CN104402897B - 超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法及用途 - Google Patents

超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法及用途 Download PDF

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Abstract

超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法及用途。本发明属于天然药物领域，公开了一种提取高纯度细辛脂素的方法及用途。该方法是将细辛粗粉置于超临界CO2萃取装置中；萃取釜压力30～40Mpa，萃取釜温度45～70℃，分离釜Ⅰ和Ⅱ压力5～10Mpa、温度30～50℃，CO2流量35～60L/h，萃取时间60～240min，得细辛总挥发油；细辛总挥发油低温静置24～72h，减压抽滤，得细辛脂素粗品；细辛脂素粗品无水乙醇中重结晶2次，即得细辛脂素纯品。本发明首次发现细辛脂素具有较好的止咳活性，可以用于制备治疗各型咳嗽的药物。本发明首次公布了一种超临界CO2萃取法提纯细辛脂素的全新制备工艺，具有工艺简单、无溶剂残留、产品纯度高等优点。

Description

超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法及用途
技术领域
本发明属于天然药物技术领域，更具体而言，涉及一种采用超临界二氧化碳萃取法从中药细辛中萃取挥发油，然后从挥发油提取高纯度细辛脂素的方法及其在制备治疗咳嗽药物中的用途。
背景技术
咳嗽是困扰呼吸科门诊患者最常见的主诉。咳嗽是一种防御性反射活动，生理性咳嗽是一种有益的动作。然而，长期频繁或过于激烈的咳嗽则是一种病理性的反应，不仅会增加患者的痛苦，影响休息和睡眠，增加体力消耗，严重时还会促进疾病的发展，产生其它并发症。
细辛作为一种传统中药，有上千年的使用历史。始载于《神农本草经》，列为上品。2010版《中国药典》规定细辛来源为马兜铃科植物北细辛Asarum HeterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、汉城细辛Asarum sieboldiiMiq.var.seoulense Nakai或华细辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根与根茎。性温，味辛，归心、肺、肾经。具有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮的功效，用于痰饮咳喘、风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风湿痹痛的治疗。已有文献报道细辛挥发油具有镇咳活性，并且认为主要药效成分为挥发油中的甲基丁香酚(周慧秋.甲基丁香酚药理作用研究.中医药学报.2000,(2):79-80)。细辛脂素被认为是细辛中含量较高的非挥发性成分(韩俊艳.中药细辛的研究进展.中国农学通报.2011,27(9):46-50)，主要存在于北细辛、汉城细辛和华细辛中，是2010版《中国药典》收载的细辛的质量控制成分。目前文献报道细辛脂素的制备方法均按1998年杨云主编的《中药化学成分提取分离手册》提取方法制备获得，此方法要经过乙醇热提取、水蒸汽蒸馏、乙醚萃取、乙醇重结晶等步骤，工艺复杂，同时，在提取过程中需加热处理，易致中药成分不稳定，此过程还需加入Pb(OAC)2、H2S、ET2O等有毒有机试剂，导致有机试剂残留问题，亦不适合工业化大生产。
细辛脂素是一种木脂素类化合物，有关细辛脂素的研究报道较少，已有研究表明它具有免疫抑制效应，可用于抗移植排斥反应(张丽丽.细辛脂素抗心脏移植急性排斥反应的作用及对黏附分子表达的影响.中国中药杂志,2006,31(06):494-497.)。我们研究发现细辛脂素对柠檬酸诱导的豚鼠咳嗽模型具有较好的镇咳作用，目前尚未见有关细辛脂素镇咳活性的研究报道，更未见利用超临界CO2萃取法(SFE-CO2)从细辛挥发油中直接制备得到细辛脂素制备方法的报道。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素(asarinin)的方法。本发明通过优化超临界CO2萃取条件获得细辛挥发油，再通过将细辛挥发油低温静置，减压抽滤，无水乙醇重结晶获得高纯度细辛脂素(白色针状晶体)。
本发明的又一目的在于提供上述方法提取得到的高纯度细辛脂素在制备治疗各型咳嗽药物中的用途。本发明的药效结果表明，细辛脂素对柠檬酸诱导的豚鼠咳嗽模型具有较好的镇咳作用，是细辛治疗咳嗽的活性成分之一。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法，按照以下操作步骤：
(1)将细辛的根与/或根茎洗净、晾干、粉碎，得细辛粗粉；
(2)将细辛粗粉置于超临界CO2萃取装置的萃取釜中，密封；对萃取釜、分离釜分别进行加热，当萃取釜温度达到45～70℃时，分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ温度达到30～50℃，打开萃取釜阀门，当萃取釜内压力同贮罐压力相等时打开排气阀排净空气，通过高压泵对系统进行加压，当萃取釜压力达到30～40Mpa、分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ达到5～10Mpa时，控制CO2流量为35～60L/h，开始循环萃取；萃取60～240min得细辛总挥发油；
(3)将细辛总挥发油在-20～4℃条件下低温静置24～72h，减压抽滤，得细辛脂素粗品；
(4)取细辛脂素粗品加入细辛脂素粗品的1～5倍体积量的无水乙醇进行溶解，置于-20～4℃低温重结晶，待白色针状结晶析出，即得质量纯度大于98％的细辛脂素纯品。
步骤(2)所述萃取釜温度设定在50℃；所述萃取釜压力达到35Mpa；所述分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ压力达到5Mpa，温度达到40℃；所述CO2流量控制在40L/h；所述萃取的时间为180min。
步骤(1)所述细辛为北细辛、汉城细辛或华细辛，更加优选为北细辛。
步骤(3)所述低温静置的温度为-5℃，时间为24h。
步骤(4)所述无水乙醇的用量为细辛脂素粗品的1倍体积量。
步骤(4)所述重结晶的次数为2次。
上述方法提取得到的高纯度细辛脂素在制备治疗各型咳嗽药物中的用途，所述细辛脂素单独或与其他药物组合制备治疗各型咳嗽药物。
所述细辛脂素与可用药物载体制成各种剂型。
所述剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、泡腾片、软膏剂、糖浆剂、注射剂、口服液、合剂、酊剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
药学上可接受的载体如：填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。填充剂包括乳糖、蔗糖、玉米淀粉、山梨醇；粘合剂包括糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；润滑剂包括硬脂酸镁；崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、交聚维酮、微晶纤维素；润湿剂如十二烷基硫酸钠。
所述的细辛脂素，是一种木脂素类化合物，分子式为C20H18O6，化学式为5,5'-[(1R,3aR,4S,6aR)-tetrahydro-1H,3H-furo[3,4-c]furan-1,4-diyl]bis-1,3-Benzod ioxole，结构式如下：
本发明可采用气相色谱法或气相色谱-质谱联用法或高效液相色谱法，测定细辛及细辛挥发油中细辛脂素的含量。
所述气相色谱条件为DB-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，i.d.)；分流比100:1，进样量：1μL；载气：高纯氦气；流速：1mL·min-1；溶剂延迟时间：3min，程序升温：柱温70℃(6min)，以10℃·min-1升至100℃(35min)，然后以10℃·min-1的速度升至230℃(20min)，进样口温度250℃。
所述质谱条件为EI电子源，载气He；电子能量70eV，离子源温度230℃，传输线温度250℃，扫描范围40～450m/z，NIST 2.0版谱库。
所述液相色谱条件为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为：0～30min，45％～60％B，30～40min，60％～100％B；运行时间：40min，平衡时间：10min；体积流量：1.0mL·min-1；检测波长：285nm；柱温：30℃；进样量：10μL。
本发明具有止咳活性的细辛脂素纯品的有效剂量按照人的体重60kg来计算，为0.35～1.4g/人·天。
本发明的原理是：
药理实验证明，本发明制备的细辛脂素具有良好的治疗咳嗽的活性，可用于预防或治疗各型咳嗽。
药效学试验结果表明，以豚鼠为咳嗽模型，柠檬酸激发后本发明制备的细辛脂素低、中、高剂量组与空白对照组相比可明显延长动物的咳嗽潜伏期，降低豚鼠的咳嗽次数；与细辛SFE-CO2挥发油相比，细辛脂素高剂量组具有更好的镇咳活性；显示本发明制备工艺制备的细辛脂素具有较好的镇咳活性。
本发明的有益效果是：
(1)本发明首次从通过优化超临界CO2萃取条件获取的细辛挥发油中提纯细辛脂素，提供了一种细辛脂素全新的制备工艺，具有工艺简单、避免氧化和热解、无有机溶剂残留、产品品质好、纯度高等优点。
(2)本发明首次证实细辛脂素具有较好的镇咳效果，提供了一种治疗咳嗽的药物，拓展了止咳药物的选择领域，也为该技术领域的发展做出了贡献。
(3)本发明制备的细辛脂素是具有明确化学结构的化合物，用于制药时可量化投料，质量控制可以通过气相色谱法或气相色谱-质谱联用法或高效液相色谱法进行含量测定分析，有利于制备现代剂型。
附图说明
图1为细辛挥发油及细辛脂素的HPLC色谱图，其中A：细辛常规挥发油(水蒸气蒸馏所得)；B：细辛总挥发油(SFE-CO2萃取所得)；C：细辛脂素纯品(本发明制备所得)；D：细辛脂素对照品。
图2为细辛脂素对柠檬酸所致豚鼠咳嗽次数的影响(n＝8)，其中A：空白组；B：溶剂组(5％Tween-80)；C：磷酸可待因30mg/kg组；D、E、F：细辛脂素30、60、120mg/kg组；G：细辛SFE-CO2挥发油200mg/kg组；与空白组相比：*p<0.05，**p<0.01；与溶剂组相比：▲▲p<0.01，▲▲▲p<0.001。
图3为细辛脂素对柠檬酸所致豚鼠咳嗽潜伏期的影响(n＝8)，其中A：空白组；B：溶剂组(5％Tween-80)；C：磷酸可待因30mg/kg组；D、E、F：细辛脂素30、60、120mg/kg组；G：细辛SFE-CO2挥发油200mg/kg组；与空白组相比：*p<0.05；与溶剂组相比：▲p<0.05，▲▲p<0.01。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
细辛脂素的制备及分析
1.1细辛脂素的制备
采用超临界CO2萃取装置萃取细辛总挥发油提取物，将细辛的根与/或根茎洗净、晾干、粉碎机粉碎，得细辛粗粉，将细辛粗粉加入萃取釜的装料瓶中，再装入萃取釜，密封；对萃取釜、分离釜分别进行加热，当萃取釜温度达到50℃、分离釜分离温度40℃时，打开萃取釜阀门，当萃取釜内压力同贮罐压力相等时打开排气阀排净空气，通过高压泵对系统进行加压，当萃取釜达到设定压力35Mpa、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ分别达到设定压力5Mpa时，控制CO2流量40L/h，开始循环萃取；保持萃取温度50℃、分离釜分离温度40℃、萃取时间180min，得细辛总挥发油，得率为2.5％(mL/g)；将细辛总挥发油-5℃静置24h，减压抽滤，得细辛脂素粗品；取细辛脂素粗品加入与细辛脂素粗品同样体积的无水乙醇溶解，置于-20～4℃低温重结晶2次，待白色针状结晶析出，即得细辛脂素纯品，得率为1.5％(g/mL)。
1.2细辛挥发油及细辛脂素的分析
1.2.1液相色谱条件
Agilent 1260高效液相色谱仪，Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为：0～30min，45％～60％B，30～40min，60％～100％B；运行时间：40min，平衡时间：10min；体积流量：1.0mL·min-1；检测波长：285nm；柱温：30℃；进样量：10μL。
1.2.2分析结果
分析结果如图1所示，从色谱图不难看出，与水蒸汽蒸馏制备的常规挥发油(SD挥发油，图1A)相比，本发明通过优化SFE-CO2的萃取条件所制得的细辛总挥发油(SFE-CO2挥发油，图1B)，不仅包含了SD挥发油所有的挥发性成分，还包含了弱挥发成分细辛脂素(色谱峰1)。目前大多数文献认为SD法与SFE-CO2法所得挥发油经分析发现所含挥发性成分较相似，且目前为止还没有见到制备的细辛挥发油中含有细辛脂素等非挥发性成分的报道，表明本发明所制备的细辛总挥发油在成分组成上与现有文献报道的挥发油明显不同。细辛脂素为本发明制备的SFE-CO2挥发油中的主要成分，含量测定结果表明本发明所制备的细辛挥发油中细辛脂素绝对含量为10.5wt％；以细辛脂素(图1D)为标准品，通过面积归一化法测定本方法制备的细辛脂素(图1C)纯度大于98％。
实施例2
细辛脂素对柠檬酸所致豚鼠咳嗽的镇咳作用
2.1实验材料
实验动物：普通级Hartley豚鼠，雌雄各半，体重250-350g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2008-0002。
试剂与仪器：一水合柠檬酸(广州化学试剂厂，批号：20121001-2)，用时加生理盐水配制成0.8M的柠檬酸溶液；动物无创Buxco肺功能检测系统(美国Buxco公司)；AeronebPro雾化器(Aerogen(爱尔兰)有限公司)；灌胃针(广东省医学实验动物中心)。
2.2实验方法
采用柠檬酸诱导豚鼠咳嗽模型进行药效评价。取112只Hartley豚鼠，将其逐一置于动物无创Buxco肺功能检测系统6L体描仪内，偏流仪空气流速2.5L/min，使用AeronebPro雾化器通入雾化的0.8M的柠檬酸超纯水溶液气溶胶1min，雾化的粒子平均直径2.5μm，观察5min，咳嗽的声音由室内放置的麦克风记录和放大，声波经Biosystem XA软件进行分析，再经电脑软件处理声音数据记录咳嗽情况。由经过训练的观察者观察有无咳嗽反应，记录自喷雾起6min内的咳嗽次数，挑选咳嗽次数大于10次的豚鼠为合格动物进行试验。
取筛选合格的56只Hartley豚鼠，雌雄各半，随机分成7组，空白对照组给予1mL/100g的生理盐水，溶剂组给予等体积的相应溶剂(体积百分比浓度5％的Tween-80水溶液)，阳性药组给予等体积的30mg/kg磷酸可待因，给药组给予等体积的细辛脂素(实施例1样品30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg)、细辛总挥发油(实施例1样品200mg/kg)，每天1次，连续给药3天。末次给药后2h在动物无创Buxco肺功能检测系统进行柠檬酸雾化激发试验(雾化条件同前)，记录6min内的咳嗽次数(N)、咳嗽潜伏期，并用公式“镇咳率＝(N空白对照-N给药组)/N空白对照×100％”计算各给药组的镇咳率。
数据用表示，采用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件对各组参数进行单因素方差分析。进行组间比较，p<0.05为有显著性差异。
2.3实验结果
2.3.1细辛脂素对柠檬酸诱导豚鼠咳嗽次数的影响
各组动物经过柠檬酸雾化激发后6min内的咳嗽次数及咳嗽抑制率见表1及图2。由表1及图2可知，与空白组相比，细辛脂素低、中、高剂量组均可以降低豚鼠的咳嗽次数，均具有显著性差异(低剂量组p<0.05；中、高剂量组p<0.01)，镇咳率分别达到39.2％、50.7％和53.0％，其中细辛脂素高剂量组(120mg/kg)镇咳效果接近磷酸可待因(30mg/kg)的水平；与细辛SFE-CO2挥发油相比，细辛脂素中、高剂量组均表现出更好的镇咳效果(细辛SFE-CO2挥发油镇咳率38.4％)，但组间均无显著性差异。
以上结果表明，细辛脂素具有良好的镇咳作用，并具量效关系。
表1 细辛脂素对柠檬酸所致豚鼠咳嗽次数的影响(n＝8)
注：与空白组相比：*p<0.05，**p<0.01；与溶剂组相比：▲▲p<0.01，▲▲▲p<0.001。
2.3.2细辛脂素对柠檬酸诱导豚鼠咳嗽潜伏期的影响
各组动物经过柠檬酸雾化激发后6min内的咳嗽潜伏期见表2和图3。由表2和图3可知，与空白组相比，细辛脂素不同剂量组均可延长豚鼠的咳嗽潜伏期，其中高剂量组p<0.05。细辛脂素高剂量组延长咳嗽潜伏期的作用接近于磷酸可待因。与细辛SFE-CO2挥发油相比，细辛脂素高剂量组具有更好的延长咳嗽潜伏期作用。
表2 细辛脂素对柠檬酸所致豚鼠咳嗽潜伏期的影响(n＝8)
注：与空白组相比：*p<0.05；与溶剂组相比：▲p<0.05，▲▲p<0.01。
实施例3
取实施例1方法制备的细辛脂素纯品，加5％(体积百分数)的Tween-80水溶液溶解，加入单糖浆至含糖质量含量50％(质量百分数)以上，加入千分之三(质量百分数)的苯甲酸钠和羟苯乙酯，混合均匀，煮沸，趁热过滤，加蒸馏水至规定量，分装即为细辛脂素止咳糖浆。
实施例4
取实施例1方法制备的细辛脂素和微粉硅胶，过60目筛充分混匀，加入硬脂酸镁，混合，干法制粒。过40目筛，灌装成胶囊剂。
实施例5
取实施例1方法制备的细辛脂素按1:0～5的比例(重量比)加入麻油，混合均匀，作为药液备用。取明胶1份，加入0.6-1.2份甘油和0.2％尼泊金甲酯-尼泊金丙脂(质量比4:1)混合物(防腐剂)，用0.7-1.4体积倍的水浸泡2h以上，加热溶解，减压除去气泡，于60-65℃保温备用。将上述药液置压丸机中，以上述明胶液为囊材，在45-55℃的条件下，压制成软胶囊。
实施例6
取实施例1方法制备的细辛脂素，加入聚乙烯聚吡咯烷酮，混匀，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，即得片剂。
上述具体实施方式为本发明的优选实施例，并不能对本发明进行限定，其他的任何未背离本发明的技术方案而所做的改变或其它等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法，其特征在于按照以下操作步骤：
(1)将细辛的根与/或根茎洗净、晾干、粉碎，得细辛粗粉；
(2)将细辛粗粉置于超临界CO2萃取装置的萃取釜中，密封；对萃取釜、分离釜分别进行加热，当萃取釜温度达到45～70℃时，分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ温度达到30～50℃，打开萃取釜阀门，当萃取釜内压力同贮罐压力相等时打开排气阀排净空气，通过高压泵对系统进行加压，当萃取釜压力达到30～40Mpa、分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ达到5～10Mpa时，控制CO2流量为35～60L/h，开始循环萃取；萃取60～240min得细辛总挥发油；
(3)将细辛总挥发油在-20～4℃条件下低温静置24～72h，减压抽滤，得细辛脂素粗品；
(4)取细辛脂素粗品加入细辛脂素粗品的1～5倍体积量的无水乙醇进行溶解，置于-20～4℃低温重结晶，待白色针状结晶析出，即得质量纯度大于98％的细辛脂素纯品。
2.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法，其特征在于：步骤(2)所述萃取釜温度设定在50℃；所述萃取釜压力达到35Mpa；所述分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ压力达到5Mpa，温度达到40℃；所述CO2流量控制在40L/h；所述萃取的时间为180min。
3.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法，其特征在于：步骤(1)所述细辛为北细辛、汉城细辛或华细辛。
4.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法，其特征在于：步骤(1)所述细辛为北细辛。
5.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法，其特征在于：步骤(3)所述低温静置的温度为-5℃，时间为24h。
6.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法，其特征在于：步骤(4)所述无水乙醇的用量为细辛脂素粗品的1倍体积量。
7.根据权利要求1所述的一种超临界二氧化碳萃取法提取高纯度细辛脂素的方法，其特征在于：步骤(4)所述重结晶的次数为2次。
8.根据权利要求1～7任一项所述方法提取得到的高纯度细辛脂素在制备治疗各型咳嗽药物中的用途，其特征在于：所述细辛脂素单独或与其他药物组合制备治疗各型咳嗽药物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述细辛脂素与可用药物载体制成各种剂型。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、泡腾片、软膏剂、糖浆剂、注射剂、口服液、合剂、酊剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂。
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