaz de prever a sensibilidade à pembrolizumab, melhor do que qualquer medida isoladamente (Figura 4C).
[00148] Da mesma forma, na coorte de validação, cinco dos seis tumores com uma elevada carga neo-antígeno clonal (definido como maior do que ou igual à mediana da coorte de validação, 69) e fracção de neo-antígeno subclonal baixo (<5%) foram associados com DCB (figura 4D- F). Por outro lado, oito dos dez tumores com cargas neo- antígeno clonais baixa ou elevada heterogeneidade neo- antígeno foram associados com NDB. Por exemplo, apesar de uma grande carga neo-antígenos, ZA6505 apresentaram uma resposta clínica não duráveis, recidivante após 2 meses. ZA6505 era um dos tumores mais heterogéneas no seio da coorte, com mais de 80% das mutações classificados como subclonal.
[00149] Em resumo, quando o grau de heterogeneidade neo-antígeno e a carga neo-antígeno clonal foram consideradas em conjunto, o resultado poderia ser previsto em quase todos os casos (Figura 4G-H).
[00150] Além disso, de acordo com análise TCGA (Figura 1E), observaram-se também uma maior expressão de DP-L1 em tumores abrigando um grande fardo neo-antígeno clonal e baixo heterogeneidade neo-antígeno em comparação com aqueles com uma baixa carga de neo-antígeno ou alta neo heterogeneidade -antigen (P = 0,0017, teste x2—, figura 1 1). Estes resultados permaneceram consistentes ao considerar todas as mutações em vez de aula I restrito neo- antígenos putativos (Figura 12), suportando a noção de que não identificado de MHC de classe II neo-antígenos restritos também podem desempenhar um papel significativo na reactividade imune (6) e a necessidade para refinamento dos algoritmos de previsão de neo-antígeno (16). de responder ao anti-DP-1 de terapia. A análise anterior dos linfócitos do sangue periférico (PBL) a partir de CA9903, um tumor com resposta excepcional para pembrolizumab, identificada uma população de células CD8 + T em PBL autólogos que reconhece um neo-antígeno prevista resultante de uma mutação HERC1P3278S (ASNASSAAK) (2). Consistente com a relevância de neo-antígenos clonais, esta mutação era provavelmente presentes em 100% das células cancerosas no interior do tumor sequenciado (Fig 4I-J). Tabela Suplementar S1: genes imunes diferencialmente expressos entre grupos de pacientes de alta e baixo neo- antígeno clonais
Figure img0003
Figure img0004
Figure img0005
Figure img0006
REFERÊNCIAS
[00151] N. A. Rizvi et al., Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science (New York, N. Y348, 124-128 (2015).
[00152] M. S. Lawrence et al., Discovery and saturation analysis of cancer genes across 21 tumour types. Nature 505, 495-501 (2014).
[00153] M. Gerlinger et al., Genomic architecture and evolution of clear cell renal cell carcinomas defined by multiregion sequencing. Nature genetics 46, 225-233 (2014).
[00154] M. Gerlinger et al., Intratumour heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England journal of medicine 366, 883-892 (2012).
[00155] A. McKenna et al., The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing nextgeneration DNA sequencing data. Genome research 20, 12971303 (2010).
[00156] H. Li, R. Durbin, Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754-1760 (2009).
[00157] H. Li et al., The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25, 2078-2079 (2009).
[00158] D. C. Koboldt et al., VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome research 22, 568-576 (2012).
[00159] J. T. Robinson et ai, Integrative genomics viewer. Nature biotechnology 2§, 24-26 (201 1 ).
[00160] K. Nakamura et al., Sequence-specific error profile of lllumina sequencers. Nucleic Acids Res 39, e90 (201 1 ).
[00161] 1 1 . K. Wang, M. Li, H. Hakonarson, ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res 38, e164 (2010).
[00162] N. Murugaesu et al., Tracking the genomic evolution of esophageal adenocarcinoma through neoadjuvant chemotherapy. Cancer discovery, (2015).
[00163] E. C. de Bruin et al., Spatial and temporal diversity in genomic instability processes defines lung cancer evolution. Science (New York, N. Y346, 251 -256 (2014).
[00164] N. McGranahan et al., Clonal status of actionable driver events and the timing of mutational processes in cancer evolution. Sci Transl Med 7, 283ra254 (2015).
[00165] C. L. Hodgkinson et al., Tumourigenicity and genetic profiling of circulating tumour cells in small-cell lung cancer. Nature medicine 20, 897-903 (2014).
[00166] S. A. Shukla et al., Comprehensive analysis of cancer-associated somatic mutations in class I HLA genes. Nature biotechnology, (In press).
[00167] A. Szolek et al., OptiType: precision HLA typing from next-generation sequencing data. Bioinformatics 30, 3310-3316 (2014).
[00168] I. Hoof et al., NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. lmmunogenetics 6 , 1-13 (2009).
[00169] M. Nielsen et al., NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B locus protein of known sequence. PloS one 2, e796 (2007).
[00170] M. Toebes et al., Design and use of conditional MHC class I ligands. Nature medicine 12, 246251 (2006).
[00171] 21 . A. H. Bakker et al., Conditional MHC class I ligands and peptide exchange technology for the human MHC gene products HLA-A1 , -A3, -A1 1 , and -B7. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 3825-3830 (2008).
[00172] 22. T. M. Frosig et al., Design and validation of conditional ligands for HLAB*08:01 , HLA- B*15:01 , HLA-B*35:01 , and HLA-B*44:05. Cytometry A, (2015).
[00173] 23. C. X. Chang et al., Conditional ligands for Asian HLA variants facilitate the definition of CD8+ T- cell responses in acute and chronic viral diseases. Eur J Immunol 43, 1 109-1 120 (2013).
[00174] 24. S. R. Hadrup et al., Parallel detection of antigen-specific T-cell responses by multidimensional encoding of MHC multimers. Nat Methods 6, 520-526 (2009).
[00175] 25. R. S. Andersen et al., Parallel detection of antigen-specific T cell responses by combinatorial encoding of MHC multimers. Nature protocols 7, 891 -902 (2012).
[00176] 26. T. Marafioti et al., Novel markers of normal and neoplastic human plasmacytoid dendritic cells. Blood 111, 3778-3792 (2008).
[00177] 27. A. U. Akarca et al., BRAF V600E mutation-specific antibody, a sensitive diagnostic marker revealing minimal residual disease in hairy cell leukaemia. Br J Haematol 162, 848- 851 (2013).
[00178] 28. T. Marafioti et al., Phenotype and genotype of interfollicular large B cells, a subpopulation of lymphocytes often with dendritic morphology. Blood 102, 2868-2876 (2003).
[00179] Todos os documentos aqui referidos são aqui incorporados por referência na sua totalidade, com atenção especial para a questão para a qual eles são referidos. Várias modificações e variações dos métodos descritos e sistema da invenção serão evidentes para os técnicos versados no assunto sem se afastar do escopo e do espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em ligação com concretizações preferidas específicas, deverá ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais concretizações específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para os especialistas em biologia molecular, imunologia celular ou áreas relacionadas pretendem estar dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (10)

1. Método para a identificação de um indivíduo com câncer que seja adequado para o tratamento com um modulador do ponto de verificação imune caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: (i) determinar o número de neo-antígenos clonais em uma ou mais células cancerosas do referido sujeito; e / ou (ii) determinar a proporção de neo-antígenos clonal: sub-clones e / ou fração de neo-antígeno sub-clonal em mais do que uma célula de câncer do referido sujeito; em que um maior número de neo-antígenos clonais, e / ou uma maior razão de neo-antígenos clonal/sub-clonal, ou fração de neo-antígeno sub-clonal inferior (ou baixa) em comparação com um amostra de referência é indicativo de resposta a um modulador do ponto de verificação imune, em que em que o câncer é selecionado de câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer de mama, câncer colorretal, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de rim (célula renal), câncer de pulmão (pequenascélulas, células não pequenas e mesotelioma), câncer cerebral (gliomas, astrocitomas, glioblastomas), melanoma, linfoma, câncer de intestino delgado (duodenal e jejunal), leucemia, câncer de pâncreas, tumores hepatobilares, câncer de células germinativas, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireoide e sarcomas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda determinar o perfil de expressão de moléculas do ponto de verificação imune em células cancerígenas e/ou células imunes infiltrantes tumorais do referido sujeito, ou tipo de tumor, em que a expressão diferencial de moléculas do ponto de verificação imune em comparação com uma amostra de referência é indicativa de resposta a um modulador do ponto de verificação imunológico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a determinação do perfil de expressão de moléculas do ponto de verificação imune é realizada por uma análise de expressão gênica diferencial ampla do transcriptoma para identificar diferencialmente genes relacionados a expressão do ponto de verificação imune.
4. Método para prever ou determinar o prognóstico de um indivíduo com câncer, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (i) determinar o número de neo-antígenos clonais em uma ou mais células cancerosas do referido sujeito; e / ou (ii) determinar a proporção de neo-antígenos clonais: sub-clonais e / ou fração de neo-antígeno sub-clonal em mais do que uma célula de câncer do referido indivíduo, em que um maior número de neo-antígenos clonais e / ou uma maior razão de neo-antígenos clonais:sub-clonais, ou fração de neo-antígeno sub-clonal inferior (ou baixa) é indicativo de um prognóstico melhor.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a intervenção do ponto de verificação imune interage com CTLA-4, DP-1, DP-L1, a LAG-3, Tim-3, TIGIT ou BTLA.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a intervenção do ponto de verificação imune é pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab ou ipilimumab.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é o câncer do pulmão ou melanoma.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o câncer é o câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC).
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um mamífero, preferencialmente, um ser humano, gato, cão, cavalo, burro, ovelha, porco, cabra, vaca, camundongo, rato, coelho ou cobaia.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
BR112018004878-0A 2015-09-10 2016-09-12 Intervenção de ponto de verificação imune no câncer BR112018004878B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1516047.6 2015-09-10
GBGB1516047.6A GB201516047D0 (en) 2015-09-10 2015-09-10 Method
PCT/EP2016/071471 WO2017042394A1 (en) 2015-09-10 2016-09-12 "immune checkpoint intervention" in cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112018004878A2 BR112018004878A2 (pt) 2018-10-02
BR112018004878B1 true BR112018004878B1 (pt) 2022-07-05

Family

ID=54362973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112018004878-0A BR112018004878B1 (pt) 2015-09-10 2016-09-12 Intervenção de ponto de verificação imune no câncer

Country Status (11)

Country Link
US (1) US11098121B2 (pt)
EP (1) EP3347039B1 (pt)
JP (1) JP7073254B2 (pt)
KR (1) KR20180081490A (pt)
CN (1) CN108135985A (pt)
AU (1) AU2016319316B2 (pt)
BR (1) BR112018004878B1 (pt)
CA (1) CA2997651A1 (pt)
GB (1) GB201516047D0 (pt)
RU (1) RU2739036C2 (pt)
WO (1) WO2017042394A1 (pt)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP2572003A4 (en) 2010-05-18 2016-01-13 Natera Inc METHOD FOR NONINVASIVE PRANATAL PLOIDIE ASSIGNMENT
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US12152275B2 (en) 2010-05-18 2024-11-26 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
BR112013020220B1 (pt) 2011-02-09 2020-03-17 Natera, Inc. Método para determinar o estado de ploidia de um cromossomo em um feto em gestação
US20140100126A1 (en) 2012-08-17 2014-04-10 Natera, Inc. Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data
CN113774132A (zh) 2014-04-21 2021-12-10 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
JP7305300B2 (ja) 2014-11-05 2023-07-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 併用免疫療法
BR112017020893A2 (pt) * 2015-04-27 2018-07-10 Cancer Research Technology Limited método para o tratamento de câncer
DK3294906T3 (en) 2015-05-11 2024-08-05 Natera Inc Methods for determining ploidy
GB201516047D0 (en) 2015-09-10 2015-10-28 Cancer Rec Tech Ltd Method
CA3016360A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Ucl Business Plc Methods for lung cancer detection
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
GB201618485D0 (en) * 2016-11-02 2016-12-14 Ucl Business Plc Method of detecting tumour recurrence
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
ES2971298T3 (es) * 2017-01-18 2024-06-04 Icahn School Med Mount Sinai Neoantígenos y usos de los mismos para el tratamiento del cáncer
SG11201907738UA (en) * 2017-03-31 2019-09-27 Pei Jia Yang Ranking system for immunogenic cancer-specific epitopes
GB201710815D0 (en) * 2017-07-05 2017-08-16 Francis Crick Inst Ltd Method
JP7307048B2 (ja) 2017-07-14 2023-07-11 ザ フランシス クリック インスティチュート リミティッド 腫瘍におけるｈｌａアレルの分析及びそれらの使用
WO2019016174A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 Institut Gustave Roussy METHOD FOR ASSESSING RESPONSE TO TARGETING DRUG PD-1 / PDL-1 MEDICINES
JP7072825B2 (ja) * 2017-09-13 2022-05-23 三菱電機ソフトウエア株式会社 コピー数計測装置、コピー数計測プログラムおよびコピー数計測方法
USD844652S1 (en) * 2017-11-26 2019-04-02 Jan Magnus Edman Display screen with graphical user interface
EP3622522A1 (en) * 2017-12-01 2020-03-18 Illumina, Inc. Methods and systems for determining somatic mutation clonality
JP2021506342A (ja) 2017-12-14 2021-02-22 ティーエーアイ ダイアグノスティックス インコーポレイテッドＴａｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 移植のための移植片適合性の評価
EP3781714A1 (en) 2018-04-14 2021-02-24 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna
US20220177534A1 (en) * 2018-05-10 2022-06-09 The Regents Of The University Of California Ccl21 and checkpoint inhibitors for the treatment of cancer
US11427873B2 (en) 2018-08-10 2022-08-30 Omniseq, Inc. Methods and systems for assessing proliferative potential and resistance to immune checkpoint blockade
KR20210148077A (ko) * 2018-12-21 2021-12-07 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 면역 체크포인트 억제 요법으로부터의 수혜를 예측하는 방법
CN111383713B (zh) * 2018-12-29 2023-08-01 北京安诺优达医学检验实验室有限公司 ctDNA检测分析装置及方法
JP2022523672A (ja) * 2019-01-28 2022-04-26 ボード オブ レジェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム がんを治療するための金属キレート化剤併用療法
WO2020201362A2 (en) * 2019-04-02 2020-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
WO2020218322A1 (ja) * 2019-04-23 2020-10-29 国立大学法人東北大学 血中ケモカインを用いた免疫チェックポイント阻害薬の治療効果予測
CN111394454B (zh) * 2020-01-06 2023-03-14 江苏省肿瘤防治研究所（江苏省肿瘤医院） 一种免疫相关生物标志物及其在头颈部鳞状细胞癌预后诊断中的应用
US20230047716A1 (en) * 2020-01-07 2023-02-16 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Method and system for screening neoantigens, and uses thereof
WO2021142088A1 (en) * 2020-01-07 2021-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Source specific exosomes for determining avoidance of cancer treatment and avoidance of checkpoint inhibitor therapies
EP3868897A1 (en) * 2020-02-20 2021-08-25 Worldwide Innovative Network Method for improving the treatment with immune checkpoint blockade therapy
CN112735513B (zh) * 2021-01-04 2021-11-19 江苏先声医疗器械有限公司 基于dna甲基化谱的肿瘤免疫检查点抑制剂治疗有效性评估模型的构建方法
GB202104715D0 (en) * 2021-04-01 2021-05-19 Achilles Therapeutics Uk Ltd Identification of clonal neoantigens and uses thereof
WO2023277086A1 (ja) * 2021-06-30 2023-01-05 ノバセラム株式会社 血中循環腫瘍細胞を含む試料を調製する方法

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988000344A1 (en) 1986-07-03 1988-01-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Peptide fragments of organ-specific neoantigens
US5670325A (en) * 1996-08-14 1997-09-23 Exact Laboratories, Inc. Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
KR101561325B1 (ko) 2008-11-03 2015-10-16 스티흐팅 산퀸 불드포르지닝 샘플에서의 항원 반응성 세포의 검출
WO2010144192A1 (en) 2009-05-05 2010-12-16 Children's Medical Center Corporation Prognosis indicators for solid human tumors
US8176660B2 (en) 2009-07-30 2012-05-15 Nike, Inc. Customizable stud for an article of footwear
US8709417B2 (en) 2009-09-30 2014-04-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
KR102315754B1 (ko) 2010-05-14 2021-10-22 더 제너럴 하스피톨 코포레이션 종양 특이적 신생항원을 확인하는 조성물 및 방법
CA2836494C (en) 2011-05-24 2023-01-03 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
WO2012159643A1 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
JP2015533473A (ja) 2012-07-12 2015-11-26 ペルシミューン，インコーポレイテッド 個別のがんワクチン及び適応免疫細胞療法
EP2882867A1 (en) 2012-08-10 2015-06-17 The Broad Institute, Inc. Methods and apparatus for analyzing and quantifying dna alterations in cancer
WO2014055561A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
EP2906684B8 (en) 2012-10-10 2020-09-02 Sangamo Therapeutics, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
EP2983702A2 (en) * 2013-04-07 2016-02-17 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for personalized neoplasia vaccines
CA2919567A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biontech Ag Tumor antigens for determining cancer therapy
WO2015014375A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biontech Ag Tumor antigens for determining cancer therapy
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
AU2014360198B2 (en) 2013-12-06 2020-06-18 The Broad Institute, Inc. Formulations for neoplasia vaccines
BR112016014410A2 (pt) 2013-12-20 2018-02-20 The Broad Institute Inc. terapia de combinação com vacina de neoantígeno
CN106164289A (zh) * 2014-01-02 2016-11-23 纪念斯隆凯特琳癌症中心 癌症对免疫疗法的反应的决定因素
KR20210069124A (ko) 2014-11-13 2021-06-10 더 존스 홉킨스 유니버시티 관문 차단 및 미소부수체 불안정성
MA40737A (fr) 2014-11-21 2017-07-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Déterminants de la réponse d'un cancer à une immunothérapie par blocage de pd-1
HUE053145T2 (hu) 2014-12-31 2021-06-28 Checkmate Pharmaceuticals Inc Kombinált tumor immunterápia
WO2016145578A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Syz Cell Therapy Co. Methods of cancer treatment using activated t cells
MY190083A (en) 2015-03-17 2022-03-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against pancreatic cancer and other cancers
RS60614B1 (sr) 2015-03-23 2020-08-31 Jounce Therapeutics Inc Antitela za icos
BR112017020893A2 (pt) 2015-04-27 2018-07-10 Cancer Research Technology Limited método para o tratamento de câncer
EP3323070B1 (en) 2015-07-14 2024-05-08 Personal Genome Diagnostics Inc. Neoantigen analysis
GB201516047D0 (en) 2015-09-10 2015-10-28 Cancer Rec Tech Ltd Method
WO2017096236A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center Circular tandem repeat proteins
CA3048193A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Moonshot Pharma Llc Methods for inducing an immune response by promoting premature termination codon read-through

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016319316B2 (en) 2022-09-08
CN108135985A (zh) 2018-06-08
US20180251553A1 (en) 2018-09-06
RU2739036C2 (ru) 2020-12-21
CA2997651A1 (en) 2017-03-16
EP3347039A1 (en) 2018-07-18
EP3347039B1 (en) 2021-08-11
GB201516047D0 (en) 2015-10-28
WO2017042394A1 (en) 2017-03-16
JP2018527935A (ja) 2018-09-27
KR20180081490A (ko) 2018-07-16
JP7073254B2 (ja) 2022-05-23
AU2016319316A1 (en) 2018-02-22
RU2018112516A3 (pt) 2020-02-10
BR112018004878A2 (pt) 2018-10-02
RU2018112516A (ru) 2019-10-10
US11098121B2 (en) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112018004878B1 (pt) Intervenção de ponto de verificação imune no câncer
Gettinger et al. A dormant TIL phenotype defines non-small cell lung carcinomas sensitive to immune checkpoint blockers
Havel et al. The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy
Liu et al. Efficient identification of neoantigen-specific T-cell responses in advanced human ovarian cancer
Chae et al. Mutations in DNA repair genes are associated with increased neoantigen burden and a distinct immunophenotype in lung squamous cell carcinoma
Yan et al. Multi-region sequencing unveils novel actionable targets and spatial heterogeneity in esophageal squamous cell carcinoma
Hensler et al. M2-like macrophages dictate clinically relevant immunosuppression in metastatic ovarian cancer
Berland et al. Current views on tumor mutational burden in patients with non-small cell lung cancer treated by immune checkpoint inhibitors
Decarvalho et al. Discordant inheritance of chromosomal and extrachromosomal DNA elements contributes to dynamic disease evolution in glioblastoma
Chen et al. PD-L1 expression and tumor mutational burden status for prediction of response to chemotherapy and targeted therapy in non-small cell lung cancer
Kiyotani et al. Integrated analysis of somatic mutations and immune microenvironment in malignant pleural mesothelioma
Giannakis et al. Genomic correlates of immune-cell infiltrates in colorectal carcinoma
Smith et al. Persistent mutant oncogene specific T cells in two patients benefitting from anti-PD-1
Addala et al. Computational immunogenomic approaches to predict response to cancer immunotherapies
JP2020525030A (ja) 癌の免疫療法への適合性を評価する方法
Ge et al. Prognostic values of immune scores and immune microenvironment-related genes for hepatocellular carcinoma
US20200386760A1 (en) Prediction of response to immune-modulatory therapies
Hsu et al. Tumor mutation burden and recurrent tumors in hereditary lung cancer
Ono et al. Assessment of associations between clinical and immune microenvironmental factors and tumor mutation burden in resected nonsmall cell lung cancer by applying machine learning to whole‐slide images
Beck et al. Clinical proteomics of metastatic melanoma reveals profiles of organ specificity and treatment resistance
Lo et al. Indication-specific tumor evolution and its impact on neoantigen targeting and biomarkers for individualized cancer immunotherapies
Doig et al. Tumour mutational burden: an overview for pathologists
Halima et al. Next-generation sequencing: unraveling genetic mechanisms that shape cancer immunotherapy efficacy
Budczies et al. Tumour mutational burden: clinical utility, challenges and emerging improvements
M. Naeini et al. Multi-omic features of oesophageal adenocarcinoma in patients treated with preoperative neoadjuvant therapy

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: CANCER RESEARCH TECHNOLOGY LIMITED (GB)

B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO EM FUNCAO DA REVOGACAO DO ART. 229-C DA LEI NO 9.279, DE 1996, POR FORCA DA LEI NO 14.195, DE 2021

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B06I Publication of requirement cancelled [chapter 6.9 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.21 NA RPI NO 2646 DE 21/09/2021 POR TER SIDO INDEVIDA (TENDO EM VISTA A ENTRADA DA PETICAO NO 870210086253 DE 20/09/2021 SOLICITANDO O TRAMITE PRIORITARIO).

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 12/09/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS