CN117447318A - 利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共熔溶剂及其发酵方法和应用 - Google Patents

利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共熔溶剂及其发酵方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共熔溶剂及其发酵方法和应用，本发明将制备的深共熔溶剂与苹果树修剪枝条粉末混合并同步提取根皮苷和根皮素，将提取溶液加热保温，促使其中的根皮苷脱糖基生成根皮素，再将提取溶液过滤，收集滤液，回收其中的根皮素；收集滤饼加入混合酶液进行酶解，酶解液与其它木本饲料原料混合制备固态发酵基质，灭菌后接种微生物发酵得木本蛋白饲料产品。本发明通过特定的深共熔溶剂以及提取发酵方法从苹果树修剪枝条中高效地制备了根皮素产品并联产了发酵木本蛋白饲料产品，其工艺条件温和、制备周期短，成本低廉，操作简单，适合工业化推广应用，并且促进了农林废弃物高值化利用。

Description

利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共 熔溶剂及其发酵方法和应用
技术领域
本发明属于农林废弃物资源利用领域，具体涉及一种利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共熔溶剂及其发酵方法和应用。
背景技术
苹果(Malus pumila Mill.)为蔷薇科(Rosaceae)苹果属Malus Mill.植物，在我国甘肃、陕西、山西、山东、河北、天津、辽宁等地广泛种植。我国是世界第一苹果生产大国，苹果种植面积占世界总种植面积的40％以上，果实年产量4500多万吨。苹果树每年一般要进行冬剪、复剪、修芽、疏蕾四次修剪，由于苹果树修剪，我国平均每年可产生1500多万吨的苹果树修剪枝条。苹果树修剪枝条中含有丰富的黄酮类活性成分，以及维生素、矿物质、有机酸、糖类、蛋白质、脂肪、纤维素等，在制备生物活性物质和生产饲料方面具有极大潜力。然而，苹果树修剪枝条资源缺乏合理开发利用途径，通常作为农林废弃物被堆积在田间地头，或被焚烧处理，影响了人居环境，并造成了巨大的资源浪费和环境污染。
根皮素是一种二氢查耳酮化合物，主要分布于苹果等植物的果实、根、枝条、叶中，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抗肿瘤、抗心血管硬化、诱导癌症细胞凋亡、祛斑及光滑肤质等作用，使用范围广泛，市场需求量也日趋增加。目前，常见方法是以海棠叶或苹果叶为原料，进行有机溶剂提取分离或结合酶解或酸水解法制备根皮素，如发明专利CN 102701938 A、CN 101979618 A和CN 106631745 A公开的方法。但是，这些方法存在以下不足：(1)多用叶片作为提取原料，原料单一、生物量小；(2)采用传统有机溶剂作为提取溶剂，有机溶剂易挥发、易残留，对环境和人体造成危害；(3)采用酶制剂水解根皮苷为根皮素，反应时间长，效率低，酶制剂成本高、稳定性差；(4)需要使用大量的无机酸，具有较强的腐蚀性、挥发性，对环境和人体造成危害。
木本饲料是指可供饲用的木本植物的叶子、嫩枝、籽实及加工后的副产品，国际上称之为Wood grass或Woody forage。由于畜牧业的快速发展，导致饲料需求量越来越大，传统的草本、粮食饲料供应出现了短缺的情况，为了保证畜牧业高质量稳定发展，寻找传统饲料的补充品迫在眉睫。木本饲料作为一种新型饲料资源，在世界范围内引起了广泛的关注，成为饲料研究的新兴领域。然而，当前木本饲料开发利用还存在一些问题：(1)本木饲料原料利用范围窄。目前开发利用的木本饲料原料较少，一方面，开发利用的乔灌木少，另一方面，农林修剪、园林修剪产生的大量的农林剩余物未得到利用；(2)木本饲料原料利用率低。木本饲料原料多利用叶片，其茎秆、枝条、修剪物等因为木质化程度高、纤维结构致密，往往没有得到很好的利用。(3)木本饲料原料转化率低。木本饲料原料中碳水化合物主要为纤维素、半纤维素等，它们与木质素缠绕在一起，难以被动物消化利用吸收。此外，木本饲料原料中的蛋白质也多为结构蛋白，与木质素、纤维素以及其它成分结合在一起，也难以被动物消化利用吸收。据报道苹果树修剪枝条中含有粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分的比例分别为9.8％、7％、8％、10％，无氮浸出物含量为59.8％，钙含量平均在1.5％以上，是玉米、高粱等精饲料中钙含量的25-50倍。长期以来，农村地区有用苹果树枝叶饲喂兔和猪的习惯，可以提高畜禽的繁殖率和增重性能。因此，利用苹果树修剪枝条生产木本蛋白饲料可以进一步拓宽木本饲料原料范围，是一条废弃物利用的良好途径。当前利用苹果渣(苹果榨汁后的残渣)生产饲料已有专利报道，如发明专利CN1363228 A、CN1470181A和CN1663421A。但是，与苹果树修剪枝条相比，苹果渣产量低，每年只有200万吨左右。此外，苹果渣的含水量大，不耐贮藏，能量密度、营养密度也低于苹果树修剪枝条。然而，目前国内外文献未见利用苹果树修剪枝条生产木本饲料的方法，也未见相关饲料产品。
发明内容
发明目的：针对苹果树修剪枝条利用现状及现有技术中存在的问题，本发明提供一种利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共熔溶剂。本发明的方法通过特定的绿色溶剂酸性深共熔溶剂同步提取根皮苷、根皮素，原位催化转化根皮苷为根皮素，富集根皮素；并通过深共熔溶剂剥离木质素、降低纤维素结晶度，酶催化降解纤维素、植酸、单宁，结合微生物发酵技术制备发酵木本蛋白饲料，实现了利用苹果树修剪枝条高效联产根皮素和发酵木本蛋白饲料，整个生产加工工艺简单，操作简便，环境相容性高，经济高效。
本发明还提供该深共熔溶剂的加工方法及其制备得到的根皮素粗品、发酵木本蛋白饲料产品及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共熔溶剂，所述深共熔溶剂包括组分A和组分B；所述组分A为对甲苯磺酸、草酸、马来酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸中的一种或几种；所述组分B为氯化胆碱、乙二醇、甘油、木糖醇、葡萄糖、甘露糖、果糖、间苯二酚、邻苯二酚中的一种或几种。
其中，所述组分A和组分B的摩尔比为(1～3)：(3～1)。
作为优选，所述组分A为对甲苯磺酸；所述组分B为乙二醇，二者摩尔比为1:2。
其中，所述深共熔溶剂由组分A和组分B混合后，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂I，向深共熔溶剂I中加入去离子水得深共熔溶剂II；所述向深共熔溶剂I中加入的去离子水量为深共熔溶剂II总质量的30％～50％。
本发明所述一种利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的方法，包括如下步骤：
(1)收集苹果树修剪枝条，晒干，粉碎至20～40目；
(2)向苹果树修剪枝条粉末中加入所述的深共熔溶剂，混合后进行提取；
(3)提取结束后，将提取溶液升温，并进行保温；
(4)保温结束后，将提取溶液过滤，得滤液和滤饼(即苹果树修剪枝条粉末提取残渣)；
(5)收集滤液，分离回收其中的根皮素，得根皮素产品；
(6)收集滤饼加入酶液，进行酶解反应；
(7)向酶解液中加入其他木本饲料原料混合，制备固态发酵基质，灭菌后接种微生物发酵，得发酵木本蛋白饲料产品。
其中，步骤(2)中苹果树修剪枝条粉末与深共熔溶剂的比例为1:10-20(g/mL)；所述提取的方法为搅拌提取，搅拌转速为40～80rpm，温度为30～50℃，时间为10～60min，同步提取苹果枝条中的根皮苷和根皮素。
其中，步骤(3)中提取溶液的温度提高到50～90℃，保温5～30min。高温下通过深共熔溶剂组分催化根皮苷原位脱糖基化生成根皮素。同时高温下，深共熔溶剂组分部分剥离苹果修剪枝条中的木质素，降低纤维素的结晶度和规整度。
其中，步骤(4)中过滤为常规抽滤，采用普通市售一层滤纸进行抽滤即可。
作为优选，步骤(5)所述的分离回收根皮素的方法是指液-液萃取法、大孔树脂吸附分离法中的一种或多种。
其中，步骤(6)中的酶液含有纤维素酶、植酸酶和单宁酶，酶活分别为3～6FPU/mL、6～12U/mL和4～8U/mL；所述残渣与酶液的混合比例为1:5～10(g/mL)；酶解时间为12～24小时，室温下30～60rpm搅拌酶解12～24小时。
其中，步骤(7)中所述木本饲料原料为辣木枝叶粉、构树枝叶粉、蛋白桑枝叶粉、柠条枝叶粉、刺槐枝叶粉、豆腐柴枝叶粉、银合欢枝叶粉、文冠果枝叶粉、杜仲枝叶粉、碧根果枝叶粉、银杏枝叶粉中的一种或几种；所述木本饲料原料的加入量控制在加入后使形成的固态发酵基质含水量在35％～55％之间。
其中，步骤(7)中接种的微生物包括霉菌、酵母菌或者杆菌中的任一种或者多种，所述霉菌包括长柄木霉、黑曲霉、米曲霉中的任意一种或者多种；所述酵母菌包括产朊假丝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母中的任意一种或者多种；所述杆菌包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的一种或多种；上述微生物扩大培养到对数生长期用无菌水制备孢子或菌悬液，霉菌孢子悬液浓度为1.0×106CFU/mL，酵母菌悬液浓度为1.0×107CFU/mL，杆菌菌悬液浓度为1.0×108CFU/mL，用孢子或菌悬液接种到发酵基质；所述霉菌孢子悬液接种量为30～70mL/kg发酵基质、酵母菌菌悬液接种20～60mL/kg发酵基质、杆菌菌悬液接种10～20mL/kg发酵基质；所述发酵是在温度25～35℃发酵3～6天，得粗蛋白大于20％、粗纤维小于18％的发酵木本蛋白饲料产品。
本发明利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的方法制备的根皮素和木本蛋白饲料产品。
其中，所述的利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的方法制备的根皮素产品在食品、药品、日化产品中的应用；制备的发酵木本蛋白饲料产品在畜禽养殖、水产养殖中的应用。
本发明提供了一种基于深共熔溶剂的同步提取、原位催化转化和微生物发酵对苹果树修剪枝条废弃物进行联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的方法及其制备的产品和应用。本发明特定的方法高效地制备了根皮素产品并联产了发酵木本蛋白饲料，工艺条件温和、制备周期短，成本低廉，操作简单，适合工业化推广应用，并且促进了农林废弃物高值化利用，有利于减少资源浪费和环境污染。
本发明以农林废弃物苹果树修剪枝条作为加工对象，组合使用绿色溶剂提取、绿色溶剂解离溶胀、酶催化和微生物发酵技术。根据根皮素及其糖基化衍生物根皮苷的极性、脱糖基化反应需要设计绿色深共熔溶剂，实现高效提取和原位催化转化富集根皮素。通过深共熔溶剂解离溶胀、酶制剂降解和微生物发酵，在温和简单的工艺条件下，实现纤维素、植酸、单宁等抗营养因子的降解、转化利用，高效地制备了粗蛋白大于20％、粗纤维小于18％的发酵木本蛋白饲料产品。
本发明设计的特定深共熔溶剂(DES)可以快速简便地将根皮素、根皮苷同时提取出来，而现有技术要获得根皮素需要进行分离纯化，或者是分离获得根皮素、根皮苷粗品再利用酸水解或酶水解根皮苷到根皮素，再分离纯化获得根皮素，工艺流程复杂。本发明的优势是原位提取、催化转化，减少了步骤，而且避免了传统酸水解(无机酸用量大、污染)或酶水解(酶解时间长、成本高)；同时提供的酸性DES对木质素有一定的剥离效果、对纤维素有溶胀作用，便于后续酶解释放可发酵糖，供给后面微生物发酵作为起始发酵的碳源。
本发明首次采用苹果树修剪枝条为原料，设计的多功能绿色酸性深共熔溶剂实现了根皮素根皮苷同步提取、原位催化转化和木质素剥离及纤维素溶胀，实现根皮素制备和发酵饲料生产，通过组分A和组分B形成的酸性深共熔溶剂的设计就可以达到的。
本发明首次提出一种利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共熔溶剂，本发明首次以苹果树修剪枝条作为处理对象，不需要像叶片等先采用有机溶剂提取根皮苷，再加入酶制剂水解根皮苷为根皮素，不仅反应时间长，而且效率低，本发明直接采用特定的深共熔溶剂可以同步提取苹果树枝条中的根皮苷和根皮素，并实现根皮苷原位转化为根皮素。本发明中特定的深共熔溶剂不仅可以作为提取溶剂还可以作为催化转化剂，在提取的同时实现根皮苷全部转化根皮素；进一步地，该深共熔溶剂还实现对苹果树修剪枝条木质素的剥离，纤维素的溶胀、降解，达到了对苹果树修剪枝条的预处理，提高了后续工序发酵生产饲料的酶解效率，实现了三位一体的显著效果。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明利用苹果树修剪枝条作为加工对象，生产原料价格低廉，资源丰富，易于获取，促进了农林废弃物高值化利用，有利于减少资源浪费和环境污染。
(2)本发明利用绿色溶剂DES在短时间内实现了根皮素及其糖基化衍生物根皮苷的提取和原位转化，转化率可达到100％；提取和转化过程中不使用易挥发、有毒有机溶剂，不需要有毒有机溶剂的多步反复萃取，工艺操作安全，产品无有毒有机溶剂残留，采用的绿色溶剂DES，具有易生物降解，无毒无害，环境相容性高等特点。
(3)本发明制备的酸性DES具有多功能性，在实现根皮素、根皮苷提取，原位催化转化的同时，还可以实现对苹果树修剪枝条木质素的剥离，纤维素的溶胀、降解，达到了对苹果树修剪枝条的预处理，提高了后续工序的酶解效率，降低了后续酶解过程中酶制剂的使用量，也有利于后续饲料的发酵加工生产。
(4)本发明在发酵前利用纤维素酶、植酸酶和单宁酶对苹果树修剪枝条粉末提取残渣进行混合酶解，一方面实现了对抗营养因子和发酵抑制物的降解，有利于提高微生物发酵效率，改善发酵饲料品质；另一方面，将纤维素一定程度上降解为可发酵糖，有利于在发酵初期为微生物提供碳源，促进微生物快速生长繁殖，加快发酵进程，缩短发酵时间；此外，通过对纤维素、植酸、单宁的降解，有利于结合状态存在的结构蛋白游离释放出来，便于动物的消化吸收。
(5)本发明向苹果树修剪枝条粉末提取残渣酶解液中添加其它木本饲料原料，一方面实现了固态发酵基质水分含量的简易调节，另一方面也通过其它饲料原料的引入增加了最终发酵饲料的营养与功能，而且使其营养与功能更加协调、完全。
(6)本发明组合使用木霉、曲霉、酵母、芽孢杆菌进行发酵，利用这些微生物分泌的强大酶系，达到了对苹果树修剪枝条粉末提取残渣的高效转化，实现了粗纤维的降解，蛋白质的积累，改善了发酵原料的风味和口感，提高了动物的采食量。
(7)本发明在国内外首次实现了利用苹果树修剪枝条高效联产根皮素、发酵木本蛋白饲料产品。
(8)本发明工艺设计巧妙、条件温和，操作简单，环境相容性高，经济高效，适合工业化推广应用。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为根皮苷(a)和根皮素(b)的标准曲线。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中的采用的微生物均为市售公知或者菌种库购买的菌株，也可以采用野生型的菌株。其中：长柄木霉ACCC30151、酿酒酵母ACCC21429、地衣芽孢杆菌ACCC19941、米曲霉ATCC42149、马克斯克鲁维酵母ATCC748、枯草芽孢杆菌ATCC6633、黑曲霉ATCC16404、产朊假丝酵母AS2.120、短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌ACCC11083。
纤维素酶、植酸酶和单宁酶均来自于宁夏夏盛实业集团有限公司，货号分别为SDG-2425、SDG-2431和FDG-2254，或者其他市售均可。
实施例1
(1)收集苹果树修剪枝条，晒干，粉碎至30目；
(2)称取草酸和氯化胆碱按1：1摩尔比混合，在100℃下加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂I(DES-I)，向DES-I中加入去离子水得深共熔溶剂II(DES-II)，去离子水占整个混合物质量的40％。
(3)称取1kg的苹果树修剪枝条粉末于提取容器中，向其中加入15L的DES-II，混合，在40℃、60rpm条件下搅拌40min同步提取苹果树修剪枝条中的根皮苷和根皮素；
(4)提取结束后，将提取溶液温度提高到70℃，并保温30min；
(5)保温结束后，将提取溶液过滤，得滤液和滤饼；
(6)收集滤液，采用大孔树脂D101分离回收其中的根皮素，得根皮素产品；
(7)收集滤饼(即苹果树修剪枝条粉末提取残渣，约相当于0.9kg苹果树修剪枝条粉末)，与体积为6.3L的混合酶液(含5FPU/mL纤维素酶、8U/mL植酸酶和6U/mL单宁酶，均来自于宁夏夏盛实业集团有限公司)在容器中混合，在室温下40rpm搅拌酶解18小时；
(8)向苹果树修剪枝条粉末提取残渣酶解液中加入重量比为1:1的蛋白桑枝叶粉和柠条枝叶粉混合物调节含水量为45％(通过含水量控制各个物质比例)，制备固态发酵基质(约15.71kg)，灭菌后接种长柄木霉ACCC30151孢子悬液(浓度为1.0×106CFU/mL)786mL，酿酒酵母ACCC21429菌悬液(浓度为1.0×107CFU/mL)629mL和地衣芽孢杆菌ACCC19941菌悬液(浓度为1.0×108CFU/mL)236mL，在30℃发酵5天，得发酵木本蛋白饲料产品。本实施例的工艺流程如图1所示。
实施例2
(1)收集苹果树修剪枝条，晒干，粉碎至20目；
(2)称取丙二酸和葡萄糖按2：1摩尔比混合，在80℃下加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂I(DES-I)，向DES-I中加入去离子水得深共熔溶剂II(DES-II)，去离子水占整个混合物质量的30％。
(3)称取1kg的苹果树修剪枝条粉末于提取容器中，向其中加入10L的DES-II，混合，在30℃、40rpm条件下搅拌10min同步提取苹果枝条中的根皮苷和根皮素；
(4)提取结束后，将提取溶液温度提高到50℃，并保温5min；
(5)保温结束后，将提取溶液过滤，得滤液和滤饼；
(6)收集滤液，采用大孔树脂HPD417分离回收其中的根皮素，得根皮素产品；
(7)收集滤饼(即苹果树修剪枝条粉末提取残渣，约相当于0.9kg苹果树修剪枝条粉末)，与体积为4.5L的混合酶液(含3FPU/mL纤维素酶、6U/mL植酸酶和4U/mL单宁酶，均来自于宁夏夏盛实业集团有限公司)在容器中混合，在室温下50rpm搅拌酶解15小时；
(8)向苹果树修剪枝条粉末提取残渣酶解液中加入重量比为1:1:1的豆腐柴枝叶粉、银合欢枝叶粉和银杏枝叶粉混合物调节含水量为35％，制备固态发酵基质(约15.40kg)，灭菌后接种米曲霉ATCC42149孢子悬液(浓度为1.0×106CFU/mL)462mL、马克斯克鲁维酵母ATCC748菌悬液(浓度为1.0×107CFU/mL)308mL、枯草芽孢杆菌ATCC6633菌悬液(浓度为1.0×108CFU/mL)154mL，在25℃发酵3天，得发酵木本蛋白饲料产品。
实施例3
(1)收集苹果树修剪枝条，晒干，粉碎至25目；
(2)称取苹果酸和甘油按3：1摩尔比混合，在90℃下加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂I(DES-I)，向DES-I中加入去离子水得深共熔溶剂II(DES-II)，去离子水占整个混合物质量的35％。
(3)称取1kg的苹果树修剪枝条粉末于提取容器中，向其中加入12.5L的DES-II，混合，在35℃于50rpm搅拌20min同步提取苹果枝条中的根皮苷和根皮素；
(4)提取结束后，将提取溶液温度提高到60℃，并保温10min；
(5)保温结束后，将提取溶液过滤，得滤液和滤饼；
(6)收集滤液，采用液液萃取法分离回收其中的根皮素，得根皮素产品；
(7)收集滤饼(即苹果树修剪枝条粉末提取残渣，约相当于0.9kg苹果树修剪枝条粉末)，与体积为5.4L的混合酶液(含4FPU/mL纤维素酶、7U/mL植酸酶和5U/mL单宁酶，均来自于宁夏夏盛实业集团有限公司)在容器中混合，在室温下60rpm搅拌酶解14小时；
(8)向苹果修剪枝条粉末提取残渣酶解液中加入重量比为1:1的文冠果枝叶粉和构树枝叶粉混合物调节含水量为40％，制备固态发酵基质(约15.58kg)，灭菌后接种黑曲霉ATCC16404孢子悬液(浓度为1.0×106CFU/mL)623mL、产朊假丝酵母AS2.120菌悬液(浓度为1.0×107CFU/mL)467mL和短小芽孢杆菌ACCC11083菌悬液(浓度为1.0×108CFU/mL)187mL，在27℃发酵4天，得木本蛋白饲料产品。
实施例4
(1)收集苹果树修剪枝条，晒干，粉碎至35目；
(2)称取草酸和氯化胆碱按1：2摩尔比混合，在95℃下加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂I(DES-I)，向DES-I中加入去离子水得深共熔溶剂II(DES-II)，去离子水占整个混合物质量的37.5％。
(3)称取1kg的苹果树修剪枝条粉末于提取容器中，向其中加入17.5L的DES-II，混合，在45℃、70rpm条件下搅拌30min同步提取苹果树修剪枝条中的根皮苷和根皮素；
(4)提取结束后，将提取溶液温度提高到80℃，并保温15min；
(5)保温结束后，将提取溶液过滤，得滤液和滤饼；
(6)收集滤液，采用大孔树脂D101分离回收其中的根皮素，得根皮素产品；
(7)收集滤饼(即苹果树修剪枝条粉末提取残渣，约相当于0.9kg苹果树修剪枝条粉末)，与体积为7.2L的混合酶液(含6FPU/mL纤维素酶、9U/mL植酸酶和7U/mL单宁酶，均来自于宁夏夏盛实业集团有限公司)在容器中混合，在室温下45rpm搅拌酶解16小时；
(8)向苹果树修剪枝条粉末提取残渣酶解液中加入重量比为1:1:1的蛋白桑枝叶粉、杜仲枝叶粉和刺槐枝叶粉混合物调节含水量为47％，制备固态发酵基质(约17.03kg)，灭菌后接种长柄木霉ACCC30151孢子悬液(浓度为1.0×106CFU/mL)1022mL、酿酒酵母ACCC21429菌悬液(浓度为1.0×107CFU/mL)852mL和地衣芽孢杆菌ACCC19941菌悬液(浓度为1.0×108CFU/mL)238mL，在32℃发酵4.5天，得发酵木本蛋白饲料产品。
实施例5
(1)收集苹果树修剪枝条，晒干，粉碎至40目；
(2)称取草酸和氯化胆碱按1：3摩尔比混合，在105℃下加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂I(DES-I)，向DES-I中加入去离子水得深共熔溶剂II(DES-II)，去离子水占整个混合物质量的40％。
(3)称取1kg的苹果树修剪枝条粉末于提取容器中，向其中加入19L的DES-II，混合，在47.5℃、75rpm条件下搅拌45min同步提取苹果树修剪枝条中的根皮苷和根皮素；
(4)提取结束后，将提取溶液温度提高到85℃，并保温25min；
(5)保温结束后，将提取溶液过滤，得滤液和滤饼；
(6)收集滤液，采用大孔树脂D101分离回收其中的根皮素，得根皮素产品；
(7)收集滤饼(即苹果树修剪枝条粉末提取残渣，约相当于0.9kg苹果树修剪枝条粉末)，与体积为8.1L的混合酶液(含6FPU/mL纤维素酶、10U/mL植酸酶和8U/mL单宁酶，均来自于宁夏夏盛实业集团有限公司)在容器中混合，在室温下搅拌35rpm酶解20小时；
(8)向苹果树修剪枝条粉末提取残渣酶解液中加入重量比为1:1:1的蛋白桑枝叶粉、文冠果枝叶粉和柠条枝叶粉混合物调节含水量为50％，制备固态发酵基质(约17.79kg)，灭菌后接种长柄木霉ACCC30151孢子悬液(浓度为1.0×106CFU/mL)1067mL、酿酒酵母ACCC21429菌悬液(浓度为1.0×107CFU/mL)889mL和地衣芽孢杆菌ACCC19941菌悬液(浓度为1.0×108CFU/mL)249mL，在34℃发酵5天，得发酵木本蛋白饲料产品。
实施例6
(1)收集苹果树修剪枝条，晒干，粉碎至40目；
(2)称取对甲苯磺酸和乙二醇按1：2摩尔比混合，在110℃下加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂I(DES-I)，向DES-I中加入去离子水得深共熔溶剂II(DES-II)，去离子水占整个混合物质量的30％。
(3)称取1kg的苹果树修剪枝条粉末于提取容器中，向其中加入20L的DES-II，混合，在50℃、80rpm条件下搅拌60min同步提取苹果树修剪枝条中的根皮苷和根皮素；
(4)提取结束后，将提取溶液温度提高到90℃，并保温30min；
(5)保温结束后，将提取溶液过滤，得滤液和滤饼；
(6)收集滤液，采用大孔树脂D101分离回收其中的根皮素，得根皮素产品；
(7)收集滤饼(即苹果树修剪枝条粉末提取残渣，约相当于0.9kg苹果树修剪枝条粉末)，与体积为9L的混合酶液(含6FPU/mL纤维素酶、12U/mL植酸酶和8U/mL单宁酶，均来自于宁夏夏盛实业集团有限公司)在容器中混合，在室温下30rpm搅拌酶解24小时；
(8)向苹果树修剪枝条粉末提取残渣酶解液中加入重量比为1:1:1的蛋白桑枝叶粉、碧根果枝叶粉和柠条枝叶粉调节水分含量为55％，制备固态发酵基质(约17.66kg)，灭菌后接种长柄木霉ACCC30151孢子悬液(浓度为1.0×106CFU/mL)1236mL、酿酒酵母ACCC21429菌悬液(浓度为1.0×107CFU/mL)1059mL和地衣芽孢杆菌ACCC19941菌悬液(浓度为1.0×108CFU/mL)353mL，在35℃发酵6天，得发酵木本蛋白饲料产品。
试验例1
采用HPLC方法测试本发明实施例1-6中步骤(6)根皮素产品中根皮素和根皮苷的含量，并折算出相对于苹果树修剪枝条原料质量的含量，色谱柱为SinoChrom ODS-BP(4.6nm×250mm,5.0μm)，检测波长为280nm，柱温为35℃，流速为1.0mL/min，进样量为20uL，流动相为甲醇：0.1％乙酸溶液＝1：1。精密称取根皮苷和根皮素对照品适量，置于量瓶中，用50％甲醇溶解分别制成标准品溶液，制作根皮苷和根皮素的标准曲线，如附图2所示。测试样品中的根皮素、根皮苷的质量根据附图2的标准曲线进行计算。
其中，滤液中根皮素的含量(mg/g)＝滤液中根皮素的质量(mg)/苹果树修剪枝条粉末的质量(g)；滤液中根皮苷的含量(mg/g)＝滤液中根皮苷的质量(mg)/苹果树修剪枝条粉末的质量(g)。
根皮素产品中根皮素的得率(％)＝根皮素产品中根皮素的质量(mg)/苹果树修剪枝条粉末的质量(mg)*100；根皮素产品中根皮苷的得率(％)＝根皮素产品中根皮苷的质量(mg)/苹果树修剪枝条粉末的质量(mg)*100。
参照《GB 5009.262-2016食品安全国家标准食品中溶剂残留量的测定》考察实施例1-6中步骤(6)根皮素产品的有机溶剂残留情况。
参照《NB/T 11255-2023木质纤维素类生物质原料结晶度的测定》测试本发明实施例1-6中步骤(7)滤饼纤维素的结晶度，并折算出相对于苹果树修剪枝条原料中纤维素结晶度的降低率。
参照《NY/T 3494-2019农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定》测试本发明实施例1-6中步骤(7)滤饼的木质素含量，并折算出相对于苹果树修剪枝条原料中木质素的减少量，进而计算出深共溶溶剂对木质素的剥离率。
上述测定结果如表1所示。
其中，对比例1采用文献(李媛媛.苹果树枝中根皮素的提取纯化、载药体系构建与评价[D].东北林业大学，2019.)中的方法处理实施例1中的苹果树修剪枝条粉末。
对比例2采用CN 102701938 A中实施例1的方法处理本发明实施例6中的等量的苹果树修剪枝条粉末。
对比例3采用CN 112811997 A中实施例1的方法处理本发明实施例6中的等量的苹果树修剪枝条粉末。
表1不同方法得到的提取液和根皮素产品的评价
由表1可以看出，本发明利用酸性DES对苹果树修剪枝条进行同步提取和原位转化，使用溶剂绿色环保，工艺操作简单，获得了较高的根皮素提取率和得率。与对比例相比本发明苹果树修剪枝条中的根皮素和根皮苷提取率明显提高，根皮苷原位转化率可达到100％，酸性DES可循环使用，无有机溶剂残留。此外，酸性DES可以剥离苹果修剪枝条中的木质素、降低纤维素的结晶度，达到酶解、发酵预处理的效果，为后续加工带来了便利。此外，由于大孔树脂回收会损失少量的根皮素，所以根皮素得率略低于实际根皮素含量。
试验例2
参照《GB/T 6432-2018饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》和《GB/T 6434-2006饲料中粗纤维的含量测定过滤法》测试本发明实施例1-6所制备的发酵木本蛋白饲料的粗蛋白和粗纤维含量，同时考察本发明所制备的发酵木本蛋白饲料对猪饲喂前后的采食量及生长情况影响，结果如表2所示。
南京市高淳区某大型猪场，选取猪龄为两个月左右、猪龄相差较近、生长状况基本相同的育肥猪450头，随机分为9组，每组50头，在所饲用的猪饲料(饲料配方：玉米20％、高粱20％、大麦20％、豆粕18％、鱼粉5％、麸皮5％、米糠10％和碳酸氢钙1.7％，外加盐0.3％)中使用本发明实施例1-6所制备的发酵木本蛋白饲料及对比例4、5和6所得样品替代10％的豆粕(替换猪用配合饲料中配方中使用的豆粕量的10％)进行饲养试验(自由饮食)。饲喂观察30天，测定饲喂前后的采食量及生长情况，具体结果见表2。
其中，对比例4采用实施例1中步骤(5)所得滤饼(未酶解、未发酵)。
对比例5采用实施例1中步骤(7)的滤饼酶解液(已酶解、未发酵)。
对比例6采用实施例1中步骤(8)的发酵方法处理实施例1中步骤(5)的滤饼(未酶解、已发酵)。
表2不同方法制备的饲料的指标以及对猪饲喂前后的采食量及生长情况影响
注：对于同一组数据，字母标注相同的值无显著差异(P>0.05)。
由表2可以看出，本发明所制得的发酵木本蛋白饲料粗蛋白含量高于20％，粗纤维量低于18％，符合蛋白饲料的要求；猪食用本发明所制得的发酵木本蛋白饲料后，其日采食量总体高于对比例1～3，日增重量显著高于对比例1～3，腹泻率和料重比显著低于对比例1～3；另外，本发明木本蛋白饲料原料价格低廉易得，制备周期短，未额外添加高价原料，操作简单，适合工业化推广应用。
实施例7
实施例7采用本发明实施例6的方法，不同之处在于：将对甲苯磺酸分别替换成戊二酸、乙酰丙酸、乙酸，并按实施例1的方法进行测试，根皮素含量为13.24mg/g、12.46mg/g、12.75mg/g。
实施例8
实施例8采用本发明实施例6的方法，不同之处在于：将乙二醇分别替换成甜菜碱、山梨醇，并按实施例1的方法进行测试，根皮素含量为11.87mg/g、12.15mg/g。
由实施例7和8可以看出，采用不同的原料制备的深共熔溶剂其效果明显不如本发明的实施例6，说明本发明中的特定深共熔溶剂原料组成十分重要。
实施例9
实施例9采用本发明实施例6的方法，不同之处在于：将对甲苯磺酸和乙二醇的摩尔比调整成1:4或者4:1，并按实施例1的方法进行测试，根皮素含量为14.73mg/g、10.27mg/g。
由实施例9可以看出，不同比例原料制备的深共熔溶剂其效果明显不如本发明的实施例6，说明本发明中的特定深共熔溶剂原料比例在提取中也十分重要。

Claims (10)

1.一种利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的深共熔溶剂，其特征在于，所述深共熔溶剂包括组分A和组分B；所述组分A为对甲苯磺酸、草酸、马来酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸中的一种或几种；所述组分B为氯化胆碱、乙二醇、甘油、木糖醇、葡萄糖、甘露糖、果糖、间苯二酚、邻苯二酚中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的深共熔溶剂，其特征在于，所述组分A和组分B的摩尔比优选为(1～3)：(3～1)。
3.根据权利要求1所述的深共熔溶剂，其特征在于，所述深共熔溶剂由组分A和组分B混合后，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共熔溶剂I，向深共熔溶剂I中加入去离子水得深共熔溶剂II；所述向深共熔溶剂I中加入的去离子水量为深共熔溶剂II总质量的30％～50％。
4.一种利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)收集苹果树修剪枝条，晒干，粉碎；
(2)向苹果树修剪枝条粉末中加入权利要求1所述的深共熔溶剂，混合后进行提取；
(3)提取结束后，将提取溶液升温，并进行保温；
(4)保温结束后，将提取溶液过滤，得滤液和滤饼；
(5)收集滤液，分离回收其中的根皮素，得根皮素产品；
(6)收集滤饼加入酶液，进行酶解反应；
(7)向酶解液中加入其它木本饲料原料混合，制备固态发酵基质，灭菌后接种微生物发酵，得发酵木本蛋白饲料产品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中苹果树修剪枝条粉末与深共熔溶剂的比例为1:10-20(g/mL)；所述提取的方法为搅拌提取，搅拌转速为40～80rpm，温度为30～50℃，时间为10～60min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中提取溶液的温度提高到50～90℃，保温5～30min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(6)中的酶液含有纤维素酶、植酸酶和单宁酶，酶活分别为3～6FPU/mL、6～12U/mL和4～8U/mL；所述滤饼与酶液的混合比例为1:5～10(g/mL)；室温下30～60rpm搅拌酶解12～24小时。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(7)中所述其它木本饲料原料为辣木枝叶粉、构树枝叶粉、蛋白桑枝叶粉、柠条枝叶粉、刺槐枝叶粉、豆腐柴枝叶粉、银合欢枝叶粉、文冠果枝叶粉、杜仲枝叶粉、碧根果枝叶粉、银杏枝叶粉中的一种或几种；所述木本饲料原料的加入量控制在加入后使形成的固态发酵基质含水量在35％～55％之间。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(7)中接种的微生物包括霉菌、酵母菌或者杆菌中的任一种或者多种，所述霉菌包括长柄木霉、黑曲霉、米曲霉中的任意一种或者多种；所述酵母菌包括产朊假丝酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母中的任意一种或者多种；所述杆菌包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的一种或多种；上述微生物扩大培养到对数生长期用无菌水制备孢子或菌悬液进行接种；所述发酵是在温度25～35℃发酵3～6天。
10.一种权利要求4所述的利用苹果树修剪枝条联产根皮素和发酵木本蛋白饲料的方法制备的根皮素产品在食品、药品、日化产品中的应用；制备的发酵木本蛋白饲料产品在畜禽养殖、水产养殖中的应用。
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