CN107760740A - 一种高纯度魔芋甘露大糖及其制备方法、应用 - Google Patents

一种高纯度魔芋甘露大糖及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高纯度魔芋甘露大糖，所述高纯度魔芋甘露大糖由魔芋精粉通过β‑甘露聚糖酶可控酶解后产生，并经过纯化得到的重均分子量为6000‑8000Da的多糖体系。该多糖体系具有增殖阴道有益菌、抑制有害菌的生理功能，可以用于阴道炎的抗菌治疗。

Description

一种高纯度魔芋甘露大糖及其制备方法、应用
技术领域
1 本发明属于生物化工领域，具体涉及一种高纯度魔芋甘露大糖的制备方法。
背景技术
2 魔芋葡甘露聚糖（KGM）是D-葡萄糖和D-甘露糖通过β-1, 4糖苷键结合形成的多糖，其平均聚合度介于 1000～10000 之间。由于KGM存在分子聚合度较高，粘性较大，溶解度较小等缺陷，因此在一定程度上限制了天然KGM的应用。
3 KGM经降解可以生成不同聚合度的葡甘聚糖，其中甘露低聚糖是聚合度较低的一类糖，其糖分子的聚合度在2-10个糖，现已广泛应用于食品、化工和医药等领域。
4 中国专利（申请号为CN201310022943.X）公开了一种协同制备中聚合度魔芋葡甘聚糖的方法，提到了一种中聚合度KGM，其聚合度介于100 ～900 之间，该糖在保持了KGM原有特性的前提下，降低了 KGM 水溶胶的粘度，并使得 KGM 溶解度得到有效的增加，但是该方法采用的是辐照降解葡甘聚糖，辐照时间长，且每次试验处理量较小，不利于规模化工业生产。
5 中国专利（申请号为201110309468.5）公开了一种不同分子量魔芋葡甘聚糖及葡甘露低聚糖的制备方法，提出了将葡甘聚糖降解为不同分子量的酶解物，但是并未明确酶解物的聚合度，也未界定不同分子段的酶解物的功能特性，并且工艺简单，只经过初步醇沉分离，产品的纯度较低。
6 中国专利（申请号201210331680.6）公开了一种高生物利用度的魔芋膳食纤维食品及其制备方法，所述魔芋膳食纤维食品是由魔芋粉降解后，所产生的分子量小于52650的全部降解产物混合所组成，其中包含寡糖和聚合度2-65的葡甘聚糖，混合物的各组分分子量呈梯度，具体方法是：将一种较大分子量降解产物与一种较小分子量的降解产物混合制得，其中定义分子量在5265—52650之间的为较大分子量，分子量小于15390的为较小分子量;其中较大分子量降解产物由酸法降解制备得到，该专利还对其在肠道菌群的调节作用方面进行了研究。
发明内容
7 魔芋甘露大糖是以魔芋精粉为原料，通过β-甘露聚糖酶可控酶解得到的由30-40个单糖通过β-1，4糖苷键连接形成的聚合物，分子量为6000-8000Da。本发明人通过可控酶解技术制备得到一种高纯度魔芋甘露大糖，并对该高纯度魔芋甘露大糖在阴道炎抗菌治疗方面的应用进行了研究，令人惊讶地发现，该高纯度魔芋甘露大糖具有明确的功效。
8 本发明所要解决的技术问题是提供一种高纯度魔芋甘露大糖，所述高纯度魔芋甘露大糖由魔芋精粉通过β-甘露聚糖酶酶解后产生，并经过纯化得到的重均分子量为6000-8000Da的多糖体系。该多糖体系具有增殖阴道乳酸菌、抑制有害菌的生理功能，可以用于阴道炎的抗菌治疗。
9 本发明所要解决的技术问题还包括提供所述高纯度魔芋甘露大糖的制备方法。
10 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种高纯度魔芋甘露大糖的制备方法，依次包括以下步骤：
（1）酶解罐中按生产比例加水，控制温度为30-50℃；向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶，然后称取魔芋精粉均匀投放于酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为 6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到300-400mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；所述酶解罐设置有快速自动检测物料粘度装置；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，所述陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；
（3）一级超滤，使用截留分子量为8000Da的陶瓷超滤膜对上述过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为500L-550L/h，分别得到滤出液1和截留液2；
（4）二级超滤，选用截留分子量为6000Da的陶瓷超滤膜对上述步骤（3）中的滤出液1进行超滤，温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为800L-850L/h，分别得到滤出液3和截留液4；
（5）将步骤（3）中的截留液2泵入酶解罐内，通过连续补料的方式继续酶解；
（6）对所述步骤（4）中得到的截留液4进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露大糖精制液；
（7）真空浓缩：对所述步骤（6）制备得到甘露大糖精制液进行浓缩，浓缩后固形物浓度为45～55％；
（8）喷雾干燥：对步骤（7）浓缩后的浓缩物进行喷雾干燥，得高纯度魔芋甘露大糖。
11 上述步骤（1）中，酶解终点黏度控制在300-400mpa.s灭酶，微滤后测得的分子量分布，当黏度值为300-400mpa.s，得到分子量范围6000-8000Da的酶解物所占的百分比最高，因此选择该黏度范围处进行灭酶。
12 进一步的技术方案中，所述步骤（1）中，所述中性β-甘露聚糖酶的投入量按照酶料质量比为1：10-30计算。
13 上述技术方案中，所述步骤（8）制备得到的高纯度魔芋甘露大糖的总糖含量为95%以上，其中分子量在6000-8000Da的甘露大糖含量大于90%。
14 本发明所述酶解罐设置有快速自动检测物料粘度装置，具体结构可以参照“一种快速自动检测物料粘度的装置”（中国专利201620963523.0）的结构设置。
15 甘露大糖可抑制有害菌，增殖有益菌，主要机理是甘露大糖与病原菌结合后，使病原菌与阴道粘膜上皮细胞相应受体结合的位点饱和，阻碍了病原菌在阴道粘膜组织的黏附，当甘露大糖与病原菌结合后，病原菌无法利用其提供的营养而饥饿死亡；而有益菌可利用甘露大糖提供的营养迅速增殖，繁殖的乳酸杆菌和双歧杆菌可通过占位定植、竞争营养、分泌 H2O2 和细菌素等抑菌物质而抑制女性阴道内致病微生物的生长繁殖。
16 本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）本发明通过控制酶解液的粘度来判定酶解终点，可在工业化生产中准确便捷地得到所需分子量范围的产物。酶解终点黏度控制在300-400mpa.s灭酶，微滤后测得的分子量分布，当黏度值为300-400mpa.s，得到分子量范围6000-8000Da的酶解物所占的百分比最高，因此选择该黏度范围处进行灭酶。
（2）本发明通过可控酶解、离子交换技术、超滤提纯技术集成制备6000-8000Da分子量范围的高纯度甘露大糖，本发明制备得到的甘露大糖（分子量分布在6000-8000Da）纯度达到90%以上。
（3）本项目产品采用成熟的可控酶解技术，可实现规模化生产，操作过程简单，纯化效果好，功效成分高，具有重要的经济和生产价值。
（4） 本发明制备的甘露大糖，具有增殖阴道乳酸菌、抑制有害菌的生理功能，可以用于阴道炎的抗菌治疗。
名词解释
17 甘露大糖：甘露大糖是以魔芋精粉为原料，通过β-甘露聚糖酶可控酶解得到的由30-40个单糖通过β-1，4糖苷键连接形成的聚合物，分子量为6000-8000Da。本发明人发现该分子范围的甘露聚糖低热、稳定、安全无毒，并且能有效增殖阴道内的有益菌，减少有害菌。因此，本发明人将该分子范围内的甘露聚糖命名为甘露大糖。
附图说明
18 图1为本发明制备甘露大糖的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
20 如图1所示一种甘露大糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）将酶解罐中加入200kg的生产用水，控制酶解罐内温度为30-50℃，向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶（酶的投入量按照酶与魔芋精粉质量比为1：10-30计算），称取10kg魔芋精粉，均匀投放于具有快速自动检测物料粘度装置的酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到300-400mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；然后测定凝胶色谱分子量分布，见表1所示。
表1
分子量分布范围 重均分子量Da 峰面积百分比%
＞1000000 2256226 0.26
1000000~100000 460989 2.77
100000~10000 65873 5.28
10000~8000 9073 8.71
8000~6000 6654 46.85
6000~3000 3357 14.19
3000~2000 2055 9.22
＜2000 1157 12.72
21 表1显示，酶解终点黏度控制在300-400mpa.s灭酶时微滤后测得的分子量分布，当黏度值为300-400mpa.s，得到分子量范围6000-8000Da的酶解物所占的百分比最高，达46.85%。
（3）一级超滤，使用截留分子量为8000Da的陶瓷超滤膜对上述过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为500L-550L/h，分别得到滤出液1（分子量范围＜8000Da）和截留液2（分子量范围≥8000Da），洗涤温度为55-65℃；
（4）二级超滤，选用截留分子量为6000Da的陶瓷超滤膜对上述步骤（4）中的滤出液1进行超滤，温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为800L-850L/h，分别得到滤出液3（分子量范围＜6000Da）和截留液4（6000Da≤分子量范围≤8000Da），洗涤温度为55-65℃；
（5）将步骤（4）中的截留液2泵入酶解罐内，通过连续补料的方式继续酶解；
（6）采用D301-G大孔弱碱阴离子交换树脂、001×7强酸性阳离子交换树脂、D296R型阴离子交换树脂对上述步骤（5）中的截留液4进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露大糖液；
（7）真空浓缩：采用VEZJM-20降膜蒸发器对甘露大糖液进行浓缩，浓缩前物料浓度约为10％～15％，浓缩后固形物浓度可达45～55％，浓缩温度55-60℃ ，真空度-0.085Mpa，流量计转子位于7-9L/min，出料温度＜50℃ 。
（8）喷雾干燥：采用LPG-3型离心式喷雾干燥机对步骤（8）浓缩后的甘露大糖液进行喷雾干燥，雾化器转速为260-400r/min，进风温度为150-200℃，出风温度为80-100℃，得高纯度甘露大糖。
（9）利用液相色谱和质谱对甘露大糖进行检测，总糖含量为95%以上，甘露大糖功效成分（分子量在6000-8000Da）含量大于90%。
实施例1步骤（8）所制备得到的高纯度甘露大糖称为实施例1制品。
对比例1 分子量范围≥8000Da的甘露聚糖酶解物I的制备
（1）将酶解罐中注入200kg的生产用水，控制酶解罐内温度为30-50℃，向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶（酶的投入量按照酶料质量比为1：10-30计算），称取10kg魔芋精粉，均匀投放于具有快速自动检测物料粘度装置的酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为 6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到300-400mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；
（3）一级超滤，使用截留分子量为8000Da的陶瓷超滤膜对上述过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为500L-550L/h，分别得到滤出液1（分子量范围＜8000Da）和截留液2（分子量范围≥8000Da），洗涤温度为55-65℃；
（4）收集所述步骤（3）中的截留液2，按照以下步骤制备分子量范围≥8000Da的甘露聚糖酶解物I：采用D301-G大孔弱碱阴离子交换树脂、001×7强酸性阳离子交换树脂、D296R型阴离子交换树脂对所述步骤（3）中的截留液2进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露聚糖酶解物I；
（5）真空浓缩。
（6）喷雾干燥，得甘露聚糖酶解物I，分子量≥8000Da。
22 对比例1步骤（6）所制备得到的甘露聚糖酶解物I作为对比例1制品。
23 对比例2 分子量范围＜6000Da的甘露聚糖酶解物的制备
（1）将酶解罐中注入200kg的生产用水，控制酶解罐内温度为30-50℃，向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶（酶的投入量按照酶料质量比为1：10-30计算），称取10kg魔芋精粉，均匀投放于具有快速自动检测物料粘度装置的酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为 6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到300-400mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；
（3）一级超滤，使用截留分子量为8000Da的陶瓷超滤膜对上述过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为500L-550L/h，分别得到滤出液1（分子量范围＜8000Da）和截留液2（分子量范围≥8000Da），洗涤温度为55-65℃；
（4）二级超滤，选用截留分子量为6000Da的陶瓷超滤膜对上述步骤（4）中的滤出液1进行超滤，温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为800L-850L/h，分别得到滤出液3（分子量范围＜6000Da）和截留液4（6000Da≤分子量范围≤8000Da），洗涤温度为55-65℃；
（5）收集所述步骤（4）的滤出液3，按照以下步骤制备分子量范围＜6000Da的甘露聚糖酶解物：采用D301-G大孔弱碱阴离子交换树脂、001×7强酸性阳离子交换树脂、D296R型阴离子交换树脂对所述步骤（4）中的截留液2进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露聚糖酶解物；
（6）真空浓缩。
（7）喷雾干燥，得甘露聚糖酶解物，分子量范围＜6000Da。
24 对比例2步骤（7）所制备得到的甘露聚糖酶解物作为对比例2制品。
对比例3制品
26 以市售低聚甘露糖，（生产厂家：恩施天天佳生物科技有限公司，型号：P90）作为对比例3制品。
效果实验研究1：抑菌实验
28 本发明人针对实施例1制品，对比例1制品、对比例2制品，以及对比例3制品进行抑菌实验研究。所述制品均按照3g粉末溶于97g无菌水的方法配制后作为试验样品，即作用浓度均为3%。
试验方法参考：中华人民共和国轻工业标准QB/T 2738-2012，日化产品抗菌效果的评价方法。
各实施例配方产品试验结果如下表：
抑菌试验结果表明，本发明制备得到的甘露大糖有显著的抑菌效果，并且效果显著好于对比例制品。
效果实验研究2：有益菌生长影响试验
将实施例1、对比例1、对比例2、对比例3三种制品以三种不同浓度（0.5%，1.5%，3%）加入阴道乳酸杆菌的MRS培养液内，调整培养液的pH为该菌的最佳pH7，实验菌种按5%的接种量接种于各培养液内，分别于接种0、12小时于600nm下读取各培养液的吸光值A（OD值），以净增OD值的大小来衡量四种制品不同浓度的增菌效果。试验结果如下：
测试样品(OD值) 0.5% 1.5% 3%
实施例1制品(0h) 0.258 0.263 0.256
实施例1制品(12h) 1.613 1.902 2.096
对比例1制品(0h) 0.266 0.271 0.255
对比例1制品(12h) 0.687 0.782 0.901
对比例2制品(0h) 0.258 0.264 0.251
对比例2制品(12h) 0.77 0.924 1.092
对比例3制品(0h) 0.261 0.269 0.255
对比例3制品(12h) 0.884 1.075 1.363
试验表明，实施例1和三个对比例均有增菌效果，乳酸杆菌液的OD值随制品浓度的增大呈现递增趋势，以本发明实施例1制品的增殖作用最大，12h后净值OD值最高达到1.84，与对比例制品相比对阴道有益菌的增殖效果显著。
29 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种高纯度魔芋甘露大糖，其特征在于，所述高纯度魔芋甘露大糖由魔芋精粉通过β-甘露聚糖酶可控酶解后产生，并经过纯化得到的重均分子量为6000-8000Da的多糖体系。
2.一种高纯度魔芋甘露大糖的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
（1）酶解罐中按生产比例加水，控制温度为30-50℃；向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶，然后称取魔芋精粉均匀投放于酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为 6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到300-400mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；所述酶解罐设置有快速自动检测物料粘度装置；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，所述陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；
（3）一级超滤，使用截留分子量为8000Da的陶瓷超滤膜对所述步骤（2）得到的过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为500L-550L/h，分别得到滤出液1和截留液2；
（4）二级超滤，选用截留分子量为6000Da的陶瓷超滤膜对所述步骤（3）中的滤出液1进行超滤，温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为800L-850L/h，分别得到滤出液3和截留液4；
（5）将步骤（3）中的截留液2泵入酶解罐内，通过连续补料的方式继续酶解；
（6）对所述步骤（4）中得到的截留液4进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露大糖精制液；
（7）真空浓缩：对所述步骤（6）制备得到甘露大糖精制液进行浓缩，浓缩后固形物浓度为45～55％；
（8）喷雾干燥：对步骤（7）浓缩后的浓缩物进行喷雾干燥，得高纯度魔芋甘露大糖。
3.如权利要求2所述的一种高纯度魔芋甘露大糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述中性β-甘露聚糖酶的投入量按照酶料质量比为1：10-30计算。
4.一种高纯度魔芋甘露大糖，其特征在于，采用权利要求2或3所述方法制备得到。
5.如权利要求4所述的一种高纯度魔芋甘露大糖，其特征在于，所述高纯度魔芋甘露大糖的总糖含量为95%以上，其中分子量在6000-8000Da的甘露大糖含量大于90%。
6.如权利要求4所述的一种高纯度魔芋甘露大糖，其特征在于，所述高纯度魔芋甘露大糖能抑制金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠杆菌8099、白色念珠菌ATCC10231以及铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）ATCC15442的生长。
7.如权利要求4所述的一种高纯度魔芋甘露大糖，其特征在于，所述高纯度魔芋甘露大糖能促进阴道乳酸杆菌的生长。
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