CN108003862A - 一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针及其合成方法和应用。本发明核壳型纳米二氧化硅荧光探针是核壳结构的纳米颗粒，核壳结构包括如式(I)所示的内核荧光染料和如式(II)所示的外壳染料，纳米颗粒的结构如式(III)所示；本发明还公开了一种利用核壳型纳米二氧化硅荧光探针选育具有毒性芳烃降解活性微生物的方法，该方法建立了一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物选育研究模式，可更高效、直观、特异地对单个细胞进行快速、高灵敏分析分选，能为功能微生物的高效选育提供新的工具，也能为功能微生物单细胞研究和未培养微生物的深入挖掘提供技术支撑，对于毒性芳烃污染物防治具有重大的实践意义和应用潜力。

Description

一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明属功能微生物选育技术领域，更具体地说，本发明涉及一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针及其合成方法和在功能微生物选育中的应用。
背景技术
随着现代工业的迅速发展，人工合成的芳烃类化合物产量和种类与日俱增。这些化合物结构复杂、难以自然降解，对人类具有致癌、致畸等生物毒性，并且可以随着大气、水体、土壤、生物体等介质进行长距离迁移扩散，造成广泛的面源污染，严重威胁人类健康和生态安全。因此，芳烃类化合物的污染治理是生态环境保护的重大难题。
微生物是生态系统物质循环和能量转化的重要驱动者，具有把污染物降解为无毒无害产物的能力。利用微生物净化有毒有害物质，被认为是目前最有前景的环境污染治理手段。长期以来科学家从不同角度开展有机污染物微生物降解研究。随着微生物生理生态学分析检测技术的发展和应用，大量研究表明污染环境中广泛存在着可以利用自身酶系对毒性芳烃污染物进行降解的功能微生物。这些具有降解功能的微生物在污染环境的净化和修复过程中起着不可替代的作用，是加速芳烃污染物去除的重要力量。
分离选育芳烃污染物高效降解能力的微生物，是开展芳烃污染环境治理和修复，加速芳烃污染物去除的核心工作。传统平板分离筛选方法所获得的单个细胞的性状和功能需要在单个克隆增殖后以群体的形式体现从而导致其功能表征的滞后性和低灵敏性。而以群体形式存在的微生物细胞之间的异质性又导致其功能表征的不确定性，从而降低了筛选的准确性。而且，传统筛选方法只能对在特定培养基中生长较快的功能微生物进行筛选，对于难培养或生长较慢的微生物难以实现分析筛选。因此，在单个细胞水平实现对微生物功能活性的快速、准确地分析与追踪筛选是功能微生物高效选育的关键。
相较于传统的细胞功能代谢活性分析检测手段，如酶活的检测、代谢产物分析，荧光标记技术是一种快速、方便的生物分析手段。荧光激活细胞分选(流式细胞仪)可以对单个细胞进行快速、高灵敏度分析分选。但过去的菌株筛选研究中使用的荧光探针多是通用型的核酸探针，难以对微生物的功能活性进行追踪。利用纳米荧光探针追踪微生物，其定位性强，荧光物质不易泄露，这可以解决微生物功能细胞非特异追踪问题。利用荧光能量转移技术构建目标污染物纳米荧光探针，实现对单个功能细胞快速、准确地分析与追踪筛选，并且结合流式分选，建立高效直观、特异性追踪功能活性菌株的高通量筛选方法，将显著提高功能微生物分离选育的效率，不仅为功能微生物单细胞水平研究和未培养功能微生物资源的深入挖掘提供重要的技术支撑，也将为环境污染的微生物治理和修复提供宝贵的菌种资源。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术中存在的上述不足，提供一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针及其合成方法和在选育具有毒性芳烃降解活性微生物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针，其是核壳结构的纳米颗粒，所述核壳结构包括如式(I)所示的内核荧光染料Rod-X和如式(II)所示的外壳染料Methyl-S，所述纳米颗粒NP-2的结构如式(III)所示；
本发明还提供了核壳型纳米二氧化硅荧光探针的合成方法，其包括如下步骤：
(1)罗丹明B与烯丙基溴按照1:12摩尔比溶解于干燥DMF中，加入催化剂Cs2CO3，在氮气保护下加热至80℃，反应过夜后，将反应物加入二氯甲烷中，用盐水洗涤有机相三次，用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏去除有机溶剂，通过硅胶柱分离得到如式(I)所示的内核荧光染料Rod-X；
(2)3-氨丙基三乙氧基硅烷与甲基红按照摩尔比1:1～1:5溶解于干燥DMF中，保持体系在氮气保护下进行，加入催化剂PyBOP和4-二甲氨基吡啶，冰浴反应1h，随后撤掉冰浴，室温下搅拌24h，减压蒸出有机溶剂，分离提纯得到如式(II)所示的外壳染料Methyl-S；
(3)正硅酸乙酯与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷按照50:1的体积比溶解于干燥乙醇中，搅拌均匀后，加入催化剂氨水和去离子水，氨水与去离子水体积比为1:1，常温搅拌12个小时后，高速离心分离，在干燥乙醇下分散超声，离心洗涤三次，再分散于干燥乙醇中，得到表面修饰后的二氧化硅纳米颗粒SiO2-NPs；
(4)在搅拌下将如式(I)所示的内核荧光染料加入到SiO2-NPs乙醇溶液中，加热至70℃氮气条件下搅拌1h，再加入催化剂过硫酸钾引发聚合，反应在70℃下继续反应4h后终止反应，产物在高速离心机中分离得到，用水和乙醇洗涤离心数次至上清无颜色，得到中间产物NP-1；
(5)将中间产物NP-1分散于干燥乙醇中，在剧烈搅拌下加入氨水和去离子水，体积比为1:5，搅拌45分钟后，缓慢滴加如式(II)所示的外壳染料Methyl-S乙醇溶液，氮气保护室温下继续搅拌24h，产物在高速离心机中离心分离得到，用水和乙醇洗涤离心数次至上清液无颜色，最终得到如式(III)所示纳米颗粒。
本发明核壳型纳米二氧化硅荧光探针可用于选育具有毒性芳烃降解活性微生物。
因此，本发明还提供了一种具有毒性芳烃降解活性微生物的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：将不同类型的实验菌株培养至对数期，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤数次，用PBS重悬菌液调整OD600至菌液浓度为1*108，各种实验菌株等量混合于无机盐培养基中，加入如式(III)所示纳米颗粒共同培养3h后，离心收集菌体，用PBS洗涤、重悬菌液，后上流式细胞仪进行分选，得到具有毒性芳烃降解活性的微生物。
作为本发明具有毒性芳烃降解活性微生物的选育方法的一种优选技术方案，所述流式细胞仪使用激发波长为555nm，发射波长为576nm，信号收集通道选用DsRed通道。
作为本发明具有毒性芳烃降解活性微生物的选育方法的一种优选技术方案，所述流式细胞仪进行分选时，选取荧光信号强度最强的前5-10％的细菌作为具有毒性芳烃降解活性微生物；
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明设计并合成了一种对偶氮染料的降解作用有专一选择性的核壳型纳米二氧化硅荧光探针，在偶氮染料未被降解时，由于粒子内存在着荧光共振能量转移(FRET)，整体是无荧光的；当偶氮染料部分被细菌细胞的酶降解后，偶氮染料结构被破坏，荧光部分将会发射荧光。
(2)本发明具有毒性芳烃降解活性微生物的选育方法是以偶氮染料为目标化合物，以偶氮染料脱色菌株为实验客体，首次将核壳型纳米二氧化硅荧光探针技术应用于功能微生物选育中，利用纳米颗粒在细菌细胞内偶氮染料被降解的显色过程结合流式细胞仪进行特异筛选功能活性细菌。该研究的开展将建立一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物选育研究模式，更高效直观地特异性对单个细胞进行快速、高灵敏度分析分选，能为功能微生物的高效选育提供新的工具，也能为功能微生物单细胞研究和深入挖掘未培养微生物提供技术支撑，对于毒性芳烃污染物防治有重大的实践意义和应用潜力。
附图说明
图1是纳米探针的光谱分析。A为染料Rod-X的吸收光谱和荧光发射光谱；B为染料Methyl-S的吸收光谱和NP-1的荧光发射光谱；C为NP-1和NP-2在自然光和手持紫外灯照射下现象，自然光下NP-1呈粉红色，NP-2呈棕黄色，紫外灯照射下NP-1发射出明亮橘黄色荧光，NP-2不发出荧光。
图2是纳米颗粒各个阶段的热重分析测试结果。A为未结合染料的二氧化硅纳米颗粒的热重分析结果；B为NP-1的热重分析结果；C为NP-2的热重分析结果。
图3是本发明的纳米探针NP-2不同放大倍数下拍摄的TEM照片，其中，A为放大两万倍的图片，图中标尺为100nm，B同为放大两万倍的图片，图中标尺为200nm，C为放大一万倍的图片，图中标尺为500nm。
图4是本发明的纳米探针NP-2的动态光散射测试粒径分布结果，其平均粒径为59.0nm。
图5～10是本发明的纳米探针NP-2与脱色希瓦氏菌S12共同培养12小时，每隔一段时间取出样品进行激光共聚焦拍摄的照片，随时间增加同一视野范围内荧光信号逐渐增强，图 5为0小时照片，图6为1小时照片，图7为2小时照片，图8为3小时照片，图9为6小时照片，图10为12小时图片。
图11是本发明的纳米探针NP-2与脱色希瓦氏菌S12共同培养12小时后的TEM图。其中A为未加入氯霉素共同培养的菌株图片；B、C、D为加入氯霉素共同培养后的图片，其中图B为纳米颗粒进入细菌细胞的时刻，C、D为纳米颗粒在胞内累积的情况。
图12是纳米探针NP-2与鞘脂菌C1、C2以及大肠杆菌共同培养1h和12h的荧光成像，蔡司激光共聚焦荧光显微镜，激发波长555nm，其中：A是纳米探针NP-2与大肠杆菌共同培养1h的激光共聚焦图片；B是纳米探针NP-2与大肠杆菌共同培养12h的激光共聚焦图片； C是纳米探针NP-2与C1共同培养1h的激光共聚焦图片；D是纳米探针NP-2与C1共同培养12h的激光共聚焦图片；E是纳米探针NP-2与C2共同培养1h的激光共聚焦图片；F是纳米探针NP-2与大肠杆菌共同培养12h的激光共聚焦图片。
图13是流式分选实验的流式图谱。流式分选使用BD FACSAriaШ流式细胞仪，在555nm 激发波长下激发，选取荧光相对强度最强的细菌，得到10.3％的目标细菌。
图14是染料Rod-X和染料Methyl-S的合成反应路线。
图15是纳米探针NP-1和纳米探针NP-2的合成流程及选育功能微生物机理简图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
染料Rod-X和染料Methyl-S的合成流程简图如图14所示，NP-1和NP-2的合成流程简图如图15所示，具体合成过程如下。
1)染料Rod-X的合成：
在100mL的容量瓶中加入0.48g罗丹明B，1.46g烯丙基溴(12mmol)，2.65g Cs2CO3用50mL的干燥DMF溶解，在氮气保护条件下加热至80℃，反应过夜，加入200mL二氯甲烷，盐水洗涤有机相三次，用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏去除有机溶剂，通过硅胶柱分离，得到产物0.31g，产率64％(甲醇/二氯甲烷＝1:40,Rf＝0.2)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ1.3(t,CH3,12H),3.5(q,CH2,8H),4.5(d,CH2,2H),5.1(t,CH2,2H),5.7(qd,CH,1H),6.8(s, Ar,2H),6.9(d,Ar,2H),7.0(d,Ar,2H),7.3(m,Ar,1H),7.8(td,Ar,2H),8.32(d,Ar,1H).HRMSC31H35N2O3:calcd.483.6291；found m/z 483.2642[M]+。
2)染料Methyl-S的合成：
量取1ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)与甲基红1.35g(5mmol)加入到100ml单口圆底烧瓶中，再加入30ml除过水的DMF，冰浴。保持体系在干燥的氮气保护下进行，然后再将5.2g PyBOP(10mmol)和催化剂量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.1g一起加入圆底烧瓶中。反应1h后，撤掉冰浴，室温搅拌24h，减压蒸出有机溶剂，分离提纯。(乙醇/正己烷＝8:1, Rf＝0.6)1H NMR(400MHz,DMSO)δ1.1(m,CH2,2H),1.4(t,CH2,2H),1.7(dd,CH2,6H),3.0(dd, CH3,6H),3.4(t,CH3,9H),4.6(m,NH,1H),6.7(m,Ar,1H),7.2(m,Ar,1H),7.5(m,Ar,2H),7.6(m,Ar,2H),7.8(m,Ar,1H),8.0(m,Ar,1H).HRMS C25H38N4O4:calcd.486.6851；found m/z486.2525 [M]+。
3)荧光纳米颗粒NP-1的合成：
取5mL纯净的正硅酸乙酯和0.1mL的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(PMTMS)溶解于50mL的干燥乙醇中，搅拌均匀后，加入1mL去离子水和1mL的氨水，常温搅拌 12h后，在高速离心机中将得到的纳米颗粒离心分离，在乙醇中分散、离心三遍后得到修饰后的二氧化硅纳米产物。将得到的产物分散于干燥的乙醇中，然后将荧光染料Rod-X加入到溶液中进行聚合，加热至70℃氮气条件下搅拌1h，加入15mg的KPS引发聚合反应，反应液在70℃条件下继续反应4h后终止反应，产物同样在高速离心机中分离得到NP-1。
4)荧光纳米颗粒NP-2的合成：
将制备的纳米颗粒NP-2分散于干燥乙醇中，然后在强力搅拌的条件下加入0.2mL的浓氨水和1mL去离子水，搅拌1h后，将溶解了Methyl-S的乙醇溶液缓慢滴加入反应液中，氮气保护条件下继续搅拌24h，得到的产物同样用高速离心机分离。
纳米颗粒NP-2的结构如式(III)所示：
实施例2
纳米探针的光谱：
染料Rod-X和染料Methyl-S溶于乙醇中，纳米颗粒分散于水溶液中，测试其红外光谱、吸收光谱以及荧光光谱。红外光谱测试使用傅里叶变换红外光谱仪(Bruker/TensorII)，测试范围4000-400cm-1。紫外光谱测试使用紫外可见分光广度计(SHIMADZU/UV-2600)，测试范围400-800nm。荧光光谱测试使用荧光分光光度计(Perkin Elmer/LS-45)，激发波长范围 200-600nm，发射波长范围400-800nm。使用手持紫外灯对纳米颗粒发光情况进行观测。
图1是本发明纳米探针及染料的光谱分析。A为染料Rod-X的吸收光谱和荧光发射光谱，其最大吸收波长为555nm，最大发射波长为576nm，Stokes位移为21nm。B为染料Methyl-S 的吸收光谱和NP-1的荧光发射光谱，荧光发射光谱与吸收光谱发生一定重叠，说明染料 Methyl-S和NP-1能组成满足基于FRET机理的核壳型纳米颗粒。C为NP-1和NP-2在自然光和手持紫外灯照射下的现象，自然光下NP-1呈粉红色，NP-2呈棕黄色，紫外灯照射下NP-1 发射出明亮橘黄色荧光，NP-2不发出荧光。
实施例3
纳米颗粒的形貌结构：
将各阶段的纳米颗粒在真空干燥箱中60℃干燥过夜，充分干燥后研磨成粉末状，进行热重分析测试，测试温度范围为30-700℃，升温速率为10℃/min，在氮气气氛下测试。将纳米荧光探针分散于水溶液中，电子透射显微镜(TEM)测试观察颗粒的形态大小，动态光散射测试其粒径大小分布(DLS)(图2～4)。
图2是本发明各阶段纳米颗粒的热重分析。图A为未与染料结合的二氧化硅纳米颗粒热重谱图，其存在两个失重阶段，失去约自身9％的重量。B为NP-1的热重谱图，其存在两个失重阶段，失去约自身10％的重量。C为NP-2的热重谱图，其存在三个失重阶段，失去约12％的重量。图3为不同放大倍数下纳米颗粒探针的TEM图，可以看出纳米颗粒分散良好，呈规则球型，平均粒径在50±10nm。图4为纳米颗粒探针的动态光散射粒径分布图，纳米颗粒的平均粒径为59.0nm。
实施例4
荧光纳米探针示踪纯菌：
脱色希瓦氏菌S12(脱色希瓦氏菌S12，该菌株是现有技术中的菌株，公开于文献：Meiying Xu,Jun Guo,Guoqu Zeng,Xiaoyan Zhong,Guoping Sun，Decolorization ofanthraquinone dye Shewanella decolorationis S12，Appl Microbiol Biotechnol,2006,71:246～251)，鞘脂菌C1，鞘脂菌C2，大肠杆菌，将各菌种接种至40mL Luria-Bertani培养基(LB培养基)(胰蛋白胨 (Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH＝7.4)的锥形瓶，摇床隔夜培养确保生长完全，再将10μL该预培养菌液转接到4mL新鲜LB培养基的锥形瓶中摇床下继续培养8h，取出离心(7500rmp,10min,25℃)收获菌体用PBS(phosphate buffer saline,137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH＝7.4)缓冲液洗涤三次后用PBS缓冲液重悬制成OD600＝0.1的菌悬液，取3mL菌悬液加入30μL氯霉素(0，2.5μg/mL)、 40μL NP-2(100μg/mL,PBS)，培养1h，2h，3h，6h和12h后，取出离心PBS洗涤三次，用 PBS重悬制成菌悬液。
图5～10为脱色希瓦氏菌S12与NP-2共同培养0h、1h、2h、3h、6h和12h后的激光共聚焦照片，随着培养时间增长，同一视距下接收到的荧光信号在逐渐增强，说明随着共同培养时间增长，越来越多的NP-2上的偶氮染料被S12还原而发出荧光信号，在3h后荧光信号点明显的增多了，荧光强度也明显的增大了。图11为脱色希瓦氏菌S12与NP-2共同培养后的TEM照片，A为未加氯霉素共同培养的S12，B、C、D为加入氯霉素共同培养后的S12，可以看出，有氯霉素时可以促进纳米颗粒进入细胞内并在细胞内累积而使细胞荧光发光效果明显。图12A，B为大肠杆菌与NP-2共同培养1h和12h后的激光共聚焦照片，C，D为鞘脂菌C1与NP-2共同培养1h和12h后的激光共聚焦照片,E，F为鞘脂菌C2与NP-2共同培养 1h和12h后的激光共聚焦照片。可以看出，由于这几种菌对偶氮染料不具有降解功能，所以 NP-2上的偶氮染料并未被降解，所以即使共同培养12h后在激光共聚焦下依然几乎观察不到荧光信号。
实施例5
降解功能微生物流式分选：
将所制备的纳米微球应用到复配菌群中去，利用流式细胞仪进行功能活性特异性分析分选。将已知具有偶氮脱色功能的脱色希瓦氏菌S12，以及无脱色功能的鞘脂菌C1、鞘脂菌C2 和大肠杆菌分别培养至对数期，加入纳米颗粒和氯霉素，再培养3h，将各菌种等量混合，利用流式细胞仪进行分选，挑选出单个具有荧光的细菌，再进行培养脱色验证，及16SrDNA测序确认选出的菌种所属。
流式分选实验复配菌液使用了S12、鞘脂菌C1，鞘脂菌C2、大肠杆菌四种菌复配，其中只有脱色希瓦氏菌S12对NP-2有脱色显荧光功能，其他的菌均不会对其进行还原显荧光，因此在流式分选时，混合菌液中会被挑选出来的单菌必定是S12。流式分选使用BDFACSAria Ш流式细胞仪，在555nm激发波长下激发，选取荧光相对强度最强的细菌，得到10.3％的目标细菌(图13)，经16S rDNA测序所得基因组数据确认，分选所得的菌只有复配菌液中的 S12。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (6)

1.一种核壳型纳米二氧化硅荧光探针，其特征在于，其是核壳结构的纳米颗粒，所述核壳结构包括如式(I)所示的内核荧光染料和如式(II)所示的外壳染料，所述纳米颗粒的结构如式(III)所示；
2.权利要求1所述核壳型纳米二氧化硅荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)罗丹明B与烯丙基溴按照1:12的摩尔比溶解于干燥DMF中，加入催化剂Cs2CO3，在氮气保护下加热至80℃，反应过夜后，将反应物加入二氯甲烷中，用盐水洗涤有机相三次，用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏去除有机溶剂，通过硅胶柱分离得到如式(I)所示的内核荧光染料；
(2)3-氨丙基三乙氧基硅烷与甲基红按照摩尔比1:1～1:5溶解于干燥DMF中，保持体系在氮气保护下进行，加入催化剂PyBOP和4-二甲氨基吡啶，冰浴反应1h，随后撤掉冰浴，室温下搅拌24h，减压蒸出有机溶剂，分离提纯得到如式(II)所示的外壳染料；
(3)正硅酸乙酯与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷按照50:1的体积比溶解于干燥乙醇中，搅拌均匀后，加入催化剂氨水和去离子水，氨水与去离子水体积比为1:1，常温搅拌12个小时后，高速离心分离，弃去上清液后超声分散在干燥乙醇中，离心洗涤三次，再分散于干燥乙醇中，得到表面修饰后的二氧化硅纳米颗粒SiO2-NPs；
(4)在搅拌下将如式(I)所示的内核荧光染料加入到SiO2-NPs乙醇溶液中，加热至70℃氮气条件下搅拌1h，再加入催化剂过硫酸钾引发聚合，反应在70℃下继续反应4h后终止反应，产物在高速离心机中分离得到，用水和乙醇洗涤离心数次至上清无颜色，得到中间产物NP-1；
(5)将中间产物NP-1分散于干燥乙醇中，在剧烈搅拌下加入氨水和去离子水，体积比为1:5，搅拌45分钟后，缓慢滴加如式(II)所示的外壳染料Methyl-S的乙醇溶液，氮气保护室温下继续搅拌24h，产物在高速离心机中离心分离得到，用水和乙醇洗涤离心数次至上清液无颜色，最终得到如式(III)所示纳米颗粒。
3.权利要求1所述核壳型纳米二氧化硅荧光探针在选育具有毒性芳烃降解活性微生物中的应用。
4.一种具有毒性芳烃降解活性微生物的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：
将不同类型的实验菌株培养至对数期，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤数次，用PBS重悬菌液调整OD600至菌液浓度为1*108，各种实验菌株等量混合于无机盐培养基中，加入如式(III)所示纳米颗粒共同培养3h后，离心收集菌体，用PBS洗涤、重悬菌液，后上流式细胞仪进行分选，得到具有毒性芳烃降解活性的微生物；
5.根据权利要求4所述的具有毒性芳烃降解活性微生物的选育方法，其特征在于，所述流式细胞仪使用激发波长为555nm，发射波长为576nm，信号收集通道选用DsRed通道。
6.根据权利要求4所述的具有毒性芳烃降解活性微生物的选育方法，其特征在于，所述流式细胞仪进行分选时，选取荧光信号强度最强的前5-10％的细菌作为具有毒性芳烃降解活性微生物。
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