CN107936135A - 一种高纯度甘露次聚糖的制备方法及其应用 - Google Patents

一种高纯度甘露次聚糖的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高纯度甘露次聚糖，所述高纯度甘露次聚糖由魔芋精粉通过β‑甘露聚糖酶可控酶解后产生，并经过纯化得到重均分子量为20000~25000Da的多糖体系。将该多糖体系应用到降血糖产品中，在食用后可以显著降低血糖；并且将该多糖体系进行衍生化处理后，具有抗凝血，抗血栓功效，是一种重要的类肝素原料。

Description

一种高纯度甘露次聚糖的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种高纯度甘露次聚糖的制备方法及其在医药领域中的应用。
背景技术
近年来国内外对于功能性多糖的研究非常活跃，许多发达国家已将多种多糖类产品定为特定保健食品 ，用以防治肥胖、高血糖 、高血脂 、动脉硬化及冠心病等病症。
魔芋葡甘露聚糖（KGM）是D-葡萄糖和D-甘露糖通过β-1, 4糖苷键结合形成的多糖，其平均聚合度介于 1000～10000 之间。由于KGM存在分子聚合度较高，粘性较大，溶解度较小等缺陷，因此在一定程度上限制了天然KGM的应用。
KGM经降解可以生成不同聚合度的葡甘聚糖，其中甘露低聚糖是聚合度较低的一类糖，其糖分子的聚合度在2-10个糖，现已广泛应用于食品、化工和医药等领域。
中国专利（申请号为201310022943.X）公开了一种协同制备中聚合度魔芋葡甘聚糖的方法，提到了一种中聚合度KGM ，其聚合度介于100～900 之间，该糖在保持了KGM 原有特性的前提下，降低了 KGM 水溶胶的粘度，并使得 KGM 溶解度得到有效的增加，但是该方法采用的是辐照降解葡甘聚糖，辐照时间长，且每次试验处理量较小，不利于规模化工业生产。
中国专利（申请号为201110309468.5）公开了一种不同分子量魔芋葡甘聚糖及葡甘露低聚糖的制备方法，提出了将葡甘聚糖降解为不同分子量的酶解物，但是并未明确酶解物的聚合度，也未界定不同分子段的酶解物的功能特性，并且工艺简单，只经过初步醇沉分离，产品的纯度较低。
中国专利（申请号201210331680.6）公开了一种高生物利用度的魔芋膳食纤维食品及其制备方法，所述魔芋膳食纤维食品是由魔芋粉降解后，所产生的分子量小于52650的全部降解产物混合所组成，其中包含寡糖和聚合度2-65的葡甘聚糖，混合物的各组分分子量呈梯度，具体方法是：将一种较大分子量降解产物与一种较小分子量的降解产物混合制得，其中定义分子量在5265—52650之间的为较大分子量，分子量小于5265的为较小分子量;其中较大分子量降解产物由酸法降解制备得到，该专利还对其在肠道菌群的调节作用方面进行了研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高纯度甘露次聚糖，所述高纯度甘露次聚糖由魔芋精粉通过β-甘露聚糖酶可控精准酶解得到由100-125个单糖通过β-1，4糖苷键连接形成的聚合物，并经过纯化得到的重均分子量为20000~25000Da的多糖体系。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种高纯度甘露次聚糖粉的制备方法，依次包括以下步骤：
（1）酶解罐中按生产比例加水，控制温度为30-50℃，向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶，然后称取魔芋精粉均匀投放于酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为 6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到700-800mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；所述酶解罐设置有快速自动检测物料粘度装置；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，所述陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；
（3）一级超滤，使用截留分子量为25000Da的陶瓷超滤膜对上述过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为400L-450L/h，分别得到滤出液1和截留液2；
（4）二级超滤，选用截留分子量为20000Da的陶瓷超滤膜对上述步骤（3）中的滤出液1进行超滤，温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为600L-650L/h，分别得到滤出液3和截留液4；
（5）将步骤（3）中的截留液2泵入酶解罐内，通过连续补料的方式继续酶解；
（6）对所述步骤（4）中得到的截留液4进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露次聚糖精制液；
（7）真空浓缩：对所述步骤（6）制备得到甘露次聚糖精制液进行浓缩，浓缩后固形物浓度为45～55％；
（8）喷雾干燥：对步骤（7）浓缩后的浓缩物进行喷雾干燥，得高纯度甘露次聚糖粉。
上述步骤（1）中，酶解终点黏度控制在700-800mpa.s灭酶，微滤后测得的分子量分布，当黏度值为700-800mpa.s，得到分子量范围20000-25000Da的酶解物所占的百分比最高，因此选择该黏度范围处进行精准灭酶。
进一步的技术方案中，所述步骤（1）中，所述中性β-甘露聚糖酶的投入量按照酶料质量比为1：10-30计算。
进一步的技术方案中，所述步骤（8）制备得到的高纯度甘露次聚糖粉的总糖含量为95%以上，其中分子量在20000-25000Da的甘露次聚糖含量大于90%。
进一步的技术方案中，本发明还提供了一种将该多糖体系应用到降血糖产品中，在食用后可以显著降低血糖。
进一步的技术方案中，将该多糖体系进行衍生化处理后，具有抗凝血，抗血栓功效，提供一种重要的类肝素原料。
魔芋甘露次聚糖由于分子中存在大量的羟基，能进行一系列的化学改性，制成各种衍生物，从而极大地丰富了甘露次聚糖的研发和应用。通过化学改性提高了甘露次聚糖原有特性，使其具有更佳的作用效果，更重要的是可以制得新的衍生物，开发出更具魅力的黑科技新产品。
本发明所述酶解罐设置有快速自动检测物料粘度装置，具体结构可以参照“一种快速自动检测物料粘度的装置“（中国专利201620963523.0）的结构设置。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）本发明通过控制酶解液的粘度来判定酶解终点，可在工业化生产中准确便捷地得到所需分子量范围的产物。酶解终点黏度控制在700-800mpa.s灭酶，微滤后测得的分子量分布，当黏度值为700-800mpa.s，得到分子量范围20000-25000Da的酶解物所占的百分比最高，因此选择该黏度范围处进行精准灭酶。
（2）本发明通过可控酶解、离子交换技术、超滤提纯技术集成制备的高纯度甘露次聚糖，优化了制备工艺，使得甘露次聚糖纯度达到90%以上，分子量集中分布在20000~25000Da之间。
（3）本项目产品采用成熟的可控酶解技术，可实现规模化生产，操作过程简单，纯化效果好，功效成分高，具有重要的经济和生产价值。
（4） 本发明制备的甘露次聚糖，应用到降血糖产品中，在食用后可以显著降低血糖，此将造福于广大糖尿病患者。
（5）本发明制备的甘露次聚糖在制备肝素钠中的应用，将所述分子量分布为20000-25000Da 的甘露次聚糖进行硫酸酯化修饰，得到水溶性良好的硫酸酯化衍生物，所述的硫酸酯化衍生物具有抗凝血，抗血栓功效，是一种重要的类肝素原料，此将造福于广大心脑血管病患者。
由于KGM具有与肝素相近似的骨架结构，分子结构中C2、C3、C6位上的-OH，均具有较强的反应活性，将分子量分布为20000-25000Da的甘露次聚糖依次进行羟丙基化和硫酸酯化修饰，得到水溶性良好的甘露次聚糖醛酸丙酯硫酸钠盐（肝素钠），具有与肝素类似的抗凝血，抗血栓功效，是制备肝素钠的重要天然植物替代原料。
名词解释
甘露次聚糖：以魔芋精粉为原料，通过β-甘露聚糖酶可控酶解得到的由100-125个单糖通过β-1，4糖苷键连接形成的聚合物，分子量为20000-25000Da。该分子量范围的甘露次聚糖具有低热、稳定、安全无毒；将其应用到降血糖产品中，在食用后可以显著降低血糖；将其衍生化处理后，形成具有抗凝血，抗血栓功效的一种重要的类肝素原料。
附图说明
图1为本发明制备甘露次聚糖粉的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1: 如图1所示一种甘露次聚糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）将酶解罐中加入200kg的生产用水，控制酶解罐内温度为30-50℃，向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶（酶的投入量按照酶与魔芋精粉质量比为1：10-30计算），称取10kg魔芋精粉，均匀投放于具有快速自动检测物料粘度装置的酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到700-800mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；然后测定分子量分布，见表1所示。
表1
分子量分布范围Da 重均分子量Da 峰面积百分比%
＞1000000 2249656 0.30
1000000~100000 461024 3.01
100000~25000 65873 10.67
25000~20000 23625 55.65
20000~5000 10653 12.99
5000~2000 3125 9.02
＜2000 1096 8.36
表1显示，酶解终点黏度控制在700-800mpa.s灭酶时，微滤后测得的分子量分布。当黏度值为700-800mpa.s，得到分子量范围20000-25000Da的酶解物所占的百分比最高，达55.65%。
（3）一级超滤，使用截留分子量为25000Da的陶瓷超滤膜对上述过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为400L-450L/h，分别得到滤出液1（分子量范围＜25000Da）和截留液2（分子量范围≥25000Da），洗涤温度为55-65℃；
（4）二级超滤，选用截留分子量为20000Da的陶瓷超滤膜对上述步骤（4）中的滤出液1进行超滤，温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为600L-650L/h，分别得到滤出液3（分子量范围＜20000Da）和截留液4（20000Da≤分子量范围＜25000Da），洗涤温度为55-65℃；
（5）将步骤（4）中的截留液2泵入酶解罐内，通过连续补料的方式继续酶解；
（6）采用D301-G大孔弱碱阴离子交换树脂、001×7强酸性阳离子交换树脂、D296R型阴离子交换树脂对上述步骤（5）中的截留液4进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露次聚糖液；
（7）真空浓缩：采用VEZJM-20降膜蒸发器对甘露次聚糖液进行浓缩，浓缩前物料浓度约为10％～15％，浓缩后固形物浓度可达45～55％，浓缩温度55-60℃ ，真空度-0.085Mpa，流量计转子位于7-9L/min，出料温度＜50℃ 。
（8）喷雾干燥：采用LPG-3型离心式喷雾干燥机对步骤（8）浓缩后的甘露次聚糖液进行喷雾干燥，雾化器转速为260-400r/min，进风温度为150-200℃，出风温度为80-100℃，得高纯度甘露次聚糖粉。
（9）利用液相色谱和质谱对甘露次聚糖进行检测，总糖含量为95%以上，甘露次聚糖功效成分（分子量在20000-25000） 大于90%。
对比例1: 分子量范围≥25000Da的甘露聚糖酶解物I的制备
（1） 将酶解罐中注入200kg的生产用水，控制酶解罐内温度为30-50℃，向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶（酶的投入量按照酶料质量比为1：10-30计算），称取10kg魔芋精粉，均匀投放于具有快速自动检测物料粘度装置的酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为 6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到700-800mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；
（3）一级超滤，使用截留分子量为25000Da的陶瓷超滤膜对上述过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为400L-450L/h，分别得到滤出液1（分子量范围＜25000Da）和截留液2（分子量范围≥25000Da），洗涤温度为55-65℃；
（4）收集所述步骤（3）中的截留液2，按照以下步骤制备分子量范围≥25000Da的甘露聚糖酶解物I：采用D301-G大孔弱碱阴离子交换树脂、001×7强酸性阳离子交换树脂、D296R型阴离子交换树脂对所述步骤（3）中的截留液2进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露聚糖酶解物I；
（5）真空浓缩。
（6）喷雾干燥，得甘露聚糖酶解物I，分子量≥25000Da。
对比例2: 分子量范围＜20000Da的甘露聚糖酶解物II的制备
（1） 将酶解罐中注入200kg的生产用水，控制酶解罐内温度为30-50℃，向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶（酶的投入量按照酶料质量比为1：10-30计算），称取10kg魔芋精粉，均匀投放于具有快速自动检测物料粘度装置的酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为 6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到700-800mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；
（3）一级超滤，使用截留分子量为25000Da的陶瓷超滤膜对上述过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为400L-450L/h，分别得到滤出液1（分子量范围＜25000Da）和截留液2（分子量范围≥25000Da），洗涤温度为55-65℃；
（4）二级超滤，选用截留分子量为20000Da的陶瓷超滤膜对上述步骤（4）中的滤出液1进行超滤，温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为600L-650L/h，分别得到滤出液3（分子量范围＜20000Da）和截留液4（20000Da≤分子量范围＜25000Da），洗涤温度为55-65℃；
（5）收集所述步骤（4）的滤出液3，按照以下步骤制备分子量范围＜20000Da的甘露聚糖酶解物II：采用D301-G大孔弱碱阴离子交换树脂、001×7强酸性阳离子交换树脂、D296R型阴离子交换树脂对所述步骤（4）中的截留液2进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露聚糖酶解物II；
（6）真空浓缩。
（7）喷雾干燥，得甘露聚糖酶解物II，分子量范围＜20000Da。
效果实验实施案例1：甘露次聚糖用于降血糖试验
实验方法： 选取昆明种成年小鼠60只（雌雄各半），平均体重为(25±2.5)g，按雌雄各半原则随机选择10只作为正常对照组，其余50只采用高糖饲料饲养1-2个月后，以小剂量链脲佐菌素诱发糖尿病，空腹血糖值大于20mmol/L者纳入实验，然后随机将小鼠分为II型糖尿病模型组，二甲双胍给药组，实施例1产品给药组，对比例1产品给药组、对比例2产品给药组；正常对照组及II型糖尿病模型组给予等量蒸馏水。实验期为4周，每隔一周各组小鼠空腹眼眶取血，测其血糖含量。
具体的试验结果如表2所示。
表2 II型糖尿病小鼠降血糖试验（±s） mmol/L
组别 正常对照组 II型糖尿病 模型组 二甲双胍 给药组
剂量(g/kg) 0 0 2.0
样本数 10 10 10
给药前 5.45±0.93 21.89±1.36△ 21.91±1.07
给药第1周 5.23±0.43 21.42±0.55△ 17.78±3.51*
给药第2周 5.42±0.52 22.29±0.45△ 16.32±5.43*
给药第3周 5.35±0.56 22.16±0.63△ 15.21±4.86*
给药第4周 5.55±0.88 22.77±0.85△ 14.50±4.33*
组 别 实施例1产品给药组 对比例1产品给药组 对比例2产品给药组
剂量(g/kg) 2.0 2.0 2.0
样本数 10 10 10
给药前 21.87±1.45 21.90±1.50 21.83±1.22
给药第1周 18.78±3.65* 20.99±1.66 19.11±1.62
给药第2周 17.62±5.66* 19.50±1.68 18.61±2.33
给药第3周 15.98±4.67* 18.01±3.24* 17.42±2.22*
给药第4周 14.87±4.77* 17.22±2.42* 16.34±1.50*
△ P<0.001，和空白组相比;*P<0.05，和模型组相比。
由表1可知，给药前模型和各给药组小鼠血糖明显高于空白组（P<0.001）；二甲双胍给药组血糖下降明显，给药第1周下降就具有显著性差异（P<0.05）,以后3周继续下降；实施例1产品给药组血糖下降与二甲双胍给药组基本一致；对比例1产品给药组和对比例2产品给药组，给药第1-2周下降不明显，但随着给药时间的延长，血糖才有明显下降,时效关系显著。
二甲双胍是用于临床的降血糖药物，具有明显的降血糖作用，通过对比，表明甘露次聚糖实施例1产品给药组接近二甲双胍的降血糖作用。
效果实验实施案例2：甘露次聚糖硫酸酯化衍生物抗凝血试验
实验方法：
将上述实施例1产品、对比例1产品、对比例2产品进行硫酸酯化修饰处理，得到水溶性良好的甘露次聚糖硫酸酯化衍生物。
选取昆明种成年小鼠60只（雌雄各半），平均体重为(25±2.5)g，按雌雄各半原则随机，随机分为5组，每组12只。按照25ml/kg容量灌胃，分别给予生理盐水，法华令、实施例1产品硫酸酯化衍生物、对比例1产品硫酸酯化衍生物、对比例2产品硫酸酯化衍生物各10mg/kg，连续灌胃30d。第30d给药后1 h，从小鼠眼内眦球后静脉丛采血，按照毛细管法测定各组小鼠的凝血时间：取血至血柱高达5cm，每隔30s折断毛细管一段，检查有无凝血丝，从取血开始至出现血凝丝的所历时间为凝血时间。
具体的试验结果如表3所示。
表3 硫酸酯化衍生物对小鼠凝血时间的影响
与生理盐水组相比，*P<0.05
由表2可知，法华令和甘露次聚糖实施例1产品小鼠的凝血时间与生理盐水对照组相比均有差异性显著，P＜0.05；法华令是用于临床的抗凝血药物，用于防治血管栓塞性疾病。通过对比，表明甘露次聚糖硫酸酯化衍生物具有与法华令接近的抗凝血效果。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种高纯度甘露次聚糖，其特征在于，所述高纯度甘露次聚糖由魔芋精粉通过β-甘露聚糖酶可控酶解后产生，并经过纯化得到重均分子量为20000~25000Da的多糖体系。
2.一种高纯度甘露次聚糖粉的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
（1）酶解罐中按生产比例加水，控制温度为30-50℃，向酶解罐中投入中性β-甘露聚糖酶，然后称取魔芋精粉，均匀投放于酶解罐中，控制酶解罐内物料pH为 6.0-7.5，随着酶解时间推进，酶解液黏度快速下降，当设置在酶解罐上的黏度实时检测装置检测到酶解液的黏度达到700-800mpa.s时，立即灭酶，灭酶时间为20-30min,冷却；所述酶解罐设置有快速自动检测物料黏度装置；
（2）微滤除杂，利用陶瓷膜进行微滤处理得到过滤液，所述陶瓷膜膜孔径0.2μm，工作压力为：0.01-0.2MPa；
（3）一级超滤，使用截留分子量为25000Da的陶瓷超滤膜对所述步骤（2）得到的过滤液进行超滤，工作条件为：温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为400L-450L/h，分别得到滤出液1和截留液2；
（4）二级超滤，选用截留分子量为20000Da的陶瓷超滤膜对所述步骤（3）中的滤出液1进行超滤，温度20-30℃，压力为0.1-0.12MPa，物料流速为600L-650L/h，分别得到滤出液3和截留液4；
（5）将步骤（3）中的截留液2泵入酶解罐内，通过连续补料的方式继续酶解；
（6）对所述步骤（4）中得到的截留液4进行脱盐、脱色、脱味处理，得到甘露次聚糖精制液；
（7）真空浓缩：对所述步骤（6）制备得到甘露次聚糖精制液进行浓缩，浓缩后固形物浓度为45～55％；
（8）喷雾干燥：对步骤（7）浓缩后的浓缩物进行喷雾干燥，得高纯度甘露次聚糖粉。
3.如权利要求2所述的的一种高纯度甘露次聚糖粉的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述中性β-甘露聚糖酶的投入量按照酶料质量比为1：10-30计算。
4.一种高纯度甘露次聚糖粉，其特征在于，采用权利要求2或3所述方法制备得到。
5.如权利要求4所述的一种高纯度甘露次聚糖粉，其特征在于，所述高纯度甘露次聚糖粉的总糖含量为95%以上，其中分子量在20000-25000Da的甘露次聚糖含量大于90%。
6.权利要求5所述的高纯度甘露次聚糖粉，其特征在于，所述高纯度甘露次聚糖粉应用到降血糖产品中，食用后具有显著的降血糖效果。
7.权利要求5所述的高纯度甘露次聚糖粉，其特征在于，所述高纯度甘露次聚糖粉进行衍生化处理后，具有抗凝血，抗血栓功效，是一种重要的类肝素原料。
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