CN107805640B

CN107805640B - 一种提高链霉菌次级代谢产物产量的方法

Info

Publication number: CN107805640B
Application number: CN201710953975.XA
Authority: CN
Inventors: 李珊珊; 向文胜; 王为善; 王俊阳
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-10-13
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2037-10-13
Also published as: CN107805640A

Abstract

本发明提供一种提高链霉菌次级代谢产物产量的方法，属基因工程和发酵工程领域。该方法包括以下步骤：利用诱导启动子控制目标次级代谢产物生物合成基因簇的表达，并借助响应面模型确定最优的诱导条件；通过转录组分析，筛选与诱导启动子控制行为一致的生理启动子；最后，制备上述生理启动子控制目标次级代谢产物生物合成基因簇表达的质粒，转化入宿主菌进行发酵。本发明所提出的方法能够摆脱对诱导剂的依赖，实现目标生物合成基因簇表达的自调控，及目标产物产量提高；上述方法从时间和强度两个维度上对次级代谢产物生物合成基因簇的表达进行调节，使其与宿主的生理代谢行为适配，对于提高目标次级代谢产物在链霉菌中的产量十分重要。

Description

一种提高链霉菌次级代谢产物产量的方法

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域，具体涉及一种提高链霉菌代谢产物产量的方法。

背景技术

链霉菌能够产生大量有重要生物活性的次级代谢产物，其中很多可作为临床、兽用及农用药物。开发提高目标次级代谢产物产量的方法是链霉菌重要的研究内容。链霉菌在在发酵过程经历显著的由菌株快速生长到次级代谢产物大量积累的代谢转变过程，该过程由链霉菌复杂严谨的调控体系控制。然而，该调控网络的调控目标是最优化菌株存活，并非代谢工程产物产量最大化的目标。目前，已有方法用于提高链霉菌次级代谢产物产量，然而，能够有效适配链霉菌目标代谢途径与宿主的适配性，使菌株产量最优化的方法却未见报道。目前，利用强启动子增加前体供给、或操作调控基因等方法能够提高链霉菌目标产物产量。随着合成生物学的兴起，研究者开始利用组成型启动子库，或不同的核糖体结合位点，适配链霉菌相关代谢途径。尽管这些方法能够调节基因表达强度，但仍然是持续性表达，并不能实现对关键代谢途径表达的“适时”控制，实现其与宿主其他代谢途径的最优化适配。通过对比组成型启动子和诱导启动子控制链霉菌目标次级代谢生物合成基因簇表达对产物产量的影响，结果表明，诱导启动子能够显著提高产物产量，一个重要原因是它能从“时间”和“强度”两个维度上适配目标途径与宿主代谢。然而，在工业发酵过程中，诱导剂的使用会增加成本及产物纯化难度。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种提高链霉菌次级代谢产物产量的方法，方案为：首先，利用诱导启动子控制目标次级代谢产物生物合成基因簇的表达，并借助响应面模型确定最优的诱导条件；然后，通过转录组分析，筛选与诱导启动子控制行为一致的生理启动子；最后，制备上述生理启动子控制目标次级代谢产物生物合成基因簇表达的质粒，转化入宿主菌进行发酵。

上述方案具体为：首先利用诱导启动子控制目标次级代谢产物生物合成基因簇(后简称目标基因簇)的表达：将控制整个目标基因簇转录的关键基因与sfgfp基因串联，组成一个由诱导启动子控制的转录单元。这样，诱导启动子的控制行为就可以由sfgfp基因的转录行为反映出来。针对诱导剂的添加时间与添加量两个参数，设计中心复合实验，并对菌株进行发酵。建立响应面模型确定菌株目标次级代谢产物产量最大时的最佳诱导条件。然后，在最佳诱导条件下，在菌株不同生长阶段取样，采集该菌株的时序转录组数据。通过聚类分析，寻找与sfgfp基因转录行为一致的基因，那么理论上，控制这些基因转录的生理启动子应该与诱导启动子的控制行为一致，也应具有能够使菌株目标次级代谢产物产量达到最优的能力。为了保证所选生理启动子的完整性，选取这些基因翻译起始位点上游500bp序列为生理启动子序列，包括完整的启动子核心序列，以及其自身的核糖体结合位点。最后，为了保证启动子下游基因的表达不受其自身核糖体结合位点不同的影响，而只与生理启动子时序及强度相关，设计借助三联终止密码子的严谨启动子替换方法。基于该方法，将诱导启动子替换为生理启动子，实现不依赖于诱导剂的代谢途径“适时、适量”表达，及其与宿主代谢的最优化适配。与利用组成型启动子适配代谢途径相比，该方法能够显著将天蓝色链霉菌放线紫红素和异源表达的土霉素产量分别提高1.3和9.1倍。

上述方案进一步具体为：利用引物P1-F/P1-R和质粒pIJ8660::BsaI-sfgfp为模板，扩增质粒骨架；利用靶标链霉菌基因组为模板，及相应引物，扩增影响目标次级代谢产物生物合成的关键基因(后简称目标基因Gx)，将其与上述线性质粒骨架利用Gibson组装方法，得到含有上述目标基因的质粒pGx-sfgfp。以质粒pGCymRP21为模板，利用引物cumate-F/cumate-R扩增cumate诱导启动子，利用BglII和EcoRV酶切后连入经相应酶切过的线性质粒pGx-sfgfp，得到利用cumate诱导启动子控制目标基因簇表达的质粒pCumate-Gx-sfgfp。借助响应面模型确定最优的诱导条件；然后，通过转录组分析，筛选与诱导启动子控制行为一致的生理启动子；以靶标链霉菌基因组为模板，利用相应引物扩增筛选出的生理启动子，利用BglII和EcoRV酶切后，和用相应的酶进行酶切后的质粒pGx-sfgfp连接，得到生理启动子控制目标基因簇表达的质粒pPn-Gx-sfgfp，转化入宿主菌靶标链霉菌进行发酵。

使用的质粒和引物分别见附表1和附表2

有益效果

首先，利用诱导启动子控制目标次级代谢生物合成基因簇的表达，并借助响应面模型确定最优的诱导条件；然后，通过转录组分析，筛选与诱导启动子控制行为一致的生理启动子；最后，根据严谨设计的启动子替换方法，将诱导启动子替换为生理启动子，本发明实现了不依赖于诱导剂的代谢途径“适时、适量”表达，及目标次级代谢产物生物合成基因簇的表达与宿主代谢的最优化适配。与利用组成型启动子适配代谢途径相比，该方法能够显著将天蓝色链霉菌放线紫红素和异源表达的土霉素产量分别提高1.3和9.1倍。

附图说明

图1为提高链霉菌次级代谢产物产量策略示意图，其中，a表示利用诱导启动子确定链霉菌目标产物产量最大时的最佳诱导条件；b表示在最佳诱导条件下借助转录组分析筛选与诱导启动子控制行为一致的生理启动子；c表示借助三联终止密码子的启动子替换策略，利用生理启动子控制目标次级代谢产物生物合成基因簇的适时、适量表达，从而提高产物产量。

图2为利用组成型启动子调节链霉菌次级代谢生物合成基因簇对产物产量的影响结果；a为不同强度组成型启动子对天蓝色链霉菌放线紫红素产量的影响。b为不同强度组成型启动子对委内瑞拉链霉菌杰多霉素产量的影响。

图3为利用诱导启动子调节链霉菌次级代谢生物合成基因簇对产物产量的影响结果；a cumate诱导启动子在不同条件下对菌株M145-OA放线紫红素产量的影响。b土霉素诱导启动子在不同条件下对菌株Sv-Potr杰多霉素产量的影响。c不同生物合成基因簇调节方式对天蓝色链霉菌菌株产量的影响。d不同生物合成基因簇调节方式对委内瑞拉链霉菌菌株产量的影响。

图4为利用cumate诱导启动子确定菌株M145-OA的最佳诱导条件结果。a响应面分析法确定最佳诱导条件。b菌株在最佳诱导条件下的产量。

图5为利用生理启动子调节链霉菌次级代谢生物合成基因簇对产物产量的影响结果。a基于转录组数据筛选合适的链霉菌生理启动子。b利用三联终止密码子的启动子替换策略。c生理启动子对工程菌株产量的影响。

图6为调节异源土霉素生物合成基因簇的表达对菌株产量的影响结果。a不同调节土霉素生物合成基因簇表达的方式对产物产量的影响。b菌株M1146-OTCC最佳诱导条件的确定。c基于转录组数据筛选合适的生理启动子。d生理启动子对异源土霉素产量的影响。

具体实施方式

实施例1一种基因工程菌的构建

利用引物P1-F/P1-R和质粒pIJ8660::BsaI-sfgfp为模板，扩增质粒骨架；利用天蓝色链霉菌M145基因组为模板，及引物actII4-F/actII4-R，扩增actII-orf4基因，将其与上述线性质粒骨架利用Gibson组装方法，得到质粒pActII-sfgfp。以天蓝色链霉菌M145基因组为模板，利用相应引物扩增生理启动子。利用BglII和EcoRV酶切后，和质粒pActII-sfgfp均用相应的酶进行酶切后连接，得到生理启动子控制actII-orf4基因表达的质粒pPn-actII-sfgfp。以质粒pGCymRP21为模板，利用引物cumate-F/cumate-R扩增cumate诱导启动子，利用BglII和EcoRV酶切后连入经相应酶切过的线性质粒pActII-sfgfp，得到利用cumate诱导启动子控制actII-orf4基因表达的质粒pCumate-actII-sfgfp。将质粒pPn-actII-sfgfp和pCumate-actII-sfgfp分别通过接合转移的方法导入天蓝色链霉菌中，分别得到以生理时序启动子和cumate诱导启动子控制actII-orf4基因表达的菌株M145-Pn，M145-OA。同时，将利用土霉素诱导启动子控制jadJ基因的质粒导入委内瑞拉链霉菌中，得到菌株Sv-Potr，该菌株为已报道文献中所使用菌株(Wang et al.,ACS Syn.Biol.5,765-773)。

作为对比，参照上述方法制备以组成型启动子控制actII-orf4基因表达的菌株：利用引物P1-F/P1-R和质粒pIJ8660::BsaI-sfgfp为模板，扩增质粒骨架；利用天蓝色链霉菌M145基因组为模板，及引物actII4-F/actII4-R，扩增actII-orf4基因，将其与上述线性质粒骨架利用Gibson组装方法，得到质粒pActII-sfgfp。利用全合成的方法，合成带有BglII和EcoRV酶切位点的9个组成型启动子(ermE*，SP8，SP18，SP24，SP26，SP31，kasO*，SP42和SP44)。将启动子和质粒pActII-sfgfp均用相应的酶进行酶切后连接，得到组成型启动子控制actII-orf4基因表达的质粒pPc-actII-sfgfp(九种)。以质粒pIW01-jad为模板，利用引物对IW01-F/IW01-R扩增含有BglII和EcoRV酶切位点的质粒骨架；将9个酶切后的组成型启动子与该质粒骨架连接，得到组成型启动子控制jadJ基因的质粒pPc-jad。将九种质粒pPc-actII-sfgfp分别通过接合转移的方法导入天蓝色链霉菌中，得到九种以组成型启动子控制actII-orf4基因表达的菌株M145-Pc。利用全合成的方法，合成带有BglII和EcoRV酶切位点的9个组成型启动子(ermE*，SP8，SP18，SP24，SP26，SP31，kasO*，SP42和SP44)。将启动子和质粒pActII-sfgfp均用相应的酶进行酶切后连接，得到组成型启动子控制actII-orf4基因表达的质粒pPc-actII-sfgfp(九种)。以质粒pIW01-jad为模板，利用引物对IW01-F/IW01-R扩增含有BglII和EcoRV酶切位点的质粒骨架；将9个酶切后的组成型启动子与该质粒骨架连接，得到组成型启动子控制jadJ基因的质粒pPc-jad。将质粒pPc-jad通过接合转移的方法导入委内瑞拉链霉菌中，得到组成型启动子控制杰多霉素基因簇表达的菌株Sv-Pc。

实施例2一种基因工程菌的构建

以质粒pIJ8660::BsaI-sfgfp为模板，利用引物P1-F/P1-R扩增质粒骨架。利用龟裂链霉菌基因组为模板，及引物otcR-F/otcR-R，扩增otcR基因，将其与上述线性质粒骨架利用Gibson组装方法，得到质粒pOtcR-sfgfp。以天蓝色链霉菌为模板，利用相应的引物扩增合适的生理启动子，将质粒pOtcR-sfgfp和这些启动子均以BglII和EcoRV酶切后连接，得到利用生理启动子控制otcR基因的质粒pPn-otcR-sfgfp。同样，将酶切过的kasO*和cumate启动子片段，连入酶切后的线性质粒pOtcR-sfgfp，得到利用kasO*和cumate启动子和控制otcR基因表达的质粒pK-otcR-sfgfp和pCumate-otcR-sfgfp。将质粒pPn-otcR-sfgfp和pCumate-otcR-sfgfp分别通过接合转移的方法导入天蓝色链霉菌M1146中，分别得到生理启动子和cumate诱导启动子控制土霉素基因簇表达的菌株M1146-Pn和M1146-OTCC。

作为对比，参照上述方法制备以组成型启动子控制otcR基因表达的菌株：以质粒pIJ8660::BsaI-sfgfp为模板，利用引物P1-F/P1-R扩增质粒骨架。利用龟裂链霉菌基因组为模板，及引物otcR-F/otcR-R，扩增otcR基因，将其与上述线性质粒骨架利用Gibson组装方法，得到质粒pOtcR-sfgfp。利用全合成的方法，合成带有BglII和EcoRV酶切位点的组成型启动子kasO*。将启动子和质粒pOtcR-sfgfp均用相应的酶进行酶切后连接，得到组成型启动子控制otcR基因表达的质粒pK-otcR-sfgfp。将质粒pK-otcR-sfgfp通过接合转移的方法导入天蓝色链霉菌M1146中，分别得到组成型强启动子kasO*控制土霉素基因簇表达的菌株M1146-OTCK。

表1菌株和质粒

表2引物

实施例3发酵生产次级代谢产物放线紫红素及杰多霉素B和结果分析

利用实施例1制备得到的基因工程菌M145-Pc，M145-OA，M145-Pn发酵生产次级代谢产物放线紫红素，具体过程为：将天蓝色链霉菌工程菌株在MS固体平板(2％甘露醇，2％黄豆粉，2％琼脂)28℃上进行培养。收集孢子后，按4×10⁸个孢子/100ml的浓度，接种到装有50mL SMM培养基(81.9ml PEG6000(6.1％，w/v)，2.5ml硫酸镁(24g/L)，10ml TES缓冲液(0.25M，pH7.2)，2ml葡萄糖(50％，w/v)，0.1ml微量元素(硫酸锌，硫酸亚铁，氯化锰，氯化钙，氯化钠各0.1g/L)，1ml酪蛋白水解物(20％，w/v)，25ml甘氨酸(20％，w/v))的250mL摇瓶中进行发酵，28℃，250rpm。收集菌体，10000×g，4℃离心3min，收集上清，加入终浓度1mol/L的KOH，离心取上清，测定OD₆₄₀吸光度，根据该波长下的摩尔吸光系数(ε₆₄₀＝25320)计算放线紫红素的产量。

利用实施例1制备得到的基因工程菌Sv-Pc，Sv-Potr发酵生产次级代谢产物杰多霉素B，具体过程为：将委内瑞拉霉菌菌株在MYM培养基(0.4％麦芽糖，0.4％酵母提取物，1％麦芽提取物，2％琼脂)28℃上进行培养。收集孢子后，按4×10⁸个孢子/100ml的浓度，接种到装有50mLMYM培养基的摇瓶中进行种子培养，12h，28℃，250rpm。按1％接种量将种子培养物接入GM培养基(0.9％盐溶液(％1％NaCl，1％CaCl2)，0.21％MOPS，0.0819％硫酸镁，0.45％硫酸亚铁(0.2％，w/v)，0.45％微量元素(硫酸锌880mg/L，硫酸铜39mg/L，硫酸锰4.62mg/L，硼酸5.7mg/L，钼酸铵3.7mg/L)，2％葡萄糖(33％，w/v)，0.056％磷酸盐缓冲液(90mM)，pH7.5)，28℃，250rpm，培养48h。收集发酵液，离心过滤去菌体后，用等体积的乙酸乙酯萃取，取上层有机相。将有机相蒸干后，用一定体积的甲醇或DMSO溶解。按已经发表文献条件利用HPLC检测杰多霉素B。

利用实施例2制备得到的基因工程菌M1146-OTCK，M1146-Pn和M1146-OTCC发酵生产次级代谢产物土霉素，具体过程为：将工程菌株在MS培养平板上进行活化，按4×10⁸个孢子/100ml的浓度，接种到装有50mL SMM培养基的250mL摇瓶中进行发酵，28℃，250rpm。收集1ml发酵液，加入9mol/L盐酸溶液酸化至pH＝1.5～1.7(酸化时不停涡旋振荡混匀，用pH＝0.5～5.0试纸测试，约20μl左右)，室温放置5min；12000rpm，室温离心5min；0.22μm滤器过滤后，取20μl上清进行HPLC检测分析，C18反相色谱柱(Diamonsil，250×4.6mm)。检测土霉素产量的HPLC条件如文献报道(Chen et al.,J.Biol.Chem.280,22508-22514)。

结果分析：

利用不同强度的组成型启动子控制天蓝色链霉菌放线紫红素，以及委内瑞拉链霉菌杰多霉素B的产量，发现启动子强度并非越强好，只有当启动子强度合适时，目标产物产量才能达到最高(图2)。进一步利用诱导启动子控制放线紫红素生物合成基因簇关键基因actII-orf4的表达量与表达时间，发现在2.5μM cumate，35h诱导条件下(图3a)，放线紫红素产量为最佳组成型启动子的1.6倍，原始启动子的3.0倍(图3b)。进一步，利用土霉素诱导启动子，控制杰多霉素生物合成基因簇的“适时”表达。结果同样表明，基因簇的不同表达时间与强度对委内瑞拉链霉菌杰多霉素B的产量有显著的影响。当利用0.8μM土霉素在7h诱导基因簇的表达时，杰多霉素B的产量达到最高(图3c)，为最佳组成型启动子的1.5倍，原始启动子的2.3倍(图3d)。该结果表明，“适时”、“适量”控制链霉菌代谢途径的表达对提高产物产量具有重要作用。

利用中心复合实验与响应面分析法确定M145-OA中放线紫红素产量高时的最佳诱导条件(图4a)。结果表明，利用1.8μM cumate在35h进行诱导时，放线紫红素产量最高，可达到262mg/L(图4b)。

在M145-OA中，放线紫红素生物合成途径特异性激活子actII-orf4和sfgfp基因组成一个转录单元，被cumate诱导启动子控制，因此，诱导启动子的控制行为可以由sfgfp的转录行为来表示。为了寻找与cumate诱导启动子在最佳诱导条件下行为一致的链霉菌生理启动子，对菌株M145-OA进行时序转录组芯片分析，选择时间点为18，24，30，36，42，48和60h，涵盖了该菌株生长的不同阶段。通过对转录组芯片中的各个基因进行聚类分析，筛选到50个与sfgfp转录时序类似的基因。由于细菌中的基因多以转录单元的形式存在，因此，对50个基因分析后，结果表明，控制这些基因表达的启动子有24个(图5a)。

为了得到这24个启动子的完整序列，选择相应基因翻译起始位点上游500bp，以及下游100bp的区域为启动子区域，该区域包含了各启动子的核心区域及其识别的生理RBS区。为了避免由于RBS差异引入的启动子评价差异，设计利用三联终止密码子的精细启动子替换策略。如图5b所示，三联终止密码子能够终止基因翻译起始位点下游100bp序列所翻译出的肽段的表达，从而使启动子继续识别下下游相同的RBS，控制目标基因的表达。这样，就能够避免不同的RBS对actII-orf4和sfgfp表达的影响，其表达差异只与启动子行为相关。

按上述策略，用24个基因所对应的启动子替换cumate诱导启动子，构建相应的菌株。对这些菌株进行发酵，结果表明，15株工程菌株的放线紫红素产量与利用cumate诱导启动子的工程菌株的产量类似，而几乎所有的工程菌株的产量都高于利用最佳组成型启动子SP26的工程菌株的产量(图5c)。与利用组成型启动子适配代谢途径相比，该方法能够显著将天蓝色链霉菌放线紫红素的产量提高1.3倍。

将完整的土霉素生物合成基因簇整合至M1146基因组时，并不能检测到次级代谢产物土霉素产生。利用组成型强启动子kasOp*过表达土霉素生物合成基因簇途径特异性激活子otcR时，土霉素产量为25mg/L(图6a)。进一步，利用cumate诱导启动子控制otcR基因，利用中心复合实验与响应面分析，确定菌株M1146-OTCC的最佳诱导条件为：利用2.2μMcumate在30h诱导(图6b)。在该最佳诱导条件下，菌株土霉素产量最高达到239mg/L，为利用kasOp*启动子得到的产量的10.1倍。进而，根据时序转录组数据，筛选到15个合适的生理启动子(图6c)。利用这些启动子替换cumate诱导启动子，并构建相应的工程菌株。发酵测试结果表明，有6个生理启动子能够达到与诱导启动子一样的产量(图6d)。与利用组成型启动子适配代谢途径相比，该方法能够显著将天蓝色链霉菌M1146的土霉素产量提高为出发菌株的9.1倍。

上述结果证明：(1)本发明所提出的方法能够摆脱对诱导剂的依赖，实现目标生物合成基因簇表达的自调控，及目标产物产量提高；(2)从时间和强度两个维度上对次级代谢产物生物合成基因簇的表达进行调节，使其与宿主的生理代谢行为适配，对于提高目标次级代谢产物在链霉菌中的产量十分重要。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种提高链霉菌次级代谢产物产量的方法

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<160> 97

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco0475-F

<400> 21

ctagagatct tgacgcggcg cgaggt 26

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco0476-F

<400> 22

ctagagatct ccgagcacgg agacga 26

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> Psco1200-F

<400> 23

ctagagatct ctcgtccctg agaccggtgg 30

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco1803-F

<400> 24

ctagagatct ggtggcctcg tggagcatc 29

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco2230-F

<400> 25

ctagagatct gcggccacaa cctctc 26

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> Psco2505-F

<400> 26

ctagggatcc gccccttctt ctcctcgtac gc 32

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco2817-F

<400> 27

ctagagatct caggccctcg gagtggtg 28

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco2937-F

<400> 28

ctagagatct gagggcgatg gcggagact 29

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco3132-F

<400> 29

ctagagatct cgccggtcgc tggggt 26

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco3424-F

<400> 30

ctagagatct tcccaacccg ctggaccg 28

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco3428-F

<400> 31

ctagagatct ttacgcgtgg ggctcgcg 28

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco3429-F

<400> 32

ctagagatct gctcatgccc cgtcctgc 28

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco3800-F

<400> 33

ctagggatcc cgatcacctc cgccccg 27

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco4280-F

<400> 34

ctagagatct gaccaggttg acgcacgc 28

<210> 35

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco4297-F

<400> 35

ctagagatct cggcgtcgtc gtggagaag 29

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco4789-F

<400> 36

ctagagatct ggtgatcctc tccgtggt 28

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> Psco7676-F

<400> 37

ctagagatct gtatctgcac gcacacctcg 30

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco7677-F

<400> 38

ctagagatct ccggaaccct cccgaagc 28

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco7681-F

<400> 39

ctagagatct tcgtggccag cgggaag 27

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco7682-F

<400> 40

ctagagatct tctccaggcg ccggtga 27

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco7692-F

<400> 41

ctagagatct ggaccctggg acgcctt 27

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> Psco7693-F

<400> 42

ctagagatct atggcgtccg tgaccagttc 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> Psco7729-F

<400> 43

ctagagatct gctcctgccg cgtggttaag 30

<210> 44

<211> 31

<212> DNA

<213> Psco0477-R

<400> 44

tacagatatc tcttcaggaa gcccagggtc t 31

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco0475-R

<400> 45

tacagatatc ggccagggcg cagatg 26

<210> 46

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco0476-R

<400> 46

tacagatatc cgcacagctc ggtcag 26

<210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco1200-R

<400> 47

tacagatatc tcccgctcct tgcgcacct 29

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco1803-R

<400> 48

tacagatatc gtccagcacc aggtccca 28

<210> 49

<211> 33

<212> DNA

<213> Psco2230-R

<400> 49

tacagatatc agtgcttctg gtagccgtct ttc 33

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco2505-R

<400> 50

tacagatatc gctggagcag gccgagagg 29

<210> 51

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco2817-R

<400> 51

tacagatatc cggcacgagg agccaggc 28

<210> 52

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco2937-R

<400> 52

tacagatatc gcggctcagc acggtctc 28

<210> 53

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco3132-R

<400> 53

tacagatatc ggcgaggagg tcggtgaa 28

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco3424-R

<400> 54

tacagatatc cgagttgctg cgccgac 27

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco3428-R

<400> 55

tacagatatc gtcgttgcgg cggttctt 28

<210> 56

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco3429-R

<400> 56

tacagatatc ggatgttggg gtcgaagcg 29

<210> 57

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco3800-R

<400> 57

tacagatatc cttgtcgcgg ccgagcac 28

<210> 58

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco4280-R

<400> 58

tacagatatc gcgacggcaa cgggga 26

<210> 59

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco4297-R

<400> 59

tacagatatc cgatgcggtt gggcacggt 29

<210> 60

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco4789-R

<400> 60

tacagatatc gaggaagatc cgcagggg 28

<210> 61

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco7676-R

<400> 61

tacagatatc cggcgaggac gcactg 26

<210> 62

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco7677-R

<400> 62

tacagatatc agcacgccgc cagcagg 27

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco7681-R

<400> 63

tacagatatc accccctgcc agtgcccg 28

<210> 64

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco7682-R

<400> 64

tacagatatc cgtcgtccag ctcctccgg 29

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> Psco7692-R

<400> 65

tacagatatc gcaccgcggc ccgtc 25

<210> 66

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco7693-R

<400> 66

tacagatatc tcacgatcgc gcggacacc 29

<210> 67

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco7729-R

<400> 67

tacagatatc cgacccgggg ggaacc 26

<210> 68

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco6718-F

<400> 68

ctagagatct gacgtcggcc tcacctacc 29

<210> 69

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco1802-F

<400> 69

ctagagatct cgttgctgac cagcagatc 29

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> Psco2217-F

<400> 70

ctagagatct aaggaccggg tgttcgacgc 30

<210> 71

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco2330-F

<400> 71

ctagagatct gacgcagacg gacgtga 27

<210> 72

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco2643-F

<400> 72

ctagagatct agggcgggcg cgaagt 26

<210> 73

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco2790-F

<400> 73

ctagggatcc cagcagcaga cggcacgc 28

<210> 74

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco3366-F

<400> 74

ctagagatct ggcctggttc tcctgcat 28

<210> 75

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco3538-F

<400> 75

ctagagatct caggtcgctg gggtac 26

<210> 76

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco4544-F

<400> 76

ctagagatct ggcagaattc ctcggaac 28

<210> 77

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco4748-F

<400> 77

ctagagatct cgtgacctcc ccgaccttc 29

<210> 78

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco5758-F

<400> 78

ctagagatct acaccaccgc cgtcca 26

<210> 79

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco6206-F

<400> 79

ctagagatct gtccggcggc agcatct 27

<210> 80

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco6654-F

<400> 80

ctagagatct gaggtcgtcg aggattc 27

<210> 81

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco6655-F

<400> 81

ctagagatct acgcgccgtc tcccagt 27

<210> 82

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco7628-F

<400> 82

ctagagatct gttctcctcg accctcc 27

<210> 83

<211> 31

<212> DNA

<213> Psco6718-R

<400> 83

tacagatatc caggccgtga tcgaccttct c 31

<210> 84

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco1802-R

<400> 84

tacagatatc ctgctcatgg ccagcagc 28

<210> 85

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco2217-R

<400> 85

tacagatatc ccgccccggc tacgatctt 29

<210> 86

<211> 33

<212> DNA

<213> Psco2330-R

<400> 86

tacagatatc tgtaggtgtt ctggtagtcg acg 33

<210> 87

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco2643-R

<400> 87

tacagatatc cgccggtgag gtcgagatc 29

<210> 88

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco2790-R

<400> 88

tacagatatc acgactggcg tggctctt 28

<210> 89

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco3366-R

<400> 89

tacagatatc gcatcatcgc gatcatgag 29

<210> 90

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco3538-R

<400> 90

tacagatatc cttcttgcgt ccccgtct 28

<210> 91

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco4544-R

<400> 91

tacagatatc aagagtgcgg cggcaga 27

<210> 92

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco4748-R

<400> 92

tacagatatc cgcaggaggc gagcag 26

<210> 93

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco5758-R

<400> 93

tacagatatc acaggtcgtc ccgcacg 27

<210> 94

<211> 28

<212> DNA

<213> Psco6206-R

<400> 94

tacagatatc tccaggagcg ggagttcc 28

<210> 95

<211> 26

<212> DNA

<213> Psco6654-R

<400> 95

tacagatatc cggaagtccc gagccc 26

<210> 96

<211> 29

<212> DNA

<213> Psco6655-R

<400> 96

tacagatatc ggaatttccc gtacacggt 29

<210> 97

<211> 27

<212> DNA

<213> Psco7628-R

<400> 97

tacagatatc atgtgcggga ctcgtcg 27

Claims

1.一种提高天蓝色链霉菌次级代谢产物产量的方法，其特征在于：包括以下步骤：首先，利用诱导启动子控制目标次级代谢产物生物合成基因簇的表达，并借助响应面模型确定菌株产量最大时的最优诱导条件；然后，通过转录组分析，筛选与诱导启动子控制行为一致的生理启动子；最后，制备上述生理启动子控制目标次级代谢产物生物合成基因簇表达的质粒，转化入宿主菌进行发酵；所述步骤具体为：首先利用诱导启动子控制目标次级代谢产物生物合成目标基因簇的表达：将控制所述目标基因簇转录的关键基因与sfgfp基因串联，组成一个由诱导启动子控制的转录单元，针对诱导剂的添加时间与添加量两个参数，设计中心复合实验，并对菌株进行发酵；建立响应面模型确定菌株目标次级代谢产物产量最大时的最佳诱导条件；然后，在最佳诱导条件下，在菌株不同生长阶段取样，采集该菌株的时序转录组数据；通过聚类分析，寻找与sfgfp基因转录行为一致的基因，选取这些基因翻译起始位点上游500 bp序列以及下游100 bp的区域为生理启动子序列，包括完整的启动子核心序列，以及其自身的核糖体结合位点，设计借助三联终止密码子的严谨启动子替换方法，基于该方法，将诱导启动子替换为生理启动子，将质粒转化入宿主菌进行发酵；

其中，次级代谢产物为天蓝色链霉菌放线菌红素和异源表达的土霉素；

所述三联终止密码子为TAGTAATGA；

其中，提高天蓝色链霉菌放线菌红素的生理启动子的扩增引物序列为:

Psco0477-F:CTAGAGATCTGGCTGATCGTGGACTCG

Psco0477-R:TACAGATATCTCTTCAGGAAGCCCAGGGTCT，

Psco0475-F:CTAGAGATCTTGACGCGGCGCGAGGT

Psco0475-R:TACAGATATCGGCCAGGGCGCAGATG，

Psco0476-F:CTAGAGATCTCCGAGCACGGAGACGA

Psco0476-R:TACAGATATCCGCACAGCTCGGTCAG，

Psco1200-F:CTAGAGATCTCTCGTCCCTGAGACCGGTGG

Psco1200-R:TACAGATATCTCCCGCTCCTTGCGCACCT，

Psco1803-F:CTAGAGATCTGGTGGCCTCGTGGAGCATC

Psco1803-R:TACAGATATCGTCCAGCACCAGGTCCCA，

Psco2230-F:CTAGAGATCTGCGGCCACAACCTCTC

Psco2230-R:TACAGATATCAGTGCTTCTGGTAGCCGTCTTTC，

Psco2505-F:CTAGGGATCCGCCCCTTCTTCTCCTCGTACGC

Psco2505-R:TACAGATATCGCTGGAGCAGGCCGAGAGG，

Psco2817-F:CTAGAGATCTCAGGCCCTCGGAGTGGTG

Psco2817-R:TACAGATATCCGGCACGAGGAGCCAGGC，

Psco2937-F:CTAGAGATCTGAGGGCGATGGCGGAGACT

Psco2937-R:TACAGATATCGCGGCTCAGCACGGTCTC，

Psco3132-F:CTAGAGATCTCGCCGGTCGCTGGGGT

Psco3132-R:TACAGATATCGGCGAGGAGGTCGGTGAA，

Psco3424-F:CTAGAGATCTTCCCAACCCGCTGGACCG

Psco3424-R:TACAGATATCCGAGTTGCTGCGCCGAC，

Psco3428-F:CTAGAGATCTTTACGCGTGGGGCTCGCG

Psco3428-R:TACAGATATCGTCGTTGCGGCGGTTCTT，

Psco3429-F:CTAGAGATCTGCTCATGCCCCGTCCTGC

Psco3429-R:TACAGATATCGGATGTTGGGGTCGAAGCG，

Psco3800-F:CTAGGGATCCCGATCACCTCCGCCCCG

Psco3800-R:TACAGATATCCTTGTCGCGGCCGAGCAC，

Psco4280-F:CTAGAGATCTGACCAGGTTGACGCACGC

Psco4280-R:TACAGATATCGCGACGGCAACGGGGA，

Psco4289-F:CTAGAGATCTGGTGATCCTCTCCGTGGT

Psco4289-R:TACAGATATCGAGGAAGATCCGCAGGGG，

Psco7676-F:CTAGAGATCTGTATCTGCACGCACACCTCG

Psco7676-R:TACAGATATCCGGCGAGGACGCACTG，

Psco7677-F:CTAGAGATCTCCGGAACCCTCCCGAAGC

Psco7677-R:TACAGATATCAGCACGCCGCCAGCAGG，

Psco7681-F:CTAGAGATCTTCGTGGCCAGCGGGAAG

Psco7681-R:TACAGATATCACCCCCTGCCAGTGCCCG，

Psco7682-F:CTAGAGATCTTCTCCAGGCGCCGGTGA

Psco7682-R:TACAGATATCCGTCGTCCAGCTCCTCCGG，

Psco7692-F:CTAGAGATCTGGACCCTGGGACGCCTT

Psco7692-R:TACAGATATCGCACCGCGGCCCGTC，

和Psco7693-F:CTAGAGATCTATGGCGTCCGTGACCAGTTC

Psco7693-R:TACAGATATCTCACGATCGCGCGGACACC；

提高异源表达的土霉素的生理启动子的扩增引物序列为:

Psco6718-F:CTAGAGATCTGACGTCGGCCTCACCTACC

Psco6718-R:TACAGATATCCAGGCCGTGATCGACCTTCTC，

Psco3538-F:CTAGAGATCTCAGGTCGCTGGGGTAC

Psco3538-R:TACAGATATCCTTCTTGCGTCCCCGTCT，

Psco6206-F:CTAGAGATCTGTCCGGCGGCAGCATCT

Psco6206-R:TACAGATATCTCCAGGAGCGGGAGTTCC，

Psco3366-F:CTAGAGATCTGGCCTGGTTCTCCTGCAT

Psco3366-R:TACAGATATCGCATCATCGCGATCATGAG，

Psco5758-F:CTAGAGATCTACACCACCGCCGTCCA

Psco5758-R:TACAGATATCACAGGTCGTCCCGCACG，

Psco4544-F:CTAGAGATCTGGCAGAATTCCTCGGAAC

Psco4544--R:TACAGATATCAAGAGTGCGGCGGCAGA，

Psco2790-F:CTAGGGATCCCAGCAGCAGACGGCACGC

Psco2790-R:TACAGATATCACGACTGGCGTGGCTCTT，

Psco2217-F:CTAGAGATCTAAGGACCGGGTGTTCGACGC

Psco2217-R:TACAGATATCCCGCCCCGGCTACGATCTT，

Psco6655-F:CTAGAGATCTACGCGCCGTCTCCCAGT

Psco6655-R:TACAGATATCGGAATTTCCCGTACACGGT，

Psco2643-F:CTAGAGATCTAGGGCGGGCGCGAAGT

Psco2643-R:TACAGATATCCGCCGGTGAGGTCGAGATC，

Psco2330-F:CTAGAGATCTGACGCAGACGGACGTGA

Psco2330-R:TACAGATATCTGTAGGTGTTCTGGTAGTCGACG，

Psco4748-F:CTAGAGATCTCGTGACCTCCCCGACCTTC

Psco4748-R:TACAGATATCCGCAGGAGGCGAGCAG，

Psco7628-F:CTAGAGATCTGTTCTCCTCGACCCTCC

Psco7628-R:TACAGATATCATGTGCGGGACTCGTCG，

Psco6654-F:CTAGAGATCTGAGGTCGTCGAGGATTC

Psco6654-R:TACAGATATCCGGAAGTCCCGAGCCC，

和Psco1802-F:CTAGAGATCTCGTTGCTGACCAGCAGATC

Psco1802-R:TACAGATATCCTGCTCATGGCCAGCAGC。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤进一步具体为：利用引物P1-F/P1-R和质粒pIJ8660::BsaI-sfgfp为模板，扩增质粒骨架；利用靶标链霉菌基因组为模板，及相应引物，扩增影响目标次级代谢产物生物合成基因簇转录的关键基因Gx，将其与上述线性质粒骨架利用Gibson组装方法，得到含有上述目标基因的质粒pGx-sfgfp；以质粒pGCymRP21为模板，利用引物cumate-F/cumate-R扩增cumate诱导启动子，利用BglII和EcoRV酶切后连入经相应酶切过的线性质粒pGx-sfgfp，得到利用cumate诱导启动子控制目标基因簇表达的质粒pCumate-Gx-sfgfp；借助响应面模型确定最优的诱导条件；然后，通过转录组分析，筛选与诱导启动子控制行为一致的生理启动子；以靶标链霉菌基因组为模板，利用相应引物扩增筛选出的生理启动子，利用BglII和EcoRV酶切后，和质粒pGx-sfgfp均用相应的酶进行酶切后连接，得到生理启动子控制目标基因簇表达的质粒pPn-Gx-sfgfp，转化入宿主菌即靶标链霉菌进行发酵。