CN108025069A - 使用变应素-1拮抗剂的癌症免疫增强剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个目的是提供一种用于抑制癌症的进展、抑制癌症的复发和/或治疗癌症的试剂，其含有能够增强针对癌症的免疫力的新的活性成分。根据本发明的变应素‑1拮抗剂能够增强针对癌症的免疫力，并且可以用于抑制癌症的进展、抑制癌症的复发和/或治疗癌症。特别地，根据本发明的变应素‑1拮抗剂可用于肿瘤免疫治疗剂治疗效果不充分的癌症患者的治疗，或与抗癌药物组合的癌症疗法。

Description

使用变应素-1拮抗剂的癌症免疫增强剂
发明领域
本发明涉及用于癌症的免疫增强剂，其含有变应素-1拮抗剂作为活性成分。更具体而言，本发明涉及抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的试剂，其特征在于单独施用变应素-1拮抗剂或其与抗癌剂的组合。
发明背景
与通过外科手术，放射疗法或通过抗癌剂或分子靶向剂的药物疗法的常规疗法不同，癌症免疫疗法通过作用于癌症患者固有的免疫监视，由此增强针对癌症的免疫力来抑制癌症的进展或治疗癌症。近年来对癌症免疫研究的结果表明癌症部位周围的免疫抑制环境参与癌症的进展，并且癌症本身利用系统来避免免疫监视。作为用于逃避系统(avoidance system)的分子，已知所谓的免疫检查点分子，如CTLA-4和PD-1或作为其配体的PD-L1(PTL1和2)，并且抑制剂已经展示显著的临床效果。
然而，的确也是：即使使用免疫检查点抑制剂，仍然存在未观察到充分的治疗效果的癌症患者。因此，迫切需要用于癌症患者的新疗法和对建立所述疗法至关重要的靶分子的功能性理解。
同时，本发明涉及的变应素-1是具有在胞内区的ITIM结构域和胞外免疫球蛋白样结构的膜相关受体，并且其在肥大细胞上强表达。通过使用敲除小鼠对分子的分析已知，该分子抑制变应性反应，诸如通过IgE受体信号传导来抑制脱粒(degranulation)，从而抑制过敏性反应(anaphylaxis)或抑制由螨过敏原诱导的哮喘反应(NPL1，2和3)。
然而，尚不充分已知该分子抑制癌症免疫力。
[引文列表]
[专利文献]
[PTL1]WO 2006/121168
[PTL2]日本专利申请公开号2006-340714
[非专利文献]
[NPL1]Nature Immunology，2010，Vol.11，No.7，p.601-608
[NPL2]PLOS ONE，2013，Vol.8，No.10，e76160
[NPL3]Allergology&Immunology，2011，Vol.18，No.4，p.506-514
发明概述
[技术问题]
本发明的一个目的是提供用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的试剂，其含有能够增强针对癌症的免疫力的新的活性成分。
[解决问题的技术方案]
本发明的发明人进行了广泛的研究，并且结果发现变应素-1的拮抗剂可以解决上述问题，从而完成了本发明。
因此，本发明如下：
[1]用于癌症的免疫增强剂，其含有变应素-1(Allergin-1)拮抗剂作为活性成分。
[2].根据前述项[1]所述的试剂，用于抑制癌症的进展，抑制癌症的复发和/或治疗癌症。
[3]用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的试剂，其含有变应素-1拮抗剂作为活性成分。
[4].根据前述项[1]-[3]中任一项所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂抑制变应素-1的免疫抑制性胞内信号传导。
[5].根据前述项[1]-[4]中任一项所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂是抗变应素-1抗体、变应素-1结合蛋白或变应素-1融合蛋白。
[6].根据前述项[5]所述的试剂，其中所述抗变应素-1抗体是抗人变应素-1抗体。
[7].根据前述项[5]或[6]所述的试剂，其中所述抗变应素-1抗体是单克隆抗体。
[8].根据前述项[7]所述的试剂，其中所述抗变应素-1单克隆抗体为IgG1或IgG4同种型。
[9].根据前述项[7]或[8]所述的试剂，其中所述抗变应素-1单克隆抗体是选自由以下组成的组的抗体片段：Fab、Fab’、Fv、scFv和(Fab’)2片段。
[10].根据前述项[7]-[9]中任一项所述的试剂，，其中所述抗变应素-1单克隆抗体是人源化抗体或人抗体。
[11].根据前述项[7]所述的试剂，其中所述抗变应素-1单克隆抗体是人源化或人的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体。
[12].根据前述项[7]-[11]中任一项所述的试剂，其中，抗变应素-1单克隆抗体以5x10-8M或更少的Kd值与人变应素-1结合。
[13].根据前述项[7]-[11]中任一项所述的试剂，其中，抗变应素-1单克隆抗体以1x10-8M或更少的Kd值与人变应素-1结合。
[14].根据前述项[7]-[11]中任一项所述的试剂，其中，抗变应素-1单克隆抗体以以5x10-9M或更少的Kd值与人变应素-1结合。
[15].根据前述项[7]-[11]中任一项所述的试剂，其中，抗变应素-1单克隆抗体以1x10-9M或更少的Kd值与人变应素-1结合。
[16].根据前述项[5]或[6]所述的试剂，其中所述抗变应素-1抗体是变应素-1多特异性抗体，其识别存在于一个变应素-1分子上的两个或更多个不同表位。
[17].根据前述项[2]-[16]中任一项所述的试剂，其中所述癌症是实体癌或血液癌(hematologic cancer)。
[18].根据前述项[17]所述的试剂，其中所述实体癌是选自以下的一种或多种：恶性黑素瘤(malignant melanoma)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、头颈癌(head and neck cancer)、肾细胞癌(renal cellcancer)、透明细胞性肾细胞癌(clear cell renal cell cancer)、乳腺癌(breastcancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢透明细胞腺癌(ovarian clear celladenocarcinoma)、骨和软组织肉瘤(bone and soft tissue sarcoma)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、神经胶质肉瘤(gliosarcoma)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、子宫癌(uterine cancer)、肛门癌(anal cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、食道癌(esophageal cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、胃癌(stomach cancer)、尿路上皮癌(urothelial cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、输卵管癌(fallopian tube cancer)、原发性腹膜癌(primary peritoneal cancer)、胸膜间皮瘤(pleural mesothelioma)和骨髓增生性综合征(myeloproliferative syndrome)。
[19].根据前述项[17]所述的试剂，其中所述血液癌是选自以下的一种或多种：多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、急性髓样白血病(acute myeloid leukaemia)和慢性髓样白血病(chronic myeloid leukaemia)。
[20].根据前述项[2]-[19]中任一项所述的试剂，其施用于抗癌药物的治疗效果不充分的癌症患者。
[21].根据前述项[20]所述的试剂，其中所述抗癌药物是肿瘤免疫治疗剂。
[22].根据前述项[21]所述的试剂，其中所述肿瘤免疫治疗剂是选自以下的一种或多种：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、PD-L1融合蛋白、PD-L2融合蛋白、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗Tim3抗体、抗KIR抗体、抗-BTLA抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗HVEM抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CD28抗体、抗CCR4抗体和抗CD4抗体。
[23].根据前述项[22]的试剂，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗(Nivolumab)、REGN-2810、派姆单抗(Pembrolizumab)、PDR-001、BGB-A317、STI-A1110或AMP-514。
[24].根据前述项[22]所述的试剂，其中所述抗PD-L1抗体是阿替珠单抗(Atezolizumab)、阿维单抗(Avelumab)、度伐单抗(Durvalumab)或BMS-936559。
[25].根据前述项[22]所述的试剂，其中所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(Ipilimumab)或曲美木单抗(Tremelimumab)。
[26].根据前述项[22]所述的试剂，其中所述PD-L2融合蛋白是AMP-224。
[27].根据前述项[1]-[26]中任一项所述的试剂，其中进一步施用一种或多种抗癌药物。
[28].根据前述项[27]所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂和所述抗癌药物作为不同制剂施用。
[29].根据前述项[28]所述的试剂，其中，在施用变应素-1拮抗剂之前，施用抗癌药物。
[30].根据前述项[28]所述的试剂，其中，在施用抗癌药物之前施用变应素-1拮抗剂。
[31].根据前述项[27]-[30]中任一项所述的试剂，其中，存在变应素-1拮抗剂和抗癌药物同时施用的时期。
[32].根据前述项[27]或[28]所述的试剂，其中，变应素-1拮抗剂和抗癌药物同时施用。
[33].根据前述项[27]或[32]所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂和所述抗癌药物作为一种制剂施用。
[34].根据前述项[27]-[33]中任一项所述的试剂，其中所述抗癌药物是肿瘤免疫治疗剂。
[35].根据前述项[34]所述的试剂，其中所述肿瘤免疫治疗剂是选自以下的一种或多种：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、PD-L1融合蛋白、PD-L2融合蛋白、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗Tim3抗体、抗KIR抗体、抗-BTLA抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗HVEM抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CD28抗体、抗CCR4抗体和抗CD4抗体。
[36].根据前述项[35]的试剂，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗、REGN-2810、派姆单抗、PDR-001、BGB-A317、STI-A1110或AMP-514。
[37].根据前述项[35]所述的试剂，其中所述抗PD-L1抗体是阿替珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或BMS-936559。
[38].根据前述项[35]所述的试剂，其中所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。
[39].根据前述项[35]所述的试剂，其中，PD-L2融合蛋白是AMP-224。
[40].根据前述项[35]所述的试剂，其中，抗CD4抗体是IT1208。
[41].根据前述项[1]至[40]中任一项所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂增强I型干扰素(诸如干扰素-α和/或干扰素-β)的产生。
[42].根据前述项[1]-[41]中任一项所述的试剂，其中，变应素-1拮抗剂刺激CD8阳性T细胞的增殖。
[43].根据前述项[1]-[42]中任一项所述的试剂，其中，变应素-1拮抗剂活化CD8阳性T细胞。
[44].用于癌症的免疫增强剂，其含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述癌症是选自以下的一种或多种：恶性黑素瘤,非小细胞肺癌，小细胞肺癌，头颈癌，肾细胞癌，透明细胞性肾细胞癌，乳腺癌，卵巢癌，卵巢透明细胞腺癌，骨和软组织肉瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质肉瘤，鼻咽癌，子宫癌，肛门癌，结肠直肠癌，肝细胞癌，食道癌，胰腺癌，胃癌，尿路上皮癌，前列腺癌，输卵管癌，原发性腹膜癌，胸膜间皮瘤和骨髓增生性综合征。
[45].用于癌症的免疫增强剂，其含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述癌症是选自以下的一种或多种：多发性骨髓瘤，恶性淋巴瘤(诸如非霍奇金淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma))和霍奇金淋巴瘤)和白血病(诸如急性髓样白血病和慢性髓样白血病)。
[46].用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的试剂，其含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述癌症是选自以下的一种或多种：恶性黑素瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，头颈癌，肾细胞癌，透明细胞性肾细胞癌，乳腺癌，卵巢癌，卵巢透明细胞腺癌，骨和软组织肉瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质肉瘤，鼻咽癌，子宫癌，肛门癌，结肠直肠癌，肝细胞癌，食道癌，胰腺癌，胃癌，尿路上皮癌，前列腺癌，输卵管癌，原发性腹膜癌，胸膜间皮瘤和骨髓增生性综合征。
[47]用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的试剂，其含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述癌症是选自以下的一种或多种：多发性骨髓瘤，恶性淋巴瘤(诸如非霍奇金淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤)和白血病(诸如急性髓样白血病和慢性髓样白血病)。
[48]用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的试剂，其含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中将所述试剂施用于肿瘤免疫治疗剂的治疗效果不充分的癌症患者，并且其中所述癌症是选自以下的一种或多种：恶性黑素瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，头颈癌，肾细胞癌，透明细胞性肾细胞癌，乳腺癌，卵巢癌，卵巢透明细胞腺癌，骨和软组织肉瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质肉瘤，鼻咽癌，子宫癌，肛门癌，结肠直肠癌，肝细胞癌，食道癌，胰腺癌，胃癌，尿路上皮癌，前列腺癌，输卵管癌，原发性腹膜癌，胸膜间皮瘤和骨髓增生性综合征。
[49]用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的试剂，其含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中将所述试剂施用于肿瘤免疫治疗剂的治疗效果不充分的癌症患者，并且其中所述癌症是选自以下的一种或多种：多发性骨髓瘤，恶性淋巴瘤(诸如非霍奇金淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤)和白血病(诸如急性髓样白血病和慢性髓样白血病)。
[50].用于抑制一种或多种癌症进展，抑制一种或多种癌症复发和/或治疗一种或多种癌症的试剂，所述癌症为选自以下的癌症：恶性黑素瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，头颈癌，肾细胞癌，透明细胞性肾细胞癌，乳腺癌，卵巢癌，卵巢透明细胞腺癌，骨和软组织肉瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质肉瘤，鼻咽癌，子宫癌，肛门癌，结肠直肠癌，肝细胞癌，食道癌，胰腺癌，胃癌，尿路上皮癌，前列腺癌，输卵管癌，原发性腹膜癌，胸膜间皮瘤和骨髓增生性综合征，其含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述试剂与一种或多种肿瘤免疫治疗剂一起施用，其中所述肿瘤免疫治疗剂选自：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、PD-L1融合蛋白、PD-L2融合蛋白、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗Tim3抗体、抗KIR抗体、抗-BTLA抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗HVEM抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CD28抗体、抗CCR4抗体和抗CD4抗体。
[51].用于抑制一种或多种癌症进展，抑制一种或多种癌症复发和/或治疗一种或多种癌症的试剂，所述癌症为选自以下的癌症：多发性骨髓瘤，恶性淋巴瘤(诸如非霍奇金淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤)和白血病(诸如急性髓样白血病和慢性髓样白血病)，所述试剂含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述试剂与一种或多种肿瘤免疫治疗剂一起施用，其中所述肿瘤免疫治疗剂选自：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、PD-L1融合蛋白、PD-L2融合蛋白、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗Tim3抗体、抗KIR抗体、抗-BTLA抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗HVEM抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CD28抗体、抗CCR4抗体和抗CD4抗体。
[52].用于抑制一种或多种癌症进展，抑制一种或多种癌症复发和/或治疗一种或多种癌症的试剂，所述癌症为选自以下的癌症：恶性黑素瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，头颈癌，肾细胞癌，透明细胞性肾细胞癌，乳腺癌，卵巢癌，卵巢透明细胞腺癌，骨和软组织肉瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质肉瘤，鼻咽癌，子宫癌，肛门癌，结肠直肠癌，肝细胞癌，食道癌，胰腺癌，胃癌，尿路上皮癌，前列腺癌，输卵管癌，原发性腹膜癌，胸膜间皮瘤和骨髓增生性综合征，所述试剂含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述试剂与一种或多种抗PD-1抗体一起施用，所述抗PD-1抗体选自：纳武单抗、REGN-2810、派姆单抗、PDR-001、BGB-A317、STI-A1110或AMP-514。
[53].用于抑制一种或多种癌症进展，抑制一种或多种癌症复发和/或治疗一种或多种癌症的试剂，所述癌症为选自以下的癌症：多发性骨髓瘤，恶性淋巴瘤(诸如非霍奇金淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤)和白血病(诸如急性髓样白血病和慢性髓样白血病)，所述试剂含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述试剂与一种或多种抗PD-1抗体一起施用，所述抗PD-1抗体选自：纳武单抗、REGN-2810、派姆单抗、PDR-001、BGB-A317、STI-A1110或AMP-514。
[54].用于抑制一种或多种癌症进展，抑制一种或多种癌症复发和/或治疗一种或多种癌症的试剂，所述癌症为选自以下的癌症：恶性黑素瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，头颈癌，肾细胞癌，透明细胞性肾细胞癌，乳腺癌，卵巢癌，卵巢透明细胞腺癌，骨和软组织肉瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质肉瘤，鼻咽癌，子宫癌，肛门癌，结肠直肠癌，肝细胞癌，食道癌，胰腺癌，胃癌，尿路上皮癌，前列腺癌，输卵管癌，原发性腹膜癌，胸膜间皮瘤和骨髓增生性综合征，所述试剂含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述试剂与一种或多种抗PD-1抗体一起施用，所述抗PD-1抗体选自：阿替珠单抗、阿维单抗、度伐单抗和BMS-936559。
[55].用于抑制一种或多种癌症进展，抑制一种或多种癌症复发和/或治疗一种或多种癌症的试剂，所述癌症为选自以下的癌症：多发性骨髓瘤，恶性淋巴瘤(诸如非霍奇金淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)和霍奇金淋巴瘤)和白血病(诸如急性髓样白血病和慢性髓样白血病)，所述试剂含有人或人源化的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体作为活性成分，其中所述试剂与一种或多种抗PD-1抗体一起施用，所述抗PD-1抗体是选自：阿替珠单抗、阿维单抗、度伐单抗和BMS-936559。
[56].用于增强针对癌症的免疫力的变应素-1拮抗剂。
[57].变应素-1拮抗剂在生产用于癌症的免疫增强剂中的用途。
[58].增强针对癌症的免疫力的方法，其包括向需要癌症治疗的患者施用有效剂量的变应素-1拮抗剂。
[59].变应素-1拮抗剂，其用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症。
[60]变应素-1拮抗剂在生产用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的试剂中的用途。
[61].抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症的方法，其包括向需要癌症治疗的患者施用有效剂量的变应素-1拮抗剂。
[本发明的有益效果]
根据本发明的变应素-1拮抗剂能够增强针对癌症的免疫力，并且可以用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症。
附图简述
[图1]
图1显示了变应素-1靶向载体的结构和产生的变应素-1敲除(以下也称为变应素-1KO或ALG1-KO)杂合和纯合小鼠的Southern印迹结果。
[图2]
图2显示携带小鼠结肠直肠癌细胞系MC38的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠中MC38肿瘤体积的转变(中值和平均值)。
[图3]
图3显示携带小鼠黑素瘤细胞系B16F10的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠中B16F10肿瘤体积的转变(中值和平均值)。
[图4]
图4显示了向携带MC38的变应素-1KO小鼠施用抗小鼠PD-1抗体4H2(10mg/kg)后，MC38肿瘤体积的转变(右图)。在该图中，“mIgG”是指对照抗体。
[图5]
图5显示携带MC38的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠中肿瘤浸润淋巴细胞分析的结果。
[图6]
图6显示在将TLR9激动剂(CpG)施用于C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠后血液IFNα的测量结果。
[图7]
图7显示了向携带MC38的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠施用抗小鼠PD-1抗体4H2(3mg/kg)后MC38肿瘤体积的转变。在该图中，“mIgG”是指对照抗体。
[图8]
图8显示了向携带MC38的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠施用抗小鼠PD-1抗体4H2(1mg/kg)后MC38肿瘤体积的转变。
[图9]
图9显示了向携带MC38的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠施用抗小鼠CD4抗体GK1.5(5mg/kg)后MC38肿瘤体积的转变。图中“ratIgG2b”是指对照抗体。
[图10]
图10显示了向携带B16F10的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠施用抗小鼠CD4抗体GK1.5(5mg/kg)后B16F10肿瘤体积的转变。
[图11]
图11显示了向C57BL/6小鼠(WT)和变应素-1KO小鼠(KO)施用TLR7激动剂(多尿苷)后的血液IFNα(图A中的)和IFNβ(图B中的)的测量结果。
[图12]
图12显示了对从C57BL/6小鼠(WT)和变应素-1KO小鼠收集的腹膜内巨噬细胞添加STING激动剂(cGAMP)后产生的培养上清液中的IFNβ的测量结果。
[图13]
图13显示了向携带B16F10的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠施用抗小鼠PD-1抗体4H2(10mg/kg)后B16F10肿瘤体积的转变。
[图14]
图14分别显示携带MC38和B16F10的C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠中MC38(A)和B16F10(B)的平均肿瘤体积的转变。
发明详述
变应素-1也表示为MILR1，并且在人类中包括三种剪接变体，其为“变应素-1L”，“变应素-1S1”和“变应素-1S2”，它们是具有分别由GenBank登录号NP_001078892.1，AB542951.1和AB542952.1表示的氨基酸序列的膜相关蛋白。其小鼠同源物表示为MCA32，具有由GenBank登录号AB542953.1表示的氨基酸序列。
在本说明书中，除非另外指出，术语“变应素-1”用于包括人变应素-1及其剪接变体以及目前鉴定的哺乳动物同系物。
如本文所用，术语“变应素-1拮抗剂”是指抑制，降低或完全抑制变应素-1的固有生理功能的物质。“变应素-1拮抗剂”的实例包括通过拮抗变应素-1的天然配体来抑制，减少或完全抑制变应素-1的免疫抑制细胞内信号传导的物质。具体而言，其实例包括抗变应素-1抗体，变应素-1融合蛋白，变应素-1结合蛋白，肽，低分子化合物等。变应素-1融合蛋白是指含有变应素-1的全部或部分细胞外结构域的蛋白质分子，其例如通过拮抗变应素-1的天然配体与变应素-1的结合来抑制，减少或完全抑制变应素-1的免疫抑制细胞内信号传导，并且其实例包括与抗体的Fc区结合的变应素-1的全部或部分细胞外结构域。变应素-1结合蛋白是指与变应素-1结合，拮抗例如变应素-1的天然配体与变应素-1的结合，并由此抑制，降低或完全抑制变应素-1的免疫抑制细胞内信号传导的蛋白质。其实例包括变应素-1的天然配体，其全部或部分胞外结构域，基于前述的融合蛋白，支架蛋白(scaffoldprotein)等。变应素-1的支架蛋白的实例包括Adnectin(WO 2001/64942)，(WO95/19374，WO 2000/63243)，(WO 99/16873)，Avimer(NatureBiotechnology(2005),Vol.23,pp.1556-1561)，DARPin(Nature Biotechnology(2004),Vol.22，pp.575-582)，LRRP(Nature(2004),Vol.430,No.6996,pp.174-180)，(WO2001/04144和WO 2004/106368)，Affitin(Journal of molecular biology(2008),Vol.383,No.5,pp.1058-1068)，Fynomer(WO2011/023685)等，但不限于此。类似于变应素-1拮抗剂，抑制变应素-1的基因表达或蛋白质合成的变应素-1的反义RNA或siRNA(小干扰RNA)也可用于抑制，减少或完全抑制变应素-1的固有生理功能。
例如，可以通过以下方法检查根据本发明的变应素-1拮抗剂中的抗变应素-1抗体或变应素-1结合蛋白是否拮抗变应素-1的天然配体。
首先制备变应素-1融合蛋白，并寻找结合融合蛋白的细胞系。使用确认与变应素-1融合蛋白特异性结合的细胞系，可以通过使用变应素-1拮抗剂是否存在对变应素-1融合蛋白与该细胞的结合的拮抗作为指标，来寻找物质是否为变应素-1拮抗剂。例如，变应素-1融合蛋白与来源于人类急性单核细胞性白血病(human acute monocytic leukaemia)的细胞系THP-1结合，并且通过监测变应素-1融合蛋白与THP-1结合的抑制活性，可以获得变应素-1拮抗剂。
如本文所用，术语“抗体”包括全长抗体，即由经由二硫键连接的两条重链和两条轻链组成的全长抗体，以及其抗体片段(诸如单链抗体(诸如Fab，Fab’，Fv和scFv)和(Fab’)2)和多特异性抗体(诸如双特异性抗体和双抗体(diabody))。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由对某种抗原具有单一结合特异性的基本上一致(uniform)的群体组成的抗体。用于本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法(例如，参见Kohlerand Milstein等人,Nature(1975),256:495-97，Hongo等人,Hybridoma(1995),14(3):253-260，Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring HarborLaboratory Press,第二版；1988)和Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA方法(例如，参见美国专利号4816567)，噬菌体展示方法(例如，参见Ladner等人的美国专利号5223409，5403484和5571698，Dower等人的美国专利号5427908和5580717，McCafferty等人的美国专利号5969108和6172197，和Griffiths等人的美国专利号5885793，6521404，6544731，6555313，6582915和6593081)制备。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指对两种或多种不同抗原分子或表位具有结合特异性的抗体分子，并且通常包括双特异性抗体。在上下文中的表位可以是两个或多个不同抗原分子上的表位，或者是存在于一个抗原分子上的两个或多个不同表位。双特异性抗体的实施方案的实例包括双抗体，双特异性(Fv)2，双特异性微抗体，双特异性F(ab’)2，双特异性杂合抗体，共价双抗体(双特异性DART)(WO 2006/113665或WO 2008/157379)，双特异性(FvCys)2(J.Immunol.,1992,Vol.149,No.1,p.120-126)，双特异性F(ab’-zipper)2(J.Immunol.,1992,Vol.148,No.5,p.1547-1553)，双特异性(Fv-zipper)2(Biochemistry,1992,Vol.31,No.6,p.1579-1584)，双特异性三链抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,Vol.90,No.14,p.6444-6448)和双特异性mAb2(www.f-star.com/technology_mab.html)等。
如本文所用，术语“抗体片段”是指含有至少一个抗原结合部分的全长抗体的一部分，并且其实例包括Fab，Fab’，Fv，scFv，F(ab’)2等。抗原结合部分是指可以与抗原结合的抗体的最小单位，并且含有分别在重链可变区和轻链可变区中的三个互补决定区(CDR)，以及排列CDR使得CDR的组合可以识别所需的抗原的框架区。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指含有分别来源于不同哺乳动物的可变区序列和恒定区序列的抗体。一个实例是含有源自小鼠抗体的可变区序列和源自人抗体的恒定区序列的抗体。嵌合抗体可以通过公知的方法(例如，参见Cabillyet等人的美国专利号4816567)将编码抗体可变区的基因与编码来源于人类的抗体恒定区基因的基因连接来制备，所述抗体可变区是从上文描述的根据杂交瘤方法分离的产生抗体的杂交瘤，重组DNA方法或噬菌体展示方法根据公知的方法分离的。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指含有来自除人类以外的哺乳动物，诸如小鼠的种系的CDR序列并且所述CDR序列移植到人框架序列上的抗体。人源化抗体也可以通过根据公知的方法(例如，参见Winter的美国专利5225539和5530101以及Queen的美国专利5585089和6180370)将编码抗体CDR区域的基因与编码来源于人类的抗体框架区的基因连接来制备，所述抗体CDR区域是根据公知的方法从根据以上方法的产生抗体的杂交瘤分离的。
如本文所用，术语“人抗体”是指含有由框架区，CDR区形成的可变区和恒定区的抗体，所述可变区和恒定区二者均源自人种系免疫球蛋白序列。用于本发明的人抗体可以通过使用经转化以产生人抗体的小鼠，诸如Humab小鼠(例如，参见Lonberg和Kay等人的美国专利号5545806，5569825，5625126，5633425，5789650，5877397，5661016，5814318，5874299和5770429)、KM小鼠(例如，参见Ishida等人的WO 2002/43478)、Xeno小鼠(例如，参见美国专利号5939598，6075181，6114598，6150584和6162963)和Tc小鼠(例如，参见Tomizuka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000):722-727)的方法来制备。人抗体还可以通过使用SCID小鼠来制备(例如，参见Wilson等人的美国专利号5476996和5698767)，其中重构人免疫细胞以通过免疫法触发人抗体反应。可以通过上述的噬菌体展示方法来制备用于本发明的人抗体。
如本文所用，术语“同种型”用于表示由重链恒定区基因编码的抗体类别(诸如IgM或IgG)。根据本发明的抗变应素-1抗体优选是IgG1或IgG4。优选修饰IgG1，使得重链恒定区中的任意氨基酸被取代，缺失或插入，以便抗体消除了或降低了与Fc受体的结合。优选对IgG4进行修饰，使得重链恒定区中的任意氨基酸被替换，缺失或插入，从而抑制了交换。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指具有共价连接的具有不同性质的两个蛋白质部分的多肽。例如，当将膜相关蛋白用于融合蛋白时，主要含有膜相关蛋白的细胞外部分的部分可以与抗体的Fc区结合以获得融合蛋白，从而促进蛋白质的溶解。
可以选作为本发明的变应素-1拮抗剂的抗变应素-1抗体是以5x10-8M或更小的解离常数(Kd值)结合人变应素-1的抗体，更优选以1x10-8M或更小的Kd值结合人变应素-1，还更优选地5x10-9M或更小的Kd值结合人变应素-1，特别优选1x10-9M或更小的Kd值结合人变应素-1。
在另一个实施方案中，抗变应素-1抗体优选是识别存在于一个抗原分子上的两个或多个不同表位的抗人变应素-1多特异性抗体。
在又一个实施方案中，抗变应素-1抗体优选是抗人变应素-1单克隆抗体，并且还更优选抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体。
如本文所用，术语“癌症疗法”等包括例如具有以下的疗法(i)减少癌细胞增殖，(ii)减弱癌症引起的症状，(iii)改善癌症患者的生活质量，(iv)降低已经施用的另一种抗癌药物或癌症治疗佐剂的剂量和/或(v)延长癌症患者的存活。术语“抑制癌症进展”是指延缓癌症进展，稳定与癌症相关的症状并逆转症状的进展。术语“抑制复发”是指在通过癌症疗法或癌症切除已经完全或基本上消除或除去了癌症病变的患者中预防性地防止癌症复发。
可以用变应素-1拮抗剂经历进展的抑制，复发的抑制和/或治疗的癌症包括任何实体癌和血液癌。变应素-1拮抗剂可以特别有效针对的实体癌的实例包括以下：恶性黑素瘤(诸如皮肤、口腔粘膜上皮和眶内恶性黑素瘤)，非小细胞肺癌(诸如鳞状非小细胞肺癌和非鳞状非小细胞肺癌)，小细胞肺癌，头颈癌，肾细胞癌，透明细胞性肾细胞癌，乳腺癌，卵巢癌，卵巢透明细胞腺癌，骨和软组织肉瘤(诸如Ewing肉瘤(Ewing sarcoma)，儿童横纹肌肉瘤(childhood rhabdomyosarcoma)和子宫肉瘤)，成胶质细胞瘤，神经胶质肉瘤，鼻咽癌，子宫癌(诸如宫颈癌和子宫内膜癌症(endometrial cancer)，肛门癌(诸如肛管癌)，结肠直肠癌，肝细胞癌，食道癌，胰腺癌，胃癌，尿路上皮癌(诸如膀胱癌，上泌尿道癌，输尿管癌，肾盂癌和尿道癌)，前列腺癌，输卵管癌，原发性腹膜癌，胸膜间皮瘤和骨髓增生性综合征。变应素-1拮抗剂可以特别有效针对的血液癌的实例包括以下：多发性骨髓瘤，恶性淋巴瘤(诸如非霍奇金淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)以及霍奇金淋巴瘤)和白血病(诸如急性髓样白血病和慢性髓样白血病)。
除上述以外，也可以在以下癌症中预期此效应：胆囊癌(gallbladder cancer)、胆管癌(bile duct cancer)、胆道癌(biliary cancer)、皮肤癌(skin cancer)(诸如Merkel细胞癌(Merkel cell cancer))、直肠癌(rectal cancer)、结肠癌(colon cancer)、睾丸癌(testicular cancer)、生殖细胞癌(germ-cell cancer))、，阴道癌(vaginal cancer)、外阴癌(vulvar cancer)、阴茎癌(penile cancer)、小肠癌(small intestinal cancer)、内分泌癌(endocrine cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、甲状旁腺癌(parathyroidcancer)、肾上腺癌(adrenal cancer)、脑肿瘤(brain tumor)、脊柱肿瘤(spinal tumor)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、慢性或急性淋巴细胞白血病(chronic or acute lymphocytic leukaemia)、成人T细胞白血病(adult T-cellleukaemia)、中枢神经系统恶性淋巴瘤(central nerve systemprimary malignantlymphoma)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)、儿童癌症(cancer inchild)和不明原发性癌症(cancer of unknown primary)。
当对现有抗癌药物(抗肿瘤药物)的治疗效果不充分的癌症患者开出处方时，可以特别地认识到根据本发明的变应素-1拮抗剂的益处。其中，当对肿瘤免疫治疗剂的治疗效果不充分的癌症患者开出处方时，可以特别地认识到根据本发明的变应素-1拮抗剂的益处。“抗癌药物的治疗效果不充分的癌症患者”的实例包括甚至在用现有的抗癌药物治疗之后，通过肿瘤缩小效应评估(tumor reduction effect evaluation)RECIST鉴定为“进展(PD)”的患者。现有抗癌药物的实例包括烷化剂(alkylating agent)，铂制剂(platinumpreparation)，抗代谢物(antimetabolite)(诸如抗叶酸制剂(antifolate)，吡啶抗代谢物(pyridine antimetabolite)，嘌呤抗代谢物(purine antimetabolite)，核糖核苷酸还原酶抑制剂(ribonucleotide reductase inhibitor)和核苷酸类似物)，拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)，微管聚合抑制剂(microtubule polymerizationinhibitor)，微管解聚抑制剂(microtubule depolymerization inhibitor)，抗生素抗肿瘤药(antibiotic antineoplastic agent)，细胞因子制剂(cytokine preparation)，抗激素(antihormone)，分子靶向药物，肿瘤免疫治疗剂等。
烷化剂的实例包括达卡巴嗪(dacarbazine)，尼莫司汀(nimustine)，替莫唑胺(temozolomide)，福莫司汀(fotemustine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，异环磷酰胺(ifosfamide)等。铂制剂的实例包括顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)等。抗叶酸制剂的实例包括培美曲塞(pemetrexed)，甲酰四氢叶酸(leucovorin)，甲氨蝶呤(methotrexate)等。吡啶抗代谢物的实例包括5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，UFT，卡莫氟(carmofur)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，卡培他滨(capecitabine)等。核苷酸类似物的实例包括吉西他滨(gemcitabine)等。拓扑异构酶抑制剂的实例包括伊立替康(irinotecan)，依托泊苷(etoposide)等。微管聚合抑制剂的实例包括长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，长春瑞滨(vinorelbine)等。微管解聚抑制剂的实例包括多西他赛(docetaxel)，紫杉醇(paclitaxel)等。抗生素抗肿瘤药的实例包括博来霉素(bleomycin)，丝裂霉素C(mitomycin C)，表柔比星(epirubicin)等。细胞因子制剂的实例包括IFN-α2a，IFN-α2b，PEG-IFN-α2b，天然IFN-β，白细胞介素-2等。抗激素的实例包括他莫昔芬(tamoxifen)，氟维司群(fulvestrant)，戈舍瑞林(goserelin)，亮丙瑞林(leuprorelin)，阿那曲唑(anastrozole)，来曲唑(letrozole)，依西美坦(exemestane)等。分子靶向药物的实例包括伊马替尼(imatinib)，索拉非尼(sorafenib)，舒尼替尼(sunitinib)，贝伐单抗(bevacizumab)，吉非替尼(gefitinib)，厄洛替尼(erlotinib)，克唑替尼(crizotinib)，替西罗莫司(temsirolimus)，依维莫司(everolimus)，阿昔替尼(axitinib)，帕唑帕(pazopanib)，瑞格非尼(regorafenib)，西妥昔单抗(cetuximab)，利妥昔单抗(rituximab)，依鲁替尼(ibrutinib)，奥法木单抗(ofatumumab)，帕尼单抗(panitumumab)等。
如本文所用，术语“肿瘤免疫疗法”等是用于增强癌症免疫反应的疗法，即用于增强对癌症的免疫力，由此抑制癌症增殖或减少或消除癌症的疗法。术语“肿瘤免疫治疗剂”是指能够增强免疫反应的试剂。治疗剂的实例包括抗PD-1抗体(诸如人抗人PD-1单克隆(中和)抗体(诸如纳武单抗和REGN-2810)和人源化抗人PD-1单克隆(中和)抗体(诸如派姆单抗，PDR-001，BGB-A317和AMP-514(也称为MEDI0680)，ANB011(也称为TSR-042)和STI-A1110)，抗PD-L1抗体(诸如阿替珠单抗(Atezolizumab)(也称为RG7446或MPDL3280A)，阿维单抗(Avelumab)(也称为PF-06834635或MSB0010718C)，度伐单抗(Durvalumab)(也称为MEDI4736)，BMS-936559，STI-1010，STI-1011和STI-1014)，PD-1拮抗剂(诸如AUNP-12)，抗PD-抗-IL-3抗体(例如BMS-986016和LAG525)，PD-L1融合蛋白，PD-L2融合蛋白(诸如AMP-224)，抗CTLA-4抗体(诸如伊匹单抗和曲美木单抗)，抗LAG-3抗体(诸如BMS-986016和LAG525)，抗Tim3抗体(诸如MBG453)，抗KIR抗体(如Lirilumab)，抗BTLA抗体，抗TIGIT抗体，抗VISTA抗体，抗CD137抗体(诸如Urelumab)，抗-OX40抗体(诸如MEDI6469)，抗HVEM抗体，抗CD27抗体(诸如Varlilumab)，抗GITR抗体(诸如MK-4166和TRX-518)，抗CD28抗体，抗CCR4抗体(诸如Mogamulizumab)，抗CD4抗体(诸如MTRX-1011A，TRX-1，Ibalizumab，huB-F5，Zanolimumab，4162W94，克立昔单抗(Clenoliximab)，Keliximab，AD-519，PRO-542，Cedelizumab，TNX-355，Dacetuzumab，Tregalizumab，普立昔单抗(Priliximab)，MDX-CD4，CAMPATH-9和IT1208)，TLR拮抗剂，STING拮抗剂(诸如MIW815)等。本文使用的肿瘤免疫治疗剂不包括根据本发明的变应素-1拮抗剂。
纳武单抗可以根据在WO2006/121168中公开的方法生产，派姆单抗可以根据WO2008/156712中公开的方法生产，BMS-936559可以根据在WO2007/005874中公开的方法生产，并且伊匹单抗可以根据在WO2001/014424中公开的方法生产。
根据本发明的变应素-1拮抗剂通常以肠胃外(parenteral)形式全身或局部施用。剂量可以根据年龄，体重，症状，治疗效果，施用方式，治疗期等而变化。然而，变应素-1拮抗剂通常可以通过肠胃外施用在每个成人每剂0.1μg/kg-300mg/kg，特别优选0.1mg/kg-10mg/kg范围内每天一次至几次施用或每天1小时至24小时通过静脉内连续施用来施用。如上所述，剂量可以根据各种条件而变化。因此，足够的剂量可能小于上述范围，或者可能需要比上述范围更高的剂量。
根据本发明的变应素-1拮抗剂可以与用于治疗上述癌症的一种或多种其它试剂(主要是抗癌药物)组合以(1)抑制癌症的进展、抑制癌症的复发和/或增强对癌症的治疗效果，(2)减少组合中使用的其他试剂的剂量和/或(3)缓解组合使用的其他试剂的副作用。当变应素-1拮抗剂和其它试剂时分开施用时，可以在施用其他试剂之前施用变应素-1拮抗剂，其他试剂可以在施用变应素-1拮抗剂之前施用，或者可以存在其中两种药物同时施用的某一时期。试剂可以通过相同或不同的施用方式施用。根据试剂的特性，可以将含有变应素-1拮抗剂的制剂和含有其他试剂的制剂提供为试剂盒。其他试剂的剂量可以根据临床使用剂量适当选择。其他试剂可以通过以适当比例组合任何两种或多种试剂来施用。其他试剂包含现有的试剂以及将来会发现的试剂。
大体上可例举作为其他试剂的抗癌药物的实例包括上文所述的抗癌药物。
将根据本发明的变应素-1拮抗剂配制成注射剂或输注剂(infusion)并使用。注射剂或输注剂可以是水性溶液，悬浮液或乳剂中的任何形式，或者可以配制成固体剂，在使用前通过加入溶剂以使其溶解，悬浮或使其乳化。用于注射或输注的溶剂的实例包括注射用蒸馏水，盐水，右旋糖溶液和等渗溶液(诸如氯化钠，氯化钾，甘油，甘露醇，山梨糖醇，硼酸，硼砂或丙二醇的溶液)等。
药学上可接受的载体的实例包括稳定剂，增溶剂，助悬剂，乳化剂，安抚剂(soothing agent)，缓冲剂，防腐剂(preservative)，杀菌剂(antiseptic)，pH控制剂，抗氧化剂等，所述药学上可接受的载体用于注射剂，输液剂或固体剂以在使用前将溶剂加入以使其溶解，悬浮或乳化。可以使用的稳定剂的实例包括各种氨基酸，白蛋白，球蛋白，明胶，甘露醇，葡萄糖，葡聚糖，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，抗坏血酸，亚硫酸氢钠，硫代硫酸钠，依地酸钠，柠檬酸钠，二丁基羟基甲苯等。可以使用的增溶剂的实例包括醇(诸如乙醇)，多元醇(诸如丙二醇和聚乙二醇)，非离子表面活性剂(诸如聚山梨酯和HCO-50等。可以使用的悬浮剂的实例包括单硬脂酸甘油酯，单硬脂酸铝，甲基纤维素，羧甲基纤维素，羟甲基纤维素，月桂硫酸钠等。可以使用的乳化剂的实例包括阿拉伯树胶，精氨酸钠，黄蓍胶等。可以使用的安抚剂的实例包括苯甲醇，氯丁醇，山梨糖醇等。可以使用的缓冲剂的实例包括磷酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris缓冲液，谷氨酸盐缓冲液，ε氨基己酸盐(aminocapronate)缓冲液等。可以使用的防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯，氯代丁醇，苯甲醇，苯扎氯铵，脱氢乙酸钠，依地酸钠，硼酸，硼砂等。可以使用的杀菌剂的实例包括苯扎氯铵，对羟基苯甲酸，氯代丁醇等。可以使用的pH控制剂的实例包括盐酸，氢氧化钠，磷酸，乙酸等。可以使用的抗氧化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠(sodium metabisulphite)和亚硫酸钠，(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟甲苯，卵磷脂，没食子酸丙酯(propylgallate)和α-生育酚和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸，乙二胺四乙酸，山梨糖醇，酒石酸和磷酸。
注射剂或输注剂可以通过在最后的过程中灭菌或通过无菌操作诸如通过过滤器过滤灭菌并包装在灭菌的容器中来生产。注射剂或输注剂可以通过以下方式使用：在使用前将通过真空干燥或冷冻干燥获得的无菌粉末(其可以包含药学上可接受的载体的粉末)溶解在适当的溶剂中。
通过下文的实施例更具体地描述本发明，所述实施例不限制本发明的范围。需要说明的是，本领域技术人员可以根据本发明的描述进行各种变化和修改，这样的改变和修改也都包含在本发明的范围内。
实施例
实施例1：变应素-1KO小鼠的制备
构建变应素-1靶向载体。具体而言，包含变应素-1的起始密码子的第一个外显子被取代为新霉素抗性基因盒(图1A)。通过电穿孔用线性化的变应素-1靶向载体转染来源于C57BL/6N小鼠的ES细胞。通过抗药性筛选对细胞进行选择，并通过Southern印迹法选择同源重组克隆。使用阳性克隆，通过聚集制备嵌合体小鼠。将ICR的八细胞阶段胚胎用作受体胚胎。基于全身的毛色判断所得嵌合体小鼠的嵌合体发生率。将获得的单个嵌合体小鼠与C57BL/6N小鼠杂交，并通过Southern印迹法对F1后代进行遗传分析以获得F1杂合个体。将F1杂合个体的雄性和雌性杂交，并通过使用Southern印迹法进行的遗传分析证实获得了ALG1-KO小鼠(图1B)。
由于变应素-1KO小鼠没有表现出特别明显的表型，因此预期变应素-1拮抗剂的副作用可能较小。
实施例2：变应素-1KO小鼠中的肿瘤增殖(MC38)
将MC38以2.0x105/小鼠皮下移植至C57BL/6小鼠(WT小鼠)和ALG1-KO小鼠。一组中的小鼠数目为15。在移植后的第7、10、14、17、21和24天，测量了MC38的肿瘤体积。图2以中位数(图2，左图)和平均值±标准误差(图2，右图)显示了各组肿瘤体积的转变。与野生型小鼠相比，在变应素-1KO小鼠中，肿瘤增殖被显著抑制。
实施例3：变应素-1KO小鼠中的肿瘤增殖(B16F10)
将B16F10以2.0x105/小鼠皮下移植至C57BL/6小鼠(WT小鼠)和ALG1-KO小鼠。一组中的小鼠数目为10。在第7、11、14、18、和21天，测量了每组中B16F10的肿瘤体积，条件是移植当天为第0天。在抗小鼠PD-1抗体4H2(根据WO2006/121168实施例12中公开的方法制备的抗体)施用组中，在移植当天和移植后第6、12和18天将4H2腹膜内施用至WT小鼠。图3以中位数(图3，左图)和平均值±标准误差(图3，右图)显示了各组的肿瘤体积的转变。如图3所示，与野生型小鼠相比，在变应素-1KO小鼠中，B16F10的肿瘤增殖被显著抑制。同时，在施用了抗小鼠PD-1抗体4H2的WT小鼠组中，移植后第21天的肿瘤体积中位数为1985.6mm3(平均2105.0±418.4mm3)，携带了肿瘤但未施用的小鼠组中21天的肿瘤体积中位数为2661.0mm3(平均：2622.6±377.1mm3)。
从实施例2和3的结果可以看出，通过抑制变应素-1可以抑制肿瘤增殖。
实施例4：抗-PD-1抗体在变应素-1KO小鼠中的作用
将MC38以2.0x105/小鼠皮下移植至C57BL/6小鼠(WT小鼠)和ALG1-KO小鼠。在移植当天和移植后第6天和第12天腹膜内施用mIgG和抗-小鼠PD-1抗体4H2，条件是移植当天为第0天。4H2剂量为10mg/kg(仅在移植0天时为20mg/kg)。对于仅携带肿瘤的小鼠组，小鼠的数量为15只(图4，左图)，并且对于施用了抗体的小鼠组，小鼠的数量为10(图4，右图)。在移植后第7、11、14、18、21、24和27天测量MC38的肿瘤体积。图4以平均值±标准误差显示了每组的肿瘤体积的转变。与施用了对照抗体的变应素-1KO小鼠组相比，施用了4H2抗体的变应素-1KO小鼠的组中肿瘤增殖被进一步抑制，即在测量期间未观察到肿瘤增殖。
从实施例3和4的结果证实，通过变应素-1抑制和PD-1抑制展示了协同作用。
实施例5：变应素-1KO小鼠中癌症的免疫增强
将MC38以2.0x105/小鼠皮下移植至C57BL/6小鼠(WT小鼠)和ALG1-KO小鼠。一组中的小鼠数目为11或12个。移植后15天，从小鼠中取出肿瘤并用胶原酶处理以制备肿瘤细胞。将制备的细胞进行抗体染色，并通过FACS测定肿瘤浸润性CD8阳性T细胞的数量和肿瘤抗原(p15E)特异性CD8阳性T细胞的数量。图5以平均值±标准误差显示每1mg肿瘤的浸润淋巴细胞的数量。与野生型小鼠相比，在变应素-1KO小鼠中的肿瘤浸润性CD8细胞(图5中的“CD8+T细胞”)和肿瘤特异性CD8细胞(图5中的“CD8+四聚体+”)显著增加。
实施例6：在变应素-1KO小鼠中IFNα的产生增强
将各种CpG寡核苷酸(CpG-ODN)与脂转染试剂DOTAP混合，并通过尾静脉以52nmol/kg施用于C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO小鼠。在施用后2、6和24小时，从尾静脉收集血液，并且通过ELISA测量血液IFNα。图6对于每组显示在每个评估点时平均值±标准误差的血液IFNα(pg/mL)。在变应素-1KO小鼠中，与野生型小鼠相比，IFN产量显著增加。
从实施例5和6的结果可以看出，变应素-1抑制增强了针对肿瘤的免疫力。
实施例7：抗-PD-1抗体在变应素-1KO小鼠中的作用
将MC38以2.0x105/小鼠皮下移植至C57BL/6小鼠(WT小鼠)和ALG1-KO小鼠。在移植当天和第6天和第12天腹膜内施用对照抗体mIgG和抗-小鼠PD-1抗体4H2，条件是移植当天为第0天。4H2的剂量为1或3mg/kg。一组中小鼠数为10只。在移植后第7、11、13、18、21和24天测量MC38的肿瘤体积。图7和8以平均值±标准误差显示了每组的肿瘤体积的概况。
在施用了1mg/kg和3mg/kg的4H2抗体的ALG1-KO小鼠组中，观察到与实施例4相似水平的抗肿瘤作用。在第32天显示出肿瘤消退的每组中的动物数目如下所示。
[表1]
实施例8：抗CD4抗体在变应素-1KO小鼠中的作用
将MC38或B16F10以2.0x105/小鼠皮下移植至C57BL/6小鼠(WT小鼠)和Alg1-KO小鼠。在第5天腹膜内施用抗小鼠CD4抗体GK1.5(BioXcell)和对照大鼠抗体IgG2b，条件是移植当天为第0天。抗体剂量为5mg/kg。一组中小鼠数量为10只。移植后第7、11、14、18、21、25和28天分别测量MC38和B16F10的肿瘤体积。当一组中的一半以上的动物死亡或被实施安乐死时，在观察之后立即进行的测量是肿瘤测量的最后一天。图9和10以平均值±标准误差显示了每组的平均肿瘤体积的转变。与施用了对照抗体的Alg1-KO小鼠组相比，施用了GK1.5的Alg1-KO小鼠组中的肿瘤增殖被进一步抑制。
实施例9：在施用多尿苷后在变应素-1KO小鼠中I型IFN的产生
将多尿苷与脂质体转染试剂DOTAP一起静脉内施用于C57BL/6小鼠(WT小鼠)和Alg1-KO小鼠。剂量为50μg/只，在施用后2和6小时通过ELISA测量血清IFNα和IFNβ。图11显示了各组的血清IFNα和IFNβ。与WT相比，在施用多尿苷的Alg1-KO小鼠组中，IFNα和IFNβ的产生增加。
实施例10：cGAMP刺激后在来源于变应素-1KO小鼠的腹膜内巨噬细胞上I型IFN的 产生
以1mL/身体腹膜内施用3％硫基乙酸盐(thioglycolate)介质于C57BL/6N小鼠和Alg1-KO小鼠。3天后，注射5mL 5mMEDTA/PBS以用于腹膜内灌洗并收集排出物(drain)。溶血处理后，用流式细胞仪计算腹膜内侵入性细胞中CD11b+F4/80+细胞的比例。
将细胞接种于96孔板中，使得CD11b+F4/80+细胞为2×105细胞/孔，1小时后弃去培养上清液，用培养基洗涤细胞一次，并且加入分别含有3，10或者30μM的环GMP-AMP(cGAMP)的培养基。24和48小时后收集培养上清液，并且测量培养上清液中IFN-β的量。图12显示了每组的IFNβ的量。与WT相比，在用cAMP刺激的来源于Alg1-KO小鼠的巨噬细胞组中，IFNβ的产生增加。
实施例11：抗-PD-1抗体在变应素-1KO小鼠中的作用
将B16F10以2.0×105个细胞/小鼠皮下移植至C57BL/6小鼠(WT小鼠)和Alg-1KO小鼠。在移植当天和移植后第6、12和18天腹膜内移植mIgG和抗-小鼠PD-1抗体4H2，条件是移植当天为第0天。4H2的剂量为10mg/kg(仅在移植的第0天时为20mg/kg)，一组中小鼠的数量为10只。在移植后第7、11、14、18和21天测量B16F10的肿瘤体积。图13以中位数显示了每组的肿瘤体积的转变。与其他组相比，在施用4H2抗体的变应素-1KO小鼠组中，肿瘤增殖被显著抑制。
实施例12：变应素-1缺陷和抗PD-1抗体的联合使用在再攻击测试 (rechallengetest)中的作用
以2.0×105个细胞/小鼠皮下移植MC38至C57BL/6小鼠(WT小鼠)和变应素-1KO(Alg1-KO)小鼠。在移植当天和第6、12和18天腹腔内施用抗-小鼠PD-1抗体4H2。对于WT小鼠，4H2的剂量为10mg/kg(仅在移植的第0天时为20mg/kg)，并且对于Alg1-KO小鼠，剂量为1mg/kg或3mg/kg(仅在移植的第0天为2mg/kg或6mg/kg)。一个移植组中的小鼠的数量是对于WT小鼠的20只，并且对于Alg1-KO小鼠的每个剂量是10只。在移植的第32天，20只WT小鼠中的8只和20只Alg1-KO小鼠中的14只显示肿瘤的完全缓解(CR)。
在第一次移植后第42天将MC38和B16F10以2.0×105/小鼠分别皮下移植到实现CR的WT小鼠和Alg1-KO小鼠的右侧和左侧体侧。在移植后第7、11、14、18、21、25、28、32、35、39和42天测量MC38和B16F10的肿瘤体积。图14以平均值±标准误差显示了每组的肿瘤体积的转变。对于MC38，8只WT小鼠中的7只和所有14只Alg1-KO小鼠显示肿瘤缓解。对于B16F10，8只WT小鼠中的1只和14Alg1-KO小鼠中的11只显示出肿瘤缓解，即相比于在施用4H2后实现CR的WT小鼠组，在施用4H2后实现CR的Alg1-KO小鼠组中，观察到更多的CR个体。
这表明在仅通过PD-1抑制完全消除MC38癌细胞的小鼠中，已经针对已经遇到了小鼠的免疫系统的MC38癌细胞建立了免疫记忆，而记忆CD8T细胞对免疫系统从来没有遇到的B16F10癌症细胞没有充分地发挥功能。同时，当PD-1抑制与变应素-1抑制共存时，针对小鼠的免疫系统已经遇到的MC38癌细胞建立的记忆性CD8T细胞对免疫系统从未遇到的B16F10癌细胞充分地发挥功能，从而完全消除了B16F10癌细胞。在这种情况下，可将B16F10认为是复发性癌细胞(recurrent cancer cell)。也就是说，该结果指示，相比于仅存在PD-1抑制的环境中可被免疫系统记忆的癌抗原，在PD-1抑制与变应素-1抑制共存的环境中免疫系统可以记忆更多的各种癌抗原。在PD-1抑制与变应素-1抑制共存的环境中免疫系统记忆的癌抗原谱涵盖了具有弱抗原性的癌抗原。因此，据信具有弱抗原性的抗原在正常环境下不被免疫系统识别为癌抗原，并且即使在只有PD-1抑制的环境下也难以被识别为癌抗原。此外，据信如果保持具有变应素-1抑制的环境，则可以将在正常环境中绝不会被免疫系统识别并且在仅有PD-1抑制的环境中难以被识别的癌细胞识别为抗原，并且可以针对新的癌细胞或换言之复发性癌细胞展现抗肿瘤效应。
从实施例6、9和10中的结果证实变应素-1抑制增强了针对STING激动剂和TLR配体的反应性。据信，在变应素-1抑制的环境中，免疫系统识别癌细胞上的具有低抗原性的癌抗原以激活CD8T细胞并攻击癌细胞，并且然后在变应素抑制的环境中，来自杀死的癌细胞的TLR配体和STING激动剂进一步增强针对癌症的免疫反应，从而产生协同作用并导致复发的预防。
[工业实用性]
根据本发明的变应素-1拮抗剂能够增强癌症免疫力，并且可用于抑制癌症进展，抑制癌症复发和/或治疗癌症。

Claims (33)

1.用于癌症的免疫增强剂，其包含变应素-1拮抗剂作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的试剂，其用于抑制癌症的进展、抑制癌症的复发和/或治疗癌症。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂抑制变应素-1的免疫抑制性胞内信号传导。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂是抗变应素-1抗体、变应素-1结合蛋白或变应素-1融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的试剂，其中所述抗变应素-1抗体是抗人变应素-1抗体。
6.根据权利要求4或5所述的试剂，其中所述抗变应素-1抗体是单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂，其中所述抗变应素-1单克隆抗体为IgG1或IgG4同种型。
8.根据权利要求6或7所述的试剂，其中所述抗变应素-1单克隆抗体是选自由以下组成的组的抗体片段：Fab、Fab’、Fv、scFv和(Fab’)2片段。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的试剂，其中所述抗变应素-1单克隆抗体是人源化抗体或人抗体。
10.根据权利要求6所述的试剂，其中所述抗变应素-1单克隆抗体是人源化或人的抗人变应素-1单克隆IgG1或IgG4抗体。
11.根据权利要求4或5所述的试剂，其中所述抗变应素-1抗体是变应素-1多特异性抗体，其识别存在于一个变应素-1分子上的两个或更多个不同表位。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的试剂，其中所述癌症是实体癌或血液癌。
13.根据权利要求12所述的试剂，其中所述实体癌是选自以下的一种或多种：恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、卵巢透明细胞腺癌、骨和软组织肉瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质肉瘤、鼻咽癌、子宫癌、肛门癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、尿路上皮癌、前列腺癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、胸膜间皮瘤和骨髓增生性综合征。
14.根据权利要求12所述的试剂，其中所述血液癌是选自以下的一种或多种：多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓样白血病和慢性髓样白血病。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的试剂，其施用于抗癌药物的治疗效果不充分的癌症患者。
16.根据权利要求15所述的试剂，其中所述抗癌药物是肿瘤免疫治疗剂。
17.根据权利要求16所述的试剂，其中所述肿瘤免疫治疗剂是选自以下的一种或多种：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、PD-L1融合蛋白、PD-L2融合蛋白、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗Tim3抗体、抗KIR抗体、抗-BTLA抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗HVEM抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CD28抗体、抗CCR4抗体和抗CD4抗体。
18.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗、REGN-2810、派姆单抗、PDR-001、BGB-A317、STI-A1110或AMP-514。
19.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗PD-L1抗体是阿替珠单抗、阿维单抗、度伐单抗或BMS-936559。
20.根据权利要求17所述的试剂，其中所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。
21.根据权利要求17所述的试剂，其中所述PD-L2融合蛋白是AMP-224。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的试剂，其中进一步施用一种或多种抗癌药物。
23.根据权利要求22所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂和所述抗癌药物作为不同制剂施用。
24.根据权利要求22所述的试剂，其中所述变应素-1拮抗剂和所述抗癌药物作为一种制剂施用。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的试剂，其中所述抗癌药物是肿瘤免疫治疗剂。
26.根据权利要求25所述的试剂，其中所述肿瘤免疫治疗剂是选自以下的一种或多种：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、PD-L1融合蛋白、PD-L2融合蛋白、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗Tim3抗体、抗KIR抗体、抗-BTLA抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗HVEM抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CD28抗体、抗CCR4抗体和抗CD4抗体。
27.根据权利要求26所述的试剂，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗、REGN-2810、派姆单抗、PDR-001、BGB-A317、STI-A1110或AMP-514。
28.根据权利要求26所述的试剂，其中所述抗PD-L1抗体是阿替珠单抗、阿维单抗或度伐单抗。
29.根据权利要求26所述的试剂，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗。
30.根据权利要求26所述的试剂，其中所述PD-L2融合蛋白是AMP-224。
31.变应素-1拮抗剂，用于增强癌症患者的对癌症的免疫力。
32.增强对癌症的免疫力的方法，其包括向癌症患者施用有效剂量的变应素-1拮抗剂。
33.变应素-1拮抗剂在生产用于癌症的免疫增强剂中的用途。
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