CN107898997A - 油茶粕多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了油茶粕多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。本发明充分利用油茶籽榨油后剩下的副产品——油茶饼粕，通过一定的方法提取油茶粕蛋白，并用蛋白酶酶解油茶粕蛋白得到油茶粕多肽，测定浓度后进行相关抗动脉粥样硬化动物实验，证明了油茶粕多肽对动脉粥样硬化发病小鼠具有非常好的治疗作用，降血脂疗效比阳性对照辛伐他汀组的治疗效果更好，为动脉粥样硬化的治疗方法提供新的思路和路径，为油茶资源的充分利用以及油茶产业的开发提供新的渠道。

Description

油茶粕多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及油茶粕多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

背景技术：

动脉粥样硬化是多因素共同作用引起的，发病机制复杂，目前尚未完全阐明，是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因，并且为冠心病的主要病理基础，而冠心病是我国最常见的心血管疾病，随着我国步入老年社会，冠心病成为危害人们健康的重大疾病和主要致死原因，其发病率和病死率逐年上升，目前心脑血管疾病风险因素在全球范围内一直处于快速增长的状态，动脉粥样硬化也是其最关键的病因。

目前关于动脉粥样硬化发病机制的学说有很多，但是任何一种学说都不能全面解释动脉粥样硬化的发病机制，因此根据其相关危险因素，目前动脉粥样硬化的治疗仍主要以一级预防为主，单纯的药物治疗控制不佳，并且目前的手术治疗如介入治疗、外科搭桥术、血管移植、血管成形术等已经非常成熟，但是手术本身对于血管的损伤以及术后的再狭窄、各种并发症的出现都说明目前的治疗方式仍未能有效地预防、控制、逆转AS的病程。

油茶为常绿小乔木，属茶科，山茶属，是我国南方丘陵地区的一种优良的木本油料植物。油茶主要由油茶壳和油茶籽组成，油茶是我国目前主要的油料植物之一，我国是产油茶大国，是世界上油茶品种最多、分布最广、油茶籽产量最高的国家，仅油茶林的种植面积就达6000多万亩(2015)。茶油产量由20多万吨增加到51.8万吨，年产油茶籽约370万吨，而作为油茶籽榨油后剩下的副产品——油茶粕的年产量约为310万吨。

然而大多数的油茶粕只是作为有机肥料来使用，造成优质资源的严重浪费。在油茶粕中含有10％-20％的蛋白质，其氨基酸组成为17种，其中8种为人体必需氨基酸，组氨酸和精氨酸两种半必需氨基酸含量也较高，是一种天然非离子型表面活性剂，并有消炎、镇痛、抗渗透等药理作用，为潜在的优质植物蛋白资源。此外油茶粕蛋白经酶解后还可以制备成功能性多肽，生成的多肽及氨基酸等物质具有多种生物学活性，如促进免疫、激素调节、抗菌、抗氧化、抗病毒、降血压、降血脂、降低胆固醇等功能特性。

发明内容：

本发明的目的是提供油茶粕多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

本发明采用的ApoE-/-小鼠购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，由赣南医学院科研中心实验动物中心繁殖，取八周ApoE-/-小鼠雄鼠喂食高脂饲料(小鼠标准饲料+1.25％胆固醇+15％脂肪+0.5％胆酸盐)8-12周，构建动脉粥样硬化疾病小鼠模型。给予8周ApoE-/-小鼠高脂饲料8周后即可构建动脉粥样硬化模型，设置实验组、对照组、空白组。实验组在发病后给予油茶粕多肽，并给予高剂量；阳性对照组给予辛伐他汀进行治疗；阴性对照组则给予生理盐水。由于血脂异常为动脉粥样硬化最主要的致病因素之一，因此给药期间每隔2周眼眶取血一次，并用试剂盒测定小鼠血脂水平，检测指标主要有：甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白，以观察给予油茶粕多肽后的血脂水平变化，给药8周后取材，通过主动脉取材后大体油红O染色观察，直接了解油茶粕多肽治疗小鼠动脉粥样硬化疾病的具体情况。结果表明，油茶粕多肽对动脉粥样硬化发病小鼠具有非常好的治疗作用，降血脂疗效比阳性对照辛伐他汀组的治疗效果更好。

因此，本发明的油茶粕多肽能在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

所述的油茶粕多肽优选是通过以下方法制备的：将油茶粕粉碎后用石油醚脱脂，脱脂后的油茶粕粉末先后用纤维素酶和α-淀粉酶酶解，酶解后的油茶粕经碱提酸沉得到油茶粕蛋白沉淀，油茶粕蛋白沉淀再经碱性蛋白酶酶解，酶解液灭酶后，离心收集上清液即得油茶粕多肽。

进一步优选，所述的油茶粕多肽优选是通过以下方法制备的：

将油茶粕粉碎后，过60目筛，按料液比1g：40ml加入石油醚进行脱脂，脱脂后的油茶粕放置室温进行风干，即得到脱脂后的油茶粕粉末；

脱脂后的油茶粕粉末按料液比1g：30ml加入蒸馏水，然后再按蒸馏水质量2％的量加入纤维素酶，在反应温度50℃、pH值6.5、时间60min的条件下反应，反应结束后再按蒸馏水质量1.3％的酶添加量加入α-淀粉酶，55℃反应60min后酶预处理结束，得到酶预处理后的油茶粕；

酶预处理后的油茶粕用NaOH调整pH值至10.2后50℃水浴反应120min，过滤去渣，取得的上清液再调整pH值至4.2后常温反应60min，得到油茶粕蛋白混悬液，离心后去除上清液，所得沉淀经冷冻干燥后即为油茶粕蛋白沉淀；

将油茶粕蛋白沉淀溶解于水中，使其浓度为质量分数3％，调节pH值为8.5，然后加入碱性蛋白酶，加酶量为5000U/g油茶粕蛋白沉淀，反应温度为50℃的条件下酶解2小时，酶解完成后加热灭酶，离心后收集上清液即得油茶粕多肽。

本发明充分利用油茶籽榨油后剩下的副产品——油茶饼粕，通过一定的方法提取油茶粕蛋白，并用蛋白酶酶解油茶粕蛋白得到油茶粕多肽，测定浓度后进行相关抗动脉粥样硬化动物实验，证明了油茶粕多肽对动脉粥样硬化发病小鼠具有非常好的治疗作用，降血脂疗效比阳性对照辛伐他汀组的治疗效果更好，为动脉粥样硬化的治疗方法提供新的思路和路径，为油茶资源的充分利用以及油茶产业的开发提供新的渠道。

附图说明：

图1是不同组别小鼠2周低密度脂蛋白含量图；

图2是不同组别小鼠6周低密度脂蛋白含量图；

图3是不同组别小鼠8周低密度脂蛋白含量图；

图4是不同组别小鼠2周总胆固醇含量图；

图5是不同组别小鼠6周总胆固醇含量图；

图6是不同组别小鼠8周总胆固醇含量图；

图7是不同组别小鼠2周甘油三酯含量图；

图8是不同组别小鼠6周甘油三酯含量图；

图9是不同组别小鼠8周甘油三酯含量图；

图10是不同组的油红O染色图，其中普食组代表的是饲喂普通食物组。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.预处理后碱提酸沉法提取油茶粕蛋白

1.1油茶粕材料预处理

将油茶粕粉碎后，过60目筛，按料液比1：40(W/V g/ml)加入石油醚(沸点为60-90℃)过夜进行脱脂，脱脂后的油茶粕放置室温进行风干，即得到脱脂后的油茶粕粉末。

1.2酶预处理

脱脂后的油茶粕粉末按料液比1:30(W/V g/ml)加入蒸馏水，然后再按蒸馏水质量2％的量加入纤维素酶(纤维素酶可水解纤维素和半纤维素等细胞壁成分，可解除细胞壁对蛋白质的束缚)，在反应温度50℃、pH值6.5、时间60min的条件下反应，反应结束后再按蒸馏水质量1.3％的酶添加量加入α-淀粉酶(淀粉在一定温度下可与蛋白质结合，会加大蛋白质的提取难度，而淀粉酶可较好的解决此问题，并显著提高油茶粕蛋白的提取率)，55℃反应60min后酶预处理结束，得到酶预处理后的油茶粕。

1.3碱提酸沉

酶预处理后的油茶粕用NaOH调整pH值至10.2后水浴锅50℃反应120min，过滤去渣，取得的上清液再调整pH值至4.2后常温反应60min，得到油茶粕蛋白混悬液，4000rpm离心20min后去除上清液，所得沉淀经冷冻干燥后即为油茶粕蛋白沉淀。

2.油茶粕多肽的制备

将油茶粕蛋白沉淀溶解于水中，使其浓度为质量分数3％，调节pH值为8.5，然后加入碱性蛋白酶，加酶量为5000U/g油茶粕蛋白沉淀，反应温度为50℃的条件下酶解2小时，酶解完成后加热(85℃,10min)灭酶，离心(4000g,15min)后收集上清液即得油茶粕多肽。并用双缩脲法测定油茶粕多肽浓度。

3.油茶粕多肽抗动脉粥样硬化作用实验

载脂蛋白E基因敲除(ApoE^-/-)雄鼠，给予高脂饲料(按质量分数计，高脂饲料中含脂肪15％、胆固醇1.25％、0.5％胆酸盐)8周后建模成功。本实验设计分为实验组、对照组和空白组，建模成功后实验组和对照组都继续给予高脂饲料，空白组予普通饲料，饮水均不限。

表1

注：给药时间为高脂饲料8周后开始给药，ND：正常饲料；HDF：高脂饲料。

3.1血脂水平检测：各组小鼠分别于给药0、2、4、6周眼眶取血后，离心取血清，测定血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白的浓度，对小鼠血脂水平的变化进行监测。小鼠第8周摘眼球取血后处死，小鼠血浆装入1.5ml EP管中，静置30min后4000g/min离心7min后取血清进行血脂检测。打开小鼠胸腔，组织剪剪破小鼠右心耳部位，灌流针刺入左心室并用PBS灌流。分离小鼠全主动脉：腹正中切开，钝性分离胸骨、膈肌，游离心脏、双肾，暴露胸腹主动脉全程，剥离血管外膜游离组织，取主动脉全程。

血脂水平检测如图1-9所示，图1-9中的油茶多肽指的是高剂量200mg/kg的油茶粕多肽组，从图1-9可以看出油茶粕多肽对动脉粥样硬化发病小鼠具有非常好的治疗作用，降血脂疗效比阳性对照辛伐他汀组的治疗效果更好。

3.2油红O染色：主动脉取出，置于装有异丙醇的器皿中脱水2～3min；室温下将主动脉放入装有油红O染液的EP管中(油红O染液配制：称取0.1g油红O粉剂溶于10ml异丙醇中，摇匀，置于60℃温箱40min；取出后，加入等体积(10ml)ddH2O，过滤即为油红O染液)，避光染色2～4h(注意染色时间不宜过长)；将主动脉取出，置于85％异丙醇中漂洗3～5次，3min/次(视主动脉背景色调整漂洗次数及时间)；将异丙醇漂洗后的主动脉置于PBS中漂洗数次；将完成染色的主动脉展开、固定，观察并拍照。

油红O染色如图10所示，图10中的实验组指的是高剂量200mg/kg的油茶粕多肽组，从图10可以看出，油茶粕多肽给药组小鼠主动脉斑块显著减少。

Claims (3)

1.油茶粕多肽在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的油茶粕多肽是通过以下方法制备的：将油茶粕粉碎后用石油醚脱脂，脱脂后的油茶粕粉末先后用纤维素酶和α-淀粉酶酶解，酶解后的油茶粕经碱提酸沉得到油茶粕蛋白沉淀，油茶粕蛋白沉淀再经碱性蛋白酶酶解，酶解液灭酶后，离心收集上清液即得油茶粕多肽。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的油茶粕多肽是通过以下方法制备的：

将油茶粕粉碎后，过60目筛，按料液比1g：40ml加入石油醚进行脱脂，脱脂后的油茶粕放置室温进行风干，即得到脱脂后的油茶粕粉末；

脱脂后的油茶粕粉末按料液比1g：30ml加入蒸馏水，然后再按蒸馏水质量2％的量加入纤维素酶，在反应温度50℃、pH值6.5、时间60min的条件下反应，反应结束后再按蒸馏水质量1.3％的酶添加量加入α-淀粉酶，55℃反应60min后酶预处理结束，得到酶预处理后的油茶粕；

酶预处理后的油茶粕用NaOH调整pH值至10.2后50℃水浴反应120min，过滤去渣，取得的上清液再调整pH值至4.2后常温反应60min，得到油茶粕蛋白混悬液，离心后去除上清液，所得沉淀经冷冻干燥后即为油茶粕蛋白沉淀；

将油茶粕蛋白沉淀溶解于水中，使其浓度为质量分数3％，调节pH值为8.5，然后加入碱性蛋白酶，加酶量为5000U/g油茶粕蛋白沉淀，反应温度为50℃的条件下酶解2小时，酶解完成后加热灭酶，离心后收集上清液即得油茶粕多肽。