CN107759556A - 一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂及其制备方法和提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂(DESs)及其制备方法和提取方法，该深共熔溶剂是由氯化胆碱和丙二酸按摩尔比1:1‑2.5制备而成。本发明制备的深共熔溶剂为绿色溶剂，安全无污染，可重复利用，易生物降解，且制备工艺简单，成本低，具有蒸汽压低、不可燃、溶解性和导电性优良、电化学窗口稳定等性质；同时本发明制备的深共熔溶剂粘度小，氢键稳定，流动性好；采用本发明制备深共熔溶剂提取银杏叶原青花素的方法可以提高银杏叶中原青花素的提取率，减少提取时间，并且操作安全，对环境和人体不会产生危害。本发明深共熔溶剂的制备方法简单方便，原料来源广，成本低，生物可降解性高。

Description

一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂及其制备方法和提取 方法

技术领域

本发明涉及农林生物资源利用，具体涉及一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂及其制备方法和提取方法。

背景技术

银杏(学名：Ginkgo biloba L.)，又名公孙树、白果，属裸子植物，银杏科银杏属，单属单种。银杏叶、果等具有药用开发价值，被誉为浑身是宝的活化石。银杏原产我国，我国银杏资源拥有量占世界总量的70％以上。银杏叶中具有多种药用价值的天然活性成分，主要有黄酮类化合物、萜内酯类化合物、聚异戊烯醇类化合物、酚酸类化合物、原花青素等。银杏叶提取物(Gilkgo biloba extract，GBE)在治疗脑血栓、冠心病、脑功能障碍、神经系统疾病等方面具有独特疗效。因此，银杏叶中各种成分的提取分离研究一直是科研工作者研究的热点。

原花青素是一种具有黄烷-3-醇结构的植物多酚类化合物，在银杏叶提取物中约有4-12％的含量。除众所周知的抗氧化活性外，原花青素在心血管系统内，具有抗高血压、内皮依赖性血管舒张活性、抗缺血-再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、抗血小板凝集等功效，对急性肾功能衰竭也具有显著的保护作用。因此，银杏叶原花青素的提取有重要意义。

目前提取银杏叶原花青素的方法主要有以下几种：1、有机溶剂提取法：常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等。专利CN201110384337.3采用有机溶剂水溶液提取银杏叶原花青素。2、超临界流体提取法：专利CN99100588.0采用超临界二氧化碳加丙酮和水组成的极性改性剂提取银杏叶原花青素。有机溶剂易挥发，容易对环境造成污染，对操作人员造成伤害；超临界流体提取设备要求高，投入成本高。因此，基于绿色化学的原则，需要寻求新型的绿色溶剂，开发新型的提取方法，实现银杏叶中原花青素的安全高效绿色提取。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂(DESs)。本发明提供的深共熔溶剂作为绿色溶剂，安全无污染，可重复利用，易生物降解，且制备工艺简单，成本低，具有蒸汽压低、不可燃、溶解性优良等性质；可以绿色安全高效提取银杏叶中原花青素。

本发明还提供该深共熔溶剂的制备方法及利用该深共熔溶剂提取银杏叶原青花素的方法。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂，由氯化胆碱和丙二酸按摩尔比1:1-2.5制备而成。

作为优选，所述的深共熔溶剂，由氯化胆碱和丙二酸按摩尔比1:1.5-2.5制备而成。其中，氯化胆碱和丙二酸最优摩尔比为1:2。本发明所述的提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备原料氯化胆碱和丙二酸按照常规方法脱水；

(2)根据制备量的需要，按照摩尔比例称取氯化胆碱和丙二酸二种组分并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至透明液体形成；

(3)透明液体形成后保存在45-50℃过夜，观察液体有无固体析出，如果液体稳定没有固体析出，即得到二元深共熔溶剂可用于银杏叶原花青素的提取。

本发明所述利用深共熔溶剂提取银杏叶原青花素的方法，包括如下步骤：

(1)精确称取银杏叶粉末于提取容器内，加入用水稀释后的深共熔溶剂，混合均匀；

(2)混匀后通过搅拌提取，提取结束后离心取上清；

(3)取少量的上清用水稀释后，加显色剂反应，并用分光光度法检测原花青素含量；

(4)通过适当的方法回收其余上清中的原花青素。

作为优选，步骤(1)所述稀释后的深共熔溶剂为深共熔溶剂中水的体积分数为52.5-62.5％。最优选的比例为深共熔溶剂中水的体积分数为55％。

作为优选，步骤(1)所述银杏叶粉末与稀释后的深共熔溶剂的质量体积比为1:10-15g/mL。最优选的质量体积比为1:10g/mL。

其中，步骤(2)所述搅拌提取通过磁力搅拌进行提取。

更进一步地，所述磁力搅拌的转速为100-250rpm，温度为45-70℃，时间为35-65min。优选的搅拌的转速为150-200rpm，温度为60-65℃，时间为50-55min。最优选的磁力搅拌的转速为150rpm，温度为60℃，时间为50min。

作为优选，步骤(4)所述的回收原花青素的方法为液-液萃取法、大孔树脂吸附分离法、反溶剂法中的一种或多种。

本发明的深共溶溶剂性质与其组成成分、组成成分摩尔比及含水量之间有着重要关系，细微的变化可以引起深共熔溶剂性质极大的改变，这种易调节性可以对深共熔溶剂的性质进行调节，以满足不同应用的需求。本发明制备的深共熔溶剂，以氯化胆碱和丙二酸为组成成分，丙二酸是一个提高原花青素提取效率的有效物质。本发明中通过调整氯化胆碱和丙二酸的摩尔比使得深共熔溶剂的极性更接近原花青素，调整深共熔溶剂极性的同时改变氢键受体和氢键供体之间的氢键作用，进一步改变深共熔溶剂的粘度和表面张力，因此合适的摩尔比对深共熔溶剂形成及性质至关重要。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明制备的深共熔溶剂为绿色溶剂，安全无污染，可重复利用，易生物降解，具有蒸汽压低、不可燃、溶解性和导电性优良、电化学窗口稳定等性质；同时本发明的DESs的粘度小，氢键稳定，流动性好；使用本发明的深共熔溶剂可以提高银杏叶中原花青素的提取率，并且无有机溶剂残留，对环境和人体不会产生危害。

(2)本发明深共熔溶剂的制备方法简单方便，原料来源广，成本低，生物可降解性高。

(3)采用本发明深共熔溶剂提取银杏叶原花青素的方法，操作简便，提取效率高，使用安全，不会造成资源浪费。

附图说明

图1为DESs含水量对银杏叶原花青素提取率的影响关系图；

图2为不同提取方法对DESs提取银杏叶原花青素提取率的影响关系图；

图3为不同料液比对DESs提取银杏叶原花青素提取率的影响关系图；

图4为不同提取温度对DESs提取银杏叶原花青素提取率的影响关系图；

图5为不同提取时间对DESs提取银杏叶原花青素提取率的影响关系图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实验原料：

实验的原料银杏叶来自于邳州市铁富镇银杏叶生产基地，银杏叶采摘时间为5月。

标准品银杏叶原花青素由浙江康恩贝制药股份有限公司赠送。其他所用药品均为分析纯

UV-1200型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司

JY-2恒温搅拌油浴锅，金坛市天竟实验仪器厂

恒温培养振荡器ZWYR-2112B，上海智诚分析仪器制造有限公司

TG16A-WS台式高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

其他原料都是市售可得，将原料氯化胆碱、丙二酸用真空干燥箱干燥脱水。

实施例1

(1)按照摩尔比1:2.5称取深共熔溶剂的两种组分氯化胆碱和丙二酸并混合均匀，在110℃加热搅拌，直至透明液体形成；

(2)透明液体形成后保存在45℃过夜，观察液体无固体析出，所得深共熔溶剂可用于银杏叶原花青素的提取。

实施例2

(1)按照摩尔比1:2称取深共熔溶剂的两种组分氯化胆碱和丙二酸并混合均匀，在100℃加热搅拌，直至透明液体形成；

(2)透明液体形成后保存在50℃过夜，观察液体无固体析出，所得深共熔溶剂可用于银杏叶原花青素的提取。

实施例3

(1)按照摩尔比1:1.5称取深共熔溶剂的两种组分氯化胆碱和丙二酸并混合均匀，在80℃加热搅拌，直至透明液体形成；

(2)透明液体形成后保存在45℃过夜，观察液体无固体析出，所得深共熔溶剂可用于银杏叶原花青素的提取。

实施例4

实施例4与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：按照摩尔比1:1称取深共熔溶剂的两种组分氯化胆碱和丙二酸并混合均匀。

实施例5

(1)精确称取100mg 40目银杏叶粉末于2mL离心管中，加入实施例1-4任意一种深共熔溶剂1mL(含水量55％)，涡旋混匀；

(2)混匀后在60℃，150rpm磁力搅拌提取50min，提取结束后在10000rpm下离心10min，取0.05mL上清用水稀释至1mL后，加3mL显色剂反应，并用分光光度法检测。由于部分DESs本来就具有颜色，为了避免干扰，在测定过程中以哪种DESs提取银杏叶原花青素，就以该DESs作为空白对照。通过大孔树脂吸附分离法回收其余上清中的原花青素。

实施例6

(1)精确称取100mg 40目银杏叶粉末于2mL离心管中，加入实施例1-4任意一种深共熔溶剂1.5mL(含水量57.5％)，涡旋混匀；

(2)混匀后在65℃，200rpm磁力搅拌提取40min，提取结束后在10000rpm下离心10min，取0.05mL上清用水稀释至1mL后，加3mL显色剂反应，并用分光光度法检测。由于部分DESs本来就带有颜色，为了避免干扰，在测定过程中以哪种DESs提取银杏叶原花青素，就以该DESs作为空白对照。通过液-液萃取法回收其余上清中的原花青素。

实施例7

(1)精确称取100mg 40目银杏叶粉末于2mL离心管中，加入实施例1-4任意一种深共熔溶剂1.25mL(含水量62.5％)，涡旋混匀；

(2)混匀后在60℃，200rpm磁力搅拌提取45min，提取结束后在10000rpm下离心10min，取0.05mL上清用水稀释至1mL后，加3mL显色剂反应，并用分光光度法检测。由于部分DESs本来就带有颜色，为了避免干扰，在测定过程中以哪种DESs提取银杏叶原花青素，就以该DESs作为空白对照。通过反溶剂法回收其余上清中的原花青素。

实施例8

(1)精确称取100mg 40目银杏叶粉末于2mL离心管中，加入实施例1-4任意一种深共熔溶剂1mL(含水量52.5％)，涡旋混匀；

(2)混匀后在40℃，100rpm磁力搅拌提取65min，提取结束后在10000rpm下离心10min，取0.05mL上清用水稀释至1mL后，加3mL显色剂反应，并用分光光度法检测。由于部分DESs本来就具有颜色，为了避免干扰，在测定过程中以哪种DESs提取银杏叶原花青素，就以该DESs作为空白对照。通过大孔树脂吸附分离法回收其余上清中的原花青素。

实施例9

(1)精确称取100mg 40目银杏叶粉末于2mL离心管中，加入实施例1-4任意一种深共熔溶剂1mL(含水量55％)，涡旋混匀；

(2)混匀后在70℃，250rpm磁力搅拌提取35min，提取结束后在10000rpm下离心10min，取0.05mL上清用水稀释至1mL后，加3mL显色剂反应，并用分光光度法检测。由于部分DESs本来就具有颜色，为了避免干扰，在测定过程中以哪种DESs提取银杏叶原花青素，就以该DESs作为空白对照。通过大孔树脂吸附分离法回收其余上清中的原花青素。

实施例10

银杏叶原花青素的含量测定

原花青素含量测定选用4-二甲基肉桂醛(DMAC)分光光度法，具体检测方法为：精确量取12.5mL浓盐酸、12.5mL水，用无水乙醇定容至100mL制成酸性乙醇，酸性乙醇需现配现用。将50mg DMAC用酸性乙醇定容至50mL配制成显色剂。1mL样品液加3mL显色剂，在室温下放置10min进行显色反应，反应后在644nm处检测。

用银杏叶原花青素标准品配成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.0129、0.0258、0.0387、0.0516、0.0645、0.0774、0.0903、0.1032、0.1161、0.129mg/mL，显色后检测，并绘制标准曲线。

根据稀释后的10组标准溶液，用检测得到的吸光值与原花青素浓度在Excel图表工具中绘制标准曲线，拟出相应线性关系方程式，得到的原花青素的标准曲线方程为：

y＝8.8157x+0.0114(0<x<0.129)

R²＝0.9994，说明原花青素在0～0.129mg/mL浓度范围内线性型良好，该方法可以用于原花青素的定量分析。

试验例1

DESs对银杏叶中的原花青素提取率研究，结果如表1所示。

其中采用实施例1-3的深共熔溶剂，并采用实施例5的提取方法，考察本发明的深共熔溶剂以及提取方法对银杏叶原花青素的提取率；试验编号为1-3。

对比例1为提取溶剂为体积分数70％丙酮，并采用实施例5的提取方法。

对比例2为提取溶剂为体积分数70％甲醇，并采用实施例5的提取方法。

对比例3为提取溶剂为体积分数70％乙醇，并采用实施例5的提取方法。

表1 DESs对银杏叶原花青素提取率

试验编号	原花青素(mg/g)
		1	20.0542±0.7054
2	22.0956±0.7129
		3	18.0154±0.7124
对比例1	13.5462±0.6897
		对比例2	7.7536±0.6494
对比例3	7.9036±0.6875

由表1结果可知，采用本发明的深共熔溶剂和提取方法，对比了传统的提取溶剂70％乙醇、70％甲醇、70％丙酮的提取率，本发明的实施例提取率明显要高，最高能达到提取率(22.0956±0.7129mg/g)。这能说明，本发明的深共熔溶剂可以应用于银杏叶原花青素提取，提取效率优于传统溶剂，并且本发明深共熔溶剂是一种绿色溶剂，相对于传统有机溶剂不会产生任何污染，并且使用安全。

试验例2

DESs组分摩尔比对银杏叶原花青素提取率的影响。

采用实施例1-3的DESs，提取条件为：DESs/水＝70:30(w/w)，250rpm气浴摇床振荡提取，银杏叶与DESs的质量体积比1:10(g/mL)，提取温度25℃，提取时间5min；考察本发明实施例1-3的DESs对原花青素的提取情况，编号为4-6；结果如表2所示。

其中对比例4与实施例1的深共熔溶剂原料和制备方法相同，不同之处组分氯化胆碱和丙二酸的摩尔比为1:0.5；并采用相同的提取方法。

其中对比例5与实施例1的深共熔溶剂原料和制备方法相同，不同之处组分氯化胆碱和丙二酸的摩尔比为1:3。

表2 DESs组分的不同摩尔比对银杏叶原花青素提取率

试验编号	原花青素(mg/g)
		4	5.2928±0.2125
5	5.1254±0.2021
		6	5.1152±0.2103
对比例4	4.2266±0.1278
		对比例5	未形成透明液体

由表2结果可知，采用本发明实施例的摩尔配比深共熔溶剂与对比例相比，对于银杏叶原花青素的提取率明显要高。其中对比例5的摩尔配比不能形成透明液体，故不能进行提取。氢键受体和氢键供体的含量过多和过少都不适宜进行DESs的制备。组分摩尔比对于DESs的形成和性质的有很大影响。DESs的组分摩尔比会影响到DESs的粘度、表面张力等性质，也会影响DESs组分间、DESs与提取物间的氢键作用、范德华力、疏水作用力等分子间作用力，进而影响提取率。

试验例3

DESs含水量对银杏叶原花青素提取率的影响。

提取条件为：250rpm气浴摇床振荡提取，银杏叶与DESs的质量体积比1:10(g/mL)，提取温度25℃，提取时间5min；考察本发明实施例1的深共熔溶剂对原花青素的提取率，测定DESs与水不同比例0～100％对原花青素提取效果，同时以与实施例1相同制备方法将原料分别换成摩尔比为1:1的甜菜碱-草酸、1:2的乙醇酸-乙二醇、1:5的乙醇酸-乙二醇、1:3甜菜碱-丙二酸、1:2的丙二酸-乙二酸、1:3的丙二酸-乙二酸、1:4的丙二酸-乙二酸、1:5的丙二酸-乙二酸作为不同的对比；结果如图1所示。

在DESs中添加水可以调节DESs的极性，同时降低粘度，增加提取过程中的料液传质。由图1结果可知，随着含水量的增加，DESs的提取率呈现先增加后降低的趋势，这是由于含水量不同，溶剂的粘度、极性等物理性质的改变造成的。经分析，氯化胆碱-丙二酸1:2，DESs含量为37.5-42.5％时即含水量52.5-62.5％时，原花青素提取率较高，同时当DESs含量为45％时即含水量为55％时原花青素提取率为8.7374±0.2588mg/g，对比DESs的最大提取率都低于氯化胆碱-丙二酸形成的DESs。

试验例4

DESs提取方法对银杏叶原花青素提取率的影响。

提取条件为：选取试验例3中3个提取率较高的DESs-水混合溶剂(甜菜碱-草酸1:1、氯化胆碱-丙二酸1:2、甜菜碱-丙二酸1:3)作为提取溶剂，银杏叶与DESs的质量体积比1:10(g/mL)，提取时间5min，考察不同提取方法对银杏叶原花青素提取率的影响。其中：磁力搅拌法(150rpm)、水浴摇床法(150rpm)、超声提取法(50w)、气浴摇床振荡法(250rpm)这几种方法中，比较常温(25℃)和加热(45℃)下的提取率；结果如图2所示(图2中左柱形图为甜菜碱-草酸1:1、中柱形图为氯化胆碱-丙二酸1:2、右柱形图为甜菜碱-丙二酸1:3)。

由图2结果可知，在同等温度下，水浴振荡提取和磁力搅拌提取的提取效果较好。加热可显著增加原花青素从银杏叶扩散到DESs中的速率，提高提取率；由于磁力搅拌提取设备简单，操作简便，效率高，选取该方法进行下一步实验。

试验例5

银杏叶与DESs的质量体积比(g/mL)(即料液比)对银杏叶原花青素提取率的影响。

提取条件为：选取试验例4中较好的两个DESs-水混合溶剂(甜菜碱-草酸1:1、氯化胆碱-丙二酸1:2)作为提取溶剂，磁力搅拌150rpm，提取温度25℃，提取时间5min；考察银杏叶与DESs-水混合溶剂的质量体积比(mg/mL)对银杏叶原花青素提取率的影响，选取的料液比例分别为1:5、1:7.5、1:10、1:12.5、1:15、1:20、1:30(g/mL)的情况，结果如图3所示(图3中左柱形图为甜菜碱-草酸1:1、右柱形图为氯化胆碱-丙二酸1:2)。

由图3结果可知，随着DESs-水混合溶剂量的增加，银杏叶混合均匀，质量体积比为1:10-15g/mL提取效果好，原花青素提取率在1:10g/mL时达到拐点，进一步提高DESs-水混合溶剂的量不能提高提取率。综合考虑提取率和溶剂使用量，选取1:10作为DESs提取银杏原花青素的最优料液比。

试验例6

不同温度对DESs提取银杏叶原花青素提取率的影响。

提取条件为：选取试验例4中较好的两个DESs-水混合溶剂作为提取溶剂，磁力搅拌150rpm，银杏叶与DESs-水混合溶剂的质量体积比1:10(g/mL)，提取时间5min；考察深共熔溶剂在不同的温度下对银杏叶原花青素的提取率，选取温度25、35、45、50、55、60、65℃对原花青素进行提取；结果如图4所示。

原花青素的提取率受温度的影响较大。由图4中可以看出，温度的升高增加了原花青素的提取率，可能是因为温度升高DESs的流动性增强，原花青素的分子扩散加快，因此原花青素的提取率增加，其中45-70℃提取温度合适，原花青素提取率在60-65℃趋于稳定。选取60℃为最优选的提取温度。

试验例7

不同提取时间对DESs提取银杏叶原花青素提取率的影响。

提取条件为：选取试验例4中较好的两个DESs-水混合溶剂作为提取溶剂，磁力搅拌150rpm，银杏叶与DESs-水混合溶剂的质量体积比1:10(g/mL)，提取温度60℃；考察本发明深共熔溶剂在不同的提取时间下对银杏叶原花青素的提取率，选取时间5、10、15、25、35、45、50、55、60、65、75、85min对原花青素进行提取；结果如图5所示。

由图5结果所示。从5min起，随着时间延长，银杏叶中原花青素的提取率逐渐增加。选取35-65min提取时间为合适，在50-55min，两个DESs提取率都趋于稳定。是由于银杏叶中的原花青素基本已提取完全，因此提取率趋于稳定，因此最优提取时间选择50min。同时，比较图5中的两个类型DESs的提取进程曲线，可以看出在整个提取进程中，氯化胆碱—丙二酸形成的DESs都优于甜菜碱-丙二酸形成的DESs。

综上所述，本发明由氯化胆碱-丙二酸以1:2摩尔比混合制备而成的DESs，含水量55％作为提取溶剂，最终的提取条件为温度60℃，料液比1:10(g/mL)，提取时间50min。在同等条件下，本发明DESs的提取率明显高于传统有机溶剂70％丙酮、70％乙醇、70％甲醇。

Claims (9)

1.一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂，其特征在于，由氯化胆碱和丙二酸按摩尔比1:1-2.5制备而成。

2.根据权利要求1所述的深共熔溶剂，其特征在于，由氯化胆碱和丙二酸按摩尔比1:1.5-2.5制备而成。

3.一种权利要求1所述的深共熔溶剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将原料氯化胆碱、丙二酸干燥除水；

(2)根据制备量的需要，按照摩尔比例称取氯化胆碱和丙二酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至透明液体形成；

(3)透明液体形成后保存在45-50℃过夜，观察液体有无固体析出，如果液体稳定没有固体析出，所得到的二元深共熔溶剂可用于银杏叶原花青素的提取。

4.一种利用权利要求1所述的深共熔溶剂提取银杏叶原青花素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)精确称取银杏叶粉末于提取容器内，加入用水稀释后的深共熔溶剂，混合均匀；

(2)混匀后通过搅拌提取，提取结束后离心取上清；

(3)取少量的上清用水稀释后，加显色剂反应，并用分光光度法检测原花青素含量；

(4)回收其余上清中的原花青素。

5.根据权利要求4所述的提取银杏叶原青花素的方法，其特征在于，步骤(1)所述稀释后的深共熔溶剂为深共熔溶剂中水的体积分数为52.5-62.5％。

6.根据权利要求4所述的提取银杏叶原青花素的方法，其特征在于，步骤(1)所述银杏叶粉末与稀释后的深共熔溶剂的质量体积比为1:10-15g/mL。

7.根据权利要求4所述的提取银杏叶原青花素的方法，其特征在于，步骤(2)所述搅拌的转速为100-250rpm，温度为45-70℃，时间为35-65min。

8.根据权利要求7所述的提取银杏叶原青花素的方法，其特征在于，步骤(2)所述搅拌的转速为150-200rpm，温度为60-65℃，时间为50-55min。

9.根据权利要求4所述的提取银杏叶原青花素的方法，其特征在于，步骤(4)所述回收上清中的原花青素的方法为液-液萃取法、大孔树脂吸附分离法、反溶剂法中的一种或多种。