CN107805233B - 一种二聚倍半萜化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二聚倍半萜化合物，所述的二聚倍半萜化合物按照如下方法进行制备：取干燥的荔枝草(S.plebeia)地上部分粉碎，用乙醇浸提，提取液减压浓缩得到提取物；所得提取物依次进行萃取、硅胶柱层析、半制备高效液相色谱，分离得到式I所示二聚倍半萜化合物。所述的二聚倍半萜药物可作为活性成分在用于治疗白血病药物中的应用，所述的二聚倍半萜药物对白血病细胞具有很好的抑制作用，具有较好的药学应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一个新的二聚倍半萜化合物及其制备方法与应用。
背景技术
血液系统恶性肿瘤(hematological malignancies)包括各种类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等，是一种以骨髓以及髓外造血器官正常细胞恶变成大量肿瘤细胞为特征，可侵袭及转移至全身，进而导致患者死亡，严重威胁人类健康的恶性血液病。
淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的具有异质性的恶性肿瘤，可受累全身各组织器官。白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。按起病的缓急可分为急、慢性白血病。
急性白血病(Acute leukemia，AL)是造血干细胞的恶性克隆性疾病，发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞(白血病细胞)大量增殖，蓄积于骨髓并抑制正常造血，广泛浸润肝、脾、淋巴结等髓外脏器。表现为贫血、出血、感染和浸润等征象。骨髓或外周血中主要白血病细胞为原始细胞(淋巴系、粒系)，AL通常可以分为急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia，ALL)和急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)两大类。慢性白血病(chronic leukemia，CL)临床发病相对缓慢，起源于骨髓多造血干细胞的恶性增殖性疾病，变现为髓系祖细胞池扩展，髓细胞系及其祖细胞过度生长，骨髓或外周血中白血病细胞多为成熟的和幼稚阶段的粒细胞(chronic myelognous leukemia，CML)或成熟的小淋巴细胞(chronic lymphocytic leukemia，CLL)
由于血液系统恶性肿瘤分型和预后分层复杂，因此没有千篇一律的治疗方法，需要结合细致的分型和预后分层制定治疗方案。目前主要的治疗方法有化学治疗﹑放射治疗﹑靶向治疗、免疫治疗、干细胞移植等。
阿糖胞苷(Cytosine arabinoside，Ara-C)为嘧啶类抗代谢药，是治疗血液系统恶性肿瘤最常用的药物之一，主要作用于细胞S增殖期，作为DNA聚合酶的竞争性抑制剂，通过抑制DNA的合成，从而干扰白细胞增殖。相比较干扰素和酪氨酸激酶抑制剂，具有耐受性好，不良反应发生率低，作用机制温和，可作为长效药物等优点，适用于治疗白血病。据报道，阿糖胞苷治疗白血病的机制有以下几个方面:①阿糖胞苷在体内转化为阿糖胞三磷酸核苷，其参与脱氧核糖核酸(DNA)的核苷酸链中，阻止链的延长、引起链的断裂和影响链的复制，从而抑制肿瘤细胞的增殖；②诱导细胞凋亡；③诱导CD80和CD86表达，降低B7-H表达。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种天然来源的治疗血液瘤药物，提供具有较强抗肿瘤活性的二聚倍半萜化合物及其制备方法与应用。
本发明采用如下技术方案：
一种二聚倍半萜化合物，其结构式如式I所示：
本发明还提供了一种式I所示化合物的制备方法，所述的方法具体按照如下步骤进行：取干燥的荔枝草(S.plebeia)地上部分粉碎，用乙醇浸提，提取液减压浓缩得到提取物；所得提取物用水溶解后，依次用三氯甲烷萃取，取三氯甲烷层依次进行硅胶柱层析、半制备高效液相色谱，分离得到式I所示二聚倍半萜化合物。
所述的荔枝草2015年5月采购自河北省保定市，经鉴定为S.plebeia，样品标本由浙江工业大学药学院天然药物研究所保藏，编号为No.20150515。
进一步，具体的，所述乙醇浸提的操作方法为：
室温(25℃左右)下，将粉碎后的荔枝草地上部分按液料质量比3-7:1用95％乙醇浸提1-3次，每次2-24h，合并提取液并减压浓缩得到提取物。
再进一步，具体的，所述提取物依次进行萃取、硅胶柱层析、半制备高效液相色谱的操作方法为：
(1)将所得提取物进行三氯甲烷/水萃取，粗提物用水溶解后，用三氯甲烷萃取，得到有机相；所述水的加入量以所述提取物的质量计为3～8g/g，所述的三氯甲烷的加入量以所述提取物的质量计为3～8g/g；
(2)取步骤(1)中的有机相，减压浓缩后以200～300目硅胶为柱层析填料，用石油醚/丙酮混合液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的步骤为：依次用体积比10：1至0：1的石油醚/丙酮混合液各自分别洗脱2个柱体积，TLC检测合并洗脱液；
(3)取步骤(2)中经TLC检测合并洗脱液，减压浓缩后以200～300目硅胶为柱层析填料，用体积比9：1的三氯甲烷/甲醇混合液进行梯度洗脱，洗脱液经半制备高效液相色谱分析(流动相为8：2甲醇/水溶液)，色谱柱为C-18ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)，得到含有式I所示二聚倍半萜化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂并干燥，得到式I所示二聚倍半萜化合物。
更进一步，在所述的柱层析操作方法中，所述的式I所示二聚倍半萜化合物用TLC检测时，推荐以体积比10：1三氯甲烷/甲醇为展开剂，其Rf值为0.54。
本发明所述的式I所示的二聚倍半萜化合物在制备治疗白血病药物中的应用。
本发明采用人源急性单核细胞白血病细胞THP-1、慢性粒细胞白血病细胞K562和弥漫性大细胞淋巴瘤细胞pfeiffer作为活性筛选的细胞株，以MTT法测定化合物1对以上肿瘤细胞的体外抑制活性，以白血病临床常用药物阿糖胞苷作为阳性对照，探究该二聚倍半萜化合物对白血病细胞的抑制活性。
实验结果显示给予不同剂量的化合物1，有效抑制了血液瘤细胞THP-1、K562和pfeiffe的增殖抑制，且表现出了较好的细胞毒活性，对上述细胞的IC50分别为3.96μM,7.92μM和3.87μM。
与现有技术相比，本发明所得的有益效果是，二聚倍半萜化合物可以有效的控制血液瘤细胞THP-1、K562和pfeiffe增殖，具有比已上市药物阿糖胞苷更好抗肿瘤活性，在制备血液瘤药物中具有较好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：二聚倍半萜化合物的制备方法
(1)干燥荔枝草地上部分(2000g)粉碎，粉末用95％乙醇浸泡提取3次，每次24h，合并提取液并减压浓缩得到提取物165g；
(2)将所得提取物进行三氯甲烷/水萃取，将粗提物165g用825g水溶解后，用825g三氯甲烷萃取，得到有机相；
(3)取步骤(2)中的有机相，减压浓缩后得有机相提取物(88g)以200～300目硅胶为柱层析(
8,H:70cm)填料，用石油醚/丙酮混合液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的步骤为：依次用体积比10：1至0：1的石油醚/丙酮混合液各自分别洗脱2个柱体积，TLC检测合并洗脱液。
(4)取步骤(3)中经TLC检测合并洗脱液，减压浓缩后以200～300目硅胶为柱层析(
3,H:70cm)填料，用体积比9：1的三氯甲烷/甲醇混合液进行梯度洗脱，洗脱液经半制备高效液相色谱分析(流动相：8：2甲醇/水溶液)，得到含有式I所示二聚倍半萜化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂并干燥，得到式I所示二聚倍半萜化合物(94mg)；
二聚倍半萜化合物的理化性质及波谱数据
二聚倍半萜化合物：淡黄色色无定型粉末；分子式为C34H40O10；旋光[α]24D＝-40.0(c＝0.03mg/mL,CH3OH)；红外(KBr)νmax:3414,2924,1749,1687,1457,1381,1227,1090cm-1；紫外(EtOH)λmaxnm(logε):235.5(4.56)；质谱HR-ESI-MS(pos.)m/z:629.2357([M+H]+C34H38O10+；calcd.629.2386)；氢谱及碳谱见表1。
表1 二聚倍半萜化合物的核磁数据
1H-NMR检测频率500MHz；13C-NMR检测频率125MHz；溶剂:CDCl3.
实施例2：二聚倍半萜化合物的体外抗肿瘤活性测试
实施例1中制备得到的二聚倍半萜化合物根据溶解度配制成不同浓度的溶液，测试其对人源急性单核细胞白血病细胞THP-1、慢性粒细胞白血病细胞K562和弥漫性大细胞淋巴瘤细胞pfeiffer的抑制活性，阳性对照药选用临床常用的抗肿瘤药物阿糖胞苷。
(1)二聚倍半萜化合物和阳性对照药阿糖胞苷对K562抑制活性实验：取对数生长K562细胞，调整细胞浓度至1×105/mL，分别加入不同浓度化合物1和阳性对照药阿糖胞苷，分别接种于96孔板，每孔2×104个细胞，复种6孔。二聚倍半萜化合物终浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0和64.0μmol/L，另设阳性对照组、空白对照组与空白溶剂组。上述培养体系置37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养72h后，加入5mg/mL MTT 20μL，在相同条件下继续孵育4h。离心弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，微量振荡器振荡5min，使结晶完全溶解，酶标仪(490nm)测定OD值，计算各实验组细胞生长的抑制率并计算得到IC50值，见表2。该实验重复3次。
(2)二聚倍半萜化合物和阳性对照药阿糖胞苷对THP-1抑制活性实验：实验步骤同步骤(1)，实验结果见表2。
(3)二聚倍半萜化合物和阳性对照药阿糖胞苷对pfeiffer抑制活性实验：实验步骤同步骤(1)，实验结果见表2。
结果表明，二聚倍半萜化合物对人白血病细胞系THP-1、K562、pfeiffer具有较强的体外抗肿瘤活性，其IC50分别为3.96、7.92、3.87μM；阳性对照药阿糖胞苷对THP-1、K562、pfeiffer的IC50分别为15.9、18.7、19.5μM。由此可知，本发明涉及的二聚倍半萜对人白血病细胞系具有良好的抑制活性，其活性明显强于阳性对照药阿糖胞苷。二聚倍半萜化合物对于THP-1细胞的抑制活性为阿糖胞苷的4倍，对于K562细胞的抑制活性为阿糖胞苷的2.4倍，对于pfeiffer细胞的抑制活性为阿糖胞苷的5倍。
表2 二聚倍半萜化合物对THP-1、K562、pfeiffer细胞的抑制活性(IC50：μM)
Claims (4)
1.一种二聚倍半萜化合物，其特征在于具有式I所示的结构：
2.一种如权利要求1所述的二聚倍半萜化合物的制备方法，其特征在于：所述的方法具体按照如下步骤进行：
取干燥的荔枝草(S.plebeia)地上部分粉碎，用乙醇浸提，提取液减压浓缩得到提取物；所得提取物用水溶解后，用三氯甲烷萃取，取三氯甲烷层进行硅胶柱层析、半制备高效液相色谱，分离得到式I所示二聚倍半萜化合物；
所述提取物依次进行萃取、硅胶柱层析、半制备高效液相色谱的操作方法为：
(1)将所得提取物进行三氯甲烷/水萃取，粗提物用水溶解后，用三氯甲烷萃取，得到有机相；所述水的加入量以所述提取物的质量计为3～8g/g，所述的三氯甲烷的加入量以所述提取物的质量计为3～8g/g；
(2)取步骤(1)中的有机相，减压浓缩后以200～300目硅胶为柱层析填料，用石油醚/丙酮混合液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的步骤为：依次用体积比10∶1至0∶1的石油醚/丙酮混合液各自分别洗脱2个柱体积，TLC检测合并洗脱液；
(3)取步骤(2)中经TLC检测合并洗脱液，减压浓缩后以200～300目硅胶为柱层析填料，用体积比9∶1的三氯甲烷/甲醇混合液进行梯度洗脱，洗脱液经半制备高效液相色谱分析，流动相为8∶2甲醇/水溶液，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，得到含有式I所示二聚倍半萜化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂并干燥，得到式I所示二聚倍半萜化合物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述乙醇浸提的操作方法为：室温下，将粉碎后的荔枝草地上部分按液料质量比3-7∶1用95％乙醇浸提1-3次，每次2-24h，合并提取液并减压浓缩得到提取物。
4.一种如权利要求1所述的二聚倍半萜化合物作为活性成分在制备治疗白血病药物中的应用。
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