CN108351916A - 新生抗原分析 - Google Patents

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Abstract

癌症免疫学为癌症治疗提供了有希望的新途径，但是验证待针对为靶标的潜在的新生抗原是成本高的且昂贵的。分析MHC结合亲和力、抗原加工、与已知抗原的相似性、预测的表达水平(作为mRNA或蛋白质)、自相似性和突变体等位基因频率，提供了使用测序数据鉴定并优先化候选新生抗原的筛选方法。本发明的方法通过鉴定优先候选新生抗原以用于进一步的实验验证从而节省时间和金钱。

Description

新生抗原分析
相关申请
本申请要求于2015年7月14日提交的美国临时申请号62/192,373的权益和优先权，将其通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本发明涉及新生抗原分析领域。具体地，它涉及用于开发癌症疫苗和T细胞疗法的突变衍生的新生抗原的鉴定和优先化。
背景技术
癌症的特征是异常细胞的增殖。常规治疗的成功取决于癌症的类型和其被检测到的阶段。许多治疗包括昂贵和痛苦的手术和化疗，并且往往是不成功的，或只是适度延长患者的生命。正在开发的有前途的治疗方法包括肿瘤疫苗或靶向肿瘤抗原的T细胞疗法，其使患者的免疫系统能够区分肿瘤和健康细胞，并引发患者的免疫反应。参见Chen等人，Oncology Meets Immunology:The Cancer-Immunity Cycle[肿瘤学与免疫学：癌症-免疫循环]，Immunity[免疫]39,2013年7月25日，出于所有的目的将其内容以其全文结合在此。
新生抗原是与患者癌症特有的肿瘤特异性突变相关联的一类免疫原。新生抗原已经显示出作为抗肿瘤免疫技术的靶标的希望，所述抗肿瘤免疫技术包括用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的适应性T细胞转移、癌症疫苗和检查点抑制剂。参见Hacohen等人，GettingPersonal with Neoantigen-Based Therapeutic Cancer Vaccines[个人接种新生抗原基的治疗性癌症疫苗]，Cancer Immunol Res[癌症免疫学研究]，2013年7月1,11；Robbins等人，Mining exomic sequencing data to identify mutated antigens recognized byadoptively transferred tumor-reactive T cells[挖掘外显子组测序数据以鉴定由过继性转移的肿瘤反应性T细胞识别的突变的抗原],Nature Medicine[自然医学]19,747-752(2013)；出于所有的目的将其每个内容以其全文结合在此。
虽然存在使用所测序的肿瘤DNA和HLA分型以鉴定并优先化候选新生抗原的策略，但是常规技术缺乏灵敏度和特异性，未能鉴定一些候选新生抗原并提供了仍然需要昂贵的验证程序的非重点结果。Snyder等人，Genetic Basis for Clinical Response to CTLA-4Blockade in Melanoma[黑色素瘤中对CTLA-4阻断的临床反应的遗传基础],N Engl J Med[新英格兰医学期刊]2014；371:2189-2199；Segal等人，Epitope landscape in breastand colorectal cancer[在乳腺癌和结肠直肠癌中的表位景观]，Cancer Res.[癌症研究]2008年2月1；68(3):889-92；Fritsch等人，2014，HLA-Binding Properties of TumorNeoepitopes in Humans[人类中肿瘤新生表位的HLA结合特性]，Cancer Immunol Res[癌症免疫学研究]；2(6)；1-8；出于所有的目的将其每个内容以其全文结合在此。
发明内容
本发明涉及用于鉴定和优先化候选新生抗原的筛选方法。本发明认识到了共同操作以优先化新生抗原用于有效治疗的关键因素。作为这种认识的结果，本发明提供了使用基于基因组的和蛋白质的信息的多变量操作，以优先化新生抗原用于在癌症免疫治疗中的高度个人化效力。基于所要求保护的方法的应用，基于在获取样本的患者中的临床效力的潜力，使用新生抗原优先级对作为候选新生抗原的肽序列进行排序。
在某些实施例中，本发明的方法利用测序和所匹配的正常对照来实现鉴定突变或变体的高水平的灵敏度和阳性预测值，即使在肿瘤中低突变体等位基因频率之下。一旦在肿瘤组织中鉴定了突变的序列以及相应的候选新生抗原肽序列，则使用个体的HLA类型和以下中的两个或更多个产生每个候选新生抗原肽序列的新生抗原优先级分数：所述肽序列与已知抗原的相似性；所述肽序列的自相似性；所述肽序列的突变体等位基因频率；所述肽序列与所述个体一个或多个HLA等位基因之间预测的主要组织相容性复合物(MHC)的结合亲和力、所述肽序列的预测的抗原加工以及所述肽序列的mRNA或蛋白质表达分析。预测的抗原加工可以包括肽切割预测或抗原加工相关转运体(TAP)亲和力预测。用于计算新生抗原优先级的各种输入可以在一些实施例中被加权。基于测序数据，优先级分数被用于鉴定并优先化具有高可能性临床效用的候选新生抗原，从而重点进一步仅调查最有希望的潜在抗原。因此，本发明的方法通过向研究者提供优先级报告来帮助提高其鉴定成功新生抗原的可能性，同时减少额外的实验，提供了一种在花费大的实验验证上节省时间和金钱的筛选。
在某些方面，本发明提供了用于预测和优先化潜在的新生抗原的方法。示例性方法包括获得个体的肿瘤核酸序列和正常核酸序列。将肿瘤核酸序列与正常核酸序列进行比较以确定多个可能具有肿瘤特异性突变的翻译肽序列。然后，确定个体的HLA类型，其中所述HLA类型包括一个或多个HLA等位基因。方法还包括预测所述多个肽序列中的每一个与HLA等位基因之间的主要组织相容性复合体(MHC)结合亲和力，并预测所述多个肽序列中的每一个的抗原肽加工分数。针对所述多个肽序列中的每一个确定突变体等位基因频率，并且将所述多个肽序列中的每一个与已知抗原进行比较以确定与已知的抗原相似性分数。本发明的方法进一步包括确定来自正常核酸序列的多个肽序列中的每一个的自相似性分数，并确定所述多个肽序列中的每一个的mRNA表达水平或蛋白质表达水平。对于所述多个肽序列中的每一个，使用包括MHC结合亲和力、抗原肽加工分数、与已知抗原相似性分数、自相似性分数和mRNA表达水平或蛋白质表达水平的項进行多变量操作，以对其中每項的所述多个肽序列中的每一个产生新生抗原优先级分数。然后制备包含所述多个肽序列中的每一个的新生抗原优先级分数的报告。
在某些实施例中，本发明的方法可以包括通过对从个体的肿瘤组织提取的肿瘤核酸的全外显子组测序确定肿瘤核酸序列。全外显子组测序可以包括下一代测序或桑格(Sanger)测序或以上两者。在一些实施例中，正常参考核酸序列从共有序列的数据库中获得。在替代性实施例中，正常核酸序列可以来自被采集样本的同一个体的非肿瘤组织。本发明的方法可以包括通过对从个体的非肿瘤组织获得的正常核酸的全外显子组测序确定正常核酸序列。
在各种实施例中，抗原肽加工分数可以包括肽切割预测或抗原加工相关转运体(TAP)亲和力预测。可以从肿瘤核酸序列或正常核酸序列确定HLA类型，或者可以通过血清分型或通过细胞测定来确定HLA类型。在某些实施例中，所述方法的一个或多个步骤可以使用包括耦合到有形非暂态存储器和输入/输出设备的处理器的计算机来进行。本发明的方法可以进一步包括将报告发送到输出设备。在本发明的各种方法中，多个肽序列中的每一个可以具有小于500nM的预测的MHC结合亲和力，以IC50计。在某些实施例中，已知抗原序列可以从已知抗原序列的数据库中获得。
附图说明
图1图示了一种用于鉴定和优先化候选新生抗原的方法。
图2图示了另一种用于鉴定并然后优先化候选新生抗原的方法。
图3显示了说明在一系列病例中检测到的种系和体细胞变化以及使用所匹配的正常对照来鉴定肿瘤特异性突变的重要性的图。
图4显示了本发明的样本报告。
具体实施方式
本发明提供了用于鉴定和优先化用于癌症免疫治疗的候选新生抗原的方法。本发明的方法利用多变量分析以便提供用于确定哪个候选新生抗原最有可能成功用于发展癌症免疫治疗剂的优先级分数。本发明的方法对于确定个体化的新生抗原优先级是特别有用的，以便使特定患者中特定肿瘤的治疗功效最大化。作为本发明方法的结果，临床医生可能更了解将哪种新生抗原治疗方式带入临床试验或在临床试验中推进以便产生有效的免疫调节治疗剂。
从肿瘤核酸取得的数据以及如在此所述的HLA分型、肽相似性分析和其他标记产生反映候选新生抗原的潜在治疗功效的分数。在此提供了要求保护的多变量分析中的关键输入。这些输入合并以优先化用于进一步开发的候选新生抗原。在某些实施例中，本发明的方法依赖于全外显子组和所匹配的正常对照测序来实现鉴定突变或变体的高水平的灵敏度和阳性预测值，即使在低突变体等位基因频率之下。一旦对于一个个体鉴定出突变的序列与相应的候选新生抗原肽序列，则加权多变量操作使用个体的HLA类型和以下两个或更多个产生每个候选新生抗原肽序列的新生抗原优先级分数：所述肽序列与已知抗原的相似性；所述肽序列的自相似性；所述肽序列的突变体等位基因频率；所述肽序列与所述个体一个或多个HLA等位基因之间的预测的主要组织相容性复合物(MHC)结合亲和力、所述肽序列的预测的抗原加工以及所述肽序列的mRNA或蛋白质表达分析。预测的抗原加工可以包括肽切割预测或抗原加工相关转运体(TAP)亲和力预测。因此，本发明的方法通过向研究者提供优先级报告来帮助提高其鉴定成功新生抗原的可能性，同时减少额外的实验，提供了一种在花费大的实验验证上节省时间和金钱的初步筛选。如在此所用的候选新生抗原可以作为肽序列给出。
图1和2显示了本发明的示例性方法，这些示例性方法包括获得个体肿瘤的肿瘤核酸测序数据和正常核酸测序数据。将突变与野生型和体细胞肽对的FASTA格式数据一起鉴定，通常长度在8-11个氨基酸之间。在不同的实施例中，野生型和体细胞肽对的长度可以在11和20个氨基酸之间。FASTQ格式的核酸测序数据用于经由电脑分析的HLA-分型，或者可替代地，可以手动向所述方法提供传统的经实验验证的HLA-分型信息(例如，HLA-A01:01HLA-A26:01)。
将所确定的个体的HLA等位基因与野生型和体细胞肽对的FASTA格式数据一起使用，以例如NetMHCpan预测肽和每个HLA等位基因的MHC结合亲和力。使用肿瘤核酸测序数据预测抗原加工，例如肽切割和TAP转运体亲和力。然后使用抗原加工和MHC结合亲和力预测来选择候选新生抗原或肽序列，其中例如预测的MHC结合亲和力(以IC50计)小于500nM。然后使用肿瘤核酸序列和正常核酸序列来评估自相似性。还将候选新生抗原与已知的抗原相比较，以确定相似性，并获得携带所述肽的基因的mRNA或蛋白质表达。然后在加权多变量操作中使用突变体等位基因频率、表达、与已知抗原的相似性、自相似性和预测的MHC结合亲和力，以产生对于每种候选新生抗原的新生抗原优先级分数。这个分数可以用来优先化新生抗原用于随后的实验。
样本制备、测序和突变鉴定
本发明的方法可以包括鉴定和优先化来自所提供的核酸序列的候选新生抗原或肽序列，或者在某些实施例中，可以包括产生核酸序列的样本制备和测序技术。在某些实施例中，来自个体或患者的样本可以以诸如以下形式获得：冷冻组织、FFPE块或载玻片、胸腔积液、细胞、DNA、细胞系、血液、唾液或异种移植物。样本可以从肿瘤组织中获得，并且在某些实施例中，也可以从正常组织中获得，以提供正常或匹配的正常核酸的来源。正常核酸可以从任何非肿瘤组织或从诸如唾液或全血等的来源获得。可以使用已知方法从样本中提取肿瘤核酸和正常核酸。在优选的实施例中，应获得至少50ng的DNA以用于测序。
核酸可以包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。可以使用任何已知的方法对核酸样本进行测序。可以使用标记的终止子或引物和在平板或毛细管中的凝胶分离以经典的双脱氧测序反应(桑格测序法)对核酸样本进行测序。可以与本发明的方法一起使用的其他技术包括通过使用可逆终止的标记核苷酸的合成的测序、焦磷酸测序、454测序、Illumina/Solexa测序、与标记的寡核苷酸探针文库的等位基因特异性杂交、通过使用与标记克隆文库的等位基因特异性杂交随后连接的合成测序、在聚合步骤期间实时监测标记的核苷酸的掺入、Polony测序、通过纳米孔或纳米通道的易位、与纳米孔或纳米通道中检测核苷酸结合的DNA的消化或聚合、用纳米孔或纳米通道定位的链中核苷酸的光学检测、以及SOLiD测序。分离的分子可通过使用聚合酶或连接酶的连续或单一增长反应以及通过与探针文库的单一或连续差示杂交来测序。
在一些实施例中，使用测序技术(例如，下一代测序技术)对一个或多个捕获的靶标(例如，或其扩增子)的一部分进行测序，并且使用这些序列来计数存在的不同条形码的数目。因此，在一些实施例中，本发明的方面涉及高度多重qPCR反应。
可以使用的测序技术包括例如Illumina测序。Illumina测序基于使用折回PCR和锚定引物在固体表面上的DNA扩增。DNA被片段化，并且衔接子被添加到片段的5'和3'端。附接至流动池通道表面的DNA片段被延长并被桥接扩增。片段变成双链，并且使双链分子变性。固相扩增随后变性的多个循环可以在流动池的每个通道中产生几百万簇具有相同模板的约1,000个拷贝的单链DNA分子。使用引物、DNA聚合酶和四个荧光团标记的可逆终止核苷酸进行序列测序。核苷酸掺入后，使用激光激发荧光团，并且捕获图像并记录第一个碱基的身份。来自每个掺入的碱基的3'终止子和荧光团被去除，并且重复掺入、检测和鉴定步骤。根据这种技术进行的测序描述于美国专利号7,960,120；美国专利号7,835,871；美国专利号7,232,656；美国专利号7,598,035；美国专利号6,911,345；美国专利号6,833,246；美国专利号6,828,100；美国专利号6,306,597；美国专利号6,210,891；美国公开号2011/0009278；美国公开号2007/0114362；美国公开号2006/0292611；和美国公开号2006/0024681，其中的每一个通过引用以其全文结合于此。
测序产生多个读数。读数通常包括长度小于约150个碱基或长度小于约90个碱基的核苷酸序列的数据。在某些实施例中，读数是在约80至约90个碱基之间，例如约85个碱基的长度。在一些实施例中，这些是非常短的读数，即长度小于约50或约30个碱基。
可以在所提供发明的方法中使用的测序技术包括例如，454测序(454LifeSciences[454生命科学公司]，罗氏公司，布兰福德，康涅狄格州)(Margulies,M等人，Nature[自然]，437:376-380(2005)；美国专利号5,583,024；美国专利号5,674,713；和美国专利号5,700,673)。454测序涉及两个步骤。在第一步骤中，将DNA剪切成约300-800个碱基对的片段，并将片段平端化。然后将寡核苷酸衔接子连接到片段的端。衔接子充当用于片段的扩增和测序的引物。可以使用例如含有5'-生物素标签的衔接子B将片段附接至DNA捕获珠粒，例如链霉抗生物素蛋白包被的珠粒。附接至珠粒的片段在油-水乳剂的液滴中进行PCR扩增。结果是在每个珠粒上克隆扩增的DNA片段的多个拷贝。在第二步骤中，珠粒被捕获在孔中(微升大小)。焦磷酸测序平行地在每个DNA片段上进行。添加一个或多个核苷酸产生光信号，所述光信号由测序仪器中的CCD照相机记录。信号强度与掺入的核苷酸数量成正比。焦磷酸测序利用了在核苷酸添加时释放的焦磷酸(PPi)。通过ATP硫酸化酶在腺苷5'磷酰硫酸的存在下将PPi转化为ATP。萤光素酶使用ATP将萤光素转化为氧化萤光素，并且所述反应产生被检测和分析的光。
可以在所提供发明的方法中使用的DNA测序技术的另一个实例是来自生命科学公司(Life Technologies Corporation)(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的AppliedBiosystems[应用生物系统公司]的SOLiD技术。在SOLiD测序中，将DNA剪切成片段，并将衔接子附接至片段的5'和3'端以产生片段文库。可替代地，可以通过将衔接子连接到片段的5'和3'端，使片段环化，消化环化的片段以产生内部衔接子，并将衔接子附接至所得到的片段的5'和3'端来引入内部衔接子以生成配对的文库。接下来，在含有珠粒、引物、模板和PCR组分的微反应器中制备克隆珠粒群体。在PCR后，将模板变性并富集珠粒以分离带有延长的模板的珠粒。使所选珠粒上的模板经历3'修饰，其允许粘合到载玻片上。所述序列可以通过依次杂交和连接由特定荧光团鉴定的带有中央部分确定的碱基(或碱基对)的部分随机的寡核苷酸来确定。记录颜色后，连接的寡核苷酸被切割并除去，并且然后重复所述过程。
可以在所提供发明的方法中使用的DNA测序技术的另一个实例是Ion Torrent测序，例如在美国公开号2009/0026082、2009/0127589、2010/0035252、2010/0137143、2010/0188073、2010/0197507、2010/0282617、2010/0300559、2010/0300895、2010/0301398、和2010/0304982中所描述的，其各项内容通过引用以其全文结合在此。在Ion Torrent测序中，将DNA剪切成约300-800个碱基对的片段，并将片段平端化。然后将寡核苷酸衔接子连接到片段的端。衔接子充当用于片段的扩增和测序的引物。这些片段可以附接在一个表面上，并以一个分辨率附接，使得这些片段是可单独解析的。一个或多个核苷酸的添加释放质子(H+)，所述信号被检测并记录在测序仪器中。信号强度与掺入的核苷酸数量成正比。
可以在所提供发明的方法中使用的测序技术的另一个实例是Illumina测序。Illumina测序基于使用折回PCR和锚定引物在固体表面上的DNA扩增。DNA被片段化，并且衔接子被添加到片段的5'和3'端。附接至流动池通道表面的DNA片段被延长并被桥接扩增。片段变成双链，并且使双链分子变性。固相扩增随后变性的多个循环可以在流动池的每个通道中产生几百万簇具有相同模板的约1,000个拷贝的单链DNA分子。使用引物、DNA聚合酶和四个荧光团标记的可逆终止核苷酸进行序列测序。核苷酸掺入后，使用激光激发荧光团，并且捕获图像并记录第一个碱基的身份。来自每个掺入的碱基的3'终止子和荧光团被去除，并且重复掺入、检测和鉴定步骤。根据这种技术的测序在以下文件中描述：美国公开号2011/0009278、美国公开号2007/0114362、美国公开号2006/0024681、美国公开号2006/0292611、美国专利号7,960,120、美国专利号7,835,871、美国专利号7,232,656、美国专利号7,598,035、美国专利号6,306,597、美国专利号6,210,891、美国专利号6,828,100、美国专利号6,833,246、和美国专利号6,911,345，其中每一个都通过引用以其全文结合在此。
可以在所提供发明的方法中使用的测序技术的另一个实例包括PacificBiosciences[太平洋生物科学公司](门洛帕克，加利福尼亚州)的单分子实时(SMRT)技术。在SMRT中，将四种DNA碱基中的每一种都附接至四种不同荧光染料中的一种上。这些染料是磷酸连接的。单个DNA聚合酶在零模式波导(ZMW)的底部与单分子模板单链DNA被固定化。ZMW是一种限制结构，这使得能够观察到通过DNA聚合酶在快速扩散进出ZMW(以微秒计)的荧光核苷酸背景下掺入的单个核苷酸。将核苷酸掺入生长的链中需要几毫秒的时间。在此期间，荧光标签被激发并产生荧光信号，并且荧光标签被切断。染料的相应荧光的检测指示掺入了哪个碱基。重复所述过程。
可以在所提供发明的方法中使用的测序技术的另一个实例是纳米孔测序(Soni,G.V.和Meller,A.，Clin Chem[临床化学]53:1996-2001(2007))。纳米孔是一个直径为1纳米的量级的小孔。纳米孔浸没在导电流体中并在其上施加电势导致由于离子通过纳米孔的传导而产生轻微的电流。流动的电流量对纳米孔的尺寸是敏感的。当DNA分子穿过纳米孔时，DNA分子上的每个核苷酸都会以不同程度阻碍纳米孔。因此，当DNA分子穿过纳米孔时流经纳米孔的电流的变化表示DNA序列的读数。
可以在所提供发明的方法中使用的测序技术的另一个实例涉及使用化学敏感的场效应晶体管(chemFET)阵列来对DNA进行测序(例如，在美国公开号2009/0026082中所述)。在所述技术的一个实例中，可以将DNA分子置于反应室中，并且可以将模板分子与结合聚合酶的测序引物杂交。在测序引物的3'端处将一个或多个三磷酸掺入到新核酸链中可以通过chemFET的电流变化来检测。一个阵列可以有多个chemFET传感器。在另一个实例中，可以将单核酸附接至珠粒上，并且可以在珠粒上扩增核酸，并且可以将单个珠粒转移到chemFET阵列上的各个反应室中，每个室具有chemFET传感器，并且可以测序核酸。
可以在所提供发明的方法中使用的测序技术的另一个实例涉及使用电子显微镜(Moudrianakis E.N.和Beer M.,PNAS[美国国家科学院院刊]，53:564-71(1965))。在所述技术的一个实例中，使用金属标签标记单个DNA分子，这些金属标签是电子显微镜可区分的。然后将这些分子在平坦表面上拉伸并使用电子显微镜成像以测量序列。
可以在所提供发明的方法中使用的测序技术的另一个实例涉及如PCT申请PCT/US2013/033451中所述的快速非整倍性筛选测试-测序系统(FAST-SeqS)，将其通过引用结合。还参见Kinde等人，“FAST-SeqS:A Simple and Efficient Method for the Detection ofAneuploidy by Massively Parallel Sequencing[FAST-SeqS：通过大规模并行测序来检测非整倍体的简单而有效的方法]”DOI：10.1371/journal.pone.0041162，将其通过引用结合。FAST-SeqS使用特定的引物，特别是一对引物，其退火结合至分散在整个基因组中的一个亚组序列。这些区域由于相似性而被选择，使得可以将它们用一对引物扩增，但是足够独特以允许区分大多数扩增的基因座。与传统的全基因组扩增文库(其中每个标签必须独立地比对)相反，FAST-SeqS产生了与较小数量的位置的序列比对。
序列组装可以通过本领域已知的方法来完成，包括基于参考的组装、从头组装、通过比对的组装，或组合方法。在一些实施例中，序列组装使用低覆盖率的序列组装软件(LOCAS)工具，由Klein等人，在LOCAS-A low coverage sequence assembly tool for re-sequencing projects[用于重新测序项目的LOCAS-A低覆盖率序列组装工具],PLoS One[公共科学图书馆期刊]6(8)文章23455(2011)中描述，其内容通过引用以其全文特此结合。序列组装描述于美国专利号8,165,821；美国专利号7,809,509；美国专利号6,223,128；美国专利号2011/0257889；和美国公开号2009/0318310中，将其每个内容以其全文通过引用特此结合。
一旦获得了肿瘤核酸序列，可将其与正常核酸序列进行比较以确定肿瘤核酸序列中的突变。在某些实施例中，正常核酸可以是参照基因组，如HG18或HG19或由International Human Genome Sequencing Consortium[国际人类基因序列检测联盟]或千人基因组计划汇编的任何人类参照序列。在优选的实施例中，正常核酸序列是匹配的正常核酸，其可以从个体的非肿瘤组织或从有关连的个体获得。使用匹配的正常组织作为用于判定变体或突变的参考序列可以帮助鉴定存在于个体的肿瘤和非肿瘤细胞中的种系突变，并且可以允许消除假阳性和更准确地鉴定肿瘤特异性变体或突变。图2显示了说明在一系列病例中检测到的种系和体细胞变化的条形图，其显示了使用所匹配的正常对照来鉴定肿瘤特异性突变的重要性。如在此所用的突变可包括例如修饰、染色体改变、取代、插入缺失、单核苷酸多态性、易位、倒位、复制和拷贝数变异。
在一个示例性的实施例中，使用市售技术如可从Personal Genome Diagnostics，Inc.[个人基因组诊断公司](巴尔的摩，马里兰州)获得的CANCERXOME来鉴定肿瘤特异性突变。
HLA分型
个体或患者的HLA分型可以使用多种已知手段进行，这些手段包括细胞测定、血清分型、基因分型或从经由电脑分析序列数据。
在一个优选的实施例中，使用在计算设备上运行的诸如OptiType的一种或多种技术经由电脑分析进行HLA分型。参见Szolek等人，OptiType:precision HLA typing fromnext-generation sequencing data[OptiType：来自新一代测序数据的精确HLA分型],Bioinformatics.[生物信息学]2014年12月1日；30(23)，出于所有的目的以其全文结合在此。也可以使用各种其他的经由电脑分析的技术。参见Major等人，HLA typing from1000genomes whole genome and whole exome illumina data[来自1000个基因组全基因组和全外显子组Illumina数据的HLA分型]，PLoS One[公共科学图书馆期刊].2013年11月6日；8(11):e78410；Wittig等人，Development of a high-resolution NGS-based HLA-typing and analysis pipeline[开发高分辨率NGS基的HLA分型和分析流水线]，Nucl.Acids Res.[核酸研究](2015)，其于2015年3月9日初次在网上公开，doi:10.1093/nar/gkv184。
在某些实施例中，HLA等位基因可以通过其他手段(例如HLA-A01:01，HLA-A26:01)来确定，并且结果也可以被所述方法利用，从而避免了对经由电脑分析预测的需要。
确定候选新生抗原和优先化候选新生抗原
使用个体的HLA分型信息以及具有已鉴定的突变的肽序列，可以使用各种经由电脑分析技术和计算机程序(例如，在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/可获得的NetMHCpan版本(例如，版本2.8)、在http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/可获得的MHC-I抗原肽加工预测(MAPPP)、在http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/可获得的生物信息学和分子分析部分(BIMAS)HLA肽结合预测、在http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html可获得的Rankpep MHC肽结合预测、或在http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm可获得的SYFPEITHI表位预测器)为每个肽序列预测MHC结合亲和力。
在MHC呈递和结合之前，必须进行正确的肽加工，包括肽切割和与抗原加工相关转运体(TAP)。根据本发明的方法，可以部分地使用可以包括抗原肽加工分数的抗原肽加工预测来鉴定候选新生抗原。在某些实施例中，抗原肽加工分数可以包括肽切割预测和TAP结合亲和力预测。可以使用经由电脑分析技术或计算机程序(例如，在http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/cleavage.html可获得的MAPPP蛋白酶体切割预测器或在http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html可获得的Rankpep切割预测器)从肽序列来预测肽切割。类似地，可以使用已知方法从肽序列预测TAP结合亲和力，所述方法例如在Doytchinova等人，Transporter associated with antigen processing preselectionofpeptides binding to the MHC:a bioinformatic evaluation[与结合至MHC的肽的抗原加工预选相关的转运体：生物信息学评估]，J Immunol.[免疫学杂志]2004年12月1日；173(11)；Tenzer等人，Modeling the MHC class I pathway by combining predictionsof proteasomal cleavage,TAP transport and MHC class I binding[通过结合蛋白酶体切割、TAP转运和MHC I类结合预测来模拟MHC I类途径]，Cell Mol Life Sci.[细胞与分子生命科学]2005年5月；62(9):1025-37；Zhang等人，PREDTAP:a system for predictionof peptide binding to the human transporter associated with antigenprocessing[PREDTAP：预测与抗原加工相关人类转运体结合的肽的系统],ImmunomeResearch[免疫研究]2006年5月，2:3中所描述；以其全文并且出于所有目的将其内容通过引用结合在此。
基于抗原肽加工预测或分数，候选新生抗原可以被赋予表位(E)或非抗原(NA)的抗原肽加工分类，其中E分类优先于NA分类。
使用MHC结合亲和性截断值，例如小于100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM等的IC50值，具有高于截止值的预测的MHC结合亲和力的候选新生抗原或肽序列可以从进一步的分析或考虑中被排除。
通过分析它们与已知抗原的相似性、预测的表达水平(作为mRNA或蛋白质)、自相似性测量和突变体等位基因频率，可以进一步表征候选新生抗原。可以通过分析肿瘤核酸测序数据来确定突变体等位基因频率，以确定与所述核酸或基因的其他等位基因相比，主题突变体等位基因在所测序的核酸中出现的频率。突变体等位基因频率可以被确定为例如在肿瘤核酸中的平均表达。通常，增加的突变体等位基因频率将表明肽序列或候选新生抗原的临床效用可能性增加。
通过将突变体肽序列与等同的正常肽序列进行比较以便确定相似性分数，从而可以确定自相似性。在某些实施例中，自相似性可以沿着肽序列的逐个氨基酸确定。自相似性可以被确定为百分比值。通常，较低水平的自相似性将表明肽序列或候选新生抗原的临床效用可能性增加。在一个优选的实施例中，使用氨基酸取代PMBEC矩阵来计算相似性分数，分数小于0.05反映突变体肽中与亲本野生型肽的相似性的丧失。(参见http://www.biomedcentral.com/1471-2105/10/394)。
已知的抗原相似性可以通过将肽序列与已知抗原的肽序列进行比较来确定。在某些实施例中，与已知抗原相似性可以沿着肽序列的逐个氨基酸确定。已知的抗原可以从数据库获得，例如在http://www.iedb.org/home_v3.php可获得的免疫表位数据库和分析资源(iedb)。可以给予肽序列或候选新生抗原一个分数，其可以包含例如百分比相似性值，其可以是从一系列与多种已知抗原的比较中所确定的最高值。通常，与已知抗原的较高水平的相似性将表明肽序列或候选新生抗原的临床效用可能性增加。已知的抗原相似性可以例如通过针对IEDB的新生抗原候选物的序列相似性搜索寻找与已知抗原的序列同源性，或者通过针对可能反映新抗原的其他细菌蛋白质的数据库的搜索来确定。
可以通过例如使用RNAseq分析或微阵列测量肿瘤样本中相关基因的表达或通过参考与特定肿瘤类型相关的已知表达数据的数据库(例如，癌症基因组图谱)来预测肽序列的蛋白质或mRNA表达水平。
在各种实施例中，可以对表示以下的两种或更多种的项进行多变量操作以产生多个肽序列中的每一个的新生抗原优先级分数：MHC结合亲和力、抗原肽加工分数、与已知抗原相似性分数、自相似性分数和mRNA表达水平或蛋白质表达水平。在各种实施例中，可以使用权重值来加权一个或多个项，以相对于其他项增加或减少其对新生抗原优先级分数的影响。
在一个示例性实施例中，新生抗原优先级可以通过将规则或一系列规则应用于对多个候选新生抗原中的每一个所确定或鉴定的一个或多个特征来确定。规则可以包括排除条款和将新生抗原候选物特征优先化的多因素分类参数，这些新生抗原候选物特征如MHC结合亲和力、抗原肽加工分数或分类、与已知抗原的相似性、自相似性分数和mRNA表达水平或蛋白质表达水平。此类的实施例的实例可以在下面找到。
在某些实施例中，新生抗原优先化排序可以被包括在根据本发明的方法所制备的报告中。样本报告显示在图3中。所述报告可以由若干所鉴定的候选新生抗原或肽序列的任何组合、相关的新生抗原优先级分数、任何决定性项组合的值组成。在某些实施例中，候选新生抗原可以通过例如从最高到最低的优先性进行排序。报告可以是物理性质的，可以使用如下所述的输出设备打印或书写在纸上，或者可以是电子的，在计算设备上准备和存储。报告可以发送给感兴趣的各方，如被测试的个人或患者，订购的医生或实验室或其他医生或实验室，或其他实体。报告可以以实物形式递送或者可以通过例如电子邮件以电子方式发送。
计算设备
如本领域技术人员所认识到的那样，必要或者最适于执行本发明的方法，可以包括一个或多个计算设备、计算系统或计算机，其包括一个或多个处理器(例如，中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)等)、计算机可读存储设备(例如，主存储器、静态存储器等)或经由总线彼此通信的其组合。
处理器可以包括本领域已知的任何合适的处理器，诸如由Intel以商标XEON E7销售的处理器(圣克拉拉，加利福尼亚州)或由AMD以商标OPTERON 6200销售的处理器(森尼维耳市，加利福尼亚州)。
存储器优选地包括至少一个有形非临时性媒体，其能够存储：可执行以使系统执行在此描述的功能的一个或多个指令组(例如，体现在此中找到的任何方法或功能或上面提到的计算机程序的软件)；数据(例如，药物数据来源的图像、个人数据或药物数据库)；或两者。虽然计算机可读存储设备在示例性实施例中可以是单个媒体，但是术语“计算机可读存储设备”应当被理解为包括存储指令或数据的单个媒体或多个媒体(例如，集中式或分布式数据库和/或关联的高速缓存和服务器)。因此，术语“计算机可读存储设备”应当被理解为包括但不限于：固态存储器(例如，用户识别模块(SIM)卡、安全数字卡(SD卡)、微型SD卡或固态驱动器(SSD))、光学和磁媒体以及任何其他的有形存储媒体。
任何合适的服务都可用于存储，例如亚马逊网络服务、计算系统的存储器、云存储、服务器或其他计算机可读存储器。
根据本发明的输入/输出设备可以包括如下的一个或多个：显示单元(例如，液晶显示器(LCD)或阴极射线管(CRT)监视器)、字母数字输入设备(例如键盘)、指标控制设备(例如鼠标或触控板)、磁盘驱动单元、打印机、信号发生设备(例如扬声器)、触摸屏、按键、加速计、麦克风、蜂窝射频天线、网络接口设备(其可以是例如网络接口卡(NIC)、Wi-Fi卡或者蜂窝调制解调器或者其任何组合)。
本领域的技术人员将认识到，可以采用任何合适的开发环境或编程语言来实现在此描述的方法。例如，在此的方法可以使用Perl、Python、C++、C#、Java、JavaScript、VisualBasic、Ruby on Rails、Groovy和Grails或任何其他合适的工具来实现。对于移动设备，最好使用本地的xCode或Android Java。
实例
实例1
在一个示例性实施例中，给定一组候选新生抗原肽，这可以通过它们与由序列分析确定的体细胞突变的关联来确定，可以应用下面的一组规则。可以如上所述确定MHC结合亲和力以确定预测的IC50亲和力。然后可以将所有具有大于例如500nM的预测IC50亲和力的候选新生抗原从进一步检查中排除。
剩余的候选新生抗原然后可以根据以MHC结合亲和力分类开始的多因素分类来分类。如上所述，候选新生抗原可以被分类为SB或WB(强结合剂和弱结合剂)并且被分类，使得SB肽比WB肽被赋予更高的优先级。
然后可以如上所述，确定或预测候选新生抗原的抗原肽加工。候选新生抗原然后可以被分类为E或NA，并且在其MHC结合亲和力分类排序内进行次级分类，使得分类为E的SB肽优先于分类为NA的SB肽，其顺次优先于分类为E的WB肽。
然后可以根据上述方法确定候选新生抗原的参照基因表达水平。候选新生抗原然后可以在其现处于的MHC结合亲和力和抗原加工优先级内通过参照基因表达水平进行次级分类，其中较高水平的具有比较低水平的更高的优先级。
所得到的候选新生抗原的排序表可以包含候选新生抗原的优先组，优先级最高的候选新生抗原位于列表的顶部。所述列表可以以其他地方描述的报告的形式呈现并递送给要求的个人或实体。
在某些实施例中，方法可包括在对候选新生抗原进行分级之后，基于一个新生抗原的排序用靶向该新生抗原的疫苗或T细胞疗法治疗患者。方法可以包括基于新生抗原的排序实验性地验证候选新生抗原。方法还可以包括基于新生抗原的排序，用靶向新生抗原的疫苗或T细胞疗法引起对患者的治疗。
实例2
在一个第二示例性实施例中，给定一组候选新生抗原肽，这可以通过它们与由序列分析确定的体细胞突变的关联来确定，可以应用下面的一组规则。可以如上所述确定MHC结合亲和力以确定预测的IC50亲和力。然后可以将所有具有大于例如1000nM的预测IC50亲和力的候选新生抗原从进一步检查中排除。
可以针对剩余的候选新生抗原确定RNAseq表达值，并且可以从进一步检查中排除具有低于约10个读数/千碱基/百万映射读数(RPKM)阈值的相关基因RNAseq表达值的肽。
剩余的候选新生抗原然后可以根据以MHC结合亲和力分类开始的多因素分类来分类。如上所述，候选新生抗原可以被分类为SB或WB并且被分类，使得SB肽比WB肽被赋予更高的优先级。
然后可以如上所述，确定或预测候选新生抗原的抗原肽加工。候选新生抗原然后可以被分类为E或NA，并且在其MHC结合亲和力分类排序内进行次级分类，使得分类为E的SB肽优先于分类为NA的SB肽，其顺次优先于分类为E的WB肽。
然后可以使用如上所述的PMBEC比较来确定候选新生抗原的自相似性。候选新生抗原然后可以在其现处于的MHC结合亲和力和抗原加工优先级内通过自相似性分数进行次级分类，较低分数具有比较高分数更高的优先级。
所得到的候选新生抗原的排序表可以包含候选新生抗原的优先组，优先级最高的候选新生抗原位于列表的顶部。所述列表可以以其他地方描述的报告的形式呈现并递送给要求的个人或实体。
实例3
在第三示例性实施例中，给定一组候选新生抗原肽，这可以通过它们与由序列分析确定的体细胞突变的关联来确定，可以应用下面的一组规则。可以如上所述确定MHC结合亲和力以确定预测的IC50亲和力。然后可以将所有具有大于例如750nM的预测IC50亲和力的候选新生抗原从进一步检查中排除。
可以针对剩余的候选新生抗原确定RNAseq表达值，并且可以从进一步检查中排除具有低于约25个读数/千碱基/百万映射读数(RPKM)阈值的相关基因RNAseq表达值的肽。
剩余的候选新生抗原然后可以根据以MHC结合亲和力分类开始的多因素分类来分类。如上所述，候选新生抗原可以被分类为SB或WB并且被分类，使得SB肽比WB肽被赋予更高的优先级。
然后可以如上所述，确定或预测候选新生抗原的抗原肽加工。候选新生抗原然后可以被分类为E或NA，并且在其MHC结合亲和力分类排序内进行次级分类，使得分类为E的SB肽优先于分类为NA的SB肽，其顺次优先于分类为E的WB肽。
然后可根据例如上述方法为候选新生抗原确定与已知抗原的相似性。然后可以基于与已知抗原的100％同一性氨基酸匹配(具有更长的完美匹配反映更高优先级)对候选新生抗原进行次级分类。
所得到的候选新生抗原的排序表可以包含候选新生抗原的优先组，优先级最高的候选新生抗原位于列表的顶部。所述列表可以以其他地方描述的报告的形式呈现并递送给要求的个人或实体。所述列表可用于实验性地验证或选择，施用或导致施用包含靶向来自列表的优先的候选新生抗原的疫苗或T细胞疗法的治疗。
实例4
使用测序数据；已知的来自Fritsch等人，Cancer Immunol Res[癌症免疫学研究]2014的新生抗原；经实验验证的新生抗原来自Robbins等人Nat Med[自然医学]2013；和使用Snyder等人NEJM[新英格兰医学杂志]2014的技术确定的检查点抑制剂的预测性生物标志物；将本发明的方法应用于测序数据，并且使用实例1中描述的规则组的应用，将优先化的肽序列或候选新生抗原与已验证的新生抗原进行比较。
由所述操作产生的优先候选新生抗原的数量和来自Robbins等人，Nat Med[自然医学]2013的经实验验证的新生抗原的排序在下表1中显示：
表1
所述操作将经实验验证的新生抗原排序到所有候选新生抗原的最高20％之内。
所述操作的比较将候选新生抗原与来自Fritsch等人，Cancer Immunol Res[癌症免疫学研究]2014的已知新生抗原作鉴定，其揭示所述操作鉴定出19种已知新生抗原中的18种，如表2所示，灵敏度大于90％。
表2
实例5
使用癌症基因组数据组(例如TCGA)和癌症突变数据库(例如COSMIC)，我们鉴定了在任何肿瘤类型中发生频率为至少1％的1000个以上的频发突变。然后，我们预测了侧接于突变的蛋白质区域以及由于移码突变的neoORF。使用来自NCBI的dbMHC编制北美人群中最普遍的HLAI类等位基因，得到90个独特的4位等位基因，每个等位基因具有≥0.15％的群体频率。
将本发明的方法应用于超过1000个体细胞突变相关肽和该90个HLA等位基因以预测和优先化候选新生抗原。表3提供了部分频发性体细胞突变的列表，其中突变相关肽被预测为所编制的至少一种HLA等位基因的候选新生抗原。所报道的北美人群中HLA等位基因的频率允许评估具有特定新生抗原相关体细胞突变的患者将具有至少一个识别该新生抗原的HLA等位基因的可能性。
这里鉴定的频发性体细胞突变可能产生作为有效的疫苗和T细胞疗法的潜在有希望的靶标的新生抗原。由于这些抗原仅在肿瘤细胞上表达，而不在其他细胞上表达，因此靶向它们的疫苗和T细胞疗法将产生集中的免疫反应并具有降低的细胞毒性。此外，由于这些突变发生在多个患者中，所以它们中的大多数可能赋予肿瘤生长优势，因此一旦根除会阻止肿瘤生长。此外，对于许多突变，所产生的候选新生抗原可能与北美人群的大量亚组中的HLA等位基因结合，这表明靶向这些新生抗原的疫苗或T细胞疗法可能潜在地有益于许多患者。不出所料，上面列出的分析所鉴定的许多突变已被证明可诱导抗肿瘤免疫，包括IDH1-R132H(Schumacher等人，Nature[自然]2014)，KRAS-G12突变(Chaft等人，Clin LungCancer[临床肺癌]2014)和EGFR-VIII缺失(Taylor等人，Curr Cancer Drug Targets[当前肿瘤药物靶标]2012)。
表3
通过引用并入
在本披露的全部内容中已经参考和引用了诸如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网页内容等其他的文献。出于所有目的，所有这些文献都通过引用以其全文结合在此。
等效物
除了在此所示和所述的那些之外，本发明的各种修改及其许多其他实施例对于本领域技术人员而言从此文件的全部内容(包括对在此中引用的科学和专利文献的参考)将变得显而易见。在此的主题包含可以适用于本发明在其各种实施例及其等效物中的实践的重要信息、范例和指导。

Claims (21)

1.一种用于优先化对于患者的候选新生抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
获得多个候选新生抗原；
确定所述多个候选新生抗原的成员的自相似性；
确定所述多个候选新生抗原的成员与已知抗原的相似性；
确定所述多个候选新生抗原的成员的表达水平；
鉴定对所述多个候选新生抗原的成员编码的外显子中的突变体等位基因频率；及将规则应用于所述确定步骤和鉴定步骤的结果，以根据临床显著性的可能性对所述多个候选新生抗原的成员进行排序。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括准备包含经排序的所述多个候选新生抗原的成员的报告。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述多个候选新生抗原衍生自患者肿瘤样本。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述多个候选新生抗原是通过确定从肿瘤样本获得的候选肽的HLA基因型和MHC结合亲和力来获得。
5.如权利要求4所述的方法，其中候选肽的所述HLA基因型和所述MHC结合亲和力是从肽序列数据经由电脑分析来确定。
6.如权利要求4所述的方法，其中候选肽的所述HLA基因型和所述MHC结合亲和力是通过测定来确定。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述候选肽是通过将来自所述肿瘤样本的肽与来自正常样本的相应的肽进行比较而获得，其中候选肽相对于所述相应的肽包含一突变。
8.如权利要求4所述的方法，其中所述应用步骤包括从所述多个候选新生抗原中排除具有大于1000nM的MHC结合亲和力的候选新生抗原。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述应用步骤包括从所述多个候选新生抗原中排除具有大于750nM的MHC结合亲和力的候选新生抗原。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述应用步骤包括从所述多个候选新生抗原中排除具有大于500nM的MHC结合亲和力的候选新生抗原。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述多个候选新生抗原各自被编配为强结合(SB)或弱结合(WB)的MHC分类，并且所述应用步骤包括对所述多个新生抗原进行排序，使得SB候选新生抗原排序高于WB候选新生抗原。
12.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
确定所述多个新生抗原的成员的抗原肽加工分类。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述多个新生抗原被编配为表位(E)或非抗原(NA)的分类，并且所述应用步骤包括对所述多个新生抗原进行排序，使得E候选新生抗原排序高于NA候选新生抗原。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述应用步骤包括对所述多个新生抗原进行排序，使得具有较低自相似性的候选新生抗原排序高于具有较高自相似性的新生抗原。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述表达水平包含RNAseq表达值，并且所述应用步骤包括从所述多个候选新生抗原中排除具有表达值低于10个读数/千碱基/百万映射读数(RPKM)的候选新生抗原。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述应用步骤包括从所述多个候选新生抗原中排除具有表达值低于25个读数/千碱基/百万映射读数(RPKM)的候选新生抗原。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述应用步骤包括基于与已知抗原的部分的100％的氨基酸同一性对所述多个新生抗原进行排序，使得与已知抗原的较长部分具有氨基酸同一性的候选新生抗原排序高于与已知抗原的较短部分具有氨基酸同一性的候选新生抗原。
18.如权利要求12所述的方法，其中所述抗原肽加工分类是使用肽切割预测或与抗原加工相关转运体(TAP)亲和力预测来确定。
19.如权利要求2所述的方法，其中所述获取、确定、鉴定或应用步骤中的一个或多个是使用计算机进行，所述计算机包含耦合到有形非暂态存储器和输入/输出设备的处理器。
20.如权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括将所述报告发送到所述输出设备。
21.一种用于鉴定共有新生抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
选择于多于一种肿瘤类型中发生的多个频发突变；
基于所预测的肽序列确定所述多个频发突变中哪个是潜在的新生抗原；及
基于跨多种肿瘤类型的HLA I类等位基因的流行率和频发突变的流行率，将所述潜在的新生抗原鉴定为共有新生抗原。
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