CN108117994A - 一种草菇菌种保藏的培养基制备方法和培养基及其保藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，和该制备方法制备得到的培养基及使用该培养基对草菇菌种进行保藏的方法，属于菌种保藏领域，将稻草经过特定的碱溶液和超声处理后，与普通的琼脂培养基一起，用于草菇菌种的保藏。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明以稻草为原料，原料成本低，本发明的培养基的保藏不需要在低温下保藏，进一步降低成本，也不需要投入冰箱等器械或使用液氮、海藻糖等高成本的原料，经证实，保藏时间可以达到30天以上，活力基本没有降低。

Description

一种草菇菌种保藏的培养基制备方法和培养基及其保藏方法

技术领域

本发明涉及一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，和该制备方法制备得到的培养基及使用该培养基对草菇菌种进行保藏的方法，属于菌种保藏领域。

背景技术

草菇的味道鲜美，肉质脆嫩，是一种深受群众喜爱的农产品。由于其生产周期短，从播种到采收只需要10天左右，一般13-20天完成一个生长周期，是目前经济效益最好的食用菌之一。2016年我国草菇产量213304吨，广东省草菇产量63000吨，占全国产量30％左右，居全国首位。

草菇是一种高温型食用菌，。据史料记载，草菇的栽培和食用最早见于我国南部地区。据福建《宁德县志》载：“城北瓮窑禾朽，雨后生蕈，宛如星斗丛簇竞吐，农人集而投于市。”可见，腐烂的稻草是草菇天然的栽培基质。在上世纪80年代之前，稻草一直是草菇栽培的主要原料。此后，技术人员开发现了废棉、中药渣等新型栽培基质并开发出相应的栽培技术，获得了草菇高产的技术。近年来，来自工业生产的副产物废棉被发现存在安全隐患，而来自农业下脚料的稻草则重新被重视。

优质的草菇菌种是草菇生产的基础，而草菇保藏问题一直未有得到很好的解决。低温、隔绝空气、低营养或增加营养吸收难度等限制菌丝体生长而又不致死亡的条件，是食用菌保藏技术的基本原理。但是，草菇菌种不耐低温，较长时间保藏在10℃以下环境里会失去活力，甚至死亡，草菇菌种不能像其他食用菌使用4-10℃环境进行保藏，其菌丝在此条件下发生自溶。目前，草菇保藏方法主要有：传代培养保藏法、液氮超低温保藏法、使用海藻糖等保藏剂。但是，草菇营养繁殖体菌丝由于生长快速，容易发生变异、老化和退化。长期的继代培养也会造成草菇种质退化，表现为生长速度下降、菌丝密度降低、水解酶产量下降等。而且传代培养保藏法需要间隔一段时间进行传代操作，比较繁琐，污染率也高。而液氮保藏法技术较为复杂，在浸入液氮前需要程序性降温，液氮容器及补充液氮的费用高，降低了草菇的经济价值。而海藻糖等保藏剂也存在价格昂贵，经济价值低的缺陷。

发明内容

针对以上不足，本发明提供一种简单经济的草菇菌种保藏的培养基，该培养基的制备方法以及采用该培养基进行菌种保藏的方法。

本发明通过以下方案达到上述目的：

发明人创造性地发现，将稻草经过特定的碱溶液和超声处理后，与普通的琼脂培养基一起，用于草菇菌种的保藏，不仅可以长期保持其活力，而且不需要在低温下保藏，容易操作，不需要增添其他器械，稻草价格低，成本低，具有经济价值和推广价值。

在本发明的第一方面，提供一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，该方法包括：

(1)、稻草的碱-超声处理：将稻草茎段采用重量百分比为2-5％的氧化钙悬浊液处理，稻草茎段与悬浊液用量比为1:20以上，同时进行超声处理，超声结束后得到静置处理12-18小时，优选12小时；

(2)、培养基配制：将处理后的稻草茎段清洗并且灭菌，将稻草茎段排布在无菌培养皿中，从空隙处倒入重量百分浓度2-4％的琼脂溶液，优选2％，得到培养基。

优选的，在上述方法中，超声处理的条件为：温度30-40℃，超声频率40-60kHz，超声输出功率140-150W，时间30-60min。

进一步优选的，在上述方法中，超声处理的条件为：温度30℃，超声频率60kHz，超声输出功率140W，时间30min。

进一步优选的，在上述方法中，超声处理两次，间隔1小时。

进一步优选的，在上述方法中，超声结束以后在32℃静置处理12-18小时，优选12小时。

优选的，在上述方法中，将稻草茎段采用重量百分比为2-5％的氧化钙悬浊液的玻璃器皿中处理，在超声结束后，玻璃器皿封口，静置处理12-18小时，优选12小时。

优选的，在上述方法中，选择的稻草茎段为包裹有叶鞘的稻草茎段。

优选的，在上述方法中，选择的稻草茎段为未经化学品处理过的稻草茎段。

优选的，在上述方法中，稻草茎段为4-5cm的稻草茎段。

进一步优选的，在上述方法中，将稻草茎段清洗后，再采用2-5％氧化钙悬浊液处理。

进一步优选的，所述清洗的方法包括：将稻草茎段竖立，完全浸没水中，流水冲洗，倒去余水，清洗三次至五次。

优选的，在上述方法中，将稻草茎段排布在无菌培养皿中的方式为采用将稻草茎段长边相挨的方式一字排布在无菌培养皿中。

优选的，在上述方法中，倒入琼脂溶液的量不没过稻草茎段。

在一个优选的实施例中，一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，该方法包括：

(1)、稻草的碱-超声处理：将包裹有叶鞘的4-5cm的稻草茎段清洗，将清洗好的稻草茎段浸没在盛有重量百分浓度为2-5％的氧化钙悬浊液中，稻草茎段与悬浊液用量比例为稻草重(g)：悬浊液体积(mL)在1:20以上，同时，将处理的稻草茎段进行超声处理，超声处理条件为：温度30-40℃，超声频率40-60kHz，超声输出功率140-150W，时间30-60min，超声操作两次，间隔1h，间隔期间温度保持30℃，置32℃恒温静置处理12-18小时，将处理后的稻草茎段取出，清洗，灭菌；

(2)、培养基配制：将上述已处理并灭菌后的稻草茎段，以稻草茎段长边相挨的方式一字排布在无菌培养皿中，然后在培养皿中稻草茎段外的空隙地方倒入重量百分浓度2-4％琼脂溶液，倒入琼脂溶液的量不没过稻草茎段，静置冷却凝固，得到培养基。

在另一优选的实施例中，一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，该方法包括：

(1)、稻草的碱-超声处理：选择未经化学品处理过的水稻秸秆的筒状、有多层叶鞘包裹的茎部，弃去叶片、花序等部分，将水稻秸秆的茎部切段，切段时包裹的叶鞘不脱落，得到包裹有叶鞘的4-5cm的稻草茎段，将稻草茎段清洗，将稻草茎段竖立，完全浸没水中，流水冲洗，倒去余水，如此清洗三次至五次，将清洗好的稻草茎段浸没在盛有重量百分比为2-5％的氧化钙悬浊液的玻璃器皿中，稻草茎段与悬浊液用量比例为稻草重(g)：悬浊液体积(mL)在1:20以上，同时，将盛有稻草茎段的玻璃器皿置超声处理，超声处理条件为：温度30℃，超声频率60kHz，超声输出功率140W，时间30min，超声操作两次，间隔1h，间隔期间温度保持30℃，超声结束后将盛有稻草的玻璃器皿取出封口，置32℃恒温静置处理12小时，将处理后的稻草茎段取出，浸泡在水中，用上述清洗方法清洗五次，将清洗好的稻草茎段，沥干滴水，重新浸没在纯化水中，蒸汽灭菌处理，灭菌条件为121℃，0.1MPa，20min；

(2)、培养基配制：将上述已处理并灭菌后的稻草茎段，沥干滴水，以稻草茎段长边相挨的方式一字排布在无菌培养皿中，然后在培养皿中稻草茎段外的空隙地方倒入已灭菌的2％琼脂溶液，倒入琼脂溶液的量不没过稻草茎段，静置冷却凝固，得到培养基。

在本发明的第二方面，提供一种采用上述制备方法制备得到的培养基。

采用上述制备得到的培养基，得到在琼脂固体上排布有经过碱-超声处理的稻草的培养基。

稻草的处理方式已经在上述制备方法中详细描述。

发明人研究发现，在本发明这样的培养基中，琼脂基质一方面可以起到生长过渡的作用，让新接种的接种块的菌丝能尽快恢复并延伸到稻草上；另一方面可以起到保湿作用，在菌丝生长满稻草之前维持培养环境湿度；琼脂中不添加其他物质，起到营养限制作用，让更多菌丝体向稻草中生长、分解其中物质获得营养。

在本发明中，采用2-5％的氧化钙悬浊液对稻草进行处理而不使用其他碱性溶液，发明人分析发现，这首先是因为钙离子是草菇需要较多的一种元素，其次钙离子更容易与其他负电基团形成不易溶于水的物质，稳定了最终培养基pH；用氧化钙而不用氢氧化钙等其它溶液主要是利用氧化钙溶于水时产生的热量，热量有助提高稻草碱处理的效率，也不使用氢氧化钠等溶液，虽然也具有强碱性和溶解时产热，但钠离子与其他负电基团形成的盐类水溶解性较大，容易造成培养基离子毒害。

在本发明的第三方面，提供一种采用上述培养基对草菇菌种进行保藏的方法。

一种采用上述培养基对草菇菌种进行保存的方法，在培养基的琼脂部分靠近稻草茎段的任意一侧接入草菇菌种，置于30-35℃避光培养，优选32℃。

上述草菇菌种在使用时，取出带有菌丝体的稻草茎段直接转接即可，操作方便。

经发明人证实，采用本发明的方法对草菇菌种进行保藏，采用封口膜或保鲜膜封闭培养基边缘的话至少可保藏30天以上。

经发明人证实，与不处理的稻草制备的保藏培养基相比，本发明的培养基，在相同的培养时间内，能显著减缓草菇菌丝体的衰老速度。如实验结果的图1所示，不处理的稻草制备的保藏培养基中，草菇菌丝体上出现了的厚垣孢子明显多于本发明的培养基。厚垣孢子是真菌在遇到逆境时形成的一种维持和延续生命的结构，形成厚垣孢子后表明菌丝体开始衰老。因此可推断，本发明培养基更容易维持草菇菌丝体的生理年轻度，即利于作为菌种的最重要因素。

本发明创造性地采用经过碱-超声处理的稻草来保藏草菇菌种，可以克服草菇菌种无法低温保藏，或者必须采用液氮或者转接传代保藏的缺点。

发明人发现，草菇菌丝体能够在稻草上生长并保持可育性，当将稻草限制在较小用量并且在经过本发明处理后，可以作为草菇菌种的保藏基质。

发明人猜测，这可能是因为稻草中的纤维素、半纤维素等物质被酶解后，能提供足够的营养供草菇结实，完成生命周期。稻草的主要成分是纤维素，其次为半纤维素和木质素，三者很大一部分在天然状态下，呈特定的链接交错网状结构，称为结晶性纤维素。结晶性纤维素不利于草菇酶解获取营养，采用一定的物理或化学方法处理稻草，可破坏纤维素的结晶性，改变稻草纤维束的致密性和改变可溶性成分析出。例如1％氢氧化钠溶液常温处理稻草1h后发现，稻草可检测的纤维素含量增加、部分半纤维素及木质素被去除，结晶性结构被破坏；保水值升高，使其对化学溶液的吸收能力越强，酶与纤维素的接触机会越多。而物理处理方面，机械粉碎、超声波/微波、高温水煮等对增大原料内孔径或降低纤维素结晶度有作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明以稻草为原料，原料成本低，本发明的培养基的保藏不需要在低温下保藏，进一步降低成本，也不需要投入冰箱等器械或使用液氮、海藻糖等高成本的原料，经证实，保藏时间可以达到30天以上，活力基本没有降低。

附图说明

图1为草菇菌种接种于不同的保藏培养基后的生长情况图。

图2为不同保藏培养基保藏后的草菇菌种接种于CPDA培养基上的生长情况图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1：

一种草菇菌种保藏的培养基的制备：

1、稻草的选择：所用稻草为干净、无霉烂，未经化学品处理过的水稻秸秆，采用筒状、有多层叶鞘包裹的茎部，弃去叶片、花序等部分。

2、稻草预处理：将上述的稻草茎切段，每段约5cm，注意切断后包裹的叶鞘不脱落，然后用自来水清洗，清洗方法为将茎段竖立，完全浸没水中，流水稍冲洗，倒去余水，如此清洗三次。

3、稻草碱-超声处理：将清洗好的稻草茎段浸没在盛有2％重量百分比的氧化钙悬浊液的玻璃器皿中，稻草茎段与悬浊液用量比例至少1:20以上[稻草重(g)：悬浊液体积(mL)]，将盛有稻草茎段的玻璃器皿置超声波清洁仪上超声处理，超声处理条件为：水浴温度30℃，超声频率60kHz，超声输出功率140W，时间30min，超声操作两次，期间间隔1h，间隔期间水浴温度保持30℃，超声结束后将盛有稻草的玻璃器皿取出，封口，置32℃培养箱恒温静置处理12h。

4、清洗处理后的稻草：将处理过后的稻草茎段取出，浸泡再干净自来水中清洗，清洗方法采用步骤2的清洗方法，清洗五次。

5、处理后的稻草灭菌：取步骤4中清洗好的处理后的稻草茎段，沥干滴水，重新浸没在纯化水中，进行蒸汽灭菌处理，灭菌条件为121℃，0.1MPa，20min。

6、培养基配制：取步骤5中已灭菌的处理后的稻草茎段，在超净工作台中沥干滴水，以稻草茎段长边相挨的方式一字排布在无菌培养皿中，然后在培养皿中稻草茎段外的空隙地方趁热倒入已灭菌的2％琼脂溶液，倒入琼脂溶液的量不没过稻草茎段，然后静置冷却待琼脂凝固，得到培养基。

实施例2

采用实施例1制备得到的培养基进行草菇菌种保藏，在培养基琼脂部分靠近稻草茎段的任意一侧接入草菇菌种，置32℃培养箱避光培养。

经过证实，可以保藏达到30天以上而活力不降低。

实施例3

实施例3提供一种草菇菌种保藏的培养基的制备，制备方法与实施例1相似，不同的是，采用5％重量百分比的氧化钙悬浊液处理。

实施例4

采用实施例3制备得到的培养基进行草菇菌种保藏，在培养基琼脂部分靠近稻草茎段的任意一侧接入草菇菌种，置32℃培养箱避光培养。

经过证实，可以保藏达到30天以上而活力不降低。

实施例3

将草菇菌种分别不同的保藏培养基，分别为CPDA培养基(食用菌传代常规培养基)，实施例1培养基(2％U)、实施例3培养基(5％U)和CK培养基(为稻草茎段不经碱-超声处理而其他步骤与实施例1相同所制作的培养基)，其中，CPDA培养基的组分按照重量百分比计为：土豆20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、pH8.3。在各培养基上32℃培养箱避光培养9天后的生长情况如图1所示。

从如图1可以看出，培养9天后，草菇菌丝基本布满培养基表面，使用CPDA培养基(图中编号CPDA)和CK培养基(没经过碱-超声处理的稻草茎段制作的培养基)，草菇菌丝形成的红褐色厚垣孢子明显多于经过处理的稻草茎段制成的培养基(2％U和5％U)。厚垣孢子虽然是草菇菌丝体直接形成的无性繁殖体，但也是菌丝遇到逆境、或者衰老过程中产生的抗逆性生理反应。厚垣孢子的延后生成，可认为是草菇菌丝体未遇到逆境或未衰老的表现，这说明，与其他培养基相比，本发明的保藏培养基在一定时间内延缓了菌丝体衰老。

实施例4

分别采用保藏后的菌种重新接种，设置三组，分别为对照组，为保藏于CPDA培养基上的菌种在32℃保藏30天后接种于新CPDA培养基上的菌丝生长情况，2％U和5％U是指采用实施例2保藏的30天后的菌种和实施例4保藏的30天后的菌种分别重新接种于CPDA培养基上的菌丝生长情况，接种时分别从2％和5％氧化钙悬浊液处理的培养基中取出其中一根长有菌丝的稻草茎段作为种源，接种于新的CPDA培养基上，置32℃培养箱避光培养，以检测菌种活力。生长4天后的情况如图2所示。

从图2可以看出，经培养4天后，菌丝体从稻草茎段长出并长满新培养基表面，和对照组(在CPDA培养基上的菌丝体传代至新的CPDA培养基上)相比，2％U和5％U的菌丝颜色、形态、致密度、气生菌丝的状态都没有明显的差异，表明采用本发明方法保藏的草菇菌种，在32℃下保藏30天，再传代时，菌丝萌发能力和活力正常。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，其特征在于，该方法包括：

(1)、稻草的碱-超声处理：将稻草茎段采用重量百分比为2-5％的氧化钙悬浊液处理，稻草茎段与悬浊液用量比为1:20以上，同时进行超声处理，超声结束后得到静置处理12-18小时；

(2)、培养基配制：将处理后的稻草茎段清洗并且灭菌，将稻草茎段排布在无菌培养皿中，从空隙处倒入重量百分浓度2-4％的琼脂溶液，得到培养基。

2.根据权利要求1所述的一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，其特征在于，超声处理的条件为：温度30-40℃，超声频率40-60kHz，超声输出功率140-150W，时间30-60min。

3.根据权利要求1或2所述的一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，其特征在于，超声处理两次，间隔30-60分钟。

4.根据权利要求1至3中任一所述的一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，其特征在于，超声结束以后在32℃静置处理12-18小时。

5.根据权利要求1至4中任一所述的一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，其特征在于，将稻草茎段采用2-5％氧化钙悬浊液的玻璃器皿中处理，在超声结束后，玻璃器皿封口，静置处理12-18小时。

6.根据权利要求1至5中任一所述的一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，其特征在于，选择的稻草茎段为包裹有叶鞘的稻草茎段。

7.根据权利要求1至6中任一所述的一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，其特征在于，将稻草茎段排布在无菌培养皿中的方式为采用将稻草茎段长边相挨的方式一字排布在无菌培养皿中。

8.根据权利要求1至7中任一所述的一种草菇菌种保藏的培养基制备方法，其特征在于，倒入琼脂溶液的量不没过稻草茎段。

9.一种采用权利要求1至8中任一所述的制备方法制备得到的培养基。

10.一种采用权利要求9所述的培养基对草菇菌种进行保藏的方法，在培养基的琼脂部分靠近稻草茎段的任意一侧接入草菇菌种，置于30-35℃避光培养。