CN110742913B - 一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂及其制备方法和应用，该深共熔溶剂是由摩尔比为3‑1:1‑2的丁二醇和乙酰丙酸制备而成。本发明提供的深共熔溶剂作为绿色溶剂，安全无毒，制备工艺简单，成本低，可以作为银杏叶提取物增溶溶剂，可在不影响银杏叶提取物中活性物质稳定性和生物活性的情况下大大提高其溶解度。本发明提供的深共熔溶剂用于银杏叶提取物的增溶，可使银杏叶提取物中的总黄酮醇苷、萜类内酯和原花青素的溶解度与水中溶解度相比分别提高405、638、760倍。本发明提供的深共熔溶剂可作为银杏叶提取物的一种新的溶媒，用于银杏叶提取物液态剂型的制备，实现液态给药。

Description

一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及林源药食资源化学，具体涉及一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂及其制备方法和应用。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)属于落叶乔木，是裸子植物的一种，也是银杏科银杏属的唯一生存种，银杏树的果实和叶子均有很高的药用价值和食用价值。银杏叶提取物(Ginko Biloba Extract,GBE)是以银杏叶为原料，采用适当的溶剂，提取的有效成分富集的一类产品。国际上标准GBE是按Schwabe公司专利工艺生产的 EGb761，其化学组成中黄酮含量为24％，原花青素类为7％，萜类内酯为6％，羧酸类成分13％，儿茶素类2％，非黄酮苷类20％，银杏酸小于5ppm，高分子化合物4％，水分3％，无机物5％，其他3％，即EGb761中总计约87％的化学成分为已知。各种成分是一个整体的有机组成部分，其药理作用是各种相对固定的各组分共同作用的结果。
GBE具有抗炎抗氧化、抗肿瘤等活性作用，可以扩张心脑血管和动脉血管，预防高血压、高血脂、糖尿病等，还可以降低常见眼疾的发病率。以GBE为原料制成的各种制剂，广泛应用于药物、保健品、食品添加剂、功能性饮料、化妆品等领域。由于GBE的重要活性成分黄酮类化合物、萜类内酯类化合物在水中的溶解度很低，因此，尽管市场上GBE制剂已有30多种，但常见剂型还是胶囊、片剂、颗粒剂、滴丸剂、薄膜衣丸、粉针剂、崩解片、分散片、咀嚼片、泡腾片等。以片剂最为常见，也包括分散片、崩解片、咀嚼片、泡腾片等，具有质量稳定、计量准确、生产成本低、服用携带方便等优点，但制作过程中需添加大量的赋形剂、崩解剂等辅料和包衣膜，且在体内崩解缓慢从而相对起效较慢。GBE 制剂中胶囊、颗粒剂也较多，优点在于吸收快，生物利用度高，携带、储存方便，工艺和质量稳定性好，安全性高，但机动性较差，配方固定无法随症增减。片剂、胶囊、颗粒剂等剂型除上述问题外，对口服药物困难、吞咽困难的患者，尤其是老年患者用药也产生很大麻烦。为了克服这些固态剂型的不足之处，近年来，也有口服液、注射液、脂质体等液态剂型研究，这些液态剂型都是以水为主要溶剂，为了增加GBE在水中的溶解度这些液态剂型通常需要使用有机助溶剂、表面活性剂等来增溶，一方面GBE为复合物，含有多种有效成分，有机助溶剂、表面活性剂难以对GBE中的所有成分达到相同的增溶效果，导致最终剂型中各成分的比例发生变化，难以保持原有比例的协同增效作用；另一方面这种增溶方法产生的液态剂型为热力学不稳定体系，稳定性很差；此外，有机溶剂、表面活性剂的增溶效果还是很有限，GBE的有效浓度仍然较低，导致用药体积大。因此，急需开发新的GBE溶解度大、稳定的液态剂型。
2003年，Abbott(Abbott A P,Capper G,Davies D L,et al.Novel solventproperties of choline chloride/urea mixtures.Chemical Communications,2003 14(1): 70-71)首次制备出了由氯化胆碱和尿素这两种固体混合形成的液体溶剂，由此提出了深共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents,DESs)的概念。DESs通常是由一定摩尔比的氢键受体(Hydrogen bond acceptor,HBA)和氢键供体(Hydrogen bond donor, HBD)组合而成的低共熔混合物。DESs的物理化学性质与离子液体(ILs)极其相似，因此也有人把它归为一类新型ILs或ILs类似物，具有低熔点，高溶解度，不易挥发，不易燃，遇热稳定，毒性低等优点。除了具备室温离子液体的诸多优点外，DESs还具有如下特点：(1)DESs原料价格低廉，制备过程中原子利用率达100％，不产生废物，且制备简单，无需纯化，容易实现大规模工业化生产； (2)易生物降解，生物相容性优于离子液体；(3)DESs是多元体系，因此比离子液体更容易进行结构设计和修饰，以适应不同的应用要求。鉴于DESs的诸多优点，以及其低的生态足迹和吸引人的价格，近年来引起了广泛兴趣，其在分离过程、功能材料、电化学和化学反应等领域显示出良好的应用前景。
因此，利用常用的食品原料(配料)或药物辅料作为HBA和/或HBD制备深共熔溶剂，并将其用于GBE的增溶，有可能制备GBE溶解度大且稳定的液态新剂型。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂。本发明提供的深共熔溶剂作为绿色溶剂，安全无毒，制备工艺简单，成本低，可以作为银杏叶提取物增溶溶剂，可在不影响银杏叶提取物中活性物质稳定性和生物活性的情况下大大提高其溶解度。
本发明还提供该用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂的制备方法及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂，其特征在于，由摩尔比为3-1:1-2的丁二醇和乙酰丙酸制备而成。
作为优选，所述丁二醇和乙酰丙酸的摩尔比为2:1。
本发明所述的用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将原料丁二醇、乙酰丙酸干燥除水；
(2)根据制备量的需要，按照摩尔比例称取丁二醇和乙酰丙酸并混合均匀，加热搅拌，直至透明液体形成；
(3)透明液体形成后在室温下保存过夜，观察液体稳定没有固体析出，所得到的深共熔溶剂即可用于银杏叶提取物增溶。
本发明所述的深共熔溶剂进行银杏叶提取物增溶的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物加入干净的容器中，将标准银杏叶提取物加入深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物中，充分震荡，每隔1小时观察一次，待加入的标准银杏叶提取物全部溶解后，继续加入标准银杏叶提取物，直至加入的标准银杏叶提取物无法溶解，以固体析出或悬浮于深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物中，结束溶解，得到银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液；
(2)将银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液高速离心，取上清液(离心后的上清液为银杏叶提取物深共熔溶剂溶液)测定总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素三种银杏叶提取物活性物质的含量，计算银杏叶提取物在所用深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物的溶解度。
此外，以去离子水作为对照，测定银杏叶提取物中总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素三种银杏叶提取物活性物质在去离子水中的溶解度对比，可以计算出深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物的增溶效果。去离子水中的溶解度测定方法与上述银杏叶提取物在DES中的溶解度测定方法步骤相同，只是将DES换成去离子水。
其中，步骤(1)所述的深共熔溶剂-水混合物为深共熔溶剂中添加不同体积分数的去离子水而制成，去离子水的体积分数占整个深共熔溶剂-水混合物的 0-90％。通常使用时，可以根据成本及操作方便或者溶液的粘度等条件选择适宜的水的体积分数。一般地，随着水的体积分数增加银杏叶提取物的溶解度会下降， DES的粘度也会降低。比如根据测定获得DES对银杏叶提取物的增溶能力最大范围后，得到能够溶解的最大值。需要制备一个低溶解度的银杏叶提取物液体剂型，为了降低液体剂型的粘度或者减少DES的使用量以降低溶剂成本，可以添加去离子水进行调整。
其中，步骤(1)所述充分震荡条件为25-30℃，250-280rpm。作为优选，所述充分震荡条件为25℃，280rpm。
其中，步骤(2)所述的高速离心条件为25-30℃，离心力10000-15000g，离心时间为10-30分钟。作为优选，所述的高速离心条件为25℃，离心力12000g，离心时间为20分钟。
本发明所述的银杏叶提取物深共熔溶剂均一溶液剂型的制备方法，通过银杏叶提取物增溶的测定方法所测定获得的深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物对标准银杏叶提取物的溶解能力范围内，称取标准银杏叶提取物加入对应量的深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物中，混合均匀，即可制备不同银杏叶提取物含量的银杏叶提取物深共熔溶剂均一溶液剂型。
其中，所述的混合均匀的方法为震荡，条件为25-30℃，250-280rpm。作为优选，所述震荡条件为25℃，280rpm。
本发明所述用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂在制备银杏叶提取物液态剂型产品中的应用。
本发明中的原料均是市售可得，其中银杏叶提取物如采购于国外需达到欧洲药典(最新版)或美国药典(最新版)的质量要求，如采购于国内需达到中国药典(最新版)的质量要求。
本发明选用银杏叶提取物作为植物源难溶有效部位药物的模型，研究深共熔溶剂对植物源难溶有效部位药物的增溶效果，通过考察银杏叶提取物在各种 DESs中的溶解情况，探究银杏叶提取物在DESs中的稳定性，并考察以DESs 为溶解介质对药效的影响，最终期望筛选出一种最佳DES作为溶剂用于银杏叶提取物液态剂型的制备，实现液态给药。
本发明中使用的丁二醇和乙酰丙酸为常用的食品、药品辅料，安全无毒。丁二醇和乙酰丙酸分子中含有羟基、羧基、羰基等，它们相互之间可以形成氢键，从而使丁二醇与乙酰丙酸制备而成的深共熔溶剂熔点低、流动性好，溶解性能强。此外，丁二醇与乙酰丙酸优选摩尔比为2:1时，不仅能在这两个分子之间形成氢键，而且还能与银杏叶提取物中的黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素分子上的基团形成氢键，从而形成庞大的、稳定的氢键网络，利于银杏叶提取物的溶解。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明制备的深共熔溶剂作为绿色溶剂，安全无毒(毒性研究表明IC50 值是大于2000mg/L)，制备工艺简单，成本低，可以作为银杏叶提取物增溶溶剂。
(2)本发明制备的深共熔溶剂用于银杏叶提取物的增溶，可使银杏叶提取物中的总黄酮醇苷、萜类内酯和原花青素的溶解度与水中溶解度相比分别提高 405、638、760倍。
(3)本发明银杏叶提取物溶解于深共熔溶剂后其稳定性和生物活性没有受到影响。
(4)本发明银杏叶提取物溶解于深共熔溶剂后形成的是热力学稳定的均一溶液，体系稳定性高。
(5)本发明银杏叶提取物溶解于深共熔溶剂实现了银杏叶提取物的增溶，避免了传统方法中有机溶剂、表面活性剂的使用，而且增溶操作非常简便。
(6)本发明提供的一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂可以作为溶剂用于银杏叶提取物液态剂型的制备，实现液态给药。
附图说明
图1为总黄酮醇苷在DESs、DESs-水混合物中的稳定性示意图；
图2为萜类内酯在DESs、DESs-水混合物中的稳定性示意图；
图3为原花青素在DESs、DESs-水混合物中的稳定性示意图；
图4为银杏叶提取物、DES5-2及银杏叶提取物-DES5-2溶液红外光谱叠加图；
图5为银杏叶提取物、DES8-5及银杏叶提取物-DES8-5溶液红外光谱叠加图；
图6为银杏叶提取物HPLC指纹图谱：(a)溶解在甲醇中；(b)溶解在DES5-2 中；(c)溶解在DES8-5中；
图7为HPLC指纹图谱：(a)DES5-2；(b)DES8-5；
图8为银杏叶提取物溶解在70％乙醇及DES5-2中ABTS自由基清除活性示意图；
图9为银杏叶提取物溶解在70％乙醇及DES5-2中DPPH自由基清除活性示意图；
图10为银杏叶提取物溶解在70％乙醇及DES5-2中FRAP铁离子还原能力示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
主要原料与试剂：
Figure BDA0002208755780000051
Figure BDA0002208755780000061
主要仪器设备：
Figure BDA0002208755780000062
银杏叶提取物购自专业生产厂家，按照中国药典(最新版)中的方法测定各项指标，达到中国药典要求，用于增溶研究。
本发明中采用的标准银杏叶提取物购买于徐州恒凯银杏制品有限公司。
实施例1
(1)将原料丁二醇、乙酰丙酸干燥除水；
(2)按照摩尔比例2:1称取丁二醇和乙酰丙酸并混合均匀，在80℃加热搅拌，直至透明液体形成；
(3)透明液体形成后保存在室温过夜，观察液体稳定没有固体析出，所得到的深共熔溶剂可用于银杏叶提取物增溶。
实施例2
(1)将原料丁二醇、乙酰丙酸干燥除水；
(2)按照摩尔比例3:1称取丁二醇和乙酰丙酸并混合均匀，在80℃加热搅拌，直至透明液体形成；
(3)透明液体形成后保存在室温过夜，观察液体稳定没有固体析出，所得到的深共熔溶剂可用于银杏叶提取物增溶。
实施例3
(1)将原料丁二醇、乙酰丙酸干燥除水；
(2)按照摩尔比例1:2称取丁二醇和乙酰丙酸并混合均匀，在80℃加热搅拌，直至透明液体形成；
(3)透明液体形成后保存在室温过夜，观察液体稳定没有固体析出，所得到的深共熔溶剂可用于银杏叶提取物增溶。
实施例4
深共熔溶剂用于银杏叶提取物增溶的测定方法，包括如下步骤：
(1)将1mL深共熔溶剂(实施例1)置于离心管中，加入银杏叶提取物于 25℃，280rpm充分震荡，每隔1小时观察一次，待加入的银杏叶提取物全部溶解后，继续加入银杏叶提取物，直至加入的银杏叶提取物无法溶解，以固体析出或悬浮于深共熔溶剂中，结束溶解，得到银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液；
(2)将银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液在25℃、12000g条件下离心20 min，取上清液稀释，测定总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素测定含量，根据稀释倍数，计算银杏叶提取物在深共熔溶剂中的溶解度。
实施例5
深共熔溶剂用于银杏叶提取物增溶的测定方法，包括如下步骤：
(1)将0.3mL深共熔溶剂(实施例2)和0.7mL去离子水混合后置于离心管中，加入银杏叶提取物于30℃，250rpm充分震荡，每隔1小时观察一次，待加入的银杏叶提取物全部溶解后，继续加入银杏叶提取物，直至加入的银杏叶提取物无法溶解，以固体析出或悬浮于深共熔溶剂-水混合物中，结束溶解，得到银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液。
(3)将银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液在25℃、10000g条件下离心30 min，取上清液稀释，测定总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素测定含量，根据稀释倍数，计算银杏叶提取物在深共熔溶剂中的溶解度。
实施例6
深共熔溶剂用于银杏叶提取物增溶的测定方法，包括如下步骤：
(1)将0.5mL深共熔溶剂(实施例1)和0.5mL去离子水混合后置于离心管中，加入银杏叶提取物于30℃，250rpm充分震荡，每隔1小时观察一次，待加入的银杏叶提取物全部溶解后，继续加入银杏叶提取物，直至加入的银杏叶提取物无法溶解，以固体析出或悬浮于深共熔溶剂-水混合物中，结束溶解，得到银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液。
(2)将银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液在30℃、15000g条件下离心10 min，取上清液稀释，测定总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素测定含量，根据稀释倍数，计算银杏叶提取物在深共熔溶剂中的溶解度。
实施例7
银杏叶提取物深共熔溶剂均一溶液剂型的制备方法，按如下操作：在测定获得的深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物对标准银杏叶提取物的溶解能力范围内 (实施例4、5、6)，称取标准银杏叶提取物加入对应量的深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物中，在30℃、280rpm振荡混合均匀，即可制备不同银杏叶提取物含量的银杏叶提取物深共熔溶剂均一溶液剂型。
实施例8
银杏叶提取物深共熔溶剂均一溶液剂型的制备方法，按如下操作：在测定获得的深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物对标准银杏叶提取物的溶解能力范围内 (实施例4、5、6)，称取标准银杏叶提取物加入对应量的深共熔溶剂或深共熔溶剂-水混合物中，在25℃、250rpm振荡混合均匀，即可制备不同银杏叶提取物含量的银杏叶提取物深共熔溶剂均一溶液剂型。
实施例9
银杏叶提取物中成分复杂，主要包括黄酮类化合物、萜类内酯、原花青素、有机酸类、酚类、聚戊烯醇类、甾体化合物及其他营养与功能元素等。其中黄酮类和银杏萜类内酯是银杏叶发挥多方面独特药理活性的主要化学成分，而且是银杏叶及其提取物和植物药制剂质量控制的重要依据。
本发明采用的银杏叶提取物购自专业生产厂家，按照中国药典(2015版) 中的方法测定各项重要成分的含量，其中黄酮含量约为24％，萜类内酯含量为 6％，原花青素含量占7％，因此选取这三种指标作为检测依据对深共熔溶剂进行筛选。在深共熔溶剂筛选中三种指标的测定方法如下：
实施例4-6中测定总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素测定吸光值参照如下测定方法，根据稀释倍数，计算银杏叶提取物各指标成分在深共熔溶剂中的溶解度。
(1)总黄酮醇苷的测定方法
标准曲线的建立：将芦丁标准品用体积分数70％乙醇配成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.09、0.18、0.27、0.36、0.45、0.54、0.63、0.72、0.81、0.90mg/mL，取0.5mL芦丁标准品溶液置于10mL离心管中，加入5％ (w/w)的NaNO2溶液，摇匀后静置6min，然后加入10％(w/w)Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀后静置6min，再加入4％(w/w)NaOH溶液4mL，70％(v/v) 乙醇4.5mL，用漩涡器混匀后静置20min，用酶标仪在510nm下检测，然后以浓度(x)为横坐标，以吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线。
样品测定：样品测定时取0.5mL待测样品(银杏叶提取物深共熔溶剂溶解液离心后的上清液)，按照上述操作步骤依次加入试剂反应后于510nm下检测。
(2)萜类内酯的测定方法
标准曲线的建立：用体积分数70％乙醇将银杏内酯A配制成1.54mg/mL的标准溶液10mL，然后用移液器分别吸取标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL于10支10mL离心管中，每支离心管加70％(v/v) 乙醇溶液至1.0mL，加入0.4mL预先配置好的碱性羟胺溶液[13.9％(w/w)盐酸羟胺水溶液+3.5mol/L NaOH溶液(1:2)混合，现用现配]，反应5min后加入0.4 mL的3mol/LHCl溶液和0.2mL的6％(w/w)FeCl3溶液，混合均匀，再加入 70％(v/v)乙醇溶液3mL，摇匀。在波长517nm处测定吸光值，然后以浓度 (x)为横坐标，以吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线。
样品测定：样品测定时取1mL待测样品液于10mL离心管中，按照上述操作步骤依次加入试剂反应后在波长517nm处测定吸光值。
(3)原花青素的测定方法
标准曲线的建立：用体积分数70％乙醇将银杏叶原花青素标准品配成0.25 mg/mL的标准液并稀释至相应倍数，使得标准品浓度梯度分别为0.00390625、 0.0078125、0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25mg/mL，取1mL标准液加 3mL显色剂，用漩涡器混匀后在室温下放置10min进行显色反应，之后用酶标仪在640nm处检测，然后以浓度(x)为横坐标，以吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线。
酸性乙醇的配制方法：精确量取6.25mL浓盐酸、6.25mL水于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容至50mL制成酸性乙醇，酸性乙醇需现配现用。
显色剂的配制：将50mg 4-二甲基肉桂醛(DMAC)用酸性乙醇定容至50mL 配制成1mg/mL显色剂。
样品测定：原花青素含量测定选用4-二甲基肉桂醛(DMAC)分光光度法，按照样品量将浓盐酸、水、无水乙醇按照1:1:6的比例精确量取定容后制成酸性乙醇，酸性乙醇需现配现用。将4-二甲基肉桂醛(DMAC)用酸性乙醇定容至刻度配制成1mg/mL浓度作为显色剂。1mL样品液加3mL显色剂，用漩涡器混匀后在室温下放置10min进行显色反应，然后在640nm处测定吸光度值。
三种成分的标准曲线
总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素的标准曲线均以其浓度(x)为横坐标，以吸光度值(y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。
表1三种成分的标准曲线
Figure BDA0002208755780000101
根据表1可以看到R2均在0.999以上，因此表明在此浓度范围内线性关系良好，可以用于后续定量分析。
实施例10
DESs的制备及初筛
以氯化胆碱及多种糖、醇、酸作为HBAs和HBDs，选取各组分比例，制备了一系列DESs(见表2)，制备好的DESs存放在室温下过夜观察它的流动性及外观状态。
表2用于初筛的各种DESs
Figure BDA0002208755780000102
Figure BDA0002208755780000111
Figure BDA0002208755780000121
在表2中共尝试制备了60种DESs，其中以糖类为HBAs时均未能成功制备 DESs(46～48号)，以糖类作为HBDs时，要么会颜色变黄(2～5、28号)，要么未能形成透明液体(17、23～27、30～32、36、41、43、56号)，要么会很粘稠(1号)，结果表明以糖类作为HBA或者HBD时不能形成透明且流动性较好的DESs，即将DES作为医药方面输送介质时应尽可能减少或避免使用糖类组分制备DESs；以酸类为HBAs时，除非其本身为液体，则可能形成流动性较好的DESs(42、45 号)，否则较难形成DESs(30～36、39、44号)或者会比较粘稠(29、38、40号)，这可能是因为摩尔比的选择不合理，故制备时需要根据组分的相对分子质量等因素选择合适的摩尔比；以醇类为组分的DESs则是最容易制备成功的，而且制备好的DESs一般粘度较低(49、50、54、56～60号)，因此液体醇类是DESs制备中较好的选择。
总体来看，常温下为液体的组分无论是属于哪种类别都可以在较低温度下快速形成透明且流动性良好的DESs，而只有单一组分为液体或者两种组分都为固体时，制备的DESs较为粘稠或者无法形成，这说明DESs的形成不仅与组成成分的性质、比例有关，而且与其组分的自身状态也有关系，因此DESs制备时可以适当选择液体单组分或者增加液体组分比例以增加其流动性。由表2中结果，筛选出10个成功制备的透明且流动性良好的DESs进行下一步的溶解实验，为方便后续研究，将其重新编号并列于表3中。
表3 DESs初筛结果
Figure BDA0002208755780000122
Figure BDA0002208755780000131
实施例11
初筛的10个深共熔溶剂的细胞毒性测定
采用MTT法(Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth andsurvival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].Journal ofImmunological Methods,1983,65(1-2):55-63.)，所选细胞为A549细胞和RAW细胞，取处于对数生长期、生长状态良好的细胞10万个接种至96孔板，每组设3 个复孔，另外设阴性对照组(0μg·mL-1)和空白对照组。每种DESs配制4个浓度 (2000mg/L、1000mg/L、500mg/L和250mg/L)，每个浓度设置三组平行。
首先将细胞复苏，将冷冻管从液氮中取出，迅速将其用镊子夹住放入37℃水浴中并不时晃动使其均匀受热，待融化后尽快(约1min)移出37℃水浴，迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒，小心开启瓶盖，将细胞转入含6mL RPMI-1640培养液(含10％小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的离心管中，800g，4℃条件下离心5min，倒掉上清液，向离心管中加入6mL RPMI-1640培养液，反复吹打使细胞充分溶于其中，然后转移到培养皿中，于培养箱(37℃,5％CO2)中培养24h后，更换新鲜培养液，继续培养直到形成单层即可传代，然后以5×104/mL的细胞密度进行种板，6h后将100μL用RPMI-1640 培养液配制的不同浓度的DESs加到含有100μL细胞液的96孔板中。然后在细胞培养箱(37℃,5％CO2)中培养48h后，每孔中加入20μL 4mg/mL的MTT[溴化-3-(4,5-2甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑]溶液，继续培养4h后取出，于1000g， 4℃条件下离心5min，吸出上清液，每孔加200μL二甲亚砜(DMSO)溶液，然后震荡10min后，用酶标仪在540nm波长下测定OD值。
对A549细胞的毒性作用
DESs最大添加量为2000mg/L，然后进行梯度稀释至250mg/L，测定结果如表4所示，其中DES编号为表3中对应编号。
表4 DESs对A549细胞的毒性作用
Figure BDA0002208755780000132
Figure BDA0002208755780000141
所用A549细胞是腺癌人类肺泡基底上皮细胞。由表4可看出，随着DESs 浓度的增加，A549细胞的存活率在降低，表明浓度越高时毒性越大。从总体结果来看，IC50值都是大于2000mg/L的，表明所有的DESs的细胞毒性可以忽略。
对RAW264.7细胞的毒性作用
DESs最大添加量为2000mg/L，然后进行梯度稀释至250mg/L，测定结果如表5所示，其中DES编号为表3中对应编号。
表5 DESs对RAW264.7细胞的毒性作用
Figure BDA0002208755780000142
所用RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞。结果如表5所示，表格中大于100的数据(1、2、4、5、8号)即存活率在100％以上的表明该DESs在不同浓度时不仅没有毒性，而且可以促进细胞生长，其中DESs(1、2、3、4、5、 8号)在浓度为1000mg/L时效果最好，而DESs 6、7、9、10则在浓度为500mg/L 时效果最好，其中DES6在浓度为2000mg/L时表现出明显的抑制作用，说明浓度越高，毒性越大，故用药时需要严格控制剂量，但总体上DESs的IC50值都是大于2000mg/L的，认为无毒可作为输送介质应用于医药方面。
实施例12
银杏叶提取物在初筛的10个DESs中的增溶效果
采用实施例4的深共熔溶剂用于银杏叶提取物增溶的测定方法，以及实施例 9的检测方法，测定银杏叶提取物在表3中10种DESs中溶解度，结果见表6。
表6银杏叶提取物在DESs中溶解度
Figure BDA0002208755780000151
银杏叶提取物在10个DESs中的溶解度如表6所示。其中总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素在水中的溶解度分别为0.142mg/mL、0.027mg/mL、0.032 mg/mL，就总黄酮醇苷指标而言，DESs溶解后的溶解度是水中溶解度的175-860 倍不等，溶解效果最好的是DES8，其次是DES5；就萜类内酯而言，其溶解度分别为水中溶解度的29～1299倍，效果最好的也是DES8，其次是DES5；就原花青素而言，其溶解度分别为水中溶解度的233～1325倍，溶解效果最好的也是 DES8和5。分析DESs的单组分，其中丙二醇和丁二醇作为单组分时溶解度排名较前，其次是乙二醇和乙酰丙酸，最后是乳酸和正丙醇，但相互之间作用较为复杂，并不完全与单独组分有关，与组分之间的相互作用也有关系，选取溶解度较高的DES8、DES5进行下一步实验，同时选择溶解度相对较低的DES1作为参照，考察其经过调制后及摩尔比优化对溶解度的影响。
实施例13
DESs摩尔比对银杏叶提取物溶解度的影响
分别调整实施例12中DES1、5、8的氢键供体和氢键受体放入摩尔比例后制备新的DESs，然后将银杏叶提取物溶解在新制备的DESs后采用实施例9中相同的方法测定其溶解度，结果如表7所示。
表7银杏叶提取物在改变摩尔比后DESs中的溶解度
Figure BDA0002208755780000161
在表7中，DES1在增加HBA即氯化胆碱的比例时，制备好的DESs放置一段时间后会析出，因此继续增加氢键供体即乙酰丙酸的比例，测定结果显示增加乙酰丙酸比例时，总黄酮醇苷呈现先上升后下降的趋势，因其在银杏叶提取物中所占比重(24％)最大，为保证药效，在选择时应以总黄酮醇苷的溶解度提高为首要目标，其次再结合原花青素和内酯，因此选择1:5作为DES1的最佳摩尔比；对于DES5，以2:1的原始摩尔比为中心，分别增加两组分比例时溶解度反而都有不同程度下降，丁二醇/乙酰丙酸摩尔比为4:1时略有提高，但差异不大，因此仍然选取2:1作为最佳摩尔比；对于DES8，在摩尔比为1:3时显示出最大溶解度，总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素的溶解度相比于水中分别提高了950、1353、 1504倍，故而选择1:3作为最佳摩尔比进行下一步实验。
实施例14
DESs/水的比例对银杏叶提取物溶解度的影响
对实施例13中溶解度较高的DES5-2和DES8-5进行含水量的调整，按10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％(v/v)的比例加入水后重新制备DES-水混合物，然后利用过饱和法对银杏叶提取物进行溶解，采用实施例 9中相同的方法测定其溶解度(测定批次不同于实施例12)，结果如表8和9所示。
表8 DES5-2加水后对银杏叶提取物的溶解度
Figure BDA0002208755780000171
表9 DES8-5加水后对银杏叶提取物的溶解度
Figure BDA0002208755780000172
选取DES5-2和DES8-5进行含水量的优化，由表8和表9可以看出，DESs 加水后对三种成分溶解度的有一定的影响。实际应用中可根据需要制备的银杏叶提取物深共熔溶剂液态剂型的浓度(如低溶解度液态剂型)以及降低粘度或者成本需要，适当加水。
实施例15
银杏叶提取物在DESs中的稳定性测定
在室温条件下降解速度会比较慢，升温会加速其降解，因此采用升温加速降解法测定其稳定性，分别测定银杏叶提取物在选出的溶解度较高的两种DESs(不加水的DES5-2和DES8-5)和水-DES(水和DES5-2或DES8-5体积比1:1)混合物(水和DES5-2或DES8-5体积比为1:1)中的降解率。首先打开水浴锅升温至 80℃，期间称取少量银杏叶提取物加入DES或DES-水混合物中(只要保证银杏叶提取物在DES或DES-水中能完全溶解即可，形成均一液体，便于稳定性测定)，配制成一定浓度的溶液，使银杏叶提取物在DES中快速完全溶解，然后在带盖的透明西林瓶中加入5mL以上银杏叶提取物-DES溶液，将其放入80℃的水浴锅中，分别在0、2、4、6、12、24h进行取样测定，根据银杏叶提取物(其中各物质黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素)在0点吸光度值(A)和数小时后吸光度值(B)算出对应浓度A′、B′，则残余浓度百分比为B′/A′×100％。以银杏叶提取物残余率为纵坐标，取样时间为横坐标作图，比较银杏叶提取物在不同溶剂中的稳定性。
总黄酮醇苷在DES5-2、DES8-5及它们分别加入50％水后的稳定性如图1 所示，其中总黄酮醇苷在DES8-5、DES8-5加水及DES5-2加水中都比较稳定， 24h后的残余率分别为92.79％、96.72％和94.51％，在DES5-2中的稳定性略有下降，24h后的残余率为84.11％，总体来说，总黄酮醇苷在两种DESs及DESs 加水混合物中的稳定性都在84％以上，说明总黄酮醇苷在其中还是比较稳定的，其中DES8-5作为溶剂的稳定性是高于DES5-2的，而加水后稳定性比原DES稳定性高，这是因为向DESs中加入水后会使黄酮受热分解从而产生更多的酚羟基，这会使测定的吸光度值偏高，从而显示为稳定性高，但实际操作过程中发现持续高温会使其加水后DES溶解银杏叶提取物的溶液颜色变深，而且会有略微的沉淀出现，而溶解在纯DES中则一直保持澄清透明，其中溶解在DES5-2中时总黄酮醇苷降解较快，原因是DES5-2的pH仅为2.39，而黄酮在强酸强碱条件下都是比较不稳定的。
萜类内酯在DES5-2、DES8-5及它们分别加入50％水后的稳定性如图2所示，可以看出萜类内酯在在DES8-5加水及DES5-2加水中都是比较稳定的，24h后残余率分别为97.94％和97.83％，在DES5-2及DES8-5中的稳定性略有下降， 24h后的残余率分别为93.43％和94.83％，总体来说，萜类内酯在两种DESs及 DESs加水混合物中的稳定性都在93％以上，说明萜类内酯在其中非常稳定，其中pH位于3.5～5.5之间时，银杏内酯是最稳定的。
原花青素在DES5-2、DES8-5及它们分别加入50％水后的稳定性如图3所示，实验原定温度为80℃，但是原花青素在高温条件下降解较快，故将温度调整为 50℃，测定其在6h内稳定性，原花青素在50℃条件下在DESs以及DESs加水中都是比较稳定的，因为原花青素光稳定性较差，所以实验过程中进行了避光处理，从结果来看，银杏叶提取物溶解在DES5-2及其加水后时原花青素稳定性相当而且最好，6h后残余浓度为初始浓度的93％左右，其次是DES8-5加水，略高于DES8-5，分别剩余初始浓度的89.12％和87.96％，这是因为原花青素在酸性条件下更稳定，而pH测试后发现DES5-2的pH为2.39，DES5-2加水的pH 为2.36，DES8-5的pH为4.23，而DES8-5加水的pH为3.57。
综合三个稳定性实验来看，银杏叶提取物溶解在DES中时较稳定，也就是说DES在用于银杏叶提取物增溶时不会影响其稳定性。
实施例16
DESs溶解银杏叶提取物的红外光谱分析
采用VERTEX80/80v傅立叶变换红外光谱仪，仪器开机预热、测试后，扫描背景，然后进行样品扫描。光谱范围400～4000cm-1，扫描32次，银杏叶提取物样品制备方法采用溴化钾压片法，液体样品采用ATR法，测量过程中严格控制水分。此处分析样品分别为银杏叶提取物、DES5-2和DES8-5以及溶解银杏叶提取物的DES5-2溶液和DES8-5溶液(溶液即为实施例13中溶解银杏叶提取物的DES5-2溶解液或DES8-5溶解液经离心获得的上清液)。
在图4中，(a)为标准银杏叶提取物的红外谱图，(b)为DES5-2的红外谱图， (c)为银杏叶提取物-DES5-2溶液的红外谱图，可以看出，将银杏叶提取物溶解在 DES中后，相应的特征峰并没有消失，而是DES谱图和银杏叶提取物谱图的叠加。3845cm-1处吸收频率向低波数移动，吸收强度增加并变宽说明形成了分子内氢键，使银杏叶提取物在DES中趋于稳定。
在图5中，(a)为标准银杏叶提取物的红外谱图，(b)为DES8-5的红外谱图， (c)为银杏叶提取物-DES8-5溶液的红外谱图，可以看出，当银杏叶提取物溶解在 DES8-5中时，在4000～2000cm-1处的特征峰消失了，说明银杏叶提取物溶解在 DES8-5中发生了较强烈分子间相互作用，从而导致银杏叶提取物的特征峰消失。如果银杏叶提取物溶解在DES8-5中发生了较强烈分子间相互作用而产生新的物质，DES8-5则不适合作为溶媒溶解银杏叶提取物，接下来通过指纹图谱分析进行进一步地验证。
实施例17
DESs溶解银杏叶提取物的指纹图谱分析
本实施例所用色谱条件如下：采用依利特ODS-BP(4.6mm×200mm,5μm) 色谱柱，以0.1％甲酸溶液(B)-乙腈(D)为流动相，进样体积10μL，流速1 mL·min-1，检测波长254nm，柱温30℃。梯度洗脱，时间程序见表10。
表10高效液相色谱流动相梯度洗脱条件
Figure BDA0002208755780000201
供试品溶液的制备：精确称取银杏叶提取物50mg，分别加入5mL DES5-2 和DES8-5中振荡溶解，转移至10mL容量瓶中，然后定容至刻度。同样取银杏叶提取物50mg溶于5mL甲醇中定容至10mL作为对照。试样均经0.45μm微孔滤膜过滤后进样色谱分析。
通过HPLC指纹图谱考察银杏叶提取物在DES中是否会发生化学变化，制备5mg/mL的银杏叶提取物甲醇溶液以及DES5-2和DES8-5的溶液，进样分析得到对应的HPLC指纹图谱。图6中(a)为银杏叶提取物溶解在甲醇中得到的指纹图谱，(b)为银杏叶提取物溶解在DES8-5中得到的指纹图谱，(c)为银杏叶提取物溶解在DES5-2中得到的指纹图谱，为考察纯DES在该条件下会不会有杂峰出现，将纯DES作为样品进样测定，图7中(a)为DES5-2对应的色谱图，(b)为 DES8-5对应的色谱图，其中前八分钟的峰视为溶剂峰，另DES8-5中保留时间为11.8和12.6分钟、28.6分钟、35、36.2、37.2、47、50.8分钟的峰和DES5-2 中保留时间为35、47、50.8分钟的峰均为溶剂峰，将分别以甲醇、DES5-2和 DES8-5溶解的银杏叶提取物溶液HPLC指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行分析，扣除溶剂峰的影响，选取其中41个峰(见图6)作为共有峰，并将其作为对照进行色谱峰匹配，计算分析得色谱图相似度均＞0.9，说明银杏叶提取物溶解在DESs中的指纹图谱与溶解在甲醇中的指纹图谱是基本一致的，说明银杏叶提取物溶解在DESs中时并未发生化学变化。这个结果说明图5中银杏叶提取物溶解在DES8-5中导致红外光谱分析时特征峰的消失，只是分子间产生了强烈的相互作用，这种作用并没有产生新的物质。但是，在不确定这种强烈的相互作用是否会影响银杏叶提取物的功效的情况下，还是不选DES8-5作为增溶溶剂，选择DES5-2更为合适。
实施例18
DES5-2溶解银杏叶提取物的体外抗氧化活性
银杏叶提取物具有较广泛的抗氧化活性，具有清除DPPH自由基、ABTS自由基以及铁还原能力。DES5-2作为新的给药途径溶解银杏叶提取物时，应保证其抗氧化活性不受影响，因此通过测定DES5-2溶解银杏叶提取物的抗氧化活性来评价DES5-2是否可作为一种新的溶媒。具体方法如下：
(1)DES5-2溶解银杏叶提取物清除ABTS自由基活性
将7mmol/L的ABTS(2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))溶液与2.45 mmol/L的K2S2O8溶液按1:1(v/v)混合，混合物于暗处静置反应12～16h产生ABTS自由基。ABTS使用前，用甲醇稀释至稀释液在734nm处吸光值为 0.7±0.02。20μL银杏叶提取物DES5-2溶液中加入180μL稀释液，反应6min 后，在734nm处检测吸光值。
ABTS自由基清除抑制率＝(A0-A1)/A0×100％
其中，A0为空白样的吸光值，A1为样品的吸光值。
(2)DES5-2溶解银杏叶提取物清除DPPH自由基活性
在20μL不同浓度的银杏叶提取物DES5-2溶液中加入180μL的0.2mmol/L 的DPPH(1.1-二苯基-2-苦肼基)乙醇溶液(现配现用)，摇匀，暗处反应30min 后，在515nm处检测吸光值。
DPPH自由基清除抑制率＝(A0-A1)/A0×100％
其中，A0为空白样的吸光值，A1为样品的吸光值。
(3)DES5-2溶解银杏叶提取物FRAP铁离子还原能力
20μL不同浓度的银杏叶提取物DES5-2溶液中加入180μL的FRAP溶液，置于37℃水浴中反应15min后在593nm处测定吸光值。
FRAP溶液的配制：0.3mol/L的乙酸钠缓冲溶液、10mmol/L的TPTZ溶液、 20mmol/L的三氯化铁溶液以10:1:1的比例混合，现用现配。
清除ABTS自由基活性研究：
ABTS法测定总抗氧化能力的原理是，ABTS在适当的氧化剂作用下会被氧化成绿色的ABTS+，而有抗氧化物时则会抑制ABTS+的产生，在734nm时测定所产生的ABTS+的吸光度，根据IC50值来衡量抗氧化能力的大小，IC50值越小，表明抗氧化能力越强。银杏叶提取物具有较强的清除ABTS自由基的能力，而且其清除能力与银杏叶提取物浓度呈现出线性关系，浓度越高时，清除能力越强，将银杏叶提取物溶解在DES5-2及70％乙醇中不同浓度梯度对ABTS自由基的清除能力如图8，其中DES5-2溶解的银杏叶提取物的IC50值为0.2mg/mL，而70％乙醇溶解的银杏叶提取物的IC50值为0.14mg/mL，说明银杏叶提取物溶解于 DES5-2中也有很好的抗氧化活性。
清除DPPH自由基活性评价研究：
DPPH在有机溶剂中为稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，可以接受一个电子或氢离子，在波长为517nm下有最大吸收。当存在自由基清除剂时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，从而导致吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度值越低表明抗氧化性越强。将银杏叶提取物溶解在DES5-2及70％乙醇中不同浓度梯度对DPPH自由基清除能力如图9，当用DES5-2溶解银杏叶提取物浓度为0.45mg/mL时，DPPH自由基清除清除率达到50％左右，而70％乙醇溶解银杏叶提取物浓度在0.32mg/mL时，DPPH自由基清除清除率达到50％左右，说明银杏叶提取物溶解于DES5-2中也有很好的抗氧化活性。
银杏叶提取物FRAP铁离子还原能力评价：
FRAP法易于操作、反应快速、重复性好，是目前食品和医药领域测定样品抗氧化能力的常用方法之一，FRAP法测定总抗氧化能力的原理是在酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可评价样品的总抗氧化能力，浓度越高，吸光度值越大，还原力越强，即抗氧化能力越强，将银杏叶提取物溶解在DES5-2 及70％乙醇中测定其还原能力，由图10可看出，浓度与吸光度值是呈线性关系的，银杏叶提取物溶解在DES5-2中浓度由0.04mg/mL升至0.2mg/mL时，吸光度由0.1753升至0.5467，而溶解在70％乙醇中时，同样浓度下吸光值则从0.1522升至0.6779，说明银杏叶提取物溶解于DES5-2中也有很好的抗氧化活性。
综合3个体外抗氧化实验结果来看，将银杏叶提取物溶解于DES5-2中具有很好的抗氧化活性。
实施例19
DES5-2溶解银杏叶提取物的生物活性
HepG2细胞株常规培养于DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育。将处于对数生长期的HepG2、MCF-7细胞用0.5％的胰蛋白酶消化，用含胎牛血清的培养基制成105/mL的细胞悬液，计数后以每孔100μL接种于96孔细胞培养板中，每组设3个复孔，培养6h后取出100μL HepG2、MCF-7细胞，进行以下实验。空白组：加入DMEM培养基100μL；溶媒组：分别加入含25 mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L银杏叶提取物的DES5-2溶液和DMSO的细胞培养液100μL；每个浓度设3个复孔，各组均置于37℃、5％ CO2培养箱中培养48h，每孔中加入20μL 4mg/mL的MTT溶液，然后再放入培养箱中培养4h后，于1000g，4℃条件下离心5min，吸出上清液，每孔加 200μL DMSO，震荡10min后，用酶标仪在540nm波长下测定OD值。
表11 DES5-2溶解银杏叶提取物对癌细胞的抑制率
Figure BDA0002208755780000231
根据陈佳等及史琳等的文献报道(银杏叶提取物GBE50对HepG2细胞甘油三酯代谢的影响[J].中国药理学通报,2010,26(7):961-964；银杏叶提取物对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及Caspase-3表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013, 19(17):262-265.)，银杏叶提取物会影响HepG2细胞代谢而且可以抑制MCF-7 细胞增殖，故本实施例选取这两种细胞进行DES5-2溶解银杏叶提取物生物活性的考察(溶解方法采用实施例7)，选择DMSO为对照溶剂，定义纯DES5-2对细胞的抑制率为0，即扣除溶剂对细胞的影响后的抑制率分别如表11中所示，可以看出随着银杏叶提取物浓度的增加，对细胞的抑制率也是不断增加的，说明银杏叶提取物可以抑制肿瘤细胞的增殖，其中以DES5-2作为溶剂时的抑制率比较高，浓度为400mg/L时对HepG2细胞生长抑制率可达到(80.54±2.45)％，对 MCF-7细胞生长抑制率也在79％左右，而溶解在DMSO中时抑制率则分别为 (75.28±2.17)％和(38.92±1.51)％，随着银杏叶提取物浓度的降低，抑制率也是不断降低的，但当浓度为25mg/L时，不管是溶解在DES中还是DMSO中，对两种细胞的抑制率都是小于10％的，说明低浓度时抑制效果并不明显，故用药时应选择合适浓度。综合来看，以DMSO为溶媒溶解的银杏叶提取物对细胞的抑制率低于用DES5-2溶解时的抑制率，说明DES5-2溶解银杏叶提取物不仅没有影响银杏叶提取物的生物活性，而且更有利于银杏叶提取物生物活性的发挥。
综上，本发明筛选出的10个DESs进行银杏叶提取物的溶解，然后选择其中溶解性好的DESs进行溶解条件的优化，随后对优化出的最终DES5-2溶解银杏叶提取物的稳定性、抗氧化活性、生物活性进行了研究，同时考察了银杏叶提取物溶解在DES中的溶液的红外光谱和指纹图谱，研究结果如下：
(1)筛选出对总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素综合溶解度较高的DES5和 DES8，其中DES5可分别将黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素的溶解度提高405、 638、760倍，DES8可分别将黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素的溶解度提高860、 1299、1325倍，摩尔比优化后DES5仍选择原摩尔比为2:1，DES8选择最优摩尔比为1:3，优化后三种成分溶解度提高倍数分别为950、1353和1504。
(2)稳定性测定结果表明总黄酮醇苷、萜类内酯、原花青素在6h内基本稳定。红外光谱分析表明DES8-5对银杏叶提取物产生影响，所以选择DES5-2作为银杏叶提取物增溶溶剂。
(3)体外抗氧化活性研究表明，DES5-2溶解的银杏叶提取物的抗氧化活性包括ABTS清除能力、DPPH自由基清除能力及FRAP铁离子清除能力依然很好。
(4)生物活性研究结果显示银杏叶提取物呈剂量依赖性抑制癌细胞的增殖，以DMSO为溶媒溶解的银杏叶提取物对细胞的抑制率低于用DES5-2溶解时的抑制率，说明DES5-2并没有影响银杏叶提取物的生物活性。
本发明中银杏叶提取物的增溶选取丁二醇/乙酰丙酸，摩尔比2:1为最佳 DES，可使总黄酮醇苷、萜类内酯和原花青素的溶解度与水中溶解度相比分别提高405、638、760倍，故可以用作溶媒用于银杏叶提取物液态剂型的制备，实现液态给药。

Claims (2)

1.一种用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂在制备银杏叶提取物液态剂型产品中的应用，所述用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂由摩尔比为2:1的丁二醇和乙酰丙酸制备而成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于银杏叶提取物增溶的深共熔溶剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将原料丁二醇、乙酰丙酸干燥除水；
（2）根据制备量的需要，按照摩尔比例称取丁二醇和乙酰丙酸并混合均匀，加热搅拌，直至透明液体形成；
（3）透明液体形成后在室温下保存过夜，观察液体稳定没有固体析出，所得到的深共熔溶剂即可用于银杏叶提取物增溶。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107759556A (zh) * 2017-11-02 2018-03-06 南京林业大学 一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂及其制备方法和提取方法
CN107789376A (zh) * 2017-11-02 2018-03-13 南京林业大学 一种提取银杏叶活性成分的两相深共熔溶剂及其制备方法和提取方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107759556A (zh) * 2017-11-02 2018-03-06 南京林业大学 一种提取银杏叶原青花素的深共熔溶剂及其制备方法和提取方法
CN107789376A (zh) * 2017-11-02 2018-03-13 南京林业大学 一种提取银杏叶活性成分的两相深共熔溶剂及其制备方法和提取方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Novel Deep Eutectic Solvent Based on Levulinic Acid and 1,4-Butanediol as an Extraction Mediafor Bioactive Alkaloid Rutaecarpine;Yue-Yue Si, et al;《Processes》;20190324;第7卷(第171期);第1-17页，尤其是第1页摘要，第9页3.6节 *
Yue-Yue Si, et al.Novel Deep Eutectic Solvent Based on Levulinic Acid and 1,4-Butanediol as an Extraction Mediafor Bioactive Alkaloid Rutaecarpine.《Processes》.2019,第7卷(第171期),第1-17页，尤其是第1页摘要，第9页3.6节. *

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