CN107827864B - 胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法及用途 - Google Patents

胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药制备技术领域，涉及药用植物化学成分提取分离方法，具体涉及胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法及用途。本发明将胡椒荜茇组合物经二氧化碳超临界流体法提取除油，药渣用70%乙醇提取，浓缩，用二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，干燥，得二氯甲烷萃取部位；用正相硅胶柱色谱、高压制备液相色谱、反相ODS柱色谱、LH‑20凝胶柱色谱及制备薄层色谱对二氯甲烷萃取部位的化学成分进行系统分离，得到10种化合物。药效学试验结果表明，从胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位分离得到的10种化合物对神经细胞均具有保护活性，其中，化合物10：邻苯二甲酸二丁酯活性最好。对脑卒中治疗药物的研发及质量控制具有重要意义。

Description

胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法及用途
技术领域
本发明属于医药制备技术领域，涉及药用植物化学成分提取分离方法，具体涉及一种回药核心药对胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法及用途。
背景技术
脑卒中（stroke），是以出现意识障碍和局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管病。脑卒中发病率高、复发率高、致残率高，已成为国民死亡的首要因素。2016年《中国脑卒中防治报告》显示，我国每年新发脑卒中患者200余万人；每年死于脑卒中的患者多达180余万，存活患者大多也引起残疾，给家庭和社会带来了很大的负担。中国政府每年因脑卒中直接经济支出374亿元。随着我国人口老龄化，脑卒中的问题日益严重，社会和经济将不堪重负（郭晋敏.ALDH2对缺血性脑卒中的作用研究.第二军医大学博士学位论文.2012）。
迄今为止，对于脑卒中尚无特效治疗药物，尤其是对错过最佳治疗时间窗（6h以内，溶栓治疗）缺血性脑卒中治疗，全世界尚没有完全统一的标准。目前临床使用的治疗药物主要分为以下几类：溶栓药物、抗血小板聚集药物、降纤药物、抗凝药物和神经保护药物等。这些药物虽然有一定的疗效，但药物不良反应较多，有的会发生胃肠道不良反应（如阿司匹林），或者可能会增加颅外出血的危险性（如肝素），即使是近几年备受关注的神经细胞保护药物亦缺乏安全性及有效性等临床评价（任雪梅,杨光福．脑梗死治疗研究现状与进展[J].河北医学.2010，16(2):237-238.；段云霞,陈小玉,张梓倩等.缺血性脑卒中治疗药物研究进展[J].中央民族大学学报(自然科学版).2012,21(2):65-68.）。因此，寻找疗效确切、安全有效的脑卒中治疗药物异常迫切。
回医药是回族丰富的文化遗产之一，是祖国传统医学的重要组成部分，2008年被列为世界非物质文化保护遗产（《第二批国家级非物质文化遗产名录》977 Ⅸ-17 回族医药，2008年）。回医药治疗脑卒中历史悠久，《回回药方》、《海药本草》、《瑞竹堂经验方》等经典著作中收录治疗脑卒中的方剂百余首，以扎里奴思方、哈黑里里方为代表的一系列方剂经临床验证疗效显著。脑卒中新药的研发亦是宁夏回族自治区十三五期间发展民族特色医药及大健康的主要方向。
胡椒，为胡椒科植物胡椒Piper nigrum L.的干燥近成熟或成熟的果实。气芳香，味辛辣。温中散寒，下气，消痰。所述胡椒包括白胡椒和黑胡椒。
荜茇，为胡椒科植物荜茇Piper longum L.的干燥近成熟或成熟果穗。有特异香气、味辛辣。温中散寒，下气止痛。用于脘腹冷痛，呕吐，泄泻，寒凝气滞，胸痹心痛，头痛，牙痛。
现代药理学研究结果表明，胡椒、荜茇具有较高的药用价值，在心血管系统、中枢神经系统、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、抗癌等方面均具有药理活性。
本发明通过对古今文献中治疗脑卒中的回药方剂进行挖掘、整理，并结合临床药效研究等方法，确定“胡椒+荜茇”的组合物在治疗脑卒中的方剂中应用最多，是出现频次最高的两味药材，“胡椒+荜茇”的组合出现频次为 37 次（李婷婷,王星,马学琴等.回药治疗脑卒中方剂配伍规律研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(20):307-311.）。但在文献中并未明确指出发挥治疗作用的有效部位及其药物化学成分。
综上所述，现有技术存在的主要问题有：（1）现有治疗脑卒中药物虽然有一定的疗效，但药物不良反应较多，寻找疗效确切、安全有效的脑卒中治疗药物异常迫切；（2）现有技术指出“胡椒+荜茇”的组合物在治疗脑卒中的方剂中应用最多，但未明确指出发挥治疗作用的有效部位及其药物化学成分。
因此，对该组合物中治疗脑卒中发挥作用的化学成分进行深入研究，探索药理活性的物质基础，对药物研发及质量控制具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分提取分离方法。本发明所述的方法是先将胡椒荜茇组合物经二氧化碳超临界流体法提取除油，然后用乙醇提取药渣，将所得乙醇浸膏用二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷萃取部位；然后采用正相硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、LH-20凝胶柱色谱和制备薄层色谱法将二氯甲烷萃取部位的化学成分进行系统分离、测定，得到10种化合物。
本发明的第二个目的是提供胡椒荜茇组合物中二氯甲烷萃取部位化学成分的用途，用于改善和治疗脑卒中。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现。
本发明提供了一种胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法：取所述胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位，加1-2倍量甲醇超声溶解，然后将溶液加入100-200目的硅胶中，拌匀，于通风处挥干溶剂，得固体粉末，作为总样，备用；用常压层析柱干法装柱上样，层析柱直径10cm，柱高110 cm；先将100-200目硅胶装入层析柱中，再将所得总样加入层析柱中，总装柱量为三分之二个柱体积；以体积比为石油醚-乙酸乙酯=20:1-0:1的洗脱剂进行梯度洗脱，按500 ml一瓶，收集洗脱液，总洗脱量为6个柱体积；用薄层色谱检测（TLC）合并相似流分，得到E1至E9九个组分；所述E6组分经LH-20凝胶柱色谱分离得到E6-1至E6-4四个组分；所述E6-1组分通过ODS-A-HG柱色谱分离得到E6-1-1至E6-1-10十个组分；所述E6-1-3组分经制备薄层色谱纯化得化合物5：4-己基-4,6-二甲基-4,5- 二氢吡咯[1,2-A]喹喔啉、化合物6：N-(5,6,7,8-四氢萘-2-基)乙酰胺、化合物7：E-4(15)-桉叶烯-1β,6α二醇；
所述E6-3组分经高压制备型液相色谱分离得到化合物4：(2S,3S)-2-(5-甲氧基-3,4-亚甲基二氧苄基)-3-(3,4-亚甲基二氧苄基)丁内酯。
进一步，所述取E6组分经LH-20凝胶柱色谱分离的条件为：洗脱剂为甲醇，等度洗脱；所述将E6-1组分通过ODS-A-HG柱色谱分离的条件为：填料粒径：50μm，梯度洗脱，流动相为60%-100%甲醇；所述将E6-1-3组分经制备薄层色谱纯化的色谱条件为：GF254薄层硅胶，展开剂分别为石油醚∶乙酸乙酯=2:1和石油醚∶乙酸乙酯=1:1，展距均为12-15cm；所述E6-3组分经高压制备型液相色谱分离的条件：流动相为65%甲醇。
进一步，所述E7组分经硅胶柱层析分离得到E7-1至E7-5五个组分；所述E7-2组分经LH-20凝胶柱色谱和ODS-A-HG柱色谱，并结合高压制备型液相色谱分离得到化合物8：3-(3',4'-亚甲基二氧苯基)-丙烯醛；
进一步，所述化合物4、5、6、7可用于治疗脑卒中或建立胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位的质量标准，控制产品质量。
取所述E7-5组分，进行3-7次重结晶，结晶剩余母液浓缩后经ODS中压制备液相色谱分离得到E7-5-1至E7-5-9九个组分；取所述E7-5-3组分，过中压制备液相色谱，得到E7-5-3-1至E7-5-3-7七个组分；取所述E7-5-3-4组分通过LH-20凝胶柱色谱、ODS柱色谱，结合硅胶柱层析分离得到化合物10：邻苯二甲酸二丁酯；
取所述E7-5-5组分通过LH-20凝胶柱色谱，结合制备薄层色谱得到化合物3：胡椒环丁酰胺C；
取所述E7-5-6组分，经硅胶柱色谱分离，得到E7-5-6-1至E7-5-6-5五个组分；将E-7-5-6-2、E-7-5-6-3和E-7-5-6-4组分分别经制备薄层色谱纯化得化合物1：胡椒环丁酰胺G、化合物9：7-去甲氧基-齐墩果醇-9(z),12(z)亚油酸、化合物2：胡椒环丁酰胺H。
进一步，所述E7组分经硅胶柱层析分离的条件为：洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯=8:1-0:1，梯度洗脱；所述E7-2组分经LH-20凝胶柱色谱和ODS-A-HG柱色谱，并结合高压制备型液相色谱分离的条件为： LH-20凝胶柱色谱：流动相为甲醇，等度洗脱；ODS-A-HG柱色谱：流动相为60%-100%甲醇，梯度洗脱；高压制备型液相色谱：流动相为65%甲醇；
所述E7-5组分，进行3-7次重结晶，结晶剩余母液浓缩后经ODS中压制备液相色谱分离的条件为：填料为ODS，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱剂为60%-100%甲醇；
所述E7-5-3组分，过中压制备液相色谱的条件为：填料为ODS，梯度洗脱，洗脱剂为60%-100%甲醇；
所述E7-5-3-4组分通过LH-20凝胶柱色谱、ODS柱色谱，结合硅胶柱层析分离的条件为：LH-20凝胶柱色谱：等度洗脱，流动相为甲醇；ODS-A-HG柱色谱：流动相为60%-100%甲醇，梯度洗脱；硅胶柱层析色谱：流动相为石油醚∶乙酸乙酯=12:1-0:1，梯度洗脱；
取所述E7-5-5组分通过LH-20凝胶柱色谱的条件为：流动相为甲醇，结合制备薄层色谱的条件为：GF254 薄层硅胶，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=2:1，展距均为12-15cm；
所述E7-5-6组分，经硅胶柱色谱分离的条件为：梯度洗脱，流动相为石油醚∶乙酸乙酯=8:1-0:1；所述E-7-5-6-2、E-7-5-6-3和E-7-5-6-4组分分别经制备薄层色谱纯化的条件为：GF254 薄层硅胶，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=2:1，纯化次数3-7次。
进一步，所述胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位的制备方法为：按重量比胡椒︰荜茇为1:10-10:1称取胡椒、荜茇，粉碎，混匀，用CO2超临界萃取除油，药渣用70%乙醇提取，提取液减压浓缩至无醇味，用二氯甲烷萃取，回收萃取液中的二氯甲烷，得流浸膏，干燥，即得。其中，所述的二氯甲烷可用等极性有机混合溶媒替代。
进一步，所述胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位的制备方法包括以下步骤：
S1：CO2超临界萃取除油：按重量比胡椒︰荜茇为1:1称取胡椒、荜茇，置粉碎机中粉碎，混合均匀，用CO2超临界萃取至不出油；
S2：乙醇提取：取除油后的药渣，用70%乙醇提取，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得乙醇粗提物溶液；
S3：二氯甲烷萃取：取乙醇粗提物溶液，加入等体积二氯甲烷，萃取，静置分层，收集二氯甲烷萃取液，减压回收二氯甲烷，干燥，即得二氯甲烷萃取部位，密封储存。其中，所述的二氯甲烷可用等极性有机混合溶媒替代。
进一步，所述化合物1、2、3、8、9、10可用于治疗脑卒中或建立胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位的质量标准，控制产品质量。
进一步，所述胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法可用于治疗脑卒中药物的制备。
本发明的有益效果：
本发明将胡椒荜茇组合物用二氧化碳超临界萃取除油，药渣用70%乙醇提取，提取液减压浓缩至无醇味，用二氯甲烷萃取，回收萃取液中的二氯甲烷，干燥，得到二氯甲烷萃取部位；本发明还采用正相硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、LH-20凝胶柱色谱和制备薄层色谱法将二氯甲烷萃取部位的化学成分进行系统分离、测定，得到10种化合物；药效学实验结果表明，从胡椒、荜茇二氯甲烷萃取部位中分离、纯化得到的10种化合物对治疗脑卒中具有确切的疗效，对药物研发及质量控制具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例2胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行详细说明，但本发明的实施并不局限于此。
实施例1：
一种胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位，其制备方法包括以下步骤：
S1：CO2超临界萃取除油：称取胡椒、荜茇各20kg，混合均匀，置粉碎机中粉碎，投入CO2超临界萃取釜中萃取至不出油，萃取条件：压力300Bar，温度55℃，分离釜I压力80Bar，分离I温度50℃，分离釜II压力60Bar，分离II温度40℃。
S2：乙醇提取：将由步骤S1得到的药渣分多次加入多功能提取罐中，用70%乙醇提取3次，每次3h，药渣∶70%乙醇的体积比=1:10。合并提取液，置旋转蒸发仪中，旋至无醇味，得乙醇粗提物溶液。
S3：二氯甲烷萃取：将由步骤S2得到的乙醇粗提物溶液和二氯甲烷以体积比1:1的比例混合，加入分液漏斗，摇匀，静置分层，收集二氯甲烷萃取液；每批萃取次数不少于4次，合并二氯甲烷萃取液，用旋转蒸发仪回收二氯甲烷萃取液中的二氯甲烷，得流浸膏。取出流浸膏，自然干燥，即得二氯甲烷萃取部位；密封储存，储存温度为-4℃。
实施例2：
在实施例1的基础上，如图1所示，取200 g由实施例1得到的二氯甲烷萃取部位，按照如下步骤进行操作：
1. 硅胶柱层析：
取二氯甲烷萃取部位加适量甲醇超声溶解，然后将溶液加入100-200目的硅胶中，拌匀，于通风处挥干溶剂，得固体粉末，作为总样，备用；用常压层析柱干法装柱上样，层析柱直径10cm，柱高110 cm；先将100-200目硅胶装入层析柱中，再将所得总样加入层析柱中，总装柱量为三分之二个柱体积；以体积比为石油醚-乙酸乙酯=20:1-0:1的洗脱剂进行梯度洗脱，按500 ml一瓶，收集洗脱液，总洗脱量为6个柱体积；用薄层色谱检测（TLC）合并相似流分，得到9 个组分E1～E9。
2. 取E6组分（1.21g）经LH-20凝胶柱色谱分离，以甲醇为流动相，等度洗脱，得到E6-1至E6-4组分。
2a. E6-1组分 通过ODS-A-HG柱色色谱分离，填料粒度为50μm，流动相为60%-100%甲醇，得到10个组分；E6-1-3组分经制备薄层色谱分离，载体为GF254薄层硅胶，展开剂分别为石油醚∶乙酸乙酯=2:1和石油醚∶乙酸乙酯=1:1，展距均为12-15cm，纯化得到化合物5（2.7mg）：4-己基-4,6-二甲基-4,5- 二氢吡咯[1,2-A]喹喔啉，化合物6（1.4mg）：N-(5,6,7,8-四氢萘-2-基)乙酰胺，化合物7（1.1mg）：E-4(15)-桉叶烯-1β,6α二醇。
2b. E6-3组分经高压制备型液相色谱（PHPLC）分离，流动相为65%甲醇，得到化合物4（9.3mg）：(2S,3S)-2-(5-甲氧基-3,4-亚甲基二氧苄基)-3-(3,4-亚甲基二氧苄基)丁内酯。
3. 取E7组分（91.92g）经硅胶柱层析分离，梯度洗脱，流动相为石油醚∶乙酸乙酯=8:1-0:1，得到E7-1至E7-5，共5个组分。
3a. 将E7-2组分经LH-20凝胶柱色谱分离，以甲醇为流动相，梯度洗脱；ODS-A-HG柱色谱分离，填料粒径为50μm，流动相为60%-100%甲醇，并结合高压制备型液相色谱（PHPLC）分离，流动相为65%甲醇，得到化合物8（1.0mg）：3-(3',4'-亚甲基二氧苯基)-丙烯醛。
3b. 取所述E7-5组分，进行5次重结晶，结晶剩余母液浓缩后经ODS中压制备液相色谱分离，填料为ODS，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱剂为60%-100%甲醇，分离得到E7-5-1至E7-5-9。
3c. 取E7-5-3（24.47g）组分，过中压制备液相色谱，填料为ODS，梯度洗脱，洗脱剂为60%-100%甲醇，得到E7-5-3-1至E7-5-3-7七个组分；
取所述E7-5-3-4组分通过LH-20凝胶柱色谱等度洗脱，流动相为甲醇；ODS-A-HG柱色谱，流动相为60%-100%甲醇，梯度洗脱；并结合硅胶柱层析色谱，流动相为石油醚∶乙酸乙酯=12:1-0:1，梯度洗脱，分离得到化合物10（16.1mg）：邻苯二甲酸二丁酯。
3d. 取E7-5-5组分通过LH-20凝胶柱色谱，流动相为甲醇，结合制备薄层色谱，GF254 薄层硅胶，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=2:1，展距均为12-15cm，分离得到化合物3（24.8mg）：胡椒环丁酰胺C。
3e. 取E7-5-6组分经硅胶柱色谱分离，梯度洗脱，流动相为石油醚∶乙酸乙酯=8:1-0:1，得到5个组分，E7-5-6-1至E7-5-6-5。
将E-7-5-6-2、E-7-5-6-3和E-7-5-6-4组分分别经制备薄层色谱分离，GF254 薄层硅胶，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=2:1，纯化5次，得化合物1（12.4mg）：胡椒环丁酰胺G，化合物9（7.3mg）：7-去甲氧基-齐墩果醇-9(z),12(z)亚油酸，化合物2（15.0mg）：胡椒环丁酰胺H。
实施例3：
在实施例2的基础上，对由本发明实施例2中从二氯甲烷萃取部位中分离纯化所得10种化合物进行结构鉴定。
化合物 1：胡椒环丁酰胺G
淡黄色固体，C34H40N2O6，易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 1.25 (2H, m,H-9 ), 2.15 (2H, m, H -10 ), 3.04 (1H, m, H-1 ), 3.48 (1H, br s, H-2), 3.53(1H, ddd, J = 2.1, 2.1, 9.7 Hz, H-3), 4.02 (1H, dd, J = 9.7, 10.0 Hz, H-4),1.19-1.43 (4H, m, H-2'',4''), 1.43, 1.65 (2H, m, H-3' ,3''), 1.59 (4H, m, H-2',4'), 3.42-3.99 (4H, m, H-1'',5''), 3.67, 3.69 (2H, br s, H-2',4'), 5.87,5.92 (4H, br s, 2-OH2O- ), 6.68 (1H, dd, J = 1.5, 7.9 Hz, H-12), 6.72 (1H, d,J = 1.5 Hz, H-16 ), 6.71 (2H, br s, H-2''',6'''), 6.73 (1H, d,J = 8.2 Hz, H-5'''), 6.72 (1H, br s, H-13), 5.71 (1H, ddd, J = 2.1, 5.1, 9.8 Hz, H-6), 5.84(1H, d, J = 9.8 Hz, H-7); 13C NMR (CDCl3, 100 Hz) δC: 24.8 (C-1), 26.1, 27.0(C-4,C-9), 43.0(C-1''), 47.1 (C-5''), 100.8 (2-OCH2O-), 108.1 (C-5''',C-13)108.4 (C-6''',C-16), 120.4 (C-12), 121.5 (C-2'''), 123.5 (C-6), 134.0 (C-7),170.4 (C-8), 173.2 (C-1''). 上述数据与文献(Matsuda H, Ninomiya K, Morikawa T,et al. Hepatoprotective amide constituents from the fruit of Piper chaba:Structural requirements, mode of action, and new amides[J]. Bioorganic &Medicinal Chemistry,2009,17(20):7313-7323.)报道基本一致，故鉴定为胡椒环丁酰胺G。
化合物 2：胡椒环丁酰胺H
Figure 34752DEST_PATH_IMAGE002
淡黄色固体，C38H46N2O6，易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 1.16-1.27(4H, m, H-2',4'), 1.27-1.43 (2-H, m, H-9), 1.36-1.55 (2H, m, H10), 1.55 (2H,br s, H-11), 2.13 (2H, m, H-12), 2.09-3.54 (3H, m, H-2,1), 3.67 (1H, br d, J= 11 Hz, H-3), 4.02 (1H, dd, J = 10.8, 11.0 Hz, H-4), 3.07-3.90 (4H, m, H-1',5'), 3.56 (4H, br s, H -1'',5''), 5.70 (1H, m, H-5), 5.83 (1H, d, J = 9.8 Hz,H-7), 5.94-6.02 (4H, m, 2-OCH2O-), 6.67 (1H, br s, H-6'''), 6.72 (1H, d, J =1.2 Hz, H-2'''), 6.73 (2H, br d, J = 8 Hz, H-5''',16 ), 6.86 (2H, br s, H-17,20). 13C NMR (CDCl3, 100 Hz) δC: 24.8 (C-3''), 25.0 (C-3'), 25.9 (C-2''), 26.0(C-4''), 26.2 (C-2'), 27.0 (C-4'), 27.1 (C-11), 29.6 (C-10), 29.9 (C-9), 33.1(C-12), 38.0 (C-2), 39.7 (C-1), 42.9 (C-1', C-1''), 45.3 (C-4), 46.7 (C-3),47.1 (C-5', C-5''), 100.8 (-OCH2O-), 101.0 (-OCH2O-), 105.5 (C-6''), 108.2 (C-17), 108.3 (C-2'''), 109.1 (C-5'''), 120.3 (C-16), 121.5 (C-6'''), 123.5 (C-6), 129.3 (C-13), 129.6 (C-14), 132.5 (C-15), 134.1 (C-7), 138.1 (C-1'''),146.1 (C-4'''), 146.7 (C-18), 147.6 (C-3'''), 148.1 (C-19), 170.6 (C-8),173.5 (C-5).
上述数据与文献(Matsuda H, Ninomiya K, Morikawa T, et al.Hepatoprotective amide constituents from the fruit of Piper chaba: Structuralrequirements, mode of action, and new amides[J]. Bioorganic & MedicinalChemistry,2009,17(20):7313-7323.)报道基本一致，故鉴定为胡椒环丁酰胺H。
化合物 3：胡椒环丁酰胺C
Figure 63756DEST_PATH_IMAGE003
淡黄色固体，C37H44N2O6,易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 0.90 (6H, d,J=6.6 Hz, H-3'', 4''), 1.51 (1H, m, H-2''), 2.17 (2H, m, H-4), 2.95 (2H, m,H-5), 3.41 (2H, m, H-1''), 3.45 (1H, br. s, -NH-), 3.64 (1H, m, H-2), 5.96(4H, s, 2-OCH2O-), 6.22 (1H, br, d, J=7.8 Hz, H-6'), 6.57 (1H, d, J=1.8 Hz,H-2'), 6.75 (1H, d, J=7.8 Hz, H-5'), 6.83 (1H, dt, J=15.0, 7.2 Hz, H-3); 13CNMR (CDCl3, 100 Hz) δC: 20.3 (C-3'', 4''), 28.7 (C-2''), 34.2 (C-4), 34.5 (C-5), 47.0 (C-1''), 100.9 (2-OCH2O-), 108.3 (C-2'), 108.9 (C-5'), 121.3 (C-6'),124.4 (C-2), 135.0 (C-1'), 143.4 (C-3), 145.9 (C-4'), 147.7 (C-3'), 166.0 (C-1). 上述数据与文献(Thitima R, Samran P, Penprapa C, et al. Chabamide, a NovelPiperine Dimer from Stems of Piper chaba[J]. PLANTA MED,2002,68(9):853-855.)报道基本一致，故鉴定为胡椒环丁酰胺C。
化合物4：（2S，3S）-2-（5-甲氧基-3,4-亚甲基二氧苄基）-3-（3,4-亚甲基二氧苄基）丁内酯
Figure 767620DEST_PATH_IMAGE004
白色固体, C21H20O7,易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 2.50 (1H, m,H-2), 2.48 (1H, m, H-3), 2.50-2.60 (2H, m, H-5), 2.80-2.94 (2H, m, H-6), 3.86(3H, s, -OCH3), 3.87-4.18 (2H, m, H-4), 5.93 (4H, m, -OCH2O-), 6.30 (1H, d, J=1.2, H-6''), 6.31 (1H, d, J=1.2, H-2''), 6.46 (1H, s, H-2'), 6.47 (1H, dd, J=1.7, 7.8, H-6'), 6.70 (1H, d, J=7.8, H-5'); 13C NMR (CDCl3, 100 Hz) δC: 35.3(C-6), 38.6 (C-5), 41.3 (C-3),46.7 (C-2), 56.7 (-OCH3), 71.3 (C-4), 101.2 (-OCH2O-), 101.6 (-OCH2O-), 103.4 (C-2'), 108.4 (C-6'), 108.9 (C-5''), 121.7 (C-6''), 131.7 (C-1''), 132.2 (C-1'), 134.2 (C-4'), 143.8 (C-5'), 146.5 (C-4''),148.0 (C-3''), 149.1 (C-3'), 178.6 (C-1)。上述数据与文献(Li N, Wu J, HasegawaT, et al. Bioactive Dibenzylbutyrolactone and Dibenzylbutanediol Lignans fromPeperomia duclouxii[J]. Journal of Natural Products,2006,69(2):234-239.)报道基本一致，故鉴定为（2S，3S）-2-（5-甲氧基-3,4-亚甲基二氧苄基）-3-（3,4-亚甲基二氧苄基）丁内酯 。
化合物5：4-己基-4,6-二甲基-4,5- 二氢吡咯[1,2-A]喹喔啉
Figure 831260DEST_PATH_IMAGE005
无色固体, C19H26N2,易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 0.86 (3H, t,J = 6.8 Hz, H-18), 0.87-1.55 (10H m, H13-17), 1.25 (3H, s, H-19), 2.70 (3H,s, H-7), 3.53 (1H, s, -NH-), 5.98 (1H, dd, J = 3.0, 1.5 Hz, H-1), 6.14 (1H,t, J = 3.0 Hz, H-11), 6.46 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-2), 6.80 (1H, d, J = 7.5 Hz,H-6), 6.90 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-10), 7.21 (1H, dd, J = 3.0, 1.5 Hz, H-12);13C NMR (CDCl3, 100 Hz) δC: 14.3 (C-18), 22.8 (C-17), 24.3 (C-7), 25.3 (C-16),25.7 (C-15), 29.5 (C-14), 29.9 (C-13), 32.1 (C-19), 42.6 (C-7), 47.8 (C-8),101.2 (C-1, 11), 108.4 (C-2), 109.3 (C-10), 114.8 (C-1), 116.9 (C-12), 122.3(C-3), 122.5 (C-6), 130.8 (C-5), 136.1 (C-4). 上述数据与文献(Patil N T,Lakshmi P G V V, Singh V. AuI-Catalyzed Direct Hydroamination/Hydroarylationand Double Hydroamination of Terminal Alkynes[J]. European Journal of OrganicChemistry,2010,2010(24):4719-4731.)报道基本一致，故鉴定为4-己基-4,6-二甲基-4,5- 二氢吡咯[1,2-A]喹喔啉。
化合物6：N-（5,6,7,8-四氢萘-2-基）乙酰胺
Figure 905920DEST_PATH_IMAGE006
无色固体, C12H15NO,易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 0.95 (2H, d, J=6.6 Hz, H-3), 1.24-1.58 (2H, d, J=13.2 Hz, H-2), 3.22 (2H, t, H-4), 3.49(3H, s, H-12), 4.01 (1H, d, J=1.0, H-1), 6.37 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 7.36(1H, m, H-5), 7.51(1H, m, H-7), 7.61(1H, d, J=1.8 Hz, H-6); 13C NMR (CDCl3,100 Hz) δC: 20.3 (C-3), 28.8 (C-4), 29.9 (C-2), 47.2 (C-1), 51.1 (C-12),127.9 (C-6, 7), 129.0 (C-5, 8), 129.8 (C-9) 135.0 (C-10), 141.1 (C-11). 上述数据与文献(Schneider H, Agrawal P. Conformations and "C NMR Shifts inTetralins[J]. Organic Magnetic Resonance,1984.)报道基本一致，故鉴定为N-（5,6,7,8-四氢萘-2-基）乙酰胺。
化合物7：E-4（15）-桉叶烯-1β，6α二醇
Figure 422221DEST_PATH_IMAGE007
无色固体, C15H26O2,易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 0.70 (3H, s,H-14), 0.87 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-13), 0.94 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-15), 1.20(1H, m, H-6b), 1.26 (1H, m, H-5a), 1.30 (1H, m, H-7), 1.53 (1H, m, H-5b),1.55 (1H, m, H-3a), 1.75 (1H, d, J = 9.9 Hz, H-4), 1.87 (1H, m, H-3b), 1.90(1H, m, H-6a), 2.07 (1H, ddd, J = 13.2, 13.2, 5.5 Hz, H-2b), 2.23 (1H, ddddd,J = 7.0, 7.0, 7.0, 7.0, 2.6 Hz, H-12), 2.33 (1H, ddd, J = 13.2, 5.1, 1.8 Hz,H-2a), 3.43 (1H, dt, J = 11.4, 4.8 Hz, H-4), 3.71 (1H, dd, J = 9.5, 8.1 Hz,H-8), 4.74 (1H, s, H-11a), 5.02 (1H, s, H-11b); 13C NMR (CDCl3, 100 Hz) δC:11.7 (C-15), 16.3 (C-13), 18.2 (C-6), 21.3 (C-14), 26.1 (C-12), 32.0 (C-3),35.2 (C-2), 36.4 (C-10), 41.8 (C-9), 49.4 (C-5), 56.0 (C-8), 76.1 (C-7),107.9 (C-11), 146.3 (C-1). 上述数据与文献(Nagashima F, Kishi K, Hamada Y, etal. ent-Verticillane-type diterpenoids from the Japanese liverwort Jackiellajavanica[J]. Phytochemistry,2005,66(14):1662-1670.)报道基本一致，故鉴定为E-4（15）-桉叶烯-1β，6α二醇。
化合物8：3-（3'，4'- 亚甲基二氧苯基）-丙烯醛
Figure 203396DEST_PATH_IMAGE008
淡黄色固体, C10H8O3,易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 6.04 (2H, s,-OCH2O-), 6.55 (1H, dd, J=15.7, 7.8 Hz, H-2), 6.86 (1H, d, J=6.4 Hz, H-8),7.06 (2H, m, H-3, H-5), 7.39 (1H, d, J=15.7 Hz, H-9), 9.65 (1H, d, J=7.8 Hz,H-1); 13C NMR (CDCl3, 100 Hz) δC: 101.9 (-OCH2O-), 106.9 (C-3), 108.9 (C-7),125.4 (C-2), 126.9 (C-6), 128.6 (C-4), 148.7 (C-8), 150.6 (C-9), 152.7 (C-5),193.7 (C-1). 上述数据与文献(刘文峰, 江志勇, 陈纪军,等. 荜茇三氯甲烷部位化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2009, 34(9):1101-1103.)报道基本一致，故鉴定为3-（3'，4'- 亚甲基二氧苯基）-丙烯醛。
化合物9：7-去甲氧基-齐墩果醇- 9（z），12（z）亚油酸
Figure 121543DEST_PATH_IMAGE009
淡黄色固体, C36H46O5,易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 0.87 (3H;t, J=6.7 Hz H-18), 1.31 (14H, m, H-4-H-7, H-15-H-17), 1.58 (2H, m, H-3), 1.63(2H, dd, J=7.5, 6.5 Hz, H-2), 2.03 (2H, dd, J=9.7, 6.4 Hz, H-8), 2.13 (2H,dd, J=13.7, 6.8 Hz, H-14), 2.18 (1H, t, H-2), 2.76 (2H, m, H-11, 21), 3.52(2H, t, J=6.5 Hz, H-19), 5.87 (1H, dd, J=10.1,7.0 Hz, H-13), 5.89 (1H, dd, J=10.8,8.0Hz, H-9), 5.93 (2H, s, -OCH2O-), 5.98 (1H, dd, J=10.8, 7.4 Hz, H-10),6.06 (1H, dd, J=10.8, 5.2 Hz, H-12), 6.73 (H, s, H-7'), 6.89 (1H, d, J=8.2Hz, H-5''), 6.98 (1H, dd, J=8.4, 1.3 Hz, H-3'), 7.20 (1H, d, J=1.4 Hz, H-2''), 7.34 (1H, brs, H-6''), 7.35 (1H, dd, J = 8.2, 1.4 Hz, H-6''), 7.36 (1H,d, J = 8.4 Hz, H-3'); 13C NMR (CDCl3, 100 Hz) δC: 14.3 (C-18), 24.8 (C-17),25.3 (C-3), 25.8 (C-11), 28.9 (C-14), 29.1 (C-8), 29.2 (C-15), 29.3 (C-5),29.5 (C-4), 29.6 (C-6 ), 29.8 (C-7), 31.1 (C-21), 31.8 (C-16), 32.7 (C-20),33.0 (C-2), 63.8 (C-19), 100.1 (CH, C-3), 101.3 (-OCH2O-), 105.5 (C-2''),108.4 (C-5''), 109.4 (C-7), 120.3 (C-6''), 120.4 (C-4), 122.6 (C-1'''), 127.5(C-8'), 129.0 (C-10), 129.2 (C-12), 129.6 (C-1'), 132.6 (C-9), 142.6 (C-3'''), 142.9 (C-4'''), 148.1 (C-5'), 148.3 (C-5), 173.6 (C-1). 上述数据与文献([11]Liu J, Dumontet V, Simonin A, et al. Benzofurans from Styrax agrestis AsAcetylcholinesterase Inhibitors: Structure-Activity Relationships andMolecular Modeling Studies[J]. Journal of Natural Products,2011,74(10):2081-2088.)报道基本一致，故鉴定为7-去甲氧基-齐墩果醇- 9（z），12（z）亚油酸。
化合物10：
Figure 367104DEST_PATH_IMAGE010
淡黄色固体, C16H22O4,易溶于氯仿。1H NMR (CDCl3, 400 Hz) δH: 0.88 (6 H,t, J =5 Hz, C-5', 5''), 1.42 (4 H, m, C-4', 4''), 1.74 (4H, m, C-3', 3''),4.32 (4 H, t, J =5 Hz, C-2', 2''), 7.52 (2 H, dd, J =10 Hz, 5 Hz, H-1, 2);7.71 (2H, dd, J =10 Hz, 5 Hz, H-3, 6). 13C NMR (CDCl3, 100 Hz) δC: 13.82 (C-5', 5''), 19.32 (C-4',4''), 30.72 (C-3', 3''), 65.68 (C-2', 2''), 128.99 (C-1, 2), 131.02 (C-3, 6), 132.52 (C-4, 5), 167.84 (C-1', 1''). 上述数据与文献([11]Liu J, Dumontet V, Simonin A, et al. Benzofurans from Styrax agrestis AsAcetylcholinesterase Inhibitors: Structure-Activity Relationships andMolecular Modeling Studies[J]. Journal of Natural Products,2011,74(10):2081-2088.)报道基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸二丁酯。
实施例4：
在实施例2的基础上，对由实施例2中从二氯甲烷萃取部位分离纯化所得的化合物1-10进行抗神经元缺氧损伤实验。
一、实验方法
（1）溶液配制
药物的配制：各药物用少量DMSO溶解配制成母液，给药时用相应的无菌培养液稀释至相应浓度；
溶液：取NaCl（8 g）、KCl（0.2 g）、Na2HPO4（1.44 g）、KH2PO4（0.24 g）溶于600 ml的ddH2O中。调节溶液pH至7.4（HCl），定容至1 L，滤器过滤后，高压灭菌，室温保存；
神经元细胞培养液： Neurobasal和 2% B27混合，4 ℃保存。
（2）胎鼠大脑皮层神经元提取及体外原代培养
用7%水合氯醛麻醉17-19天龄的SD胎鼠，于超净工作台内分离大脑皮层。将得到的大脑皮层放入含有胰蛋白的离心管中水浴（37℃）消化15min，每5 min摇晃1次。消化完成后收集细胞。用DMEM重悬细胞，计数后将细胞浓度调整至 1×106个/mL接种于6孔板中（用Poly-D-lysine 包被过夜），放入5% CO2培养箱（37℃）中培养，5 h后，将种植培养液全量换成Neurobasal神经元细胞培养液。体外培养第3天以终浓度10 μmol/L的阿糖胞苷抑制胶质细胞增殖，作用24 h后吸出。此后每7 d半量换液1次，体外培养第7~8天的细胞用于实验。
（3）大脑皮层神经元细胞免疫荧光鉴定
取培养至第7日的原代大脑皮层神经细胞，接种到35mm细胞培养皿中，放入5% CO2培养箱（37℃）中培养过夜；
取出培养皿，用PBS（pH7.4）洗2次，每次2min；
加入4%多聚甲醛室温固定30min，用PBS洗涤三次，每次3min；
0.5%Triton X-100（PBS 稀释）室温通透20min，洗涤三次，每次3min；
封闭：5%BSA，37℃ 封闭1h，吸去皿中的洗涤液；
加一抗稀释液；4℃，过夜孵育；PBS洗涤三次，每次5min；
加二抗稀释液，37℃，1h；PBS 洗涤五次，每次3min；
加Hochest 33342室温染细胞核5 min（避光）；PBS，洗涤五次，每次3min；
荧光显微镜观察。以MAP-2 阳性细胞占Hoechst 33342 染色细胞的比例进行大脑皮质神经元的纯度鉴定。神经元细胞纯度大于90%方可进行实验。
（4）氧糖剥夺（OGD）模型的建立
在OGD模型建立的前一天，将对数生长期的细胞接种到96孔板中，每孔100µL，每块板接种 3个同样的孔作为复孔，2×103个细胞/孔，以100µL培养液做空白对照，37℃培养过夜；第二天模型组吸去神经元培养液，加入无糖DMEM，按实验分组至于厌氧发生装置内，在37 ℃培养箱中分别培养1h、2h、3h、4h、5h、6h。对照组细胞在5% CO2培养箱（37 ℃）中培养，不做任何处理。孵育完成后，收集不同时间的细胞。用MTT法在490 nm处测量各孔的吸光值。每组重复3次。确定最佳OGD时间。
（5）给药与分组
OGD前24 h给药至复氧24 h后停止给药。每个单体化合物剂量分别为：0.1、0.5、1、5、10μM。OGD 后24 h 用MTT法测定各孔吸光值，每组重复3次，计算EC50。
二、实验结果
通过MTT法测定化合物1-10体外细胞EC50值（半最大效应浓度，是指能引起50%最大效应的浓度），各化合物的EC50见表1。
表1化合物1-10的神经细胞存活率试验 (EC50μM)。
Compound 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
EC<sub>50</sub> 1.127 3.379 0.956 0.401 0.283 0.336 1.020 0.767 10.530 0.253
由表1可知，分离的得到的10个化合物对神经细胞均具有保护活性，化合物 10活性最好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非用以限制本发明的权利范围。任何以本申请专利范围所涵盖的权利范围实施的技术方案，或者任何熟悉本领域的技术人员，利用上述揭示的方法内容做出许多可能的变动和修饰的方案，均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法，其特征在于：
所述胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位的制备方法包括以下步骤：
S1：CO2超临界萃取除油：按重量比胡椒︰荜茇为1:1称取胡椒、荜茇，置粉碎机中粉碎，混合均匀，用CO2超临界萃取至不出油；
S2：乙醇提取：取除油后的药渣，用70％乙醇提取，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得乙醇粗提物溶液；
S3：二氯甲烷萃取：取乙醇粗提物溶液，加入等体积二氯甲烷，萃取，静置分层，收集二氯甲烷萃取液，减压回收二氯甲烷，干燥，即得二氯甲烷萃取部位，密封储存；
所述分离方法为：取胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位，加1-2倍量甲醇超声溶解，然后将溶液加入100-200目的硅胶中，拌匀，于通风处挥干溶剂，得固体粉末，作为总样，备用；
用常压层析柱干法装柱上样，层析柱直径10cm，柱高110cm；先将100-200目硅胶装入层析柱中，再将所得总样加入层析柱中，总装柱量为三分之二个柱体积；以体积比为石油醚-乙酸乙酯＝20:1-0:1的洗脱剂进行梯度洗脱，按500ml一瓶，收集洗脱液，总洗脱量为6个柱体积；用薄层色谱检测合并相似流分，得到E1至E9九个组分；
所述E6组分经LH-20凝胶柱色谱分离得到E6-1至E6-4四个组分；所述取E6组分经LH-20凝胶柱色谱分离的条件为：洗脱剂为甲醇，等度洗脱；
所述E6-1组分通过ODS-A-HG柱色谱分离得到E6-1-1至E6-1-10十个组分；所述将E6-1组分通过ODS-A-HG柱色谱分离的条件为：填料粒径：50μm，梯度洗脱，流动相为60％-100％甲醇；
所述E6-1-3组分经制备薄层色谱纯化得化合物5：4-己基-4,6-二甲基-4,5-二氢吡咯[1,2-A]喹喔啉、化合物6：N-(5,6,7,8-四氢萘-2-基)乙酰胺、化合物7：E-4(15)-桉叶烯-1β,6α二醇；所述将E6-1-3组分经制备薄层色谱纯化的色谱条件为：GF254薄层硅胶，展开剂分别为石油醚∶乙酸乙酯＝2:1和石油醚∶乙酸乙酯＝1:1，展距均为12-15cm；
所述E6-3组分经高压制备型液相色谱分离得到化合物4：(2S,3S)-2-(5-甲氧基-3,4-亚甲基二氧苄基)-3-(3,4-亚甲基二氧苄基)丁内酯，E6-3组分经高压制备型液相色谱分离的条件：流动相为65％甲醇；
所述E7组分经硅胶柱层析分离得到E7-1至E7-5五个组分；所述E7组分经硅胶柱层析分离的条件为：洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝8:1-0:1，梯度洗脱；
所述E7-2组分经LH-20凝胶柱色谱和ODS-A-HG柱色谱，并结合高压制备型液相色谱分离得到化合物8：3-(3',4'-亚甲基二氧苯基)-丙烯醛；所述E7-2组分经LH-20凝胶柱色谱和ODS-A-HG柱色谱，并结合高压制备型液相色谱分离的条件为：LH-20凝胶柱色谱：流动相为甲醇，等度洗脱；ODS-A-HG柱色谱：流动相为60％-100％甲醇，梯度洗脱；高压制备型液相色谱：流动相为65％甲醇；
取所述E7-5组分，进行3-7次重结晶，结晶剩余母液浓缩后经ODS中压制备液相色谱分离得到E7-5-1至E7-5-9九个组分；所述E7-5组分，进行3-7次重结晶，结晶剩余母液浓缩后经ODS中压制备液相色谱分离的条件为：填料为ODS，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱剂为60％-100％甲醇；
取所述E7-5-3组分，过中压制备液相色谱，得到E7-5-3-1至E7-5-3-7七个组分；所述E7-5-3组分，过中压制备液相色谱的条件为：填料为ODS，梯度洗脱，洗脱剂为60％-100％甲醇；
取所述E7-5-3-4组分通过LH-20凝胶柱色谱、ODS柱色谱，结合硅胶柱层析分离得到化合物10：邻苯二甲酸二丁酯；所述E7-5-3-4组分通过LH-20凝胶柱色谱、ODS柱色谱，结合硅胶柱层析分离的条件为：LH-20凝胶柱色谱：等度洗脱，流动相为甲醇；ODS-A-HG柱色谱：流动相为60％-100％甲醇，梯度洗脱；硅胶柱层析色谱：流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝12:1-0:1，梯度洗脱；
取所述E7-5-5组分通过LH-20凝胶柱色谱，结合制备薄层色谱得到化合物3：胡椒环丁酰胺C；取所述E7-5-5组分通过LH-20凝胶柱色谱的条件为：流动相为甲醇，结合制备薄层色谱的条件为：GF254薄层硅胶，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝2:1，展距均为12-15cm；
取所述E7-5-6组分，经硅胶柱色谱分离，得到E7-5-6-1至E7-5-6-5五个组分；所述E7-5-6组分，经硅胶柱色谱分离的条件为：梯度洗脱，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝8:1-0:1；
将E-7-5-6-2、E-7-5-6-3和E-7-5-6-4组分分别经制备薄层色谱纯化得化合物1：胡椒环丁酰胺G、化合物9：7-去甲氧基-齐墩果醇-9(z),12(z)亚油酸、化合物2：胡椒环丁酰胺H；所述E-7-5-6-2、E-7-5-6-3和E-7-5-6-4组分分别经制备薄层色谱纯化的条件为：GF254薄层硅胶，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝2:1，纯化次数3-7次。
2.如权利要求1所述的一种胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法，其特征在于：所述的二氯甲烷可用等极性有机混合溶媒替代。
3.如权利要求1所述的一种胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法，其特征在于：所述化合物4、5、6、7可用于治疗脑卒中或建立胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位的质量标准，控制产品质量。
4.如权利要求1所述的一种胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法，其特征在于：所述化合物1、2、3、8、9、10可用于治疗脑卒中或建立胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位的质量标准，控制产品质量。
5.如权利要求1所述的一种胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法，其特征在于：所述胡椒荜茇组合物二氯甲烷萃取部位化学成分分离方法可用于治疗脑卒中药物的制备。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111217800B (zh) * 2018-11-23 2023-03-31 四川大学 生物碱及从黑胡椒中的提取方法和用途
CN113702520B (zh) * 2021-08-17 2022-09-16 中南民族大学 一种荜茇药材质量控制的方法
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CN115252611B (zh) * 2022-06-30 2023-08-15 武汉大学 一种酰胺类化合物、其应用及抗肿瘤药物组合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62178582A (ja) * 1986-02-03 1987-08-05 Mitsubishi Chem Ind Ltd ピペリン系アルカロイド
CN101791336A (zh) * 2010-04-08 2010-08-04 首都医科大学 来自荜茇的提取物及其制备方法与应用
CN101863872A (zh) * 2010-06-05 2010-10-20 内蒙古医学院 一种荜茇碱的提取方法和包含荜茇碱的药物组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62178582A (ja) * 1986-02-03 1987-08-05 Mitsubishi Chem Ind Ltd ピペリン系アルカロイド
CN101791336A (zh) * 2010-04-08 2010-08-04 首都医科大学 来自荜茇的提取物及其制备方法与应用
CN101863872A (zh) * 2010-06-05 2010-10-20 内蒙古医学院 一种荜茇碱的提取方法和包含荜茇碱的药物组合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioactive Dibenzylbutyrolactone and Dibenzylbutanediol Lignans from Peperomia duclouxii;Na Li,et al.;《J. Nat. Prod.》;20060209;234-239 *
Jiawei Liu, et al..Benzofurans from Styrax agrestis As Acetylcholinesterase Inhibitors:Structure Activity Relationships and Molecular Modeling Studies.《J. Nat. Prod.》.2011,2081-2088. *

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