KR20180081490A - 암에서의 ＂면역 체크포인트 간섭제＂ - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하기 위한 방법, 및 그러한 대상체의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암을 지닌 대상체의 예후를 예측하거나 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
발명의 분야
본 발명은 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하기 위한 방법, 및 그러한 대상체의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암을 지닌 대상체의 예후를 예측하거나 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
치료적 항종양 면역을 활성화시키는 가장 유망한 접근법 중에 면역 체크포인트의 봉쇄가 있다. 면역 체크포인트는 곁조직 손상을 최소화하기 위해 자가-관용성을 유지하고 말초 조직의 생리학적 면역 반응의 지속 및 진폭을 조절하는데 중요한 면역 시스템의 억제성 경로이다. 종양이 면역 내성의 주요 메커니즘으로서, 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대한 특정 면역-체크포인트 경로를 선택한다는 것은 이제 분명하다. 많은 면역 체크포인트가 리간드-수용체 상호 작용에 의해 개시되기 때문에, 이들은 항체에 의해 쉽게 차단되거나 리간드 또는 수용체의 재조합 형태에 의해 조절될 수 있다.
암에서의 면역 체크포인트 조절에 대한 현재의 접근법은 대부분 이들 화합물이 이용 가능해진 순서에 기반한 추측의 수준 및 뜻밖의 발견을 수반한다. CTLA4, PD-1 및 PDL1이 이 순서로 발견되고 생산되었으며, 이것이 지금까지 이들이 투여된 방법이다. 초기 임상은 CTLA-4가 FDA에 의해 최초로 승인되었으므로 이에 의해 수행되었다. 이어서, PD-1/PDL1 치료제가 승인되고 이용되었다.
WO 2015/103037호는 암세포가 환자의 면역 시스템에 의해 비-자가인 것으로 인지될 수 있는 신생에피토프를 발생시키는 체세포 돌연변이를 지닐 수 있다는 발견에 기초하여, 대상체가 면역 체크포인트 조절제에 의한 치료에 반응할 가능성이 있음을 확인하는 방법을 제공한다. 암 샘플에서 하나 이상의 신생에피토프의 확인은 어떤 암 환자가 면역 체크포인트 조절제에 의한 치료에 유리하게 반응할 지를 결정하는데 유용할 수 있다.
발명의 개요
본 발명자들은 더 높은 수의 클로날 신생-항원(neo-antigen), 및/또는 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원 또는 낮은 서브-클로날 신생-항원 분획을 갖는 암 환자가 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 반응할 가능성이 더 높다는 중요하고도 놀라운 결정을 내렸다.
본 실시예에서 입증된 대로, 높은 클로날 신생-항원 부하 및/또는 낮은 서브클로날 신생-항원 부하를 갖는 종양을 지닌 환자는 체크포인트 봉쇄에 의한 면역요법(예를 들어, 항-PD1 요법)에 더 나은 반응을 보인다. 이것은 암을 치료하고 예방하기 위한 개선되고 보다 직접적인 치료 및 예방 양상에 대한 가능성을 열어 준다는 점에서, 당 분야에 대한 중요한 기여를 나타낸다. 이와 관련하여, 치료적 및 예방적 간섭제는 개체 및 암의 특수한 상황을 표적으로 할 수 있다.
추가로, 본 발명자들은, 놀랍게도, 높은 수의 클로날 신생-항원을 지닌 종양 세포가 면역 체크포인트 분자의 유사한 발현 프로파일을 나타내고, 다시 말해, 이들이 면역 체크포인트 분자의 공통적인 발현 프로파일을 나타낸다는 것을 발견하였다. 특정 유형의 암이 면역 체크포인트 분자의 특정 발현 프로파일을 나타낸다는 것은 이전에 입증된 적이 없었기 때문에, 이것은 당 분야에 대한 중요한 기여이다. 본 발명자들은 이 사실을 최초로 밝혀내었고, 이러한 발견은 특정 암을 치료하거나 예방하는 보다 직접적인 접근을 용이하게 한다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도 더 높은 수의 클로날 돌연변이, 및 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 돌연변이를 지닌 환자가 개선된 예후를 나타냄을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 암을 치료하고 예방하는 새로운, 대안적인 및/또는 보다 효과적인 방법에 대한 당 분야의 필요성을 다룬다.
따라서, 본 발명은 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(i) 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 클로날 신생-항원의 수를 결정하는 단계; 및/또는
(ii) 상기 대상체로부터의 하나 초과의 암 세포에서 클로날:서브-클로날 신생-항원의 비 및/또는 서브-클로날 신생-항원 분획을 결정하는 단계; 및/또는
(iii) 상기 대상체로부터의 암 세포 및/또는 종양 침윤 면역 세포에서 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일 또는 종양 유형을 결정하는 단계를 포함하고,
더 높은 수의 클로날 신생-항원, 및/또는 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획, 및/또는 기준 샘플에 비해 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현은 면역 체크포인트 간섭제에 대한 반응을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암을 지닌 대상체의 예후를 예측하거나 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(i) 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 클로날 신생-항원의 수를 결정하는 단계; 및/또는
(ii) 상기 대상체로부터의 하나 초과의 암 세포에서 클로날:서브-클로날 신생-항원의 비 및/또는 서브-클로날 신생-항원 분획을 결정하는 단계를 포함하고,
더 높은 수의 클로날 신생-항원 및/또는 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획은 개선된 예후를 나타낸다.
추가 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
i) 본 발명의 방법에 따라 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 단계; 및
ii) 상기 대상체를 면역 체크포인트 간섭제에 의해 치료하는 단계를 포함한다.
또한 추가 양태에서, 본 발명은 암을 지닌 대상체를 면역 체크포인트 간섭제에 의해 치료하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 대상체는 다음을 지닌 것으로 결정되었다:
(i) 더 높은 수의 클로날 신생-항원; 및/또는
(ii) 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획; 및/또는
(iii) 기준 샘플에 비해 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현.
본 발명은 또한 대상체에서 암의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 면역 체크포인트 간섭제를 제공하고, 상기 방법은,
i) 본 발명의 방법에 따라 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 단계; 및
ii) 상기 대상체를 면역 체크포인트 간섭제에 의해 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 대상체에서 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 면역 체크포인트 간섭제를 제공하고, 상기 대상체는,
(i) 더 높은 수의 클로날 신생-항원; 및/또는
(ii) 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획; 및/또는
(iii) 기준 샘플에 비해 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현을 갖는다.
도면의 설명
도 1: (A) TCGA LUAD(LUng ADenocarcinoma) 종양의 코호트에서 총 추정 신생-항원 부하. 클로날(청색) 또는 서브클로날(적색) 돌연변이로부터 발생한 신생-항원 또는 결정되지 않은(회색) 클론성의 것들의 비율이 도시된다. (B) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해, 코호트의 상위 사분위수로서 정의된 높은 신생-항원 부하를 나타내는 종양을 지닌 환자(n = 30)에 대한 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.011), (C) 코호트의 나머지(n = 87)에 비해, 코호트의 상위 사분위수로서 정의된 높은 클로날 신생-항원 부하를 나타내는 종양을 지닌 환자(n = 29)에 대한 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.0077), 및 (D) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해, 코호트의 상위 사분위수로서 정의된 높은 서브클로날 신생-항원 부하를 나타내는 종양을 지닌 환자(n = 30)에 대한 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.12). (E) 공동-발현에 대해 클러스터링된, 코호트의 하위 사분위수로서 정의된 높은 클로날 신생-항원 부하 및 낮은 클로날 신생-항원 부하를 지닌 종양들 간의 차별적으로 발현된 유전자. 텍스트에서 강조표시된 면역 유전자의 클러스터는 박스로 표시된다.
도 2: A) 비-침묵 돌연변이의 수에 비례하는 줄기 및 가지 길이를 지닌, L011 및 L012에 대한 계통발생 트리. B) L011에서 모든 미스센스 돌연변이에 대해 예측된 추정 신생-항원. MTFR2D326Y 신생-항원(FAFQEYDSF)은 강조표시된다. C) L012에서 모든 미스센스 돌연변이에 대해 예측된 추정 신생-항원. CHTF18 L769V 신생-항원(LLLDIVAPK) 및 MYADMR30W 신생-항원(SPMIVGSPW)이 표시된다. D, E) L011(D) 및 L012(E)에 대한 3개의 종양 영역 및 정상 조직으로부터 유래된 시험관내 증식된 CD8+ T 림프구의 HC-다합체 분석. 두 경우 모두에, 돌연변이 펩티드에 반응성인 CD3+CD8+ T 림프구의 빈도가 표시된다.
도 3: A) 환자 L011(상부 패널) 및 L012(하부 패널)로부터 종양 영역 1-3, 인접한 정상 폐 조직 및 PBMC로부터 비-증식된 CD8+ T 세포의 MHC-다합체 분석. CD3+CD8+ 구획 중 MHC-다합체 양성 세포의 빈도가 표시된다. B) 동일한 종양 영역, 정상 조직 및 PBMC에서, MTFR2-반응성 CD8+ T 세포(MTFR2+)를 MHC-다합체 음성 CD8+ T 세포(MTFR2-)와 비교한, 환자 L011로부터의 종양-침윤 CD8+ T 세포의 면역표현형. 도시된 데이터는 종양 영역 3에서 얻었고 모든 영역을 대표한다. CTLA-4, PD-1, LAG-3, Ki-67 및 GzmB를 발현시키는 세포의 백분율이 도시된다. C) MTFR2-반응성(MTFR2+) 및 비-반응성 CD8+ T 세포(MTFR2-)에 대한 PD-1, Ki67 및 GzmB의 공동-발현. D) 상부 패널: L011 및 L012로부터 원발 종양의 다색성 IHC. CD8(적색), 그랜자임 B(청색) 및 LAG-3(갈색)이 도시된다. 하부 패널: L011 영역 3 대 인접한 정상 조직에서 PD-L1 염색.
도 4: 발견(A-C) 및 검증 코호트(D-F)에 대해, 클로날 신생-항원의 수 및 서브클로날 신생-항원의 분획이 지속적인 임상 효과(DCB)를 갖거나, 지속적인 효과가 없는(NDB) 환자에 대해 도시된다. 더 낮은 수의 신생-항원 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양에 비해 더 높은 수의 신생-항원 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 종양에서의 무진행 생존이 발견(C) 및 검증(F) 코호트에 대해 도시된다. G) 시퀀싱된 각 종양에 대한 클로날 아키텍쳐. PFS는 바플롯 하에 보고되며 진행중인 무진행 생존인 것들은 +로 표시된다. PD-L1은 바플롯 아래에 표시된다: 강함 (+) 50% 막 염색(membranous staining); 약함 (+/-), 1-49% 막 염색; 음성 (-), <1% 막 염색; 알려지지 않음 (?). (H) 더 높은 수의 신생-항원 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 종양을 더 낮은 수의 신생-항원 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양과 비교한 조합된 종양 코호트에서의 무진행 생존. I) CA9903 종양 샘플의 클로날 아키텍쳐, HERC1 돌연변이가 강조표시되고 서브클론이 표시된다. J) CA9903에서 모든 미스센스 돌연변이에 대해 예측된 추정 신생-항원. HERC1P3278S 신생-항원(ASNASSAAK)은 강조표시된다.
도 5: LUAD 생존의 사분위수 파괴. 총 신생-항원 로드(A), 클로날 신생-항원 로드(B), 및 서브클로날 신생-항원 로드(C)에 대해 환자들을 비교한 사분위수 4개 모두를 보여주는 전반적인 생존 곡선. 각 사분위수 사이의 관련된 log-rank p-값은 플롯의 우측에 제공된다.
도 6: LUAD에서 SNV의 수에 의한 생존. (B) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해 높은 SNV 부하를 갖는 종양을 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.01), (C) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해 높은 클로날 SNV 부하를 갖는 종양을 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.014), 및 (D) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해 높은 서브클로날 SNV 부하를 갖는 종양을 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.14).
도 7: LUSC(폐 편평 세포 암종) 코호트 개요. (A) TCGA LUSC환자의 총 추정 신생-항원 부하. 컬럼을 채색하여 클로날(청색) 또는 서브클로날(적색) 돌연변이로부터 발생하거나 결정되지 않은(회색) 클론성의 돌연변이로부터 발생한 신생-항원의 비율을 나타낸다. (B) 낮은 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 91)에 비해 높은 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.84), (C) 낮은 클로날 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 92)에 비해 높은 클로날 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 29)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.99), 및 (D) 낮은 서브클로날 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 91)에 비해 높은 서브클로날 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.32). (E) 코호트의 나머지(n = 90)에 비해 높은 SNV 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.52), (F) 코호트의 나머지(n = 91)에 비해 높은 클로날 SNV 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.89), 및 (G) 코호트의 나머지(n = 92)에 비해 높은 서브클로날 SNV 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.28).
도 8: 차별적인 유전자 발현 분석, 공동발현에 대해 클러스터링된, 높은 클로날 신생-항원 부하 환자 및 코호트의 나머지 사이의 차별적으로 발현된 유전자.
도 9: 환자 L012로부터 종양-침윤 CD8+ T 세포의 면역표현형 A) 종양(다합체-), 정상 조직 및 PBMC에서 종양-침윤 CD8+ CHTF18-반응성(CHTF18+) 및 MYADM-반응성(MYADM+) T 세포 대 MHC-다합체 음성 CD8+ T 세포의 활성화 및 기능적 표현형. CTLA-4, PD-1, LAG-3, Ki-67 및 GzmB를 발현시키는 세포의 백분율이 도시된다. L012, 영역 2 및 모든 종양 영역을 대표하는 결과로부터 히스토그램이 생성된다. B) 종양-침윤 MHC-다합체 음성 CD8+ T 세포(다합체-)에 비해 종양-침윤 CD8+ CHTF18-반응성(CHTF18+) 및 MYADM-반응성(MYADM+) T 세포에 대한 PD-1, Ki67 및 그랜자임 B의 공동-발현. C) 시험관내 증식된 종양-침윤 CD8+ T 세포는 돌연변이체 또는 야생형 펩티드가 로딩된 MHC-다합체로 염색되고, 유세포분석기에 의해 분석되었다. CD3+CD8+ 게이트의 MHC 다합체 양성 세포의 백분율이 도시된다. L011(상부 패널): 종양 영역 1로부터 증식된 CD8+ T 세포는 돌연변이체는 인지하지만 야생형 MTFR2는 인지하지 않는다. L012(중간 패널): 종양 영역 2로부터 증식된 CD8+ T 세포는 돌연변이체는 인지하지만 야생형 CHTF18은 인지하지 않는다. L012(하부 패널): 종양 영역 2로부터 증식된 CD8+ T 세포는 돌연변이체 및 야생형 MYADM 둘 모두를 인지한다. MYADM에서의 돌연변이는 앵커 잔기에 존재하여, HLA 결합에 주요 영향을 미치고 T 세포 인지에는 영향을 미치지 않는다. 상기 데이터는 이 환자의 T 세포가 돌연변이체 및 야생형 펩티드(본 발명자들의 MHC-다합체 시스템에서 안정화될 때) 둘 모두를 인지할 수 있음을 시사하지만, 야생형 펩티드의 매우 낮은 친화도는 생체내에서의 적절한 제시를 방해할 것이다. (D) L011 및 L012로부터 증식된 종양-침윤 림프구에 대한 BV650 및 PE-Cy7 MHC-다합체 결합의 검증. 증식되지 않은 종양 샘플에서 MTFR2-, MYADM- 및 CHTF18-반응성 T 세포를 특성화하기 위해 사용된 시약의 품질을 검증하기 위해, 본 발명자들은 더 많은 수의 증식된 TIL을 염색하는데 동일한 시약을 사용하였다. L011(좌측 패널), 및 L012(우측 패널)로부터의 데이터는 증식된 TIL에서 MTFR2-, MYADM- 및 CHTF18-반응성 T 세포의 명확하고 분명한 집단을 보여준다.
도 10: (A) 발견 및 (B) 검증 코호트 종양의 돌연변이 부하 및 클로날 아키텍쳐.
도 11: 두 종양 그룹에 대한 PD-L1 발현. PD-L1은 낮은 클로날 신생-항원 부하 또는 높은 서브클로날 신생-항원 분획을 지니는 종양에 비해 높은 클로날 신생-항원 부하 및 낮은 서브클로날 신생-항원 분획을 지니는 종양에서 유의하게 더 강력한 발현을 나타낸다.
도 12: A) 지속적인 임상 효과(DCB)를 갖거나, 지속적인 효과가 없는(NDB) 환자로부터의 발견 코호트 종양에서 예측된 클로날 돌연변이의 수. B) DCB 또는 NDB인 환자로부터의 종양에서 서브클로날 분획 C) 더 낮은 수의 클로날 돌연변이 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양에 비해 더 높은 수의 클로날 돌연변이 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 발견 종양에서 무진행 생존. D) DCB이거나 NDB인 환자로부터의 검증 코호트 종양에서 예측된 클로날 돌연변이의 수. E) DCB 또는 NDB인 검증 환자로부터의 종양에서 서브클로날 분획 F) 더 낮은 수의 클로날 돌연변이 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양에 비해 더 높은 수의 클로날 돌연변이 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 검증 종양에서 무진행 생존. G) 바플롯에 표시되는 클로날(어두운 음영) 및 서브클로날(밝은 음영)을 지닌 각 시퀀싱된 종양에 대한 클로날 및 서브클로날 돌연변이의 수. 바는 임상 이익 상태를 나타내기 위해 음영 처리된다: DCB, 녹색; NDB, 적색. PFS는 바플롯 하에 보고되며 진행중인 무진행 생존인 것들은 +로 표시된다. PD-L1은 바플롯 아래에 표시된다: 강함 (+) 50% 막 염색; 약함 (+/-), 1-49% 막 염색; 음성 (-), 1% 막 염색; 알려지지 않음 (?), 평가 불가능. H) 더 높은 수의 클로날 돌연변이 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 종양을 더 낮은 수의 클로날 돌연변이 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양과 비교한 조합된 종양 코호트에서의 무진행 생존.
도 1: (A) TCGA LUAD(LUng ADenocarcinoma) 종양의 코호트에서 총 추정 신생-항원 부하. 클로날(청색) 또는 서브클로날(적색) 돌연변이로부터 발생한 신생-항원 또는 결정되지 않은(회색) 클론성의 것들의 비율이 도시된다. (B) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해, 코호트의 상위 사분위수로서 정의된 높은 신생-항원 부하를 나타내는 종양을 지닌 환자(n = 30)에 대한 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.011), (C) 코호트의 나머지(n = 87)에 비해, 코호트의 상위 사분위수로서 정의된 높은 클로날 신생-항원 부하를 나타내는 종양을 지닌 환자(n = 29)에 대한 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.0077), 및 (D) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해, 코호트의 상위 사분위수로서 정의된 높은 서브클로날 신생-항원 부하를 나타내는 종양을 지닌 환자(n = 30)에 대한 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.12). (E) 공동-발현에 대해 클러스터링된, 코호트의 하위 사분위수로서 정의된 높은 클로날 신생-항원 부하 및 낮은 클로날 신생-항원 부하를 지닌 종양들 간의 차별적으로 발현된 유전자. 텍스트에서 강조표시된 면역 유전자의 클러스터는 박스로 표시된다.
도 2: A) 비-침묵 돌연변이의 수에 비례하는 줄기 및 가지 길이를 지닌, L011 및 L012에 대한 계통발생 트리. B) L011에서 모든 미스센스 돌연변이에 대해 예측된 추정 신생-항원. MTFR2D326Y 신생-항원(FAFQEYDSF)은 강조표시된다. C) L012에서 모든 미스센스 돌연변이에 대해 예측된 추정 신생-항원. CHTF18 L769V 신생-항원(LLLDIVAPK) 및 MYADMR30W 신생-항원(SPMIVGSPW)이 표시된다. D, E) L011(D) 및 L012(E)에 대한 3개의 종양 영역 및 정상 조직으로부터 유래된 시험관내 증식된 CD8+ T 림프구의 HC-다합체 분석. 두 경우 모두에, 돌연변이 펩티드에 반응성인 CD3+CD8+ T 림프구의 빈도가 표시된다.
도 3: A) 환자 L011(상부 패널) 및 L012(하부 패널)로부터 종양 영역 1-3, 인접한 정상 폐 조직 및 PBMC로부터 비-증식된 CD8+ T 세포의 MHC-다합체 분석. CD3+CD8+ 구획 중 MHC-다합체 양성 세포의 빈도가 표시된다. B) 동일한 종양 영역, 정상 조직 및 PBMC에서, MTFR2-반응성 CD8+ T 세포(MTFR2+)를 MHC-다합체 음성 CD8+ T 세포(MTFR2-)와 비교한, 환자 L011로부터의 종양-침윤 CD8+ T 세포의 면역표현형. 도시된 데이터는 종양 영역 3에서 얻었고 모든 영역을 대표한다. CTLA-4, PD-1, LAG-3, Ki-67 및 GzmB를 발현시키는 세포의 백분율이 도시된다. C) MTFR2-반응성(MTFR2+) 및 비-반응성 CD8+ T 세포(MTFR2-)에 대한 PD-1, Ki67 및 GzmB의 공동-발현. D) 상부 패널: L011 및 L012로부터 원발 종양의 다색성 IHC. CD8(적색), 그랜자임 B(청색) 및 LAG-3(갈색)이 도시된다. 하부 패널: L011 영역 3 대 인접한 정상 조직에서 PD-L1 염색.
도 4: 발견(A-C) 및 검증 코호트(D-F)에 대해, 클로날 신생-항원의 수 및 서브클로날 신생-항원의 분획이 지속적인 임상 효과(DCB)를 갖거나, 지속적인 효과가 없는(NDB) 환자에 대해 도시된다. 더 낮은 수의 신생-항원 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양에 비해 더 높은 수의 신생-항원 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 종양에서의 무진행 생존이 발견(C) 및 검증(F) 코호트에 대해 도시된다. G) 시퀀싱된 각 종양에 대한 클로날 아키텍쳐. PFS는 바플롯 하에 보고되며 진행중인 무진행 생존인 것들은 +로 표시된다. PD-L1은 바플롯 아래에 표시된다: 강함 (+) 50% 막 염색(membranous staining); 약함 (+/-), 1-49% 막 염색; 음성 (-), <1% 막 염색; 알려지지 않음 (?). (H) 더 높은 수의 신생-항원 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 종양을 더 낮은 수의 신생-항원 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양과 비교한 조합된 종양 코호트에서의 무진행 생존. I) CA9903 종양 샘플의 클로날 아키텍쳐, HERC1 돌연변이가 강조표시되고 서브클론이 표시된다. J) CA9903에서 모든 미스센스 돌연변이에 대해 예측된 추정 신생-항원. HERC1P3278S 신생-항원(ASNASSAAK)은 강조표시된다.
도 5: LUAD 생존의 사분위수 파괴. 총 신생-항원 로드(A), 클로날 신생-항원 로드(B), 및 서브클로날 신생-항원 로드(C)에 대해 환자들을 비교한 사분위수 4개 모두를 보여주는 전반적인 생존 곡선. 각 사분위수 사이의 관련된 log-rank p-값은 플롯의 우측에 제공된다.
도 6: LUAD에서 SNV의 수에 의한 생존. (B) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해 높은 SNV 부하를 갖는 종양을 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.01), (C) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해 높은 클로날 SNV 부하를 갖는 종양을 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.014), 및 (D) 코호트의 나머지(n = 86)에 비해 높은 서브클로날 SNV 부하를 갖는 종양을 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.14).
도 7: LUSC(폐 편평 세포 암종) 코호트 개요. (A) TCGA LUSC환자의 총 추정 신생-항원 부하. 컬럼을 채색하여 클로날(청색) 또는 서브클로날(적색) 돌연변이로부터 발생하거나 결정되지 않은(회색) 클론성의 돌연변이로부터 발생한 신생-항원의 비율을 나타낸다. (B) 낮은 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 91)에 비해 높은 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.84), (C) 낮은 클로날 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 92)에 비해 높은 클로날 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 29)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.99), 및 (D) 낮은 서브클로날 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 91)에 비해 높은 서브클로날 신생-항원 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.32). (E) 코호트의 나머지(n = 90)에 비해 높은 SNV 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.52), (F) 코호트의 나머지(n = 91)에 비해 높은 클로날 SNV 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.89), 및 (G) 코호트의 나머지(n = 92)에 비해 높은 서브클로날 SNV 부하를 지닌 환자(n = 30)의 전반적인 생존 곡선(log-rank P = 0.28).
도 8: 차별적인 유전자 발현 분석, 공동발현에 대해 클러스터링된, 높은 클로날 신생-항원 부하 환자 및 코호트의 나머지 사이의 차별적으로 발현된 유전자.
도 9: 환자 L012로부터 종양-침윤 CD8+ T 세포의 면역표현형 A) 종양(다합체-), 정상 조직 및 PBMC에서 종양-침윤 CD8+ CHTF18-반응성(CHTF18+) 및 MYADM-반응성(MYADM+) T 세포 대 MHC-다합체 음성 CD8+ T 세포의 활성화 및 기능적 표현형. CTLA-4, PD-1, LAG-3, Ki-67 및 GzmB를 발현시키는 세포의 백분율이 도시된다. L012, 영역 2 및 모든 종양 영역을 대표하는 결과로부터 히스토그램이 생성된다. B) 종양-침윤 MHC-다합체 음성 CD8+ T 세포(다합체-)에 비해 종양-침윤 CD8+ CHTF18-반응성(CHTF18+) 및 MYADM-반응성(MYADM+) T 세포에 대한 PD-1, Ki67 및 그랜자임 B의 공동-발현. C) 시험관내 증식된 종양-침윤 CD8+ T 세포는 돌연변이체 또는 야생형 펩티드가 로딩된 MHC-다합체로 염색되고, 유세포분석기에 의해 분석되었다. CD3+CD8+ 게이트의 MHC 다합체 양성 세포의 백분율이 도시된다. L011(상부 패널): 종양 영역 1로부터 증식된 CD8+ T 세포는 돌연변이체는 인지하지만 야생형 MTFR2는 인지하지 않는다. L012(중간 패널): 종양 영역 2로부터 증식된 CD8+ T 세포는 돌연변이체는 인지하지만 야생형 CHTF18은 인지하지 않는다. L012(하부 패널): 종양 영역 2로부터 증식된 CD8+ T 세포는 돌연변이체 및 야생형 MYADM 둘 모두를 인지한다. MYADM에서의 돌연변이는 앵커 잔기에 존재하여, HLA 결합에 주요 영향을 미치고 T 세포 인지에는 영향을 미치지 않는다. 상기 데이터는 이 환자의 T 세포가 돌연변이체 및 야생형 펩티드(본 발명자들의 MHC-다합체 시스템에서 안정화될 때) 둘 모두를 인지할 수 있음을 시사하지만, 야생형 펩티드의 매우 낮은 친화도는 생체내에서의 적절한 제시를 방해할 것이다. (D) L011 및 L012로부터 증식된 종양-침윤 림프구에 대한 BV650 및 PE-Cy7 MHC-다합체 결합의 검증. 증식되지 않은 종양 샘플에서 MTFR2-, MYADM- 및 CHTF18-반응성 T 세포를 특성화하기 위해 사용된 시약의 품질을 검증하기 위해, 본 발명자들은 더 많은 수의 증식된 TIL을 염색하는데 동일한 시약을 사용하였다. L011(좌측 패널), 및 L012(우측 패널)로부터의 데이터는 증식된 TIL에서 MTFR2-, MYADM- 및 CHTF18-반응성 T 세포의 명확하고 분명한 집단을 보여준다.
도 10: (A) 발견 및 (B) 검증 코호트 종양의 돌연변이 부하 및 클로날 아키텍쳐.
도 11: 두 종양 그룹에 대한 PD-L1 발현. PD-L1은 낮은 클로날 신생-항원 부하 또는 높은 서브클로날 신생-항원 분획을 지니는 종양에 비해 높은 클로날 신생-항원 부하 및 낮은 서브클로날 신생-항원 분획을 지니는 종양에서 유의하게 더 강력한 발현을 나타낸다.
도 12: A) 지속적인 임상 효과(DCB)를 갖거나, 지속적인 효과가 없는(NDB) 환자로부터의 발견 코호트 종양에서 예측된 클로날 돌연변이의 수. B) DCB 또는 NDB인 환자로부터의 종양에서 서브클로날 분획 C) 더 낮은 수의 클로날 돌연변이 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양에 비해 더 높은 수의 클로날 돌연변이 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 발견 종양에서 무진행 생존. D) DCB이거나 NDB인 환자로부터의 검증 코호트 종양에서 예측된 클로날 돌연변이의 수. E) DCB 또는 NDB인 검증 환자로부터의 종양에서 서브클로날 분획 F) 더 낮은 수의 클로날 돌연변이 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양에 비해 더 높은 수의 클로날 돌연변이 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 검증 종양에서 무진행 생존. G) 바플롯에 표시되는 클로날(어두운 음영) 및 서브클로날(밝은 음영)을 지닌 각 시퀀싱된 종양에 대한 클로날 및 서브클로날 돌연변이의 수. 바는 임상 이익 상태를 나타내기 위해 음영 처리된다: DCB, 녹색; NDB, 적색. PFS는 바플롯 하에 보고되며 진행중인 무진행 생존인 것들은 +로 표시된다. PD-L1은 바플롯 아래에 표시된다: 강함 (+) 50% 막 염색; 약함 (+/-), 1-49% 막 염색; 음성 (-), 1% 막 염색; 알려지지 않음 (?), 평가 불가능. H) 더 높은 수의 클로날 돌연변이 및 낮은 서브클로날 분획을 지닌 종양을 더 낮은 수의 클로날 돌연변이 또는 높은 서브클로날 분획을 지닌 종양과 비교한 조합된 종양 코호트에서의 무진행 생존.
발명의 상세한 설명
"신생-항원"은 암 세포 내부의 돌연변이의 결과로서 발생하는 종양-특이적 항원이다. 따라서, 신생-항원은 대상체의 건강한 세포에 의해서는 발현되지 않는다.
본원에 기재된 신생-항원은 야생형의 건강한 세포에 의해 발현된 비-돌연변이된 단백질과 비교하여 암 세포에 의해 발현된 단백질을 변경시키는 임의의 비-침묵 돌연변이에 의해 초래될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 단백질은 전위 또는 융합 단백질일 수 있다.
"돌연변이"는 동일한 개체로부터의 건강한 세포와 비교하여 종양 세포에서 뉴클레오티드 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 차이를 나타낸다. 뉴클레오티드 서열의 차이는 동일한 개체로부터의 건강한 세포에 의해 발현되지 않는 단백질의 발현을 발생시킬 수 있다.
예를 들어, 돌연변이는 아미노산 서열에서의 변화(코딩 돌연변이)를 초래하는 단일 뉴클레오티드 변이(SNV), 다중 뉴클레오티드 변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 전위, 미스센스 돌연변이 또는 스플라이스 부위 돌연변이일 수 있다.
돌연변이는 엑솜 시퀀싱, RNA-seq, 전체 게놈 시퀀싱 및/또는 표적화된 유전자 패널 시퀀싱 및 또는 단일 유전자의 전형적인 Sanger 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다. 적합한 방법은 당 분야에 공지되어 있다.
엑솜 시퀀싱 및 RNA-seq의 설명은 각각 문헌[Boa et al. (Cancer Informatics. 2014;13(Suppl 2):67-82.) 및 문헌[Ares et al. (Cold Spring Harb Protoc. 2014 Nov 3;2014(11):1139-48)]에서 제공된다. 표적화된 유전자 패널 시퀀싱의 설명은, 예를 들어, 문헌[Kammermeier et al. (J Med Genet. 2014 Nov; 51(11):748-55) and Yap KL et al. (Clin Cancer Res. 2014. 20:6605)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 문헌[Meyerson et al., Nat. Rev. Genetics, 2010 and Mardis, Annu Rev Anal Chem, 2013]을 참조하라. 표적화된 유전자 시퀀싱 패널이 또한 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, Biocompare((http://www.biocompare.com/ Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting-Tools/)에 요약된 바와 같음).
비-종양 샘플로부터의 DNA 및/또는 RNA와 비교하여 종양 샘플로부터의 DNA 및/또는 RNA에서 뉴클레오티드 차이(예를 들어, SNV)를 확인하기 위한 서열 정렬은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 기준 샘플과 비교한 뉴클레오티드 차이는 문헌[Koboldt et al. (Genome Res.; 2012; 22: 568-576)]에 기술된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 기준 샘플은 생식세포(germline) DNA 및/또는 RNA 서열일 수 있다.
클로날(clonal) 신생-항원
본 발명자들은 종양내 이종성(ITH)이 종양의 상이한 영역에서 발현된 신생-항원들 사이 그리고 종양 내 상이한 세포들 사이에 변이를 초래할 수 있다고 판단하였다. 특히, 본 발명자들은 종양 내에서, 특정 신생-항원이 모든 영역 및 본질적으로 모든 종양 세포에서 발현되는 반면, 다른 신생-항원은 단지 종양 영역 및 세포의 서브세트에서만 발현된다고 판단하였다.
이와 같이, "클로날" 또는 "중심성(truncal)" 신생-항원은 종양 전반에 걸쳐 효과적으로 발현되고 본질적으로 모든 종양 세포 내에서 인코딩되는 신생-항원이다. "서브-클로날" 또는 "분지된" 신생-항원은 종양 내 세포 또는 영역의 서브세트 또는 일부에서 발현되는 신생-항원이다.
"본질적으로 모든"이라는 본원에서의 언급은 대상체에서 대다수의 종양 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 이는 대상체에서 세포의 60-100%, 예를 들어, 종양 세포의 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%를 포함할 수 있다.
"종양 전반에 걸쳐 존재하는", "종양 전반에 걸쳐 효과적으로 발현되는" 및 "본질적으로 모든 종양 세포내에서 인코딩되는"이라 함은 샘플을 분석하는 종양의 모든 영역에서 클로날 신생-항원이 발현됨을 의미할 수 있다.
돌연변이가 "본질적으로 모든 종양 세포 내에서 인코딩된다"라고 하는 판단은 통계적 계산을 나타내며, 따라서 통계적 분석 및 임계값에 종속됨이 이해될 것이다.
마찬가지로, 클로날 신생-항원이 "종양 전반에 걸쳐 효과적으로 발현된다"라고 하는 판단은 통계적 계산을 나타내며, 따라서 통계적 분석 및 임계값에 종속된다.
"본질적으로 전체 종양 세포 또는 본질적으로 모든 종양 세포에서 효과적으로 발현된다"는 것은 적절한 통계적 방법을 사용하여 결정하는 경우, 돌연변이가 샘플에서 분석된 모든 종양 세포에 존재함을 의미할 수 있다.
예를 들어, 돌연변이를 갖는 암 세포의 비율을 기술하는 암 세포 분획(CCF)은 돌연변이가 클로날인지 또는 분지인지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 암 세포 분획은 문헌[Landau et al. (Cell. 2013 Feb 14;152(4):714-26)]에 기술된 바와 같이 변이 대립유전자 빈도와 복사체 수 및 순도 추정치를 통합함으로써 결정될 수 있다.
간단하게는, CCF 값은 분석된 각 종양 영역 및 모든 종양 영역 내에서 확인된 모든 돌연변이에 대해 계산된다. 단 하나의 영역(즉, 단지 단일 샘플)이 사용되는 경우, 단 한 세트의 CCF 값이 수득될 것이다. 이는 어떤 돌연변이가 그러한 종양 영역 내의 모든 종양 세포에 존재하는지에 대한 정보를 제공할 것이며, 이에 따라 돌연변이가 클로날인지 또는 분지인지에 대한 지표를 제공할 것이다. 종양 영역의 모든 서브클로날 돌연변이(즉, CCF<1)는 분지된 것으로서 결정되는 반면, CCF=1의 클로날 돌연변이는 클로날인 것으로 결정된다.
언급된 바와 같이, 클로날 돌연변이를 결정하는 것은 통계적 분석 및 임계값에 종속된다. 이와 같이, 돌연변이는 CCF 95% 신뢰 구간 >= 0.60, 예를 들어, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00 또는 >1.00을 갖는 것으로 결정되는 경우, 클로날로서 확인될 수 있다. 반대로, 돌연변이는 임의의 분석된 샘플에서 CCF 95% 신뢰 구간 <= 0.60, 예를 들어 0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25, 0.20, 0.15, 0.10. 0.05 또는 0.01을 갖는 것으로 결정되는 경우, 분지된 것으로 확인될 수 있다.
클로날 돌연변이를 확인하는 방법의 정확성은 종양으로부터 분리된 하나 초과의 샘플에 대한 클로날 돌연변이를 확인함으로써 증가됨이 이해될 것이다.
종양 샘플
종양으로부터 샘플 및 생검의 분리는 당 분야에서 통상적인 관례이며, 임의의 적합한 방법에 따라 수행될 수 있고, 그러한 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
본 양태의 방법은, 예를 들어, 종양으로부터 분리된 하나 이상의 종양 영역으로부터 암 세포에 존재하는 돌연변이를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양으로부터 분리된 단일 생검, 또는 대안적으로, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 그 초과의 생검에 존재하는 돌연변이가 결정될 수 있다.
개개 종양 샘플은 원발성 부위 내 또는 원발성 및 전이부 사이 또는 전이부 내부 또는 전이부 사이의 종양을 통틀어 위치한 상이한 영역으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 상이한 영역에서 형태학적으로 이질적인 조직학을 나타내는 것으로 공지된 종양에 존재하는 돌연변이를 결정하는 것은 형태학적으로 이질적인 영역으로부터 분리된 수많은 개개 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은 순환하는 종양 DNA, 순환하는 종양 세포 또는 종양 DNA를 포함하는 엑소솜을 포함할 수 있다.
치료에 적합한 대상체
본 발명은 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 클로날 신생-항원의 수를 결정하는 것을 포함하고, 높은 수의 클로날 신생-항원은 면역 체크포인트 간섭제에 대한 반응을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "치료에 적합한"이라 함은 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 반응할 가능성이 높거나, 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료의 후보인 대상체를 나타낼 수 있다. 치료에 적합한 대상체는 본 발명을 사용하여 적합하지 않다고 판단된 대상체보다 상기 치료에 반응할 가능성이 더 높을 수 있다. 본 발명에 따른 치료에 적합하다고 판단된 대상체는 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 반응하여 적어도 6개월 동안 지속되는 부분 반응 또는 안정한 질병으로 정의될 수 있는 지속적인 임상 효과(DCB)를 입증할 수 있다.
대상체로부터 수득된 암 세포에서 확인되거나 예측된 클로날 신생-항원의 수를 하나 이상의 소정의 임계값과 비교할 수 있다. 그러한 임계값을 이용하여, 대상체는 치료에 대한 반응의 정도를 나타내는 범주로 계층화될 수 있다.
임계값은 암 환자의 기준 코호트와 관련하여 결정될 수 있다. 코호트는 10명, 25명, 50명, 75명, 100명, 150명, 200명, 250명, 500명 이상의 암 환자를 포함할 수 있다. 코호트는 임의의 암 코호트일 수 있다. 대안적으로 환자는 모두 해당 대상체의 관련 또는 특정 암 유형을 가질 수 있다.
한 구체예에서, "높은" 수의 클로날 신생-항원은 기준 코호트의 상위 사분위수에서 예측되는 클로날 신생-항원의 최소 숫자와 같이, 암 환자의 기준 코호트에서 예측되는 클로날 신생-항원의 중간 숫자보다 큰 수를 의미한다.
또 다른 구체예에서, "높은" 수의 클로날 신생-항원은 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상의 클로날 신생-항원으로서 정의될 수 있다.
당업자는 클로날 신생 항원의 "높은" 또는 "더 높은" 수에 대한 언급이 문맥에 따라 다를 수 있으며, 이에 따라 적절한 분석을 수행할 수 있었음을 이해할 것이다.
본 발명은 추가로 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 초과의 암 세포 대상체에서 클로날:서브-클로날 신생-항원의 비 및/또는 서브-클로날 신생-항원 분획을 결정하는 것을 포함하고, 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원 또는 더 낮은/낮은 서브-클로날 신생-항원 분획은 면역 체크포인트 간섭제에 대한 반응을 표시한다.
상기와 같이, 클로날:서브-클로날 비는 어떤 암 또는 관련/특정 암을 지닌 대상체의 코호트의 맥락 내에 있을 수 있다. 따라서, 클로날:서브-클로날 신생-항원 비는 상기 논의된 방법을 기준 코호트에 적용함에 의해 결정될 수 있다. 따라서 "높은" 또는 "더 높은" 클로날:서브-클로날 비는 기준 코호트의 상위 사분위수에서 예측되는 최소 클로날:서브-클로날 비와 같이, 암 환자의 기준 코호트에서 예측되는 중간 클로날:서브-클로날 비보다 큰 수에 상응할 수 있다.
또 다른 구체예에서, "높은" 또는 "더 높은" 클로날:서브-클로날 비는 적어도 3:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 50:1, 75:1 또는 100:1의 비와 같은 3:1 내지 100:1 범위의 비를 의미한다. 당업자는 값들이 해당 코호트에 의존할 수 있음을 이해할 것이다.
서브클로날 신생-항원의 분획은 또한 상기 논의된 대로 기준 코호트와 관련하여 정의될 수 있다. 예를 들어, 서브클로날 신생-항원의 "더 낮은" 또는 "낮은" 분획은 코호트의 하위 사분위수에서 예측되는 최대 수와 같이, 암 환자의 기준 코호트에서 예측되는 서브클로날 신생-항원의 중간 분획보다 작은 분획에 상응할 수 있다.
대안적으로, 당업자는 서브-클로날 신생-항원 분획이 서브클로날 신생-항원의 수(예를 들어, 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 예측됨)를 총 신생 항원의 수(예를 들어, 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 예측됨)로 나눔에 의해 결정될 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, 각 환자에 대해).
한 구체예에서, 서브클로날 신생-항원의 "더 낮은" 또는 "낮은" 분획은 20, 15, 10, 5, 3, 2 또는 1% 이하의 분획과 같은 25% 이하의 분획을 의미할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 방법은 클로날 신생-항원의 수 및 클로날:서브-클로날 신생-항원의 비 또는 서브-클로날 신생-항원의 분획 둘 모두를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 실시예에 제시된 대로, 신생 항원 부하 및 신생-항원 서브-클로날 분획 둘 모두의 측정을 조합하여, 어느 한 단독 측정에 비해 양호한 펨브롤리주맙(pembrolizumab)에 대한 민감도를 예측할 수 있었고(도 4C 참조), 결과는 거의 모든 경우에 예측될 수 있었다(도 4G-H).
이에 따라 본 발명은 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(i) 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 클로날 신생-항원의 수를 결정하는 단계; 및
(ii) 상기 대상체로부터의 하나 초과의 암 세포에서 클로날:서브-클로날 신생-항원의 비 및/또는 서브-클로날 신생-항원 분획을 결정하는 단계를 포함하고,
더 높은 수의 클로날 신생-항원 및 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획은 면역 체크포인트 간섭제에 대한 반응을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은, 놀랍게도, 높은 수의 클로날 신생-항원을 갖는 종양 세포가 면역 체크포인트 분자의 유사한 발현 프로파일을 나타내고, 다시 말해 이들이 면역 체크포인트 분자의 공통적인 발현 프로파일을 나타내는 것을 발견하였다. 이와 같이, 비-암성 세포에 비해 발현이 증가하거나 감소된 특정 면역 체크포인트 분자를 확인하기 위한 접근법은 또한 체크포인트 봉쇄 요법에 반응할 가능성이 있는 환자를 확인하는데 사용될 수 있다.
따라서, 한 양태에서 본 발명은 면역 체크포인트 간섭제에 반응할 가능성이 높은 암을 지닌 대상체를 확인하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체로부터의 암 세포에서 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일, 또는 종양 유형을 결정하는 것을 포함한다.
한 양태에서 상기 방법은 종양에서 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일을, 예를 들어, 적합한 기준 샘플과 비교하여, 예를 들어, 차별적으로 발현된 유전자를 확인함에 의해, 결정하는 것을 포함한다. 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현과 관련하여 기준 샘플은 비-암성 세포 또는 종양, (예를 들어, 낮은 클로날 신생-항원 부하를 지님) 또는 말초혈 림프구일 수 있다.
예를 들어, 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일은,
(i) 종양으로부터 분리된 샘플의 RNA 서열을 결정하고/하거나
(ii)
전사체-범위(transcriptome-wide) 차별적인 유전자 발현 분석을 수행하여 면역 체크포인트-관련 유전자의 차별적인 발현을 확인함에 의해(예를 들어, p<0.05로 조정됨) 결정될 수 있다. 예를 들어, 동일한 환자 또는 표준 참조로부터의 비-암 세포 데이터를 비교로서 이용할 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하여, 특정 암 유형에서 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일을 결정하는 방법을 추가로 제공한다:
(i) 관심 암을 지닌 환자의 코호트에 대한 암 유전체 지도(TCGA) 데이터 포털로부터 RNA-시퀀싱 데이터를 수득하는 단계;
(ii) 각 환자로부터 Level_3 유전자-수준 데이터를 수득하는 단계;
(iii) 분석을 위해 원시 판독 카운트(raw read count)를 패키지 DESeq2에 입력하는 단계; 및
(iv) 전사체-범위 차별적인 유전자 발현 분석을 수행하여 유의하게 차별적으로 발현된(p < 0.05로 조정됨) 면역 체크포인트-관련 유전자를 확인하는 단계.
따라서 본 발명은 면역 체크포인트 간섭제에 반응할 가능성이 높은 암을 지닌 대상체를 확인하는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 대상체로부터의 암 세포에서, 상기 방법을 이용하여 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일 또는 종양 유형을 결정하는 것을 포함한다.
바람직한 양태에서, 높은 클로날 신생-항원 부하 및 낮은 클로날 신생-항원 부하를 지닌 종양들 사이의 차별적으로 발현된 유전자가 확인된다(예를 들어, 도 1E 참조). 따라서, 클로날 신생-항원의 수에 관한 정보는 유익하고 두 접근법의 조합을 용이하게 하며, 즉, 높은 수의 클로날 신생-항원을 지닌 대상체/종양을 확인하고 표적화며, 높은 수준의 클로날 신생-항원을 지닌 대상체/종양에서 면역 체크포인트 분자의 유전자 발현을 추가로 조사하는 것을 용이하게 한다. 이는 "두-갈래(double-pronged)" 치료 공격을 촉진한다.
한 양태에서, 상기 차별적인 면역 발현은 적합한 기준 샘플과 비교하여 억제 수용체 또는 공동자극 수용체인 면역 체크포인트 분자의 상향조절 또는 높은 발현이며, 그러한 상향조절 또는 높은 발현은 상향조절되었거나 높은 발현을 보인 면역 체크포인트 분자를 표적화하는 면역 체크포인트 간섭제에 대한 반응을 나타낸다.
유전자 발현 프로파일은, 예를 들어, 본 실시예 1에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1 및/또는 LAG-3이다. 특히 바람직한 구체예에서, 대상체는 폐암, 바람직하게는 비소세포폐암을 갖는다.
대안적인 구체예에서, 면역 체크포인트 분자는 CTLA4이다.
바람직한 구체예에서, 암은 폐암 또는 흑색종, 바람직하게는 비소세포폐암 또는 흑색종이다.
이 방법은 또한 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 반응할 가능성이 있는 암을 지닌 대상체를 확인하기 위해 전술한 방법과 함께 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(i) 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 클로날 신생-항원의 수를 결정하는 단계; 및
(ii) 상기 대상체로부터의 암 세포 및/또는 종양 침윤 면역 세포에서 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일 또는 종양 유형을 결정하는 단계를 포함하며,
더 높은 수의 클로날 신생-항원 및 기준 샘플에 비해 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현은 면역 체크포인트 간섭제에 대한 반응을 나타낸다.
예측 방법
본 발명자들은 더 높은 수의 클로날 신생-항원, 및/또는 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원 또는 낮은 서브-클로날 신생-항원 분획를 지닌 암 환자가 걔선된 예후를 가진다는 중요하고도 놀라운 결정을 내렸다.
당업자는, 예를 들어, 대상체의 코호트 내에서 또는 다수의 상이한 대상체 또는 코호트를 이용하여 확인된 범위 내에서, 높은 또는 더 높은 수의 클로날 신생-항원을 지닌 대상체가 더 낮은 수의 클로날 신생-항원을 지닌 대상체보다 개선된 생존력을 가질 수 있음을 본 발명의 맥락에서 이해할 것이다.
클로날 신생-항원의 수에 대한 기준 값은 다음 방법을 이용하여 결정될 수 있었고, "높은 수" 또는 "더 높은 수"는 그 이상의 어떤 값이다.
상기 방법은 암 대상체의 코호트에서 예측되는 클로날 신생-항원의 수를 결정하고,
(i) 그 코호트에서 예측되는 클로날 신생-항원의 중간 숫자를 결정하거나(이 때 중간 숫자는 기준 값이다);
(ii) 그 코호트의 상위 사분위수에 있을 것으로 예측되는 클로날 신생-항원의 최소 숫자를 결정하는 것을 포함할 수 있다(이 때 최소 숫자는 기준 값이다)(예를 들어, 본 실시예의 TCGA 데이터 분석을 참조하라).
그러한 "중간 숫자" 또는 "상위 사분위수에 있는 최소 숫자"는 임의의 암 코호트 그 자체, 또는 대안적으로 관련/특정 암 유형에서 결정될 수 있었다.
대안적으로, "높은" 또는 "더 높은" 수의 클로날 신생-항원은 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 이상의 클로날 신생-항원으로서 정의될 수 있다.
당업자는 클로날 신생 항원의 "높은" 또는 "더 높은" 수에 대한 언급이 문맥에 따라 다를 수 있으며, 이에 따라 적절한 분석을 수행할 수 있었음을 이해할 것이다.
이와 같이, 본 발명은 또한 암을 지닌 대상체의 예후를 예측하거나 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 클로날 신생-항원의 수를 결정하는 것을 포함하고, 예를 들어, 상기 논의된 코호트와 비교하여, 클로날 신생-항원의 더 높은 수는 개선된 예후를 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 암은 폐암 또는 흑색종, 바람직하게는 비소세포폐암 또는 흑색종이다.
대안적인 구체예에서, 본 발명은 암을 지닌 대상체의 예후를 예측하거나 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 대상체로부터의 하나 초과의 암 세포에서 클로날:서브-클로날 비 및/또는 서브-클로날 신생-항원 분획을 결정하는 것을 포함하고, 예를 들어, 상기 논의된 코호트와 비교하여, 더 높은 클로날:서브-클로날 비 및/또는 더 낮은/낮은 서브-클로날 신생-항원 분획은 개선된 예후를 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 암은 흑색종 또는 폐암, 바람직하게는 흑색종 또는 비소세포폐암이다.
암의 치료
본 발명은 또한 대상체의 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) 본 발명의 방법에 따라 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 단계; 및
ii) 상기 대상체를 면역 체크포인트 간섭제에 의해 치료하는 단계.
본원에서 정의된 바와 같은 "치료"는 치료되기 전의 증상과 비교하여 치료되는 질환, 장애 또는 감염의 하나 이상의 증상을 감소, 경감 또는 제거하는 것을 의미한다.
"예방"(또는 예방(prophylaxis))은 질환, 장애 또는 감염의 증상 개시를 지연 또는 예방하는 것을 나타낸다. 예방은 완벽할 수 있거나(질병이 발생하지 않도록) 일부 개체 또는 제한된 양의 시간 동안만 효과적일 수 있다.
용어 "면역 체크포인트 간섭제"는 면역 체크포인트 분자와 상호작용하거나 조절하는 임의의 치료를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 면역 체크포인트 간섭제는 또한 "체크포인트 봉쇄 요법", "체크포인트 조절제" 또는 "체크포인트 억제제"로서 본원에서 언급될 수 있다.
"억제제"는 이들 경로에 의한 T 세포 활성의 억제를 막는 임의의 수단을 의미한다. 이것은 수용체 리간드 상호작용을 차단하는 항체 또는 분자, 세포내 신호전달 경로의 억제제, 및 T 세포 표면에서 면역 체크포인트 분자의 발현을 막는 화합물에 의해 달성될 수 있다.
체크포인트 억제제는, 예를 들어, CTLA-4 억제제, PD-1 억제제, PD-L1 억제제, Lag-3 억제제, Tim-3 억제제, TIGIT 억제제 및 BTLA 억제제를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 공동-자극성 항체는 비제한적으로 ICOS, CD137, CD27 OX-40 및 GITR을 포함하는 면역-조절 수용체를 통해 양성 신호를 전달한다.
적합한 면역 체크포인트 간섭제의 예는 펨브롤리주맙, 니볼루맙(nivolumab), 아테졸리주맙(atezolizumab) 및 이필리무맙(ipilimumab)을 포함한다.
실시예 1에 제시된 대로(도 5 및 7 참조), 높은 수의 클로날 신생-항원을 지닌 폐 종양은 높은 수준의 PD-1 및 Lag-3을 발현시키고, 일관되게, 폐암 대상체의 클로날 신생-항원에 반응성인 T 세포는 또한 높은 수준의 PD-1 및 LAG-3을 발현시킨다. 높은 클로날 신생-항원 부하 대 낮은 클로날 부하를 갖는 종양에서 PD-1 및 Lag-3의 공동-발현은 두 경로 모두의 동시 표적화가 최대 이익을 발생시킬 수 있음을 시사한다.
따라서, 한 양태에서 본 발명은, 예를 들어, 폐암에서, 각각의 경로를 표적으로 하는 억제제를 공동-투여하거나 둘 모두의 경로를 표적으로 하는 단일 시약의 투여에 의해 PD-1 및 Lag-3 경로의 공동-표적화에 관한 것이다. 후자의 예로서, 이중특이적 항체는 PD-1 및 Lag-3, 또는 PD-L1 및 Lag-3에 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니피그이지만, 가장 바람직하게는 대상체는 인간이다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 암의 치료 또는 예방 방법은 상기 치료 또는 요법을 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 포함한다.
암은, 예를 들어, 방광암, 위암, 식도암, 유방암, 결장직장암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 신장암(신장 세포), 폐암(소세포, 비소세포 및 중피종), 뇌암(예를 들어, 신경아교종, 별아교세포종, 아교모세포종), 흑색종, 림프종, 소장암(십이지장 및 공장), 백혈병, 췌장암, 간담도 종양, 생식세포암, 전립선암, 두경부암, 갑상선암 및 육종으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 암은 폐암이다. 특히 바람직한 구체예에서, 폐암은 비소세포폐암이다.
본 발명의 한 구체예에서, 암은 흑색종이다.
본 발명의 한 양태에서, 대상체는 침습 전의(pre-invasive) 질환을 갖거나, 본 발명에 의해 제공되는 바와 같이, 보조 요법을 필요로 하거나 이로부터 혜택을 받을 수 있는 이들의 주요 질병이 절제된 대상체이다.
본 발명의 방법을 이용한 치료는 또한 순환하는 종양 세포 및/또는 종양으로부터 유래된 전이를 표적화하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 암을 치료하기 위한 방법 및 용도는 추가의 암 치료와 함께 수행될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 면역 체크포인트 간섭제는 공동-자극성 항체, 화학요법 및/또는 방사선요법, 표적화 요법 또는 모노클로날 항체 요법과 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 이제 본 발명을 수행함에 있어서 당업자를 돕기 위해 제공하고자 하는 실시예에 의해 추가로 기술될 것이고, 이는 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
실시예 1
NSCLC ITH의 맥락에서 신생-항원 및 면역조절의 임상적 관련성, 및 신생-항원-반응성 종양-침윤 T 세포의 정체를 조사하였다.
물질 및 방법
환자 코호트의 설명
시퀀싱을 위한 샘플(L011 및 L012)은 화학요법 또는 방사선요법과 같은 임의의 형태의 보조 요법을 받기 전에 최종 외과적 절제술을 받은 비소세포폐암(NSCLC)으로 진단된 환자로부터 수득하였다. 게놈 시퀀싱을 수락한다는 사전 동의를 얻었다. 두 샘플은 모두 University College London Hospital, London(UCLHRTB 10/H1306/42)로부터 수집하여 조직학적 아형을 확립하기 위한 병리학적 검토를 받았다: 한 종양은 CK7+/TTF1+ 샘암종(L011)으로 분류되었고 한 종양(L012)은 편평 세포 암종 조직학으로 분류되었다. 상세한 임상 특징은 표 S1에 제공된다.
단계 IV NSCLC의 환자 코호트를 반영한 (1)로부터 수득된 샘플, 및 종양 처리를 포함하는 이 환자 코호트의 자세한 설명은 (1)의 보충 자료에서 찾아볼 수 있다. 이 코호트의 상세한 임상 특징은 표 S3에 제공된다.
임상 효능 분석
임상 효능 분석은 (1)에서와 같이 수행되었다. 간단히 말해, 펨브롤리주맙에 대한 객관적인 반응은 연구 방사선학자에 의해 조사자-평가된 면역관련 반응 기준(irRC)에 의해 평가되었다. 프로토콜에 개요된 대로, CT 스캔은 9주마다 수행되었다. 부분적 및 완전 반응은 초기 반응 확인 후 최소 4주 후에 발생하는 반복 영상화에 의해 확인되었다; 확인되지 않은 반응은 2차 CT 스캔의 결과에 따라 안정성 또는 진행성 질병으로 간주되었다. 지속적인 임상 효과(DCB)는 6개월 넘게 지속되는 안정성 질환 또는 부분적 반응으로 정의되었다(27주, 세 번째 프로토콜-예약된 반응 평가 시간). 지속적인 효과 없음(NDB)은 치료 시작 후 6개월 이내에 질환의 진행으로서 정의되었다. 연구 요법에 대한 계속 진행중인 반응이 있는 환자의 경우, 가장 최근의 영상화 평가 일에 무진행 생존(progression-free survival)이 검열되었다. 살아있는 환자의 경우, 전반적인 생존은 마지막으로 알려진 접촉 일에 검열되었다. 각 환자에 대한 응답에 관한 세부사항은 표 S2에서 확인할 수 있다.
TCGA 엑솜 데이터 세트
돌연변이 호출(mutation call) 및 아래 설명된 HLA 형결정을 지닌 종양 샘플을 폐 샘암종(LUAD, n = 124) 및 폐 편평 세포 암종(LUSC, n = 124)의 코호트에 대한 암 유전체 지도(TCGA)로부터 수득하였다. SNV 데이터를 LUAD 및 LUSC TCGA 코호트에 대해 TumourPortal (2)로부터 수득하였다 (http://www.tumourportal.org/tumour_types? ttype=LUAD | LUSC). 한 LUAD 환자인 TCGA-05-4396은 주로 C[C>G]G 맥락에서, 7000개가 넘는 낮은 품질의 호출된 돌연변이로 인해 제외되었다. LUSC 환자인 TCGA-18-3409는 LUSC 종양의 특징이 없는, 강력한 UV 사인을 지니므로 제외되었다.
종양 처리
둘 모두의 L011 및 L012에 대해 단일 종양 덩어리로부터 1cm 간격으로 분리된 4개의 원발 종양 영역 및 인접한 정상 조직을 병리학자에 의해 선택하고, 사진 촬영에 의해 문서화하고, 급속 동결시켰다. L011의 뇌 전이에서, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 의해 결정된 4개의 종양 영역을 포르말린-고정되고, 파라핀-임베딩된(FFPE) 조직 블록의 형태로 병리학자에 의해 선택하였다. 모든 환자로부터 수술시에 말초혈을 수집하여 급속 동결시켰다. 약 5x5x5mm의 급속 동결된 종양 조직 및 500μl의 혈액을 DNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 게놈 DNA 추출에 사용하였다. FFPE 조직의 경우, 수동 블레이드 거시절단법(macrodissection)을 이용하여 10-40μm의 염색되지 않은 슬라이드로부터 조직의 종양-풍부 부위를 제거하고, DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen)를 이용하여 이로부터 DNA를 추출하고, DNA를 Qubit(Invitrogen)에 의해 정량하고, 아가로스 젤 전기영동에 의해 DNA 무결성을 검사하였다. 검증 및 발견 코호트의 처리에 관한 세부사항은 (1)의 보충 자료에서 찾아볼 수 있다.
다중-영역 전체-엑솜 시퀀싱 및 변이체 호출
L012
환자 L012로부터의 각 종양 영역 및 매칭된 생식세포에 대해, 엑솜 포집을 Illumina Nextera 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라(Illumina) 1-2 ㎍ DNA 상에서 수행하였다. 샘플은 이전에 설명한 바와 같이(3, 4) LRI의 고급 시퀀싱 설비에서 Illumina HiSeq 2500 상에서 시퀀싱된 페어드-엔드 멀티플렉스(paired-end multiplex)였다. 각 포집된 라이브러리를 Illumina 플랫폼 상에 로딩시키고 요망되는 평균 시퀀싱 깊이(엑솜 전면 평균 = 392.75)로 페어드-엔드 시퀀싱하였다. Illumina 파이프라인에서 생성된 FastQ 포맷의 원시 페어드 엔드 리드(raw paired end reads)(100bp)를 bwa mem(bwa-0.7.7)(6)을 이용하여, GATK 번들 2.8(5)로부터 수득된 전체 hg19 게놈 어셈블리(알려지지 않은 콘틱 포함)에 정렬시켰다. Picard 도구 v1.107을 이용하여 동일한 환자 영역으로부터의 파일을 정리, 분류 및 병합하고 중복 리드를 제거하였다(http://broadinstitute.github.io/picard). Picard 도구(1.107), GATK(2.8.1) 및 FastQC(0.10.1)의 조합을 사용하여 품질 관리 메트릭스를 수득하였다(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
SAMtools mpileup(0.1.16)(7)을 이용하여 종양 및 생식세포 샘플에서 비-참조 위치를 찾았다. <20의 phred 점수를 갖는 염기 또는 <20의 맵핑-품질을 갖는 리드를 건너 뛰었다. BAQ 계산은 불가능하였고, 다운그레이딩 맵핑 품질에 대한 계수는 50으로 설정되었다. 종양 및 매칭된 생식세포 사이의 체세포 변이체는 SAMtools mpileup로부터의 결과를 활용하여 VarScan2 somatic(v2.3.6)(8)를 사용하여 결정하였다. 디폴트 파라미터는 10으로 설정된 생식세포 샘플의 최소 커버리지를 제외하고 이용되었고, 최소 변이 빈도는 0.01로 변경되었고, 종양 순도는 0.5로 설정되었다. VarScan2 processSomatic은 체세포 변이체를 추출하는데 사용되었다. 생성된 SNV 호출은 먼저 bam-readcount(0.5.1)를 통해 데이터를 실행시키는, Varscan2와 연결된 fpfilter.pl 스크립트를 사용하여 위양성에 대해 필터링되었다. VarScan2 processSomatic에 의해 '높은 신뢰도'로 분류된 INDEL 호출만이 추가 분석을 위해 보관되었다.
IGV(Integrated Genomics Viewers)(9)를 사용하여 모든 변이체를 수동으로 검토하고, Illumina 특정 오류 프로파일(10)을 보여주는 것들을 제거하였다. 남아 있는 변이체를 Ion Torrent PGM 시퀀서(Life Technologies) 상에서 1513의 중간 깊이로 시퀀싱하였다. 이를 위해 Ion AmpliSeqTM 커스텀 패널(Life Technologies)을 온라인 디자이너(www.ampliseq.com)를 이용하여 설계하였다. 멀티플렉스 PCR을 각 영역으로부터의 DNA에서 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 바코딩된 시퀀싱 라이브러리는 TM 작제되었고, 이것은 Ion Torrent PGM 시퀀서(Life Technologies) 상에서 200 bp의 판독 길이로 시퀀싱되었다. IonTorrent TorrentSuiteTM 소프트웨어를 사용하여 hg19 게놈으로부터의 표적 영역에 대한 서열 정렬을 수행하였다. 적어도 하나의 영역에서 커버리지가 50인 변이체가 선택되었다. 변이체 빈도가 SNV의 경우 ≥ 0.01이고 INDELS의 경우 ≥ 0.02인 경우 변이체는 한 영역에 존재하는 것으로 간주되었다. 다시 IGV에서 수동 검토가 수행되었고, 이 단계를 통과한 변이체를 이후 분석에 사용하였다. 모든 변이체는 ANNOVAR(11)을 사용하여 주석을 달았고 잠재적인 드라이버 돌연변이는 (12)에서 설명된 대로 정의되었다.
L011
생식세포 및 원발 종양 영역의 시퀀싱 및 분석은 이전에 (13)에서 설명되었다. 전이 영역의 시퀀싱은 (13)에 설명된 프로토콜에 따라 BGI Tech에 의해 수행되었다. 전이 영역의 계산 처리는 상기 L012에 설명된 방법을 사용하여 수행되었고, 샘플 전면의 평균 중간 깊이는 93.7이다. 비-침묵 변이체는 L012와 마찬가지로 IGV를 사용하여 수동으로 검토되었다.
Rizvi 데이터로부터 변이체 호출
(i) 발견 코호트를 나타내는 16개 샘플 및 검증 코호트를 나타내는 18개 샘플로부터 생식세포 및 종양 영역 둘 모두를 나타내는 BAM 파일(Rizvi 데이터)을 수득하고, picard 도구(1.107) SamToFastq 정렬을 사용하여 FASTQ 포맷으로 변환시키고, 변이체 호출을 상기 L012에 대해 설명한 대로 수행하였다.
클로날 분석
TCGA 샘플의 경우, 각 돌연변이의 클로날 상태는 종래 기재된 대로(14) 야생형 및 돌연변이 대립유전자 카운트, 절대적 주요 및 부수 복사체 수, 및 종양 순도 추정치를 통합시킴에 의해 추정되었다. L011 및 L012의 경우 각 돌연변이의 클로날 상태는 다중영역 시퀀싱 분석에 기반하여 추정되었다. 간단히 말해, 각 돌연변이는 종양 내 시퀀싱된 각각의 및 모든 종양 영역에서 확인되고 존재하는 경우 클로날로 분류되었다. 반대로, 모든 종양 영역에 보편적으로 존재하지 않는 임의의 돌연변이는 서브클로날로 분류되었다.
(1)로부터 수득된 데이터를 포함하는 발견 및 검증 코호트 종양의 경우, 각 돌연변이의 암세포 분획은 국소 복사체 수(ASCAT로부터 얻음, 하기 참조), 종양 순도(역시 ASCAT로부터 얻음), 및 변이체 대립유전자 빈도를 통합시킴에 의해 추정되었다. 간단히 말해, 주어진 돌연변이에 대해, 본 발명자들은 먼저 관찰된 돌연변이 복사체 수, nmut를 계산하였는데, 이는 다음 식을 사용하여 주어진 돌연변이에 그 유전자좌에서의 염색체 복사체의 수를 곱한 종양 세포의 분획을 설명하였다:
상기 식에서, VAF는 돌연변이된 염기에서의 변이체 대립유전자 빈도에 상응하고, p, CN t , CN n 은 각각 종양 순도, 종양 유전좌자 특이적 복사체 수, 및 정상 유전자좌 특이적 복사체 수이다. 이후 본 발명자들은 예상된 돌연변이 복사체 수, n chr 을 VAF를 이용하여 계산하고, 돌연변이를 최대 가능도를 사용하여 가능한 복사체 수 중 하나에 할당하였다. 본 발명자들은 또한 적용 가능한 경우 돌연변이 복사체 수가 서브클로날 복사체 수에 의해 양호하게 설명될 수 있었는지를 평가하였다. 궁극적으로, 이것은 본 발명자들로 하여금 복사체 수 및 종양 순도 둘 모두에 대해 수정된, 모든 돌연변이에 대해 변형된 변이체 및 참조 카운트를 수득할 수 있게 하였다. 이후 모든 돌연변이를 PyClone Dirichlet 프로세스 클러스터링(15)을 사용하여 클러스터링하였다. 복사체 수와 순도가 이미 수정되었다면, 본 발명자들은 정수 복사체 수를 1 그리고 순도를 1로 설정하였다; 클러스터링을 통해 클로날 및 서브클로날 돌연변이를 간단하게 그룹화할 수 있다. 본 발명자들은 10,000회 반복 및 1000회의 번인(burn-in), 및 디폴트 파라미터로 PyClone을 실행시켰다. 특히, 돌연변이 클로날 상태를 평가하기 위해, 돌연변이를 먼저 추가로 필터링하여 신뢰할 만한 클러스터링을 보장하였다. 간단히 말해, 생식세포 및 종양 둘 모두에서 적어도 10의 판독 깊이를 갖는 돌연변이만을 사용하였고, Varscan2 somatic p-값의 임계값은 0.01이다. 각각의 변이체에 대해 최소 5회의 교대 판독이 요구되었고, 뿐만 아니라 최소 종양 변이체 대립유전자 빈도는 1%이다. 돌연변이는 또한 최대 2회 생식세포 판독, 2% 생식세포 변이체 대립유전자 빈도가 허용되도록 필터링되었다.
2개의 종양, ZA6965 및 GR0134에 대해, 신뢰할 만한 복사체 수, 돌연변이 및 순도 추정치는 추출될 수 없었고, 이는 클로날 아키텍쳐 분석을 매우 다루기 어렵게 하여, 이러한 종양은 분석으로부터 제외되었다.
복사체 수 분석
(1)로부터 수득된 데이터에 대해 쌍을 이룬 종양-정상으로부터 처리된 샘플 엑솜 SNP 및 복사체 수 데이터를 VarScan2(v2.3.6)를 이용하여 생성하였다. Varscan2 복사체 수는 최소-커버리지(21221095) 및 데이터-비를 제외하고는 디폴트 파라미터를 이용하여 실행되었다. 데이터-비는 (22300766)에서 설명한 대로 샘플-당 기준으로 계산되었다. Varscan으로부터의 출력은 ASCAT v2.3(20837533)을 사용하여 처리되어 엑솜 시퀀스 데이터를 기반으로 모든 샘플에 대해 세그먼트화된 복사체 수 데이터 및 세포충실성 및 배수성 추정치를 제공하였다. 다음 설정이 이의 디폴트 값으로부터 변경되었다: ACF를 1로 설정하기 위한 임계값이 0.2에서 0.15로 조정되었고 패키지가 감마 설정 1로 실행되었다.
TCGA 샘플의 경우, SNP6.0 데이터는, 문헌[McGranahan, 2015]에 설명된 대로, 복사체 수 정보를 산출하도록 처리되었다.
계통발생 트리 구성
계통발생 트리를, (12)에 설명된 대로, 종양 내 변이체의 지역적 분포로부터 구축된 이원 존재/부재 매트릭스를 이용하여 구축하였다. 종양 L011의 경우, 원발 종양 데이터를 L012 및 L011 전이 영역에 대해 설명된 방법을 이용하여 재분석하여, 원발 및 전이 영역 둘 모두를 특징으로 하는 조합된 트리를 허용하였다.
환자 샘플의 HLA 형결정
모든 TCGA 환자에 대해, POLYSOLVER(POLYmorphic loci reSOLVER)(16)를 이용하여 4자리 HLA 유형을 결정하였다. 환자 L011 및 L012를 혈청형 검사하고, 동시에 Optitype(17)을 이용하여 유전자형 검사하여, 일치된 결과를 얻었다.
추정 신생-항원의 확인
확인된 비-침묵 돌연변이를 이용하여 각 가능한 위치에 나타난 돌연변이된 아미노산을 지닌 9-11개 아미노산 길이의 펩티드의 포괄적인 목록을 생성하였다. 환자의 생식세포 HLA 대립유전자에 대한 모든 돌연변이 펩티드 및 이의 상응하는 야생형 펩티드의 결합 친화도는 netMHCpan-2.8(18, 19)을 사용하여 예측되었다. 후보 신생-항원은 예상 결합 강도가 500nM 미만인 것들로 확인되었다.
TCGA 생존 분석
TCGA 환자에 대한 임상 데이터는 TCGA 데이터 포털을 통해 접근하여 https://tcgadata.nci.nih.gov/tcgafiles/ftp_auth/distro_ftpusers/anonymous/tumour/CANCER.TYPE/bcr/biotab/clin/로부터 다운로드하였다. 생존 분석은 생존 패키지를 사용하여 R에서 수행되었다.
차별적인 유전자 발현 분석
RNA-시퀀싱 데이터는 TCGA 데이터 포털로부터 다운로드하였다. 각 LUAD 환자에 대해, 모든 이용 가능한 'Level_3' 유전자-수준 데이터를 수득하였다. 원시 판독 카운트는 분석을 위해 R 패키지 DESeq2로의 입력으로 사용되었다. 전사체-범위(transcriptomewide) 차별적인 유전자 발현 분석을 수행하고, 유의하게 차별적으로 발현된(조정된 p<0.05) 면역 관련 유전자(표 S1에 열거됨)를 확인하였다. 이러한 유전자를 메트릭 1-r2를 이용하여 이들의 공동-발현에 대해 클러스터링하였다.
L011 및 L012에 대한 종양-침윤 림프구(TIL)의 분리
종양은 수술실에서 병리학부로 직접 가져 왔고, 여기서 샘플을 영역들로 나누었다. 이어서 샘플을 멸균 조건 하에서 잘게 썬 다음 37℃에서 30분 동안 효소 분해(Liberase TL 연구 등급(Roche) 및 DNAse I(Roche)과 함께 RPMI-1640(Sigma))시킨 후 gentleMACS(Miltenyi Biotech)를 이용하여 기계적 해리시켰다. 생성된 단일 세포 현탁액을 Ficoll-paque(GE Healthcare) 구배를 통과시켜 백혈구를 농축시켰다. 살아 있는 세포를 계수하고, 10% 디메틸 설폭사이드와 함께 인간 AB 혈청(Sigma)에 -80℃로 동결시킨 다음 액체 질소로 옮겼다.
L011 및 L012에 대한 종양-침윤 림프구의 시험관내 증식
TIL을 10% 인간 AB 혈청(Sigma), 가용성 항-CD3(OKT3, BioXCell), 6000IU/mL 재조합 인간(rhIL-2, PeproTech) 및 3개의 동종이형 건강한 공여체로부터 풀링된 2x107 조사된 PBMC(30Gy)가 보충된 EX-VIVO 배지(Lonza)를 함유하는 T25 플라스크에서 급속 증식 프로토콜(REP)을 이용하여 증식시켰다. 3000IU/mL의 rhIL-2를 함유하는 신선한 배지를 필요에 따라 3일마다 첨가하였다. 2주의 증식 후, TIL을 계수하고, 유세포분석기에 의해 표현형 분석하고, 관련 검정 또는 액체 질소에서 장기 저장하기 전에 인간 AB 혈청(Sigma)에서 -80℃로 동결시켰다.
MHC 다합체 생성 및 조합 인코딩-유세포분석기 분석
예측된 신생에피토프를 보유한 MHC-다합체를 사내에서(in-house) 생산하였다(Technical University of Denmark, laboratory of SRH). 합성 펩티드를 Pepscan Presto, NL에서 구입하였다. L011(HLA-A1101, A2402, 및 B3501) 및 L012(HLA-A1101, A2402, 및 B0702)의 HLA-발현과 일치하는 HLA 분자를 UV-민감성 펩티드로 재폴딩시키고, UV 노출 후 관심 펩티드로 교환하였다(20-23). 간단히 말해, UV-민감성 펩티드가 로딩된 HLA 복합체는 384-웰 플레이트에서 후보 신생-항원 펩티드의 존재하에 4℃에서 1시간 동안 366-nm UV 광(CAMAG)으로 처리되었다. 펩티드-MHC 다합체는 총 9개의 상이한 형광 스트렙타비딘(SA) 컨쥬게이트를 사용하여 생성되었다: PE, APC, PE-Cy7, PE-CF594, 브릴리언트 바이올렛 (BV)421, BV510, BV605, BV650, 브릴리언트 울트라바이올렛 (BUV)395(BioLegend). MHC-다합체는 각각의 펩티드-특이성에 대해 2개의 상이한 스트렙타비딘-컨쥬게이트로 생성되어 각 항원 반응성 T 세포의 조합 인코딩을 가능하게 하고, 이는 최대 36개의 상이한 펩티드에 대한 반응성을 동시에 분석할 수 있게 한다(24, 25).
신생-항원-반응성 CD8+ T 세포의 확인
MHC-다합체 분석을 영역-특이적 폐암 샘플 및 인접한 정상 폐 조직으로부터 분리된 시험관내 증식된 CD8+ T 림프구에 대해 수행하였다. 290개 및 355개 후보 돌연변이 펩티드(예측된 HLA 결합 친화도 <500nM임, 동일한 미스센스 돌연변이로부터 여러 잠재적인 펩티드 변이를 포함함)를 합성하여 각각 증식된 L011 및 L012 TIL을 스크리닝하는데 이용하였다. 증식된 CD8+ T 림프구의 염색을 위해, 샘플을 해동하고, 10분 동안 DNAse로 처리하고, 세척하고, MHC 다합체 패널로 15분 동안 37℃에서 염색하였다. 이어서, 세포를 633 또는 635 nm 여기를 위한 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(Invitrogen, Life Technologies), CD8-PerCP(Invitrogen, Life Technologies) 및 CD4, CD14, CD16, CD19(모두 BD Pharmingen으로부터) 및 CD40(AbD Serotec)의 패널에 대한 FITC 커플링된 항체로 추가 20분 동안 4℃에서 염색하였다. 데이터 수집은 LSR II 유세포분석기(Becton Dickinson) 상에서 FACSDiva 6 소프트웨어로 수행하였다. 양성 반응의 정의를 위한 컷오프 값은 전체 CD8+ 세포의 ≥0.005% 및 ≥10 이벤트였다.
환자 L011의 경우, HLA-B3501 MTFR2-유래된 다합체는 돌연변이된 서열 FAFQEYDSF(netMHC 결합 점수: 22)에는 결합하지만 야생형 서열 FAFQEDDSF(netMHC 결합 점수: 10)에는 결합하지 않는 것으로 나타났다(도 11B 및 D, 도 9C). 중첩 펩티드 AFQEYDSFEK 및 KFAFQEYDSF에 대해서는 어떤 반응도 발견되지 않았다. 환자 L012의 경우 HLA-A1101 CHTF18-유래된 다합체는 돌연변이된 서열 LLLDIVAPK(netMHC 결합 점수: 37)에는 결합하지만 야생형 서열 LLLDILAPK(netMHC 결합 점수: 41)에는 결합하지 않았다(도 11C 및 E, 도 9C). 중첩 펩티드 CLLLDIVAPK 및 IVAPKLRPV에 대해서는 어떤 반응도 발견되지 않았다. 마지막으로, HLA-B0702 MYADM-유래된 다합체는 돌연변이된 서열 SPMIVGSPW(netMHC 결합 점수: 15)는 물론 야생형 서열 SPMIVGSPR(netMHC 결합 점수: 1329)에도 결합하였다. 중첩 펩티드 SPMIVGSPWA, SPMIVGSPWAL, SPWALTQPLGL 및 SPWALTQPL에 대해서는 어떤 반응도 발견되지 않았다.
L011 및 L012에 대한 기준선, 비증식된 종양 샘플의 MHC-다합체 분석 및 다중-파라미터 유세포분석의 표현형 분석
종양 샘플을 해동시키고, 세척하고, 먼저 맞춤형(custom-made) MHC다합체로 10-15분 동안 37℃에서 암실에서 염색하였다. 이후 세포를 습윤 얼음 위로 옮기고, 암실에서, 30분 동안 제조업체의 권장 희석율로 사용된 표면 항체의 패널로 염색하였다: CD8-V500, SK1 클론(BD Biosciences), PD-1-BV605, EH12.2H7 클론(Biolegend), CD3-BV785, OKT3 클론(Biolegend), LAG-3-PE, 3DS223H 클론(eBioscience). 세포를 eBioscience로부터 설정된 세포내 고정 및 투과 완충제를 사용하여 20분 동안 투과시켰다. 세포내 염색 패널은 얼음 위에서, 암실에서, 30분 동안 적용되었고, 이는 제조업체의 권장 희석율로 사용된 하기 항체로 구성되었다: 그랜자임 B-V450, GB11 클론(BD Biosciences), FoxP3-PerCP-Cy5.5, PCH101 클론(eBioscience), Ki67-FITC, 클론 B56(BD Biosciences) 및 CTLA-4 - APC, L3D10 클론(Biolegend). BD FACSAria III 유세포분석기(BD Biosciences) 상에서 데이터 수집을 수행하였고, Flowjo 버젼 10.0.8(Tree Star Inc.)에서 분석하였다.
L011 및 L012에 대한 면역조직화학
환자 L011 및 L012로부터의 샘플 및 반응성 인간 편도를 완충된 포르말린에 고정시키고, 통상적인 조직학적 프로토콜에 따라 파라핀에 임베딩시켰다. 파라핀 블록으로부터 2-5 마이크로미터 조직 섹션을 절단하고, 전기적으로 하전된 슬라이드로 옮겨 면역조직화학 검사를 받았다. 사용된 주요 항체의 세부사항은 아래 표에 열거되어 있다. 최적 염색 조건(즉, 항체 희석율 및 인큐베이션 시간, 항원 재생 프로토콜, 적합한 색소원)을 확립하기 위해 각 항체를 달리 설명된 프로토콜에 따라(26, 27) 자동화 플랫폼 BenchMark Ultra(Ventana/Roche) 및 Bond-III Autostainer(Leica Microsystems)를 이용한 통상적인 단일 면역조직화학에 의해 인간 반응성 편도의 섹션에 대해 시험하고 최적화하였다.
이용 가능한 경우, 동일한 단백질에 대해 생성된 적어도 2개의 별개 항체를 편도에서 분석하여 이의 염색 패턴의 특이성을 확인하였다. 다중 염색을 위해 이전에 기술된 프로토콜을 수행하였다(28). 세포질 또는 세포막에서 단백질 공동-발현의 평가를 위해, 색소원의 단일 색상의 변화, 즉, 청색 및 적색이 보라색이 되고 갈색 및 청색이 거의 흑색 라벨링이 되는 것에 주목한다. 면역조직화학 및 단백질 반응성 패턴은 TM에 의해 평가되었다. 다중 면역-염색의 채점은 AF와 함께 수행되었다. 이 연구에 대한 승인은 National Research Ethics Service, Research Ethics Committee 4(REC Reference number 09/H0715/64)로부터 얻었다.
결과
큰 종양 신생-항원 부하는 T 세포에 의한 종양 인지를 증가시켜, 면역-회피의 가능성을 감소시킬 수 있다(12). 종양 신생-항원의 임상적 타당성을 뒷받침함에 있어서(7), 높은 신생-항원 로드(코호트에서 예측된 신생-항원의 수의 상위 사분위수로서 정의됨)는 나머지 사분위수의 종양과 비교할 때 LUAD 샘플에서 더 긴 전체 생존 시간과 관련이 있었고 이는 임상 데이터(n=117)와 일치하는 것으로 나타났다(도 1B, logrank p = 0.011; 도 5A).
신생-항원 클로날 상태(종양 세포의 서브세트(서브클로날)와 비교하여 모든 종양(클로날)에서 신생-항원의 존재)가 생존 결과와의 관계에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 암세포 분획(각 돌연변이를 지니는 암세포의 비율)을 계산하고, 각각의 추정 신생-항원을 클로날 또는 서브클로날로서 분류하였다(13). 높은 수의 예측된 클로날 신생-항원을 지니는 종양(코호트의 상위 사분위수로 정의됨)은 코호트의 모든 다른 종양과 비교하여 더 긴 전반적인 생존과 관련되었다(도 1C, log-rank p = 0.0077; 도 5B). 반대로, 예측된 서브클로날 신생-항원의 수는 전반적인 생존과 유의한 관련이 없었다(도 1D, log-rank p = 0.12; 도 5C). 비록 신생-항원 부하가 돌연변이 부하와 관련되었지만, 본 발명자들은 전반적인 생존과 신생-항원의 수 사이에서 돌연변이의 수에 비해 더 강한 상관관계를 관찰하였다(도 6). 이러한 데이터는 LUAD에서 높은 수의 클로날 신생-항원의 존재가 효과적인 면역감시를 지지할 수 있음을 시사한다. LUSC 코호트는 중간 절대 편차가 50이고 사분위수간 범위가 71인 더 좁은 범위의 추정 신생-항원을 가졌고(도 7A), 전반적인 생존과 신생-항원 로드 사이에 통계적으로 유의한 연관성은 이 코호트에서 관찰되지 않았다(도 7B-G). 이것은 단일 샘플로부터 종양의 클로날 아키텍쳐를 해부하는데 있어서의 어려움을 반영할 수 있다(14).
유전자 발현 분석은 낮은(코호트에서 예측된 클로날 신생-항원의 수의 하위 사분위수로서 정의됨) 및 높은 클로날 신생-항원 코호트 사이에 차별적으로 발현된 27개의 면역-관련 유전자를 밝혀내었다(표 S1). CD8A(p=0.005) 및 항원 제시(TAP-1 p=0.003, STAT-1 p<0.001), T 세포 침윤(CXCL-10 p=0.005, CXCL-9 p = p<0.001) 및 이펙터 T 세포 기능(IFN-γ p<0.001, 그랜자임 B p<0.001 및 H p=0.008)과 관련된 유전자는 높은 클로날 신생-항원 코호트에서 상향조절되었고, 함께 클러스터링되었다(도 1E). PD-1(p=0.02) 및 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3, p<0.001), T 세포 기능의 음성 조절제(15)를 또한 이 클러스터에서 확인하였다. PD-L1도 높은 클로날 코호트에서 유의하게 상향조절되었고(p<0.001), PD-L2와 클러스터링되었다. 본 발명자들이 높은 클로날 신생-항원 종양을 코호트의 모든 다른 종양과 비교했을 때, PD-L1은 가장 유의하게 차별적으로 발현된 면역 유전자로서 확인되었다(도 8, p<0.001).
이러한 데이터는 높은 클로날 신생-항원 부하가 특이적 면역 체크포인트 단백질(PD-1, LAG-3, PD-L1/2)의 발현에 의해 잠재적으로 조절되는 활성화된 이펙터 T 세포의 존재와 관련이 있음을 시사한다.
다음으로, 클로날 신생-항원에 반응성인 CD8+ T 세포가 원발 NSCLC 종양에서 확인될 수 있었는지를 다루었다. 2개의 초기 단계 종양인 L011 및 L012를 다중-영역 엑솜 시퀀싱으로 처리하여(13), 각 원발 종양 영역 내에서 신생-항원의 계통발생학적 분석 및 예측을 허용하였다(도 2A). L011은 뇌 전이를 포함하였고, 이는 원발성 수술 후 14개월 후에 절제되고, 다중-영역 시퀀싱으로 처리되었다. 둘 모두의 종양은 여성 흡연자(>40팩-여러 해)로부터 유래되었으나, 이들의 돌연변이 부하 및 이종성의 정도는 뚜렷이 달랐다(도 2A). 샘암종인 L011은 종양 영역 R3에서 기원한 것으로 보이는, 균일한 원발 종양 및 뇌로의 전이성 파종(M1-M4)을 나타내었다(도 2A). 총 313개의 신생-항원이 원발 종양 내에서 예측되었고, 그 중 88%는 클로날이었고, 원발 종양의 모든 영역에서 확인되었다(도 2B). 반대로, 편평 세포 암종인 L012는 낮은 돌연변이 부하 및 광범위한 이종성을 나타내었고, 예측된 신생-항원의 75%는 서브클로날이다(도 2A, C).
예측된 신생-항원으로 로딩된 MHC-다합체를 이용하여 상이한 종양 영역 및 인접한 정상 폐 조직으로부터 증식한 CD8+ T 세포를 스크리닝하였다(13). L011에서, 야생형(10nM) 및 돌연변이(22nM) 형태에서 예측된 높은 HLA 결합을 갖는 클로날 돌연변이(도 2B)인 돌연변이 MTFR2D326Y (FAFQEYDSF)에 반응성인 CD8+ T 세포는 모든 종양 영역(2.8-4.4%)에서 확인되었고 정상 영역에서 더 낮은 빈도(0.1%)로 확인되었다(도 2D). L012에서, 돌연변이 CHTF18L769V(LLDIVAPK) 및 MYADMR30W(SPMIVGSPW)에 반응성인 CD8+ T 세포는 모든 종양 영역에서 확인되었고 정상 조직에서 더 낮은 빈도로 확인되었다(도 2E). 둘 모두는 클로날 돌연변이였고, CHTF18은 돌연변이 및 야생형 형태에서 높은 예측된 HLA 결합(<50nM)을 갖고, MYADM은 돌연변이 형태에 비해(<50nM) 야생형에서(>1000nM) 예측된 더 낮은 결합을 갖는다(도 2C).
L011에서, MTFR2-반응성 CD8+ T 세포는 또한 모든 원발 종양 영역(0.79-1.35%)으로부터의 비증식된 TIL(종양 침윤 림프구)에서 검출될 수 있었고(도 3A), 정상 조직(0.16%) 및 말초혈 단핵 세포(PBMC)(0.02%)에서 더 낮은 빈도로 검출되었다. 유사하게, CHTF18-반응성 및 MYADM-반응성 CD8+ T 세포는 L012의 모든 종양 영역으로부터 비증식된 샘플에서 확인되었고(CHTF18 0.16-0.58%, MYADM 2.25-2.31%), 정상 폐 조직(CHTF18 0.02%, MYADM 0.17%) 및 PBMC(CHTF18 0.02%, MYADM 0.01%)에서 더 낮은 빈도로 확인되었다(도 3A).
비증식된 샘플에서 신생-항원-반응성 T 세포의 추가 특성규명은 유세포분석기에 의해 수행되었다. 낮은 수준이지만, CTLA-4 발현은 둘 모두의 L011 및 L012에서 종양-침윤 CD8+ T 세포에 국한되었고, 가장 높은 수준은 MTFR2, CHTF18 및 MYADM-반응성 T 세포에서 확인되었다(도 3B, 도 9A). 높은 수준의 PD-1은 MTFR2-, CHTF18- 및 MYADM-반응성 종양-침윤 CD8+ T 세포의 >99%에 의해 발현된 반면(도 3B, 도 9A), 더 낮은 수준은 종양, 정상 조직 및 PBMC에서 CD8+ MHC-다합체 음성 T 세포에 대해 관찰되었다. L011에서, LAG-3 발현은 정상 조직 및 PBMC에 비해, MTFR2-반응성 세포를 포함하는 모든 종양 침윤(rinfiltrating) CD8+ T 세포에서 더 높았다(도 3B). LAG-3 발현은 또한 L012에서 관찰되었으나, 낮은 수준이었다(도 9A). IHC 연구는 둘 모두의 L011 및 L012 원발 종양에서 LAG-3을 공동-발현시키는 CD8+ T 세포를 확인함으로써 이러한 결과를 추가로 뒷받침하였다(도 3D). Ki67은 정상 조직 또는 PBMC에서보다 종양 침윤 CD8+ T 세포에서 더 높은 수준으로 발현되었으나(도 3B, 도 9A), 증식하는 세포의 분획은 둘 모두의 신생-항원-반응성 및 MHC-다합체 음성 세포에서 낮았다(<25%). 대조적으로, 그랜자임 B(GzmB)는 연구된 모든 CD8+ T 세포 서브세트에서 높은 수준으로 발현되었다. 중요하게는, 종양에서 신생-항원 반응성 T 세포의 대부분이 고도로 활성화된 GzmB를 발현하는 것으로 나타난 반면, 이러한 세포 대부분은 PD-1을 공동-발현시켰고(>60%), Ki67 수준에 기반한 증식 제어 하에 있는 것으로 나타났다(도 3C, 도 9B).
종양 PD-L1 발현과 함께, 클로날 신생-항원에 반응성인 T 세포에 대한 LAG-3 및 PD-1의 발현(도 3D)은 높은 클로날 폐 종양에서 확인된 면역-사인을 강력하게 뒷받침한다(도 1E). 이러한 데이터는 클로날 신생-항원을 인지하는 T 세포의 활성을 제한하는데 있어서 이러한 특이적 체크포인트에 대한 잠재적인 역할 및 높은 클로날 신생-항원 부하를 지닌 NSCLC에서 이러한 체크포인트를 표적화하는 향후 연구를 지원한다.
다음으로, 추정 신생-항원의 클로날 상태가 NSCLC에서 PD-1 봉쇄에 대한 변경된 민감도와 관련이 있는지를 조사하였다. 2개의 독립적인 NSCLC 코호트를 펨브롤리주맙으로 치료한 최근 연구로부터의 엑손 시퀀싱 데이터를 수득하였고(2)(표 S2), 각 종양의 클로날 아키텍쳐를 각 돌연변이의 암세포 분획을 추정하여 해부하였다(13)(도 10). 종래 보고된 대로(2), 신생-항원 부하는 발견 및 검증 코호트에서 펨브롤리주맙의 임상 효능과 관련되었고, 높은 신생-항원 레퍼토리는 개선된 결과와 관련이 있었다(데시터는 제시되지 않음).
상관관계는 또한 각 종양의 클로날 아키텍쳐에 따라 다르다(도 4A-H). 발견 코호트에서, 지속적인 임상 효과를 나타내는 모든 종양(DCB, 6개월 넘게 지속되는 부분 반응 또는 안정한 질병으로서 (2)에서와 같이 정의됨)은 높은 클로날 신생-항원 부하(발견 코호트에서 클로날 신생-항원의 중간 숫자와 같거나 높은 것으로 정의됨, 91) 및 5%보다 낮은 신생-항원 서브클로날 분획을 지녔다(도 4A-B). 반대로, NDB(non-durable benefit)를 나타내는 모든 종양은 낮은 클로날 신생-항원 레퍼토리(<91) 또는 높은 신생-항원 서브클로날 분획(>5%)을 지녔다. 따라서, 발견 코호트에서, 신생-항원 레퍼토리 및 신생-항원 이종성(즉, 클로날:서브-클로날 신생-항원 또는 돌연변이의 비) 둘 모두를 조합시켜, 어느 한 단독 측정보다 더 나은 펨브롤리주맙에 대한 민감도를 예측할 수 있었다(도 4C).
유사하게, 검증 코호트에서, 높은 클로날 신생-항원 부하(검증 코호트의 중간과 같거나 높은 것으로 정의됨, 69) 및 낮은 서브클로날 신생-항원 분획(<5%)을 지닌 6개 종양 중 5개는 DCB와 관련이 있었다(도 4D-F). 반대로, 낮은 클로날 신생-항원 부하 또는 높은 신생-항원 이종성을 지닌 10개 종양 중 8개는 NDB와 관련이 있었다. 예를 들어, 큰 신생-항원 부하에도 불구하고, ZA6505는 비지속적인 임상 반응을 나타내었고, 2개월 후에 재발하였다. ZA6505는 코호트 내의 가장 이종성인 종양 중 하나였고, 돌연변이의 80% 이상이 서브클로날로 분류되었다.
요약하면, 신생-항원 이종성 및 클로날 신생-항원 부하의 정도가 함께 고려될 때, 결과는 거의 모든 경우에 예측될 수 있었다(도 4G-H).
더욱이, TCGA 분석과 일치하여(도 1E), 본 발명자들은 또한 큰 클로날 신생-항원 부하 및 낮은 신생-항원 이종성을 지니는 종양에서 낮은 신생-항원 부하 또는 높은 신생-항원 이종성을 지닌 것들에 비해 더 큰 PD-L1 발현을 관찰하였다(P=0.0017, χ2- 검사, 도 11). 이러한 결과는 부류-I 제한된 추정 신생-항원보다 오히려 모든 돌연변이를 고려할 때 일관성을 유지하였고(도 12), 이는 확인되지 않은 MHC 부류 II 제한된 신생-항원이 또한, 항-PD-1 요법에 반응하여, 면역 반응성(6) 및 신생-항원 예측 알고리즘의 개선 요구(16)에서 중요한 역할을 할 수 있다는 개념을 뒷받침한다. 펨브롤리주맙에 대해 예외적인 반응을 보인 종양인 CA9903으로부터의 말초혈 림프구(PBL)의 이전 분석은 HERC1P3278S 돌연변이(ASNASSAAK)로부터 생성된 예측된 신생-항원을 인지하는 자가 PBL에서 CD8+ T 세포 집단을 확인하였다(2). 클로날 신생-항원의 관련성과 일치하여, 이 돌연변이는 시퀀싱된 종양 내 암세포의 100%에 존재할 가능성이 있다(도 4I-J).
보충 표 S1: 높은 및 낮은 클로날 신생-항원 환자 그룹 간에 차별적으로 발현된 면역 유전자
참고문헌
본원에 언급된 모든 문헌은 이들이 참조되는 주제에 특별히 주의하면서, 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 본 발명의 설명된 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변경은 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다. 비록 본 발명이 특정 바람직한 구체예에 관해 설명되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정 구체예에 과도하게 제한되어서는 안 됨이 이해되어야 한다. 실제로, 분자 생물학, 세포 면역학 또는 관련 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방식의 다양한 변형은 하기 청구 범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
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Claims (15)
- 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 방법으로서, 상기 방법이,
(i) 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 클로날 신생-항원의 수를 결정하는 단계; 및/또는
(ii) 상기 대상체로부터의 하나 초과의 암 세포에서 클로날:서브-클로날 신생-항원의 비 및/또는 서브-클로날 신생-항원 분획을 결정하는 단계; 및/또는
(iii) 상기 대상체로부터의 암 세포 및/또는 종양 침윤 면역 세포에서 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일 또는 종양 유형을 결정하는 단계를 포함하고,
더 높은 수의 클로날 신생-항원, 및/또는 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획, 및/또는 기준 샘플에 비해 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현이 면역 체크포인트 간섭제에 대한 반응을 나타내는, 방법. - 제1항에 있어서, (iii)에서, 면역 체크포인트 분자의 발현 프로파일을 결정하는 것이 전사체-범위(transcriptome-wide) 차별적인 유전자 발현 분석에 의해 차별적인 발현의 면역 체크포인트-관련 유전자를 확인함으로써 수행되는 방법.
- 암을 지닌 대상체의 예후를 예측하거나 결정하는 방법으로서, 상기 방법이,
(i) 상기 대상체로부터의 하나 이상의 암 세포에서 클로날 신생-항원의 수를 결정하는 단계; 및/또는
(ii) 상기 대상체로부터의 하나 초과의 암 세포에서 클로날:서브-클로날 신생-항원의 비 및/또는 서브-클로날 신생-항원 분획을 결정하는 단계를 포함하고,
더 높은 수의 클로날 신생-항원 및/또는 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획이 개선된 예후를 나타내는, 방법. - 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이,
i) 제1항 또는 제2항의 방법에 따라 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 단계; 및
ii) 상기 대상체를 면역 체크포인트 간섭제에 의해 치료하는 단계를 포함하는, 방법. - 암을 지닌 대상체를 면역 체크포인트 간섭제에 의해 치료하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 대상체가 다음을 지닌 것으로 결정된, 방법:
(i) 더 높은 수의 클로날 신생-항원; 및/또는
(ii) 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획; 및/또는
(iii) 기준 샘플에 비해 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현. - 대상체에서 암의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 면역 체크포인트 간섭제로서, 상기 방법이,
i) 제1항 또는 제2항의 방법에 따라 면역 체크포인트 간섭제에 의한 치료에 적합한 암을 지닌 대상체를 확인하는 단계; 및
ii) 상기 대상체를 면역 체크포인트 간섭제에 의해 치료하는 단계를 포함하는 것인, 면역 체크포인트 간섭제. - 대상체에서 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 면역 체크포인트 간섭제로서, 상기 대상체가,
(i) 더 높은 수의 클로날 신생-항원; 및/또는
(ii) 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획; 및/또는
(iii) 기준 샘플에 비해 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현을 갖는, 면역 체크포인트 간섭제. - 대상체에서 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 면역 체크포인트 간섭제의 용도로서, 상기 대상체가,
(i) 더 높은 수의 클로날 신생-항원; 및/또는
(ii) 더 높은 비의 클로날:서브-클로날 신생-항원, 또는 더 낮은(또는 낮은) 서브-클로날 신생-항원 분획; 및/또는
(iii) 기준 샘플에 비해 차별적인 면역 체크포인트 분자 발현을 갖는, 용도. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 체크포인트 간섭제가 CTLA4, PD-1, PD-L1, Lag-3, Tim-3, TIGIT 또는 BTLA와 상호작용하는 방법, 면역 체크포인트 간섭제 또는 용도.
- 제9항에 있어서, 면역 체크포인트 간섭제가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙 또는 이필리무맙인 방법, 면역 체크포인트 간섭제 또는 용도.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 위암, 식도암, 유방암, 결장직장암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 신장암(신장 세포), 폐암(소세포, 비소세포 및 중피종), 뇌암(신경아교종, 별아교세포종, 아교모세포종), 흑색종, 림프종, 소장암(십이지장 및 공장), 백혈병, 췌장암, 간담도 종양, 생식세포암, 전립선암, 두경부암, 갑상선암 및 육종으로부터 선택되는 방법, 면역 체크포인트 간섭제 또는 용도.
- 제11항에 있어서, 암이 폐암 또는 흑색종인 방법, 면역 체크포인트 간섭제 또는 용도.
- 제12항에 있어서, 암이 비소세포폐암(NSCLC)인 방법, 면역 체크포인트 간섭제 또는 용도.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물, 바람직하게는 인간, 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니피그인 방법, 면역 체크포인트 간섭제 또는 용도.
- 제14항에 있어서, 대상체가 인간인 방법, 면역 체크포인트 간섭제 또는 용도.
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