CN107708665A - 用于皮肤病学用途的药用四环素组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供局部用组合物和制备与使用所述组合物的相关方法。在第一方面，所述局部用组合物包含在非水性溶剂中的米诺环素、镁盐和亚硫酸盐化合物。在另一方面，所述局部用组合物包含四环素类药物、镁源、一元脂肪醇和多元醇，其中(i)一元脂肪醇与丙二醇之间的重量比在1:1‑99:1范围内，并且(ii)所述四环素类药物溶解在所述局部用组合物中。

Description

用于皮肤病学用途的药用四环素组合物

相关申请的交叉参考

本申请药物下述的优先权利益：(i)于2016年3月4日提交的美国临时专利申请号62/304,119；(ii)于2016年1月15日提交的美国临时专利申请号62/279,654；(iii)于2015年12月13日提交的美国临时专利申请号62/266,650；(iv)于2015年11月4日提交的美国临时专利申请号62/251,001；(v)于2015年10月22日提交的美国临时专利申请号62/245,262；和(vi)于2015年3月23日提交的美国临时专利申请号62/137,216，它们分别通过引用完全结合在本文中。

领域

本公开内容整体上涉及药物组合物和制备所述组合物的方法，以及相关的应用。应用包括，例如，特别是治疗多种皮肤病学病症和疾病。更具体地，本公开内容涉及稳定的组合物，例如，其包含四环素类活性成分，镁源，如镁盐，一元脂肪醇，和多元醇，并且涉及用于制备和使用所述组合物的相关方法。还提供稳定的组合物，例如，其包含在非水性溶剂中的米诺环素(minocycline)、镁盐和亚硫酸盐化合物，以及用于制备和使用所述组合物的相关方法。

背景

一些四环素类抗生素为人所知已超过50年，但是，由于在产生商业成功的产品的同时必须解决的多个挑战，还存在相对少量商业开发的包含这些抗生素的局部用组合物。

四环素类药物，并且特别是米诺环素，由于其抗炎性作用，可用于治疗痤疮。其用于治疗痤疮的用途已经得到了表现出良好功效的口服递送的组合物的证实。然而，四环素类药物的系统递送通常伴有不利的副作用，诸如腹泻(diarrhea)、腹部绞痛(abdominalcramps)和头晕(dizziness)。高系统水平的药物通常导致更大的系统性副作用。例如，可以通过使用将药物主要递送到皮肤而不是主要是系统性递送的局部用组合物而有利地减少这些。不幸的是，四环素类药物如米诺环素的局部制剂还具有对皮肤染色的潜能，尤其是在数周的日常应用后。

药物的真皮内或局部施用涉及药物透过角质层进入而用于皮肤或局部皮肤作用；即，药物的药理学作用局限在药物渗透和沉积的皮内区域。优选地，真皮内吸收伴有很少的或没有系统性吸收或积聚。药物的真皮内吸收涉及药物从应用工具分配到角质层、药物通过角质层扩散和药物从角质层分配到表皮。与其相反，经皮施用涉及药物通过皮肤转运，使得在系统性血液循环中得到处理量的所述药物。

实现药物透过角质层递送和大部分药物保持在皮内从而使其不以显著的量进入血流的局部用组合物对于设计是具有挑战性的，并且需要创新性的方法。一些因素决定了皮肤或皮肤特定层对局部应用的药物的渗透性。这些因素包括皮肤的特征、药物的特征(例如，其尺寸(分子量或分子体积)、亲脂性/亲水性、极性等)、应用的药物的剂量、要应用的组合物的浓度和体积、药物和递送赋形剂之间的相互作用、药物与皮肤之间的相互作用、和药物与皮肤在存在递送赋形剂的成分的条件下的相互作用。由于药物的局部递送涉及多种因素，通常认为能否实现药物的皮内递送是不能确定的。因此，局部递送，尽管从患者的便利性和药物递送观点来看是合乎需要的，对于多种化合物是极大不成功的，所述化合物包括四环素，如相对少数的药物被核准用于局部递送所证实的。

与四环素类抗生素的局部施用相关的一个重要的问题是鉴别溶剂系统，在所述溶剂系统中，所述四环素类药物是稳定的、充分可溶的、并且能够渗透到目标组织或体液中，如皮脂中。

多种四环素类药物通过与亲水性氧化剂、还原剂或过氧化剂和/或水接触或溶解在其中而易于降解。如在美国专利申请公布号2014/0147504中所述，开发米诺环素局部制剂的主要挑战是其化学性质——该药物在溶液形式下部稳定并且还对湿度、温度和光敏感。已经开发了一些组合物来解决与该药物相关的挑战。这种不稳定性适用于所有目前可用的四环素类药物。

Salman等人在美国专利申请公布号2014/0147504中记载了一种局部用组合物，其中四环素悬浮在不溶解或最低程度溶解四环素的液体介质中。尽管记载这种方法限制四环素的降解，但是其中液体介质不溶解该药物的组合物不是优选的，原因在于在易于渗透皮肤的制剂内药物的不稳定性。由于施用到皮肤的多种产品将进行快速挥发，可能的是，所述药物在其应用后保留在皮肤表面上。这样的固体药物形式将不是生物可利用的。

用于保持四环素药物的效力的另一种方法是使其与潜在的活性剂分开，诸如用药物的包衣或物理包封，从而限制其与潜在的活性剂的相互作用/对潜在的活性剂的暴露。物理包封可以通过宽泛种类的技术实现。例如，Heggie等人记载了用于包衣米诺环素颗粒的组合物，使得所述颗粒悬浮在溶剂中，而不是溶解在溶剂中(美国专利申请公布号2013/0195986)。然而，这种方法具有与上述关于使用不溶解药物的溶剂系统所述的相同的多种问题。

一些提议的溶剂系统，诸如软膏，由于其具有油腻腻的感觉，对于治疗痤疮，在商业上不可行。甚至更坏的，一些这样的物质可能恶化其设计用于治疗的病况，诸如使用引起粉刺的物质作为设计用于局部治疗痤疮的组合物的递送赋形剂。另外，一些强疏水性物质，如凡士林油、石蜡和/或脂肪醇能够产生限制药物向皮肤渗透的闭塞性障碍。另外，一些疏水性物质具有高粘性，这限制药物向皮肤内的扩散，由此降低药物的生物利用度并限制其效用。

设计用于非局部区域的组合物具有不同的限制条件，使得开发用于非局部应用的方法或组合物可能不适合用于局部应用。例如，用于静脉内注射的溶液需要水系组合物，从而与进入血流的注射相容。然而，由于此类注射通常在医院和医师办公室实施，对过期日期更严格控制和与药房联系密切，控制的存储条件，如冷藏，与通常由患者保存的局部用组合物相比，可能更适合静脉内递送的组合物。美国专利申请公布号2014/0194393中，Griffith等人提议使用pH改性剂、氯化镁和抗氧化剂稳定水性米诺环素组合物。然而，对于示例性的米诺环素组合物，记载了在37℃暗存储条件下2周后最大仅有84.32％的稳定性。这种稳定性水平对于大部分的药物应用是不充分的。其中所述的其他组合物的稳定性不同，但是通常强水性环境不促进四环素类药物的稳定性。

局部应用的药物组合物通常旨在将药物均一地递送到所述组合物所涂覆的皮肤组织内的一个或多个深度。然而，一些皮肤病学病况和疾病的细菌，如痤疮的疮疱丙酸杆菌(P.acnes)细菌，主要位于某些类型的组织中，如富含脂质的组织中，包括皮脂细胞，或体液中，如皮脂中。对于此类病况和疾病，如果局部药物组合物能够被优先递送到这些细菌集中的位置，是更有效的。

对于稳定活性四环素类药物同时允许在将所述药物递送至目标组织(如皮脂腺)或目标体液(如皮脂)的递送赋形剂中充分的溶解性的局部应用的组合物存在需求。所述组合物应该保持高程度的药物功效，即，活性，提供向皮肤、皮脂和/或皮脂腺充分量的渗透，以足以抑制这些区域内的疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(P.acnes)细菌，并且不应该在重复应用后明显地染色皮肤。已经提供了满足这些标准中的一条或多条的一些组合物，然而，提供以单种组合物满足这些标准中的全部或大部分的组合物是合乎需要的。

简述

本公开内容克服了与当前含有四环素类药物的局部用组合物相关的一些或多种限制性。在第一方面，本文提供一种局部用组合物，其包含在非水性溶剂中的米诺环素、镁盐和亚硫酸盐化合物。在一个或多个优选的实施方案中，所述组合物用于局部施用。

在一个或多个与第一方面相关的实施方案中所述非水性溶剂包含一元脂肪醇。

在一个或多个另外的实施方案中，所述非水性溶剂包含一元脂肪醇和多元醇。在一些相关的实施方案中，一元脂肪醇与多元醇之间的重量比在1:1-99:1的范围内。

在一个或多个另外的实施方案中，所述组合物包含比多元醇更多百分比重量的一元脂肪醇。例如，在一个或多个相关的实施方案中，一元脂肪醇与多元醇按重量计的w/w比在约2:1-10:1范围内。

在一个或多个另外的实施方案中，所述米诺环素溶解在所述非水性溶剂中。

在一些实施方案中，镁盐与米诺环素的摩尔比在约2:1-100:1的范围内。

在与前述任一项或多项相关的一些实施方案中，所述镁盐是氯化镁，或是具有比氯离子更软的平衡离子的米诺环素盐。

在一些其他实施方案中，所述一元脂肪醇选自由下述组成的组：乙醇、异丙醇、丙醇、叔丁醇或它们的组合。在一些具体的实施方案中，所述一元脂肪醇是乙醇。

在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物包含约0.1重量％-约4重量％的米诺环素。

在一个或多个另外的实施方案中，当在密闭玻璃瓶中在40℃存储4周的时间时，所述局部用组合物表现出每周小于1.0％的4-表-米诺环素相对浓度增加。在一个或多个另外优选的实施方案中，当在密闭玻璃瓶中在40℃存储4周的时间时，所述局部用组合物表现出每周小于0.70％的4-表-米诺环素相对浓度增加。

在一些实施方案中，当在密封容器中在25℃和60％相对湿度下存储12个月时，所述局部用组合物包含小于7％的米诺环素降解产物，其中所述降解产物是4-表-米诺环素。

在一个或多个另外的实施方案中，所述多元醇是C3-C8二醇或三醇。在某些具体的实施方案中，所述多元醇是丙二醇。

在一个或多个另外的实施方案中，所述亚硫酸盐化合物是亚硫酸盐或有机亚硫酸盐。在一个或多个示例性的实施方案中，所述亚硫酸盐化合物是亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、或偏亚硫酸氢盐化合物。在一个或多个具体的实施方案中，所述亚硫酸盐化合物是无机亚硫酸盐。在一个或多个另外的实施方案中，所述亚硫酸盐是含有选自钠、钾、钙和镁的无机阳离子的无机亚硫酸盐。

在一个或多个另外的实施方案中，所述亚硫酸盐化合物是有机亚硫酸盐。在一个或多个相关实施方案中，所述亚硫酸盐是亚硫酸的酯。示例性的有机亚硫酸盐包括，例如，亚硫酸的酯、丙烯酸亚硫酸酯、和环状亚硫酸酯。在一些具体的实施方案中，所述有机亚硫酸盐是亚硫酸乙酯、对-甲苯基亚硫酸酯或亚硫酸异丙酯。

在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物包含约0.005重量％-约3.0重量％的亚硫酸盐化合物。在一个或多个具体的实施方案中，所述亚硫酸盐选自由亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠组成的组。

在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物包含少于约3重量％的水。在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物包含少于约2重量％的水。

在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物还包含精油。在一个或多个相关的实施方案中，所述精油是1,8-桉树脑。在一些实施方案中，所述局部用组合物包含约0.01-5重量％的1,8-桉树脑。

在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物包含增稠剂。在一个或多个相关的实施方案中，所述增稠剂是羟丙基纤维素。

在一些另外的实施方案中，所述组合物不是乳液剂和/或不包含纳米颗粒或微粒。

在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物在与水以1:9的重量比混合时具有3-6的有效pH。在一些实施方案中，所述局部用组合物在与水以1:9的重量比混合时具有约3.8-约5.0的有效pH。

在一个或多个另外的实施方案中，当在28天的时间里每日对大鼠施用时，所述组合物是非刺激性的，例如，非刺激性的组合物通常不刺激皮肤或引起过敏反应。

在一些实施方案中，所述组合物在密封容器内在40℃陈化(aging)4周后不表现出明显的颜色变化。在与前述相关的一些具体的实施方案中，没有明显的颜色变化是在3维RGB空间(3-dimensional RGB space)距离小于20的颜色变化，其中每个值以0-255范围测量，并且3维RGB空间中的距离按照下式计算：距离_RGB＝((ΔR)²+(ΔG)²+(ΔB)²)^0.5。

在另一个(或第二)方面，提供一种组合物，其包含四环素类药物或其盐或溶剂化物、镁源(如镁盐)、一元脂肪醇和多元醇，其中(i)一元脂肪醇与多元醇的重量比在1:1-99:1范围内，并且(ii)四环素类药物溶解在所述局部用组合物中。优选地，所述组合物用于局部施用。

在与第一或第二方面相关的一些实施方案中，所述镁源有效稳定所述四环素药物。

在与第二方面相关的一个或多个实施方案中，镁(来自镁源)与四环素药物的摩尔比在约2:1–约100:1的范围内。在一些相关的实施方案中，所述镁源是具有氯平衡离子或比氯离子软的离子的镁盐。

在一个或多个另外的实施方案中，所述四环素类药物是米诺环素，并且所述镁源有效稳定米诺环素，使得在将所述组合物在密封容器中在25℃和60％相对湿度下存储12个月后，所述组合物含有少于7％的米诺环素降解产物，其中所述降解产物是差向异构体4-表-米诺环素。例如，在上述存储条件下，米诺环素与差向异构体基于w/w的比例大于约13:1。优选地，米诺环素与差向异构体基于w/w的比例大于约15:1。

在一些另外的实施方案中，在25℃和60％相对湿度下存储12个月后，至少90％的米诺环素保持为其活性形式(即，非差向异构体化形式)。

在所述组合物的一个或多个实施方案中，所述一元脂肪醇在室温是液体。在一个或多个另外的实施方案中，所述一元脂肪醇选自由乙醇、异丙醇、丙醇、叔丁醇和它们的组合组成的组。

在一些另外的实施方案中，所述一元脂肪醇是挥发性一元脂肪醇。

在与多元醇组分相关的一些另外的实施方案中，所述多元醇在室温是液体。在一个或多个具体的实施方案中，所述多元醇是C3-C8二醇或三醇。在一些更具体的实施方案中，所述多元醇是丙二醇。

在涉及多元醇的一些另外的实施方案中，所述多元醇不是甘油。

在所述组合物的一些具体的实施方案中，所述镁源选自由下述组成的组：氯化镁，硫酸镁，水杨酸镁，以及它们的水合物和组合。

在一个或多个优选的实施方案中，所述四环素类药物是米诺环素或其盐或溶剂化物。例如，组合物可以包含约0.01-10重量％的米诺环素或其盐或溶剂化物。在一个或多个优选的实施方案中，所述米诺环素不是水合物。

在其他实施方案中，所述四环素类药物选自由下述组成的组：四环素，替吉环素(tigecycline)，赖甲环素(lymecycline)和多西环素(doxycycline)，以及它们的盐或溶剂化物。

在另一个实施方案中，所述四环素类药物是fluorocycline。

在一个或多个另外的实施方案中，所述组合物还包含增稠剂。在一些具体的实施方案中，所述增稠剂是羟丙基纤维素。

在所述组合物的一些另外的实施方案中，所述组合物在25℃具有75-10,000厘泊范围内的粘度。在第二方面的一些另外的实施方案中，所述组合物包含一种或多种另外的添加剂，诸如，例如，抗氧化剂、增稠剂、着色剂或其他适当的添加剂。

在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物不是乳液剂。

在一些另外的实施方案中，所述局部用组合物不包含纳米颗粒或微粒。

在某些实施方案中，所述局部用组合物是非水性的。在备选的实施方案中，所述局部用组合物是无水的。

在一个或多个另外的实施方案中，所述组合物在以1:9的重量比与水混合时具有3-6的有效pH。

在一个或多个另外的实施方案中，所述组合物在以1:9的重量比与水混合时具有约3.8至约5.0的有效pH。

在一些实施方案中，第一和第二方面及相关实施方案所述的组合物到离体人面部皮肤的渗透效率乘以所述局部用组合物中四环素类药物的浓度超过所述药物针对目标组织或目标体液中的目标细菌的最低抑菌浓度(MIC)。在一个或多个相关的实施方案中，所述目标细菌是疮疱丙酸杆菌。

在一些另外的实施方案中，向离体人面部皮肤的渗透效率超过5％。在一些另外的实施方案中，向离体人面部皮肤的渗透效率在5％-30％的范围内。在一些实施方案中，四环素类药物的渗透效率超过5％，更优选地超过8％，或更优选地超过10％。在一些实施方案中，所述四环素类药物的渗透效率在5％-30％的范围内，或在5％-25％的范围内，或在5％-10％的范围内，或更优选地在10％-30％的范围内。

在一些另外的实施方案中，所述组合物在施用到在体皮肤区域上时在少于60秒内变干。

在所述组合物包含多元醇和1,8-桉树脑的一些另外的实施方案中，当每周施用至少3次时，所述多元醇和1,8-桉树脑的组合有效防止皮肤由于两周以上的延长使用而脱皮和变得极度干燥。

在一个或多个另外的实施方案中，当每天在体施用到人或大鼠皮肤区域达2周时不将皮肤染色。

在一些另外的实施方案中，当每天在体施用到人或大鼠皮肤区达2周时，例如，当所述组合物包含约0.1％(w/w)-约10％(w/w)的四环素类药物时，所述组合物对皮肤组织无刺激性。

在一个或多个另外的实施方案中，本文提供的组合物直接施用到皮肤上。在一个或多个另外的实施方案中，本文提供的组合物施用到角膜或结膜上。

本文还提供治疗人受试者中的痤疮的方法，所述方法包括将有效量的本文提供的组合物局部施用到人的外部上皮体表面上。

在另一方面，提供治疗人中响应于利用四环素类药物的治疗的病况或疾病的方法，其中所述方法包括至少每天向人体的外部上皮表面局部施用本文提供的组合物达至少1周的时间。在一个或多个相关的实施方案中，所述病况或疾病是皮肤病学病况或疾病，并且所述施用步骤包括每天一次或两次将所述局部用组合物涂覆到皮肤上达约6周-约52周的时间。

在一个或多个另外的实施方案中，所述皮肤病学病况或疾病是痤疮或酒渣鼻(rosacea)。在一个或多个具体的实施方案中，所述痤疮是寻常痤疮(acne vulgaris)。在另一个或多个备选的实施方案中，所述痤疮是暴发性痤疮(acne fulminans)。

在一个或多个与治疗患有痤疮的受试者的方法相关的另外的实施方案中，当每日施用达约6周-约52周的时间时，所述方法使炎性损伤计数有效减少至少50％或至少70％。在一个或多个实施方案中，当向初始的根据研究者综合评估(Investigator’s GlobalAssessment，IGA)标度(“Guidance for Industry:Acne Vulgaris:Developing Drugs forTreatment(工业指南：寻常痤疮：开发治疗用药物)”，U.S.Department of Health andHuman Services，Food and Drug Administration，2005年9月)的痤疮强度评分在3-4范围内或在2-4范围内的人每天局部施用所述组合物达6-52周时，所述方法有效导致至少2点的痤疮强度评分减少。如果在6-52周的每日施用的任意点，炎性损伤计数都减少至少约50％，则所述方法有效满足上述需要。

在一个或多个另外的实施方案中，局部施用本文提供的组合物的方法，或本文提供的治疗疾病或病况的方法，在对人受试者局部施用单一剂量的所述组合物时，没有导致受试者所述药物血液血浆水平的增加、或导致可以忽略的增加或导致临床上不明显的增加，其中所述单一剂量施用到所述受试者整张脸上，并且在局部施用后一小时测量四环素类药物的血液血浆水平。

在一个或多个另外的实施方案中，提供本文所述的组合物，其伴有用于治疗皮肤的皮肤病学病况或疾病的局部施用的使用说明。在一个或多个相关的实施方案中，使用说明包括关于下述的说明：将所述组合物每天一至三次施用到外部皮肤表面上达约2周至至少约6周的时间，或直到观察到皮肤病学病况或疾病的明显改善。

在另外的方面，本文提供用于制备组合物(例如，适用于治疗人最终的痤疮的组合物，优选局部用组合物)的方法，所述方法包括：(i)将四环素类药物或其盐或溶剂化物、镁源、挥发性一元脂肪醇和多元醇合并，形成混合物，并且(ii)搅拌(i)的混合物形成溶液。

在另一方面，提供用于制备组合物的方法，所述方法包括：(i)在非水性溶剂中合并米诺环素、镁盐、亚硫酸盐化合物，形成混合物，并且(ii)搅拌(i)的混合物形成溶液，米诺环素溶解在所述溶液中。

前述各方面和各实施方案的每一个旨在施用到任一个和每一个其他方法和实施方案。从下述描述、实施例、附图和权利要求书，所述组合物、相关方法、组合物的组分等的另外的实施方案将是明显的。在联系下述详细描述阅读后，本公开内容的这些和其他目的和特征将变得更加完全明显可见。

附图简述

图1A-B是表示盐酸米诺环素在包含不同比例的乙醇和丙二醇的液体组合物中的最大溶解度的图表，所述最大溶解度作为所述组合物中乙醇浓度的函数，如实施例1所述。虚线表示盐酸米诺环素在不含氯化镁的液体组合物中的溶解度。实线表示盐酸米诺环素对具有氯化镁(无水)的类似液体组合物的溶解度。图1A提供关于包含1％桉树脑的组合物的数据。图1B提供关于不含桉树脑的组合物的数据。

图2A-2D是表示在如实施例3所述的包含盐酸米诺环素、乙醇和丙二醇的组合物中4-表-米诺环素和米诺环素随时间变化的相对浓度的图表。图表中的虚线是关于不含氯化镁的组合物的。图表中的实线是关于含有氯化镁的类似液体组合物的。图2A和2B分别是表示对于含1％桉树脑的组合物4-表-米诺环素和米诺环素随时间的相对浓度的图表。图2C和2D分别是表示对于不含桉树脑的组合物4-表-米诺环素和米诺环素随时间变化的相对浓度的图表。

图3是表示在应用实施例4所述的包含盐酸米诺环素、氯化镁、乙醇和丙二醇的组合物后，相对于乙醇浓度，米诺环素向离体人腹部皮肤的平均渗透效率的图表。

图4A-C表示来自实施例6的“对照”组织的结果。图4A是苏木精和曙红(H&E)染色的皮肤横切面。图4B和4C是基于MALDI-TOF质谱数据的图像，其表示对于由如图4A所示的近似相同形状的组织切片的切片皮肤内米诺环素和皮脂的位置。

图5A-C表示来自实施例6的“治疗的”组织的结果。图5A是在应用实施例6所述的局部用组合物后H&E染色的皮肤横切面。图5B和5C是基于MALDI-TOF质谱数据的图像，其表示对于由如图5A所示的近似相同形状的组织切片的切片皮肤内米诺环素和皮脂的位置。

图6是显示实施例7所述的人皮肤组织的横切面内的米诺环素的荧光显微图。

图7A-C是显示实施例7所述的人皮肤组织的横切面内的米诺环素的荧光显微图。图7A显示没有应用局部用组合物的人组织的切片。图7B和7C显示分别应用了包含约1％和4％(w/w)米诺环素游离碱等价物的局部用组合物的人组织的切片。

图8A是显示如实施例9所述，在50℃强迫降解7天后，作为镁与米诺环素游离碱等价物的摩尔比的函数的相对的4-表-米诺环素浓度的增加的图表。图8B是表示如实施例9所述的作为镁与米诺环素游离碱等价物的摩尔比的函数的示例性的米诺环素组合物的荧光(A.U.)的图表。

图9A和9B分别显示如实施例12所述，在离体人面部皮肤中对于分别含1％和4％米诺环素的制剂通过HPLC测量的米诺环素的量(μg/cm²)。对于完好的和差向异构体化的米诺环素，测试的时间点为2和4小时。数据表示捐献者平均值±SE(对于图9A和B二者，亲水性和亲脂性制剂之间*P≤0.05)。

图10是显示在实施例12所述的离体研究中对于包含1％和4％米诺环素的制剂面部皮肤中米诺环素(μg/cm²)的浓度的图。

图11A和11B分别显示如在实施例12中所述，由离体局部施用包含1％和4％的米诺环素的制剂导致的米诺环素差向异构化。

图12A-E是如实施例12所述离体应用包含4％米诺环素的局部用制剂的面部皮肤的荧光显微图。

图13A和13B是在封闭玻璃瓶中在40℃陈化7天之前和之后包含四环素和多西环素的组合物的照片。

图14A，14B和14C分别是显示对于在25℃、30℃和40℃的陈化条件在实施例20中所述的组合物中米诺环素的相对浓度的图。

图15是显示实施例20中组合物SS-0004至SS-0011的水含量(作为标称米诺环素浓度(碱等价物)的函数)的图。

图16是显示如实施例20所述在25℃、30℃和40℃陈化后通过Karl Fischer滴定测量的作为所述组合物的水含量的函数的米诺环素相对浓度的减少的最佳拟合率的图。

详述

将在下文中更充分地描述本发明。然而，本发明可以以多种不同的形式实施，并且不应该解释为限于本文所述的实施方案；相反，提供这些实施方案，以使本公开内容充分完整，并且将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。从前述和下述描述可以理解，本文所述的各个和每一个特征，以及两个以上所述特征的各个和每一个组合，包括在本公开内容的范围内，条件是包括在所述组合中的特征不是矛盾的。另外，任意特征或多个特征的组合可以具体地从本发明的任意实施方案中排除。本发明另外的方面和优点在下述描述和权利要求书中列出，特别是当结合附上的实施例和附图考虑时。

除非另外指明，本文引用的所有公布、专利和专利申请通过引用完全结合于此。在相同的术语在本文通过引用结合的公布、专利或专利申请中和在本公开内容中都限定的情形中，本公开内容的定义表示统制性的定义。对于关于其对特定类型的化合物、化学品等的描述引用的公布、专利和专利申请，涉及此类化合物、化学品等的部分是通过引用结合于此的文件的那些部分。

定义

必须注意，当在本说明书中使用时，单数形式“一个”("a,""an,")和“这个”("the")包括复数引用，除非上下文清楚地另外指明。因此，例如，引用“活性成分”包括单一成分以及两种以上不同的成分，引用“溶剂”是指单一溶剂以及两种以上不同溶剂或多种溶剂的复合混合物，引用“镁盐”包括单一镁盐以及两种以上不同的镁盐，等等。

在描述和要求本发明时，下述术语将按照下文所述的定义使用。

术语“局部用组合物”是指包含药用成分(包括活性药物成分(API))并且意欲施用给动物或人受试者并且施用到皮肤表面上的物质，与口服服用或通过静脉内(皮下)注射的物质相反。局部用组合物通常旨在在应用部位具有其预期效果，并且不在血流或其他组织中导致明显的药物浓度(如例如在经皮组合物的情形中)。本文提供的局部用组合物通常施用用于减轻与皮肤病学疾病或病况相关的症状、治疗皮肤病学疾病或病况、或预防皮肤病学疾病或病况的目的。

术语“溶剂”是指其中以某种程度溶解一种或多种固体成分的物质。例如，举几个来说，乙醇、异丙醇和丙二醇被认为是米诺环素的溶剂。

术语“四环素类药物”是指四环素和四环素衍生物，诸如例如，米诺环素，多西环素，土霉素(oxytetracycline)以及它们相应的药用盐形式，以及它们的溶剂化物和水合物，包括各种结晶形式，多形体，无定形物质等。四环素抗生素通常包含四个环的八氢并四苯-2-酰胺骨架，而该骨架上实际的取代基可以变化。

术语“米诺环素”是指(4S,4aS,5aR,12aR)-4,7-二(二甲基氨基)-1,10,11,12a-四羟基-3,12-二氧代-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺(即，CAS号10118-90-8)及其相应的药用盐形式，以及它们的溶剂化物和水合物。示例性的米诺环素形式通常由其CAS号鉴别。例如，盐酸米诺环素具有的CAS号为13614-98-7。

术语“一元脂肪醇”是指包含单个羟基的单官能性有机化合物，其中所述羟基官能团与饱和碳原子共价连接，形成支链或直链烷基量的一部分，并且其不包含原子的芳香环构型。通常，用于本文提供的组合物的一元脂肪醇符合式R-OH，其中R是C₁-C₄烷基。适当的R基团包括乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。

术语“多元醇”是指包含两个以上羟基基团并且具有3-8个碳原子的药用醇。除了所述羟基基团之外，适合用于本组合物的多元醇可以，但不是必须，包含官能团，诸如例如，醚键。用于本文时，聚乙二醇不应该认为是多元醇。示例性的多元醇包括二醇，如丙二醇(PG)和二丙二醇，三醇，如甘油，1,2,6己三醇，三羟甲基丙烷，和高级醇(即，包含多于3个羟基)，如山梨醇和季戊四醇。多元醇还包括丁二醇、己二醇、1,6己二醇、甘露醇和木糖醇。应该认识到，这些溶剂中有一些是可能不合乎需要的固体，但是当在适当的混合物中组合时，它们可能适合用于本文所述的局部用组合物。

术语“桉树脑”是指1,8-桉树脑。

术语“化妆品”是指作为“旨在擦在、倒出、洒在或喷雾在、引入到、或另外涂覆到人体上的……用于清洁、美化、提高魅力或改变外观的制品”的物品(来自U.S.FD&C Act，section 201(i))。美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)将多种物品分类为化妆品或药物。该定义旨在按照U.S.FDA的分类。U.S.FDA在其网站上进一步澄清“包括在该定义下的产品是皮肤保湿霜、香水、唇膏、指甲油、眼睛和面部化妆制剂、清洁香波、持久烫发剂(permanent waves)、染发剂和除臭剂，以及旨在用作化妆品组分的任意物质”。

术语“局部用”在涉及药物或组合物施用时，是指将所述药物或组合物施用到身体外部上皮表面上，包括皮肤或角膜。为了这种应用的目的，在身体孔内的应用，诸如在嘴、鼻子或耳朵的应用，不应该认为是局部施用。

如果如实施例1测量在25℃药物的溶解度为至少0.1％(w/w)，则认为溶剂“溶解”四环素类药物(或反过来说，认为药物在溶剂中是可溶的)。对于乳液剂等，如果所述药物与溶剂直接相互作用，使得所述药物结合在溶剂中形成溶液，则仅认为所述药物“溶解”在溶剂中。因此，例如，被包衣以限制与溶剂相互作用的药物，如果其保持为颗粒形式，将不被认为溶解在所述溶剂中。

如果在溶剂或组合物中没有添加的水，则认为所述溶剂或组合物是“无水的”。也就是说，用于本文时，无水组合物是不添加水作为组分的一种组合物。为清楚起见，甚至如果溶液或组合物包含来自组合物组分的水，诸如通过加入盐酸米诺环素水合物，只要没有向所述组合物中加入游离水，则可以认为所述溶液或组合物是无水的。本文所述的多种溶剂在或大或小的程度上都是吸水性的，并且此类溶剂可以是无水组合物的一部分，而不考虑被所述物质天然吸收的水分。

如果通过Karl Fischer滴定或其他适当的方法测量，在溶剂或组合物中分别存在少于5重量％的水含量，则认为所述溶剂或组合物是“非水性的”。

如果溶剂或组合物在大气压下沸点低于100℃，则认为所述溶剂或组合物是“挥发性的”。挥发性的溶剂或组合物通常容易在室温和大气压下挥发。挥发性溶剂的实例包括异丙醇、乙醇和叔丁醇。非挥发性溶剂的实例包括水、白矿脂和橄榄油。

如果去除特定的物质，包含以相同的彼此相对比例(除活性成分或药物外)的全部所述物质的组合物，在黑暗环境中在25℃和60％相对湿度下存储时，在6个月的时间点测量时，表现出比初始组合物的功效损失更大的功效损失，则认为药物由于包含在所述组合物中的所述特定物质的存在而被“稳定”。为清楚起见，当进行替换时(即，评估稳定性增强)，组合物中药物的重量百分数不增加，而是相反，将去除的物质有效地用所述组合物除药物外剩余部分的等价比例替换。例如，如果评价包含30％(w/w)A，30％(w/w)B，20％(w/w)C，10％(w/w)D和10％(w/w)E的组合物的组分A的效果，并且E是活性成分(即，四环素类药物)，则可比较的组合物包含0％(w/w)A(去除的组分)，45％(w/w)B，30％(w/w)C，15％(w/w)D，和10％(w/w)E(活性成分)。

术语“渗透效率”是指如实施例4所述，当将约12mg/cm²的组合物施用到皮肤表面上达4小时时，将所述组合物施用到人皮肤组织的离体部分后，渗透通过角质层的前几层(即，通过两次连续的胶带剥离(tape stripping)去除上层角质层多层后)的四环素类药物的百分数。

“MIC”或最低抑菌浓度定义为抗微生物化合物在温育48小时后抑制微生物的明显生长的最低浓度。

缩写“(w/w)”表示组合物中组分以“重量对重量”计的相对浓度(即，百分比是指总重量的百分比)，而不是基于体积或一些其他的基础计的相对浓度。关于四环素类药物(例如，米诺环素)的溶剂化物或水合物，重量百分比应该是校正后的重量，以说明关于在所述药物来源中包含的溶剂/或水合物分子的质量。例如，基于米诺环素游离碱(457.48)与盐酸米诺环素二水合物(529.97)的分子量比，包含1.16％(w/w)盐酸米诺环素二水合物组合物的组合物等价于1％米诺环素游离碱等价物。

关于四环素类药物的术语“相对浓度”通常通过HPLC测量确定，并且对应于活性四环素类药物的峰面积除以在溶剂峰洗脱后HPLC层析图多次出现的所有峰的峰面积总和。为清楚起见，该测量的意图是HPLC层析图忽略每个溶剂峰的峰面积，并且包括由于四环素类药物及其检测到的主要降解组分产生的每个峰。例如，对实施例19中所述的每个组合物测量活性米诺环素的相对浓度。

关于四环素类药物的差向异构体的术语“相对浓度”通常通过HPLC测量确定，并且对应于活性四环素类药物的一个或多个差向异构体的峰面积除以所述差向异构体的峰面积与活性四环素类药物的峰面积的和。例如，对实施例19中所述的每个组合物测量4-表-米诺环素的相对浓度。

关于四环素类药物的术语“浓度”通常通过HPLC测量确定，并且对应于活性四环素类药物的峰面积乘工作标准物中活性四环素药物的浓度再除以包含已知量的活性四环素药物的工作标准物的活性四环素药物的峰面积。例如，对实施例20中所述的每个组合物测量米诺环素的浓度。

术语“密闭的”，诸如关于“密闭的小瓶”，是指密封防止小瓶中由于挥发引起溶剂或其他物质的明显的损失的小瓶。对于本文所述的实例，密闭的玻璃瓶是指用聚乙烯锥形-衬里的酚醛帽(polyethylene cone-lined phenolic cap)封闭并用石蜡膜密封的硼硅酸盐玻璃瓶。通过使用琥珀色玻璃瓶或通过用铝箔包裹小瓶，而使玻璃瓶内的组合物避光。

术语“粘度”是指使用粘度计对物质的测量，所述粘度计诸如Brookfield LVF粘度计(Brookfield Engineering Laboratories，Inc.，Middleboro，MA)或等价物，其具有适于检测适当的粘度水平的锭子和速度组合。

用于本文时，“皮肤病学病况”是指皮肤的美容和病理学病症。皮肤病学病况包括局部炎性皮肤病况，诸如湿疹(eczema)，脂溢性皮炎(seborrhoeic dermatitis)，大疱性皮肤病(bullous dermatoses)，表皮结节病(cutaneous sarcoidosis)，卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)，嗜中性皮肤病(neutrophilic dermatoses)，接触性皮炎(contactdermatitis)，酒渣鼻(rosacea)，银屑病(psoriasis)和痤疮(acne)，包括红斑痤疮(acnerosacea)，和传染病，如脓疱病(Impetigo)，蜂窝织炎(cellulitis)，丹毒(erysipelas)，毛囊炎(folliculitis)，疖(furuncles)，痈(carbuncles)，莱姆病(Lyme disease)，和其他皮肤传染病。

用于本文时，“痤疮”是以丘疹(papules)、脓疱(pustules)、囊肿(cysts)、小瘤(nodules)、粉刺(comedones)和其他瑕疵(blemishes)或皮肤损伤为特征的皮肤病症。这些瑕疵和损伤通常伴有皮肤腺和毛皮脂腺囊的炎症，以及微生物感染，特别是细菌感染。用于本文时，痤疮包括所有已知类型的痤疮。一些类型的痤疮包括，例如，寻常痤疮，囊肿性痤疮(cystic acne)，萎缩性痤疮(acne atrophica)，溴痤疮(bromide acne)，氯痤疮(chlorineacne)，聚合性痤疮(acne conglobata)，美容剂痤疮(acne cosmetica)，去垢剂性痤疮(acne detergicans)，表皮痤疮(epidemic acne)，夏季痤疮(acne estivalis)，暴发性痤疮(acne fulminans)，卤素痤疮(halogen acne)，硬结性痤疮(acne indurata)，碘痤疮(iodide acne)，瘢痕瘤性痤疮(acne keloid)，机械性痤疮(acne mechanica)，丘疹性痤疮(acne papulosa)，香膏剂痤疮(pomade acne)，经前期痤疮(premenstral acne)，脓胞性痤疮(acne pustulosa)，坏血病性痤疮(acne scorbutica)，结核性痤疮(acnescrofulosorum)，荨麻疹性痤疮(acne urticata)，痘样痤疮(acne varioliformis)，中毒性痤疮(acne venenata)，丙酸痤疮(propionic acne)，人工痤疮(acne excoriee)，革兰氏阴性痤疮(gram negative acne)，类固醇性痤疮(steroid acne)，结囊性痤疮(nodulocystic acne)和红斑痤疮(acne rosacea)。红斑痤疮特征在于炎性损伤(红斑(erythema))和毛细管扩张(telangiectasia)。毛细管扩张是与多种疾病相关的异常性且持久性膨胀的血管。例如，面部毛细管扩张与衰老、红斑痤疮、日光照射和酒精应用相关。

涉及实体或成分的术语“药用”是可以包括在本文提供的组合物中并且在指定的水平，或者如果没有指定水平，在已知本领域技术人员可接受的水平，在患者中没有引起明显的不利毒物学作用的实体或成分。本文所述的组合物中的所有成分以药用水平提供。为清楚起见，活性成分可以引起一种或多种副作用，并且包含具有从关于所述成分的调控角度看来是可接受的副作用模式的成分被认为是这些成分的“药用”水平。

“药用盐”表示药物或活性成分的盐形式，所述药物或活性成分具有至少一个适于盐形成的基团，所述药用盐对患者没有引起明显的不利毒物学作用。提及本文提供的活性成分意欲包括其药用盐，以及其溶剂化物和水合物。药用盐包括取决于所述药物中官能团的性质通过与无机酸、有机酸、碱性氨基酸、或酸性氨基酸反应制得的盐。适当的药用盐包括酸加成盐，例如，其可以通过将碱性药物溶液与能够形成所述碱性药物的药用盐形式的酸溶液混合而形成，所述酸诸如盐酸、碘酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸、磷酸、硫酸等。用于处在质子化形式的碱性药物的典型的阴离子包括氯离子、硫酸根、溴离子、甲磺酸根、马来酸根、柠檬酸根、磷酸根等。适当的药用盐形式和鉴定所述盐的方法见于，例如，Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties，Selection and Use(药物盐手册：性质、选择和应用)，Weinheim/Zürich:Wiley-VCH/VHCA，2008；P.H.Stahl和C.G.Wermuth编。

关于本文提供的局部用制剂的“非刺激性”是指对于5只以上Sprague-Dawley大鼠的检测，在改良的Draize规格上具有小于0.50的平均评分的制剂。所述改良的Draize检测是如下述进行的急性刺激检测。将Sprague-Dawley大鼠在涂覆区域剃毛，并且允许涂覆区域休息约24小时，然后用无刺激性肥皂润洗。将测试组合物以2.5mg/cm²的体积均匀地、不经明显摩擦地涂覆到10cm²的大鼠皮肤上。允许样品不被覆盖持续24小时。24小时后，将涂覆区域用1x磷酸缓冲盐水(1x PBS)和无刺激性肥皂轻柔冲洗，以促进对涂覆区域的观察。然后，按照下述规格对涂覆区域评分：0＝没有刺激迹象；1＝最低限度的红斑，几乎不可察觉；2＝明显的红斑，容易看见，最低限度的浮肿或最低限度的常规反应；3＝红斑和丘疹；4＝明显的浮肿；5＝红斑，浮肿和丘疹；6＝小泡疹(vesicular eruption)；7＝扩散出测试位点的强反应。

“治疗有效量”用在本文中意指在目标组织中或在目标部位提供需要水平的活性成分所需要的药物制剂的量或药物制剂中活性成分的量。精确的量将取决于多种因素，例如，具体的活性成分，药物制剂的组分和物理特征，目的患者群体，患者考虑等，并且本领域技术人员可以基于本文提供的和相关文献中可得到的信息容易地确定。

室温是指约20-25℃范围内的温度。关于需要准确的室温表示的测量或其他特征，室温视为是25℃。

术语“患者”是指患有或倾向于得可以通过施用本文提供的组合物进行预防或治疗的病况的活生物体，并且包括人和动物二者。优选的动物是哺乳动物。

“任选的”或“任选地”意指其后描述的境况可能发生或可能不发生，使得该描述包括发生所述境况的情形和不发生所述境况的情形。

在多种情形中，本申请描述值的范围。所述范围应该解释为包括该范围的终点，除非这样做将与内容矛盾或另外指明。

概述

本公开内容解决至少一些本文之前鉴定的(例如，在背景部分)与包含四环素类药物的局部用组合物相关的问题。在一些组合物尝试后，本申请人发现了促进四环素类药物渗透到皮肤内并且所述药物在其中具有高溶解度的组合物和相关的溶剂系统。在这样的溶剂系统中，当溶剂渗透到皮肤中时，药物理想地保留在溶液中。如本申请人已经认识到的，如果在渗透之前，溶剂中的一些由于挥发而损失，则在皮肤表面上，药物在溶剂中的浓度通常将增加，这意味着药物在所述组合物内的溶解度是设计改进的包含四环素类化合物的局部用组合物要考虑的重要特征。另外，如本申请人已经发现的，选择在存储过程中药物完全溶解在其中的溶剂减少或消除整个组合物中药物浓度的变化。在下述描述中，米诺环素通常视为是示例性的四环素类化合物，然而，本文公开的组合物和方法也适用于除米诺环素之外的四环素类化合物。另外，本文也提供包含四环素类并且具有优越的稳定性的液体组合物。

本申请提供局部用组合物和用于制备所述局部用组合物的相关方法。在一个方面中，所述局部用组合物包含在非水性溶剂中的米诺环素、镁盐和亚硫酸盐化合物，其中关于所述米诺环素(一种示例性的四环素)、所述镁盐和所述亚硫酸盐化合物的详情提供在上文中和在后面的部分中。已经发现，如本文提供的例如包含在非水性溶剂系统(优选亲水性溶剂系统)中的米诺环素和镁盐，包含亚硫酸盐系抗氧化剂的液体组合物，与包含非亚硫酸盐抗氧化剂的那些组合物相比，明显且有利地更稳定。例如，参见实施例19。令人惊讶地，当与包含非亚硫酸盐系抗氧化剂的对应制剂相比时，所述组合物随时间表现出显著更少的米诺环素降解。所述制剂关于颜色也表现出长久的稳定性，即，在存储时在颜色方面没有表现出明显的变化。

在另一个方面中，本文提供包含四环素类药物、镁源、一元脂肪醇和多元醇的局部用组合物，其中(i)一元脂肪醇与多元醇之间的重量比在1:1-99:1的范围内，并且(ii)所述四环素类药物溶解在所述局部用组合物中。在一些示例性的实施方案中，所述一元脂肪醇是乙醇、异丙醇或叔丁醇(即，叔丁基醇)。在一个或多个另外示例性的实施方案中，所述多元醇是C3-C8脂肪性饱和二醇或三醇。在一个或多个另外的实施方案中，所述多元醇是1,2-二醇、1,3-二醇或三醇。示例性的多元醇包括丙二醇、二丙二醇和甘油。本文中提供了组合物和相关方法的进一步的详情。

本申请人已经发现，四环素类药物、镁源、一元脂肪醇和多元醇的组合在组合物内形成共晶(eutectic)，以致相对于缺少这四种组分中的一种的组合物的熔点，通过差示扫描量热法(DSC)测量的挥发溶剂后所述组合物的熔点降低。本申请人还发现，相对于不含这三种非药物组分中的一种的组合物的米诺环素溶解度，米诺环素在所述组合物中的溶解度减小。基于溶解度和DSC测量，相信这四种组分可以形成独特的离子相互作用或非特异性的结合，其对于在局部用组合物中的应用具有协同性质。这些协同性质可能需要全部四种组分以获得最佳的增溶益处。不希望受理论束缚，似乎溶剂混合物中和了米诺环素-镁复合物中的离子电荷，相对于米诺环素在独立的每种溶剂中的溶解度，这增加了米诺环素在溶剂混合物中的溶解度。

在一个或多个实施方案中，所述一元脂肪醇是挥发性的，所述多元醇是非挥发性的，并且，甚至当从所述组合物中省略或去除一元脂肪醇时，或将其浓度减小(如通过蒸发)时，所述四环素类药物在所述组合物中保持可溶。在这样的实施方案中，在挥发性一元脂肪醇或非水性溶剂对组合物的稳定作用(例如，在存储过程中)与药物在组合物中和在施用到皮肤上时、甚至在将一些或全部的挥发性一元脂肪醇挥发后(当存在时)所述药物的持久的溶解度之间获得有利的平衡。这种方法可以是有利的，原因在于，1)所述挥发性一元脂肪醇表现为稳定所述组合物，并且2)所述多元醇将四环素类药物保持为溶解状态，在皮肤上达长的时间，由此允许比在用一元脂肪醇替换多元醇的情况下更长时间的增强渗透。本文提供了当施用到皮肤时有效实现延长的存储稳定性和维持四环素类药物的溶解度的平衡所需的挥发性一元脂肪醇、相对非挥发性的多元醇和四环素类药物中的每种在所述组合物中的相对重量百分比。

在一些实施方案中，所述组合物用于治疗皮肤病学病况或疾病。可以使用所述组合物的皮肤病学病况或疾病的非限制性实例包括，但不限于，痤疮，酒渣鼻，脂溢性皮炎，银屑病，和浅表皮肤感染，如脓疱病，以及伤口管理。

组合物

如上文所述，在一个方面中，所述局部用组合物包含在非水性溶剂中的米诺环素、镁盐和亚硫酸盐化合物。在另一方面中，所述组合物包含四环素类药物、镁源、一元脂肪醇和多元醇。现在将更详细地描述组合物组分和特征。

例如，四环素类药物包括四环素和四环素衍生物，如地美环素(demeclocycline)，米诺环素，多西环素，土霉素，和它们相对应的药用盐形式，以及它们的溶剂化物和水合物。所述四环素类药物也可以是fluorocycline，即，7-氟-9-取代的-6-去甲基-6-脱氧四环素，如eravacycline(TP-434)或7-氟-9-吡咯烷并乙酰胺基-6-去甲基-6-脱氧四环素。属于四环素类的药物通常包含四环八氢并四苯-2-甲酰胺骨架，而该骨架上实际的取代基可以变化。四环素是广谱抗生素，表现出针对宽泛范围的细菌的活性。用于本文提供的组合物的一种优选的四环素是米诺环素。米诺环素是具有针对宽泛范围的革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体的活性的有效的半合成的四环素。当与其他四环素型化合物相比较时，米诺环素表现出更广的谱度，并且也是四环素中最脂溶性的，即，当与其他四环素比较时，可以更容易地渗透到多种组织中。这种特征对于局部施用的米诺环素(尤其是以游离碱形式存在的)表示增加的挑战，原因在于与其他四环素相比，其转运穿过表皮的倾向性。本文提供的组合物可以包含米诺环素或任意或以任何可用形式存在的四环素抗生素，例如，作为游离碱，作为盐酸盐或气体药用盐，包括所有结晶多形体，溶剂化物，水合物，或其无定形形式。在一个或多个优选的实施方案中，所述米诺环素或米诺环素盐不是以水合物的形式存在(即，是以非水合形式存在)。然而，在一些情形中，四环素药物可以以水合形式存在，例如，包含少于约20重量％的水。在一些优选的实施方案中，所述四环素药物将包含少于约5重量％的水，或可以包含少于约2重量％的水。

所述局部用组合物中四环素类药物(例如，米诺环素)的量通常在约0.01重量％-约10重量％的范围内，或约0.1重量％-约5重量％的范围内。示例性的范围为约0.1重量％-约4重量％，或约0.2重量％-约3重量％或约0.2重量％-约1.5重量％。例如，所述局部用制剂可以包含下述米诺环素重量百分数中的任一种：0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1.0％，1.1％，1.2％，1.3％，1.4％，1.5％，1.6％，1.7％，1.8％，1.9％，1.0％，2.1％，2.2％，2.3％，2.4％，2.5％等。

所述局部用组合物还包含镁源，典型地以镁盐的形式存在。示例性的镁盐包括，但不限于，溴化镁、氯化镁、氟化镁、碘化镁、硫酸镁、水杨酸镁、和磷酸镁。镁盐通常作为水合物商业供应，并且水合物可以用在本发明的制剂中。然而，在一些优选的实施方案中，由于诸如米诺环素的四环素类药物在存在水的条件下的不稳定性，镁盐是无水的。例如，参见实施例20。在一些优选的实施方案中，镁源包括具有作为软(可极化的)离子(如氯离子或碘离子)而不是硬离子(如硫酸根或氟离子)的平衡离子的镁盐。在一些另外的实施方案中，镁源包括具有氯离子或比氯离子更软的平衡离子的镁盐。在一些另外的实施方案中，镁源包括具有乙酸根离子(CH₃COO^-)或比乙酸根离子更软的平衡离子的镁盐。

硬/软酸/碱(HSAB)理论将酸和碱分成从硬到软的级别。使用软离子降低混合物内的界面张力并且由此提高溶解度。有助于离子被分类为“软性”的因素包括大尺寸、低电荷状态、和强极化性。HSAB理论的另外的详情记载在Pearson，Ralph G."Hard and SoftAcids and Bases(硬与软酸与碱)".J.Am.Chem.Soc.1963；85(22):3533–9和Pearson，R.G.“Recent Advances in the Concept of Hard and Soft Acids and Bases(硬与软酸与碱概念的最近进展).”J.Chem.Education.July 1987，64(7):561-7中，它们通过引用结合在本文中。

如实施例1中所述，在组合物中存在镁盐有效地使四环素类药物(例如，米诺环素)在所述组合物中的溶解度增加至明显的程度。例如，参见图1A。不希望收到理论束缚，镁表现为与组合物中的米诺环素相互作用，如与单独的米诺环素的MIC值相比时其对MIC值的影响所证明的。例如，参见实施例5，其描述了关于米诺环素、无水氯化镁和这二者1:1.5w/w混合物的MIC测量。单独的米诺环素表现出0.125毫克/毫升的MIC，而组合具有0.5微升的更高的MIC——增加四倍(意味着组合具有比单独的米诺环素少四倍的活性)。因此，甚至说明组合在重量上的差异，结果表明镁与米诺环素相互作用。利用分析技术验证观察到的抗微生物活性的损失不是由于米诺环素的降解导致。

在本文提供的局部用组合物中镁源(例如，镁盐)的量在约0.2-10重量％范围内。镁源与四环素类药物(例如，米诺环素)的摩尔比在约2:1-约100:1的范围内。示例性的摩尔比典型地为至少约2:1(Mg:四环素药物)。例如，适当的摩尔比为约2:1，约2.5:1，约3:1，约3.5:1，约4:1，约4.5:1，约5:1，约5:1，约5.5:1，约6:1，约6.5:1，约7:1，约7.5:1，约8:1，约8.5:1，约9:1，约9.5:1，和约10:1。在所述局部用组合物中镁源相对四环素类药物按重量/重量(w/w)计的相对量典型地在约1:3-约3:1范围内，但是，取决于镁源的分子量和四环素类药物的形式，可以使用大于或小于该范围的范围。因此，镁源的重量相对于盐酸米诺环素(即，一种四环素类药物)的重量的相对量可以包括下述中的任一个或多个：0.4(即，按重量计，镁的量是米诺环素组分的量的0.4倍)，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0(即，相等重量的量)，约1.5，约2，约2.5，约3倍，约3.5倍，约4倍.约4.5倍，约5倍，约5.5倍，约6倍，约6.5倍，约7倍，约7.5倍，约8倍，约8.5倍，约9倍，约9.5倍，或约10倍，包括落入任意两个前述值内的任意和所有的范围。典型地，相对于米诺环素，镁源，例如，镁盐，以过量的摩尔数存在。基于本文提供的实例，可以看出，镁盐有效地稳定所述组合物。

备选地，或除了镁盐之外，局部用制剂可以包含二价金属阳离子的盐，诸如，例如，钙盐、铝盐、锌盐，其中示例性的平衡离子和相对的量(例如，全部二价金属离子的)是如上文关于镁盐所述的。优选的二价金属离子是能够与米诺环素相互作用的那些。

所述局部用组合物通常另外包含一元脂肪醇、优选挥发性醇作为其非水性溶剂系统的一部分。通常，用于本文提供的组合物的一元脂肪醇符合式R-OH，其中R是C₁-C₄烷基基团。适当的R基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。优选地，所述一元脂肪醇是伯醇，如乙醇、丙醇或丁醇。一种特别优选的一元脂肪醇是乙醇。在一些实施方案中，所述一元脂肪醇是在水中具有5％以上的溶解度的一元脂肪醇。例如，甲醇、乙醇、1-和2-丙醇以及叔丁醇与水混溶，而1-丁醇在水中具有约9％的溶解度，2-丁醇在水中具有7.7％的溶解度。优选的醇是亲水性的。

所述局部用组合物的另一种组分(即，形成其溶剂系统的一部分)可以是包含两个以上羟基基团并且具有3-8个碳原子的多元醇。典型地，所述多元醇是脂肪化合物；用于所述组合物的多元醇包括二醇，如丙二醇(PG，丙烷-1,2-二醇)，己二醇(2-甲基戊烷-2,4-二醇)，1,3-丁二醇(1,3-丁烷二醇)，和二丙二醇，三醇如甘油和三羟甲基丙烷，和高级醇(意指包含多于3个羟基基团)如山梨醇和季戊四醇。优选的多元醇是C3-C8二醇和三醇。二醇或三醇典型地具有小于约250、或甚至小于约200的分子量。在一些情形中，所述多元醇将具有小于约125的分子量。在一些情形中，所述多元醇可以是吸湿性的，诸如在丙二醇的情形中。在一些实施方案中，所述多元醇是除甘油(glycerol或glycerin)之外的三醇。

许多一元脂肪醇，如乙醇，可以为四环素类药物提供稳定的溶剂，然而，四环素类药物在乙醇与丙二醇的混合物中具有有限的溶解度。另外，由于乙醇是挥发性溶剂，当施用到皮肤上时，溶剂中的大部分快速挥发。这种挥发迅速地增加在皮肤表面上的四环素类药物浓度，并且可以导致在皮肤表面上或在皮肤上层形成固体沉积物，这两种情况都不合乎需要，特别是由于染色和/或皮肤色素沉着的可能性。本文提供的组合物至少部分目的在于克服上文所示的缺点。例如，考虑包含1.2％(w/w)盐酸米诺环素(约1％(w/w)米诺环素游离碱等价物)、1.2％(w/w)氯化镁、77.6％(w/w)乙醇和20％(w/w)丙二醇的组合物。乙醇的挥发性比丙二醇高得多，以致甚至如果所有的乙醇都从皮肤上挥发掉，在乙醇挥发后在残留的组合物中米诺环素游离碱等价物的浓度约为4.5％。考虑米诺环素与氯化镁组合时在丙二醇中以多至约7-8％米诺环素游离碱等价物的水平可溶(取决于温度)，这意味着在前述实例中，米诺环素将理想地保持在溶液中(即，处于溶解状态)，尤其是在升高的皮肤温度下。并且，由于一些乙醇将米诺环素转运到皮肤内而不是挥发掉，在残留的组合物中米诺环素的浓度将小于以该计算所述的浓度。

与多元醇相比，本文提供的示例性的组合物通常包含更大重量百分比的一元脂肪醇。例如，本文所述的有利的组合物可以包含约50％(w/w)-约95％(w/w)的一元脂肪醇，约5％(w/w)-约40％(w/w)的多元醇，约0.1％(w/w)-约10％(w/w)的四环素类药物，和约0.2％(w/w)-约15％(w/w)的镁源。本文所述的一些优选的组合物可以包含约60％(w/w)-约90％(w/w)的一元脂肪醇，约5％(w/w)-约35％(w/w)的多元醇，约0.2％(w/w)-约5％(w/w)的四环素类药物，和约0.2％(w/w)-约10％(w/w)的镁源。

例如，示意性的液体组合物可以包含下述一元脂肪醇重量-重量百分数中的任一个或多个，包括在下述值每一个之间的范围：50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％醇，其中优选地，醇的重量百分比大于多元醇的重量百分比。可以与关于本文提供的四环素药物和其他制剂组分的w/w量或范围组合的醇组分的其他代表性的范围为：50-55％w/w，50-60％w/w，50-65％w/w，50-70％w/w，50-75％w/w，50-80％w/w，50-85％w/w，50-90％w/w，50-55％w/w，55-60％w/w，55-65％w/w，55-70％w/w，55-75％w/w，55-80％w/w，55-85％w/w，55-90％w/w，55-95％w/w，60-65％w/w，60-70％w/w，60-75％w/w，60-80％w/w，60-85％w/w；60-90％w/w，60-95％w/w，65-70％w/w，65-75％w/w，65-80％w/w，65-85％w/w；65-90％w/w，65-95％w/w，70-75％w/w，70-80％w/w，70-85％w/w，70-90％w/w，70-95％w/w，75-80％w/w，75-85％w/w，75-90％w/w，75-95％w/w，80-85％w/w，80-95％w/w，80-95％w/w，85-90％w/w，85-95％w/w，90-95％w/w。

多元醇组分的代表性的量包括下述中的任一个或多个：5％，10％，15％，20％，25％30％，35％或40％(w/w)，包括在前述每一个之间的范围，诸如，例如，5％-10％w/w，5-15％w/w，5-20％w/w，5-30％w/w，5-35％w/w，5-40％w/w，10-15％w/w，10-20％w/w，10-25％w/w，10-30％w/w，10-35％w/w，10-40％w/w，15-20％w/w，15-25％w/w，15-30％w/w，15-35％w/w，15-40％w/w，20-25％w/w，20-30％w/w，20-35％w/w，20-40％w/w；25-30％w/w，25-35％w/w，25-40％w/w，30-35％w/w，30-40％w/w，或35-40％w/w。

通常，一元脂肪醇与多元醇之间的重量比处在1:1-99:1的范围内。如上文所述，所述组合物通常包含较多元醇更大重量百分比的一元脂肪醇。醇与多元醇的示例性w/w比包括，例如，约1:1，1.5:1，2:1，3:1，4:1，5:1，6:1，7:1，8:1，9:1，10:1，15:1，20:1，25:1，30:1，35:1，40:1，45:1，50:1，55:1，60:1，65:1，70:1，75:1，80:1，85:1，90:1，和95:1。所述组合物可以包含约1:1-20:1，或约1:1-约15:1，或约1:1-约10:1，或约2:1-约20:1，或约2:1-约10:1，或约2:1-约7:1的一元脂肪醇与多元醇之间的w/w比。

在某些实施方案中，所述组合物不包含疏水性油或石蜡。在一些其他的实施方案中，所述组合物不包含脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，液体制剂不包含发泡剂。

所述组合物还可以包含相对少量的，例如，少于约10％(w/w)的一种或多种适于局部施用的辅助赋型剂，包括，但不限于，pH改性剂，防腐剂，增稠剂，凝胶形成剂，乳化剂，抗氧化剂，香味剂等。例如，适用于掺加的化合物可见于R.C.Rowe，等人，Handbook ofPharmaceutical Excipients(药物赋型剂手册)(第4版)，Pharmaceutical Press，London，2003。

可以用于所述局部用组合物的胶凝剂包括因其胶凝性质而公知的常规的胶凝剂，诸如，例如，纤维素醚，如羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟乙基纤维素等；乙烯醇；乙烯吡咯烷酮；天然树胶，如刺梧桐树胶(karaya gum)，豆角胶(locust bean gum)，瓜尔胶(guar gum)，吉兰糖胶(gelan gum)，黄原胶(xanthan gum)，阿拉伯树胶(gum arabic)，黄蓍胶(tragacanth gum)，角叉菜胶(carrageenan)，果胶(pectin)，琼脂(agar)，海藻酸(alginic acid)，海藻酸钠(sodium alginate)等，以及甲基丙烯酸酯，诸如可以商业名称从Rohm Pharma获得的那些。其他的胶凝剂包括聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)，诸如可以商业名称得到的那些，等等。优选的胶凝剂是不含游离羧酸基团的那些，诸如，例如，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，甲基纤维素，有机/冷水可溶的纤维素，羟乙基甲基纤维素，乙基纤维素，乙基(羟乙基)纤维素。对于取代的纤维素，优选中等至高程度的取代，从而限制羟基基团对四环素药物稳定性的影响和/或从而增加所述胶凝剂在所选的溶剂系统中的溶解度。优选的取代程度为至少1.0，或优选在1.2-6.0的范围内，或更优选地在2.5-4.5的范围内。

所述组合物还可以包含抗氧化剂。如果存在的话，抗氧化剂的量通常在所述组合物重量的约0.005％-约3.0％范围内。示例性的范围包括约0.01重量％-约2.5重量％的抗氧化剂，约0.05重量％-约2重量％的抗氧化剂，以及约0.1重量％-约1.5重量％的抗氧化剂。示例性量的抗氧化剂包括0.01重量％，0.025重量％，0.05重量％，0.075重量％，0.1重量％，0.2重量％，0.3重量％，0.4重量％，0.5重量％，0.6重量％，0.7重量％，0.8重量％，0.9重量％和1重量％。在一个实施方案中，包含在所述组合物内的抗氧化剂的量为0.01重量％。在另一个实施方案中，包含在所述制剂内的抗氧化剂的量为0.2重量％。例如，适当的抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚(BHA)，丁基羟基甲苯(BHT)，叔丁基氢醌，没食子酸丙酯，α-生育酚，偏亚硫酸氢钠等。一类优选的抗氧化剂是含硫的抗氧化剂，诸如偏亚硫酸氢钠，谷胱甘肽，N-乙酰半胱氨酸，硫代脯氨酸，和牛磺酸。另外优选的组合物包含选自由下述组成的列表的抗氧化剂：亚硫酸盐化合物，BHT，亚硒酸钠，DL-α-生育酚，二硫代赤藓醇与DL-α-生育酚的组合，和异抗坏血酸钠。亚硫酸盐和有机酯(统称为“亚硫酸盐”)也是优选的，诸如亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐等。

在一个或多个实施方案中，所述局部用组合物包含适量的(例如，约0.005重量％-约3.0重量％)亚硫酸盐化合物，例如，亚硫酸盐，偏亚硫酸氢盐或亚硫酸氢盐，其中所述亚硫酸盐伴有适当的平衡离子。如在实施例19中所述，亚硫酸盐抗氧化剂用在所述局部用制剂中是特别有利的。如表24所示，在抑制局部用米诺环素组合物中形成4-表-米诺环素方面，亚硫酸盐系抗氧化剂似乎是特别有益的。例如，参见第5和6列的数据。示例性的亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和偏亚硫酸氢盐，例如，具有适当的平衡离子，如无机或其他阳离子(例如，钠、钾、镁、钙等)，特别有效地抑制4-表-米诺环素形成，以及在存储时防止制剂明显的颜色变化(即，变黑)。也可以使用有机亚硫酸盐化合物，诸如亚硫酸的有机酯、无环亚硫酸酯(acyclic sulfites)、和环状亚硫酸酯。尽管可以使用任意适当的有机亚硫酸盐，但是示例性的有机亚硫酸盐包括亚硫酸乙酯、对-甲苯基-亚硫酸酯或亚硫酸异丙酯。

如实施例19所述，优选的包含亚硫酸盐-抗氧化剂的组合物表现出低的基线4-表-米诺环素浓度(相对于米诺环素)，以及随时间(例如，每周)4-表-米诺环素的形成增加少或没有增加。例如，在一些优选的组合物中，4-表-米诺环素的相对浓度在基线低于5.0％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时每周增加少于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。在一些优选的组合物中，基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度低于1.0％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时每周增加少于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。更优选地，基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度低于1.0％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时每周增加少于0.70％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度在约0.50％-约1.00％范围内，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时每周增加速率在约0.20％-约0.40％范围内。

优选的组合物另外表现出高的活性米诺环素相对浓度和活性米诺环素相对浓度随时间减少的少或没有减少。例如，在一些优选的组合物中，在基线测量时，活性米诺环素的相对浓度为至少95.0％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周减少少于1.50％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。在一些优选的组合物中，在基线测量时，活性米诺环素的相对浓度为至少98.0％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周减少少于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。更优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度为至少98.50％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周减少少于0.70％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度在约97.0％-约99.0％范围内，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周的减少速率在约0.30％-约1.00％范围内，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。

如表24所示，在防止含有米诺环素的制剂颜色变化(即，变黑)方面，亚硫酸盐系抗氧化剂也是特别有利的，如第6列所示。该研究评估了组合物在基线时与在密闭玻璃瓶中在40℃陈化4周后之间的颜色差异。四种包含亚硫酸盐抗氧化剂的组合物，即，组合物2-ss，3-sb，17-ps，和1-sbs，在视觉观察时，在陈化的和基线组合物之间没有表现出明显的颜色差异。具有非亚硫酸盐系抗氧化剂的组合物在所用的存储条件下随时间表现出明显的颜色变化(变黑)。在密闭玻璃瓶中在40℃陈化4周后，优选的组合物不表现出明显的颜色变化。用于评估颜色变化的适当方法记载在实施例19中。

所述组合物可以进一步包含一种或多种防腐剂，其量典型地在所述组合物重量的约0.01％-约2.0％范围内。例如，示例性的防腐剂包括苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯甲醇等。

所述局部用组合物还可以包含少量的，诸如0.1重量％-10重量％的一种或多种有效引入有利的香味或香气的化合物，诸如天然油或其他适当的试剂。适当的精油包括，例如，来自桉树、乳香(frankincense)、绿叶刺蕊草(patchouli)、薄荷、柠檬、熏衣草、橙子、蔷薇果、迷迭香、茶树、茉莉等的植物精油。例如，在一个或多个实施方案中，所述组合物包含少量的，如0.1重量％-5重量％的1,8-桉树脑，或一些其他的精油。

多元醇与1,8-桉树脑的组合可以特别有效地防止皮肤脱皮和极端干燥，尤其是当施用持续延长的时间时，例如，持续2周以上。可以防止的干燥皮肤的迹象包括脱皮和瘙痒。

所述局部用组合物可以以多种不同的形式存在，包括，例如，溶液，液体，喷雾剂，泡沫剂，洗液，凝胶等。优选地，所述组合物是液体，具有良好的稳定性，粘附在皮肤上，并且具有平滑的感觉。优选地，所述组合物不是乳液剂。通常，优选的组合物不含纳米颗粒和/或微粒，尽管在一些情形中，所述组合物可以包含纳米颗粒和/或微粒。关于适当的制剂的另外的信息，例如，参见“Remington:The Science and Practice of Pharmacology(雷明顿：药理学科学与实践),”第22版，(Pharmaceutical Press，2013)。

关于本文提供的组合物的稳定性，对示例性的组合物进行稳定性实验，从而评估组合物中四环素类药物随时间的降解程度，如实施例3所述。四环素化合物，米诺环素，例如，在存在水或极性质子溶剂的条件下，进行C4差向异构化。降解产物具有微小的抗生素活性，使得制剂中米诺环素在其保质期内的显著降解将导致降低的制剂活性。由表3和4的结果可以看出，基于18个月的外推数据，关于形成的差向异构体的量(相反的，组合物中保留的完好的米诺环素的量)，与不含镁的组合物相比，包含镁的组合物表现出显著的提高。指定为90-Mg、80-Mg和75-Mg的组合物(包含约75-90％(w/w)乙醇(即，一元脂肪醇)和10-25％(w/w)丙二醇(即，多元醇))在测试条件下仅形成3％(w/w)-约7％(w/w)的差向异构体，而对于不含镁的组合物，观察到99-100％的差向异构体转化。该实例证明镁对所述组合物的显著的稳定作用，例如，防止/最小化米诺环素的降解/差向异构化，并且随时间维持所述制剂的活性。当在含有镁的组合物之间比较时，与具有更高重量百分比的一元脂肪醇和更低重量百分比的多元醇的含Mg组合物相比，包含约25-50％(w/w)乙醇(即，一元脂肪醇)和约50-75％(w/w)多元醇(丙二醇)的组合物包含约两倍外推量的差向异构体。因此，在一个或多个实施方案中，似乎乙醇组分(例如，一元醇)对所述局部用组合物具有稳定作用，尤其是在存在镁的条件下和与多元醇组合时。

可以使用很多种方法来制备本文所述的组合物。广而言之，所述组合物可以通过将本文所述的组合物的各成分在室温组合在一起并且持续一段时间而制备，所述时间足以提供药学有效的和合乎需要的组合物。术语“组合在一起”用在本文中意指将所述组合物的所有组分大约同时组合并混合在一起，或者将多种组分以一种或多种添加顺序或次序组合，从而提供需要的产物。所述组合物可以以重量/重量(w/w)或重量/体积(w/v)计制备。所述组合物通常是容易涂抹的，例如，容易涂抹在皮肤表面上，并且优选不是流动的。

例如，所述组合物可以通过通常利用强力搅拌(如高剪切混合)混合各成分而制备。混合也可以通过利用任何适当的手工或自动方式的任意适当的方法实现。任选的另外的步骤包括导致加入上文所述的任选辅助成分中的一种或或多种的那些步骤。制备药物组合物的方法在本领域中是公知的，并且，例如，记载在Handbook of PharmaceuticalFormulations:Liquid Products(药物制剂手册：液体产品)，Vol 3，S.Niazi.，CRC Press，2004中。

所述组合物可以直接局部施用到皮肤受影响的区域，例如，使用指尖，海绵涂药器，棉花涂药器，通过喷雾，烟雾化作用，或任意其他适当的方法。本文提供的组合物可用于治疗对使用四环素类药物(如米诺环素)的治疗敏感的任意病况。例如，本文提供的组合物可以用于治疗下述病况，如痤疮，脓疱病，蜂窝织炎，丹毒，毛囊炎，疖，痈，莱姆病和其他皮肤传染病，酒渣鼻，脂溢性皮炎(seborrheic dermatitis)，大疱性皮肤病，表皮结节病，卡波西肉瘤，和嗜中性皮肤病，以及与其相关的炎症。痤疮的类型包括，例如，特别是寻常痤疮，红斑痤疮，聚合性痤疮，暴发性痤疮，革兰氏阴性毛囊炎，和面部脓皮病(pyodermafaciale)。例如，所述组合物可以用于治疗中度至重度痤疮，并且所述痤疮可以是结节性的或囊肿性的。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括将本文提供的局部用组合物施用到需要所述治疗的人或动物的可及的身体表面的步骤。通常，将所述组合物以常规量一周一次或几次或每天施用到皮肤受影响的区域上，至少被治疗的痤疮或病况已经明显减轻或消失。例如，所述局部用组合物可以每天至少一次局部施用，持续至少1个月的时间，或者可以每天一次或两次施用到皮肤上，持续6-52周或甚至更久的时间。应用的次数和治疗疗程将随被治疗病况的严重性、患者考虑等而变化。由此，在某些情形中，所述组合物可以每天应用一次，每天两次，每隔一天一次，每周一至三次，每周1-4次，每3天一次等。

常规量是足以在受影响区域涂抹(例如，薄薄地涂抹)的量。如果需要，可以通过使用分级系统，如Leeds系统(O’Brien，SC.，等人，J.Dermatol Treat 1998；9:215-220)，综合痤疮严重性量度(Comprehensive Acne Severity Scale)(Tan，JK，等人，J.Cutan MedSurg 2007年11月；11(6):211-6)，或综合痤疮分级系统(Global Acne Grading System)(Doshi，A.，等人，Int.J.Dermatol 1997年6月36(6)；416-8)，量化治疗的功效。在一个或多个实施方案中，通过视觉检查受影响区域评估治疗的功效。在一些情形中，甚至如果病况已经明显减轻或消失，也可以继续预防性治疗，作为预防措施。在一些实施方案中，通过评价总损伤计数的减少而评估治疗功效，其中应用本文所述的局部用组合物有效地导致在治疗开始时测量的总损伤计数减少。

溶剂系统和局部用组合物的特征

现在考虑实施例，实施例1证明，在室温和大气条件下，与在相同溶剂系统中的单独的米诺环素(即，非络合的米诺环素)相比较，镁-络合的米诺环素的溶解度作为所述组合物中乙醇和丙二醇浓度的函数。可以看出，镁-络合的米诺环素在包含乙醇和丙二醇的混合物中比其在单独的乙醇或丙二醇中更加可溶。另外，在包含乙醇和丙二醇的混合物中，镁-络合的米诺环素比米诺环素显著更可溶。

如实施例1中证明的，在室温，在所选的包含乙醇、丙二醇和氯化镁的组合物中，盐酸米诺环素具有超过100mg/ml(例如，100mg/ml-约165mg/ml)的溶解度。因此，在某些优选的实施方案中，除了四环素类药物之外，所述局部用组合物还包含前述组分，即，乙醇，丙二醇，和氯化镁。

此外，如实施例1中证明的，本申请人已经发现向本文所述的局部用组合物中添加镁源，如氯化镁，增加四环素类药物(如米诺环素)在一元脂肪醇(如乙醇)和多元醇(如丙二醇)混合物(特别是对于其中醇的重量的量超过所述多元醇的量的组合物)中的溶解度。因此，在一个或多个优选的实施方案中，组合物中醇的重量的量超过多元醇组分的重量的量。

在图1a和1b所示的图表中，盐酸米诺环素的浓度作为溶剂系统中乙醇浓度的函数绘图。图1a和1b二者都表明掺加到所述组合物中的氯化镁显著增加盐酸米诺环素的溶解度，特别是对于单独的乙醇(100％乙醇)和对于在乙醇和丙二醇的混合物中具有高乙醇浓度的组合物。并且，当加入镁盐时，每种组合物成分(例如，一元脂肪醇和多元醇)的相对量需要获得最大的药物溶解度变化。显著地，在实施例1中，当掺加镁盐时，对于乙醇和丙二醇的混合物的溶解的药物的峰值(即，最大)浓度从约25％乙醇转变为约75％乙醇，并且溶解的药物的最大量在掺加镁盐后增加约2倍。

在示例性的局部用组合物中，一元脂肪醇与多元醇的比例超过1:1(w/w)，即，介于1:1与99:1(w/w)之间，或介于3:2与9:1(w/w)之间，或介于2:1与4:1(w/w)之间，并且组合物中多元醇和一元脂肪醇的组合量超过50％(w/w)，或优选地超过组合物的75％(w/w)，或更优选地超过组合物的90％(w/w)。在一些组合物中，乙醇与丙二醇之比超过1:1(w/w)，如1:1至99:1(w/w)，3:2至9:1(w/w)，或2:1至4:1(w/w)，并且丙二醇与乙醇在组合物中的总量超过50％(w/w)，或优选超过组合物的75％(w/w)，或更优选超过组合物的90％(w/w)。在所述组合物中，在一个或多个实施方案中，所述四环素类药物是米诺环素。

当将包含挥发性一元脂肪醇(如乙醇或异丙醇)的组合物施用到皮肤上时，所述挥发性醇通过挥发、渗透或二者的组合快速离开皮肤表面。溶剂含量的这种快速减少可以显著地增加皮肤表面上或皮肤组织上层内活性四环素类药物的浓度。如果物质在剩余的溶剂中的溶解度不足以将所述药物维持在溶液中，所述药物可能形成固相，这将降低后续药物向皮肤的渗透率，原因在于，在渗透到皮肤中之前，药物必须首先克服溶出能垒(dissolution energy barrier)。由于这个原因，如果使用挥发性的一元脂肪醇，其可以优选地高于最大溶解度点的挥发性醇浓度。

在一些组合物中，一元脂肪醇与多元醇的比例超过3:1(w/w)，诸如介于3:1与99:1(w/w)之间，介于3:1与9:1(w/w)之间，或介于4:1与8:1(w/w)之间，并且组合物中多元醇与一元脂肪醇的组合量超过50％(w/w)，或优选超过组合物的75％(w/w)，或更优选超过组合物的90％(w/w)。在一些实施方案中，乙醇与丙二醇的比例超过3:1(w/w)，诸如介于3:1与99:1(w/w)之间，介于3:1与9:1(w/w)之间，或介于4:1与8:1(w/w)之间，并且组合物中丙二醇与乙醇的组合量超过50％(w/w)，或优选超过组合物的75％(w/w)，或更优选超过组合物的90％(w/w)。在所述组合物中，所述四环素类药物是米诺环素。

另外，对于其中多元醇挥发性低于醇的组合物，在皮肤表面上，药物在所述组合物中的浓度通常沉淀得不如不使用多元醇时快速。这种减缓的沉淀速率将允许药物具有更多的时间渗透到皮肤中，这可能对于提高药物向目标组织(例如，表皮，真皮，或皮脂腺)或目标体液(例如，皮脂)递送的效率有益。

现在看实施例2，该实施例提供差示扫描量热法数据，其证明实施例1中所述的溶解度差异似乎是由代表种类的组分，即米诺环素、镁、乙醇和丙二醇的相互作用形成的共晶体导致的。

实施例3提供短期稳定性数据，表明米诺环素在单独的丙二醇中不是充分稳定的，甚至当通过镁的存在进行稳定时。相反，通过组合物乙醇与丙二醇产生稳定的组合物。镁稳定作用显著地提高组合的组合物的稳定性，这可以由表2的结果看出。优选的组合物是具有少量差向异构体形成的那些，此时外推至18个月的稳定性。其中在所用的加速稳定性条件下差向异构体形成少于约15％的组合物是优选的。

看实施例4，实施例4提供来自对人组织样品的离体药物渗透研究的数据。这些实验定量在局部施用所述组合物后渗透通过皮肤前两层的米诺环素的量，并且证明(i)当用乙醇替换丙二醇时，渗透效率增加，并且(ii)良好的向皮肤的渗透效率。

在一些实施方案中，渗透效率乘组合物中四环素类药物的浓度将理想地超过所述四环素类药物对疮疱丙酸杆菌ATCC 6919的最低抑菌浓度。在一些实施方案中，四环素类药物的渗透效率(在实施例4所述的离体人皮肤样品中)超过5％，更优选超过8％，或甚至更优选超过10％。在一些实施方案中，四环素类药物的渗透效率在约5％至30％的范围内，或在约5％-10％的范围内，或更优选地，在10％-30％的范围内。

考虑实施例5提供的结果，该实施例表明，镁的存在改变了米诺环素的MIC值，这表明米诺环素与镁形成复合物(与钙不形成)。MIC值(或，备选地，其指定的倍数)可以用作确定是否已经获得进入目标组织的充分递送的阈值。实施例4的数据表明，对于充分低于实施例1中检测的溶解度限度的米诺环素浓度，渗透效率足以超过米诺环素的MIC。

实施例6和7表明，不仅包含在本文提供的制剂中的局部施用的米诺环素渗透到皮肤中，而且其优先且有利地分配到皮肤的皮脂腺和油质储蓄库中。显示是数据来自使用基质辅助的激光脱附/离子化飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight mass spectrometry，MALDI-TOF质谱)(实施例6)和荧光显微镜检(实施例7)技术的实验。例如，参见图4a-c和图5a-c，以及图6。基于该数据，似乎四环素被优先递送到在皮肤上和皮肤内的富含脂质的组织中。

实施例8提供来自Sprague-Dawley大鼠体内研究的数据，这表明重复性每日局部施用本发明所述的组合物是非刺激性的，并且不对皮肤染色。因此，在一个或多个实施方案中，当施用到皮肤上时，所述局部用组合物是非刺激性的。在另一个实施方案中，当施用到受试者的皮肤上时，所述局部用组合物是非刺激性的。

实施例9描述了对于特定溶剂系统初步优化镁与四环素类药物的摩尔比的方法。该方法表明制剂内药物的稳定性与其荧光发射之间大致的相关性。利用该方法，可以确定镁与米诺环素的最优比例。

按照本公开内容，实施例10中描述了所述局部用组合物的多种示例性的实施方案。

为了给所述制剂的稳定性提供另外的支持，实施例11提供了6个月的室温稳定性数据，所述数据表明，在包含丙二醇、乙醇和氯化镁的溶液中，米诺环素是稳定的。

除了上文关于实施例6和7所述的数据之外，实施例12对本发明所述的液体制剂的优异的皮肤吸收提供了进一步的支持，并且另外证明了所述制剂相较于示例性的亲脂性制剂的优良的性质。与表9所述的亲脂性制剂相比，在示例性的1％和4％两种米诺环素制剂中，吸收效率是本文提供的亲水性制剂(包含米诺环素、氯化镁、乙醇、丙二醇和偏亚硫酸氢钠)的2-3倍高。另外，当与亲脂性制剂相比较时，本发明所述的制剂导致在所治疗的皮肤中检测到更低量的米诺环素差向异构体，这表明所述制剂相较于亲脂性制剂的提高的稳定性。荧光成像结果表明，当与示例性的4％亲脂性制剂相比较时，4％的米诺环素制剂BPX-4M向角质层、表皮和毛囊皮脂腺的多层递送增加量的米诺环素。

当局部施用到皮肤上时，所述制剂有效的提供治疗有效剂量的四环素类药物；例如，参见实施例13。所述支持实施例还表明所述组合物的无刺激性性质。例如，参见实施例14、15和18。另外，诸如实施例16所述的那些的结果证明，对于本文提供的组合物，以在0.0mg/cm²/天-0.5mg/cm²/天的范围，或优选在约0.025mg/cm²/天-约0.5mg/cm²/天的范围，或更优选在约0.025mg/cm²/天-约0.25mg/cm²/天的范围的米诺环素剂量水平，可以安全地对哺乳动物进行重复给药。较高剂量的米诺环素允许更加积极的治疗(aggressivetreatments)。优选至少0.01mg/cm²/天的剂量或至少0.025mg/cm²/天的剂量。

实施例19表明，当在存储条件下放置持久的时间时，与在本文所述的类型的液体局部用组合物中使用亚硫酸盐系抗氧化剂相关的一些优点。该实施例突出了这样的认识：本文提供的包含亚硫酸盐化合物(作为抗氧化物)的组合物比包含非亚硫酸盐抗氧化剂的组合物显著更稳定。当在代表性的存储条件下存储时，优选的组合物表现出低的基线4-表-米诺环素相对浓度和每周4-表-米诺环素相对浓度的少量增加或没有增加。例如，在一些优选的组合物中，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度小于5.0％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量(评价)时每周增加少于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。在一些优选的实施方案中，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度小于1.0％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周增加少于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。更优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度小于1.0％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周增加少于0.70％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度在约0.50％-约1.00％的范围内，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周以0.20％-约0.40％范围内的比率约增加，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。

另外，优选的组合显示高活性米诺环素相对浓度和活性米诺环素相对浓度每周小的减少或没有减少。例如，在一些优选的组合物中，在基线测量时，活性米诺环素的相对浓度为至少95.0％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周减少小于1.50％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。在一些优选的组合物中，在基线测量时，活性米诺环素的相对浓度为至少98.0％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周减少小于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。更优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度为至少98.50％，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周减少小于0.70％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度在约97.0％-约99.0％的范围内，并且当在密闭玻璃瓶内在40℃经过4周的时间测量时每周以约0.30％-约1.00％范围内的比率减少，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。用于确定4-表-米诺环素和活性米诺环素的相对浓度的计算记载在实施例19中。

如在实施例19中所示，包含亚硫酸盐化合物作为抗氧化剂的代表性的组合物，即，组合物2-ss、3-sb、17-ps和1-sbs，当在上文所述的存储条件下检验时，在陈化的组合物和基线组合物之间没有明显的颜色差异。其余包含非亚硫酸盐的组合物中的每一种表现出明显的颜色差异。这些颜色差异的强度不与活性米诺环素相对浓度的降解量相关。优选的组合物在密闭玻璃瓶中在40℃陈化4周后没有显示明显的颜色变化。在优选的组合物中，在3维RGB空间中的距离方面，在密闭玻璃瓶中在40℃陈化4周后的颜色变化小于50，或更优选小于20，其中每个值以0-255的范围测量。在3维RGB空间中的距离按照下式计算：

距离_RGB＝((ΔR)²+(ΔG)²+(ΔB)²)^0.5。

在整个所述文件中描述了所述制剂的另外的优点和特征。

因此，一些有利的特性与本文所述的制剂和局部治疗方法相关。所述局部用制剂将四环素有效地直接递送到表皮和皮脂腺。并且，本文所述的制剂易于应用，不粘滞，并且不堵塞皮肤。所述制剂提供治疗有效量的四环素药物(例如，米诺环素)向存在疮疱丙酸杆菌的皮脂腺的有效递送，并且没有表现出刺激潜力或表现出最低限度的刺激潜能。并且，所述制剂在延长的时间和在应用时是稳定的，例如，由形成最少量的差向异构化产物所证明的。

实施例

提出下述实施例以为本领域普通技术人员提供关于如何制备和评价所述组合物、其组分、活性成分、溶剂等以及相关的方法的完全公开和描述，并且目的完全是示例性的。因此，所述实施例绝不是意欲限制本发明人视作其发明的范围。存在多种变化和组合，例如，组分浓度、需要的溶剂、溶剂混合物、抗氧化剂和其他可以用于优化组合物特征的混合物参数与条件，所述组合物特征如纯度、产量、稳定性、气味、颜色、粘度、渗透性等。这些被视为充分在本公开内容的范围内。

除了另外指明，在下述每一个实施例中，所用的盐酸米诺环素的形式为盐酸米诺环素二水合物，在后续实施例中其被简称为“盐酸米诺环素”。本领域技术人员知晓可以怎样使用米诺环素的其他盐和水合物来制备组合物。

实施例1

米诺环素与镁稳定的米诺环素的溶解度

进行研究以评估氯化镁(MgCl₂)对米诺环素在乙醇与丙二醇的混合物中的溶解度的影响。乙醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、丙二醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和1,8-桉树脑(Penta International Company，Livingston，NJ)的混合物按照表1所述制备。所述组合物对应于下述大致重量比的乙醇和丙二醇：0:1，1:3，1:1，3:1，4:1，9:1，和1:0。

表1.用于溶解度实验的具有不同量的氯化镁的混合物

使用表1所示的两种测试物质。第一种测试物质为“具有MgCl₂的米诺环素*HCl”，其通过以1:1的比例(w/w)混合盐酸米诺环素(Euticals S.P.A，Origgio，Italy)与氯化镁(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)形成。(如之前所述，在提及“盐酸米诺环素”的实施例中，使用的是“盐酸米诺环素二水合物”。)混合物在涡旋混合器(VORTEX GENIE，Scientific Industries，Inc.Bohemia，NY)中以大约3000rpm混合，直到得到均匀的混合物，或持续至少3分钟。氯化镁(无水)与盐酸米诺环素的1:1(w/w)比例对应于约5.6:1的镁与米诺环素的摩尔比。第二种测试物质，“米诺环素*HCl”是单独的盐酸米诺环素。

将两克(2.0g)表1所列出的每种溶剂放置在4mL透明玻璃瓶(Phenomenex，Torrance，CA)中。向每个玻璃瓶中加入少量的所述测试物质，将盖子盖到小瓶上，并且将小瓶用涡旋混合器(VORTEX GENIE，Scientific Industries，Inc.Bohemia，NY)搅动并超声处理(Branson 3210，Branson Ultrasonics，Danbury，CT)。重复这些步骤，直到添加的测试物质在超声处理后不再完全溶解。然后将每个玻璃瓶用盖子紧密密封在暗条件下在室温放置过夜。这些步骤在每个玻璃瓶中产生饱和溶液。从每个小瓶的上部取出该混合物液体部分的100微升(μL)样品。在该取样步骤过程中，小心不要扰乱在每个小瓶底部的任何沉淀的固体。将这些样品部分分别在微量离心机(SORVALL RMC 14，DuPont SustainableSolutions，Wilmington，DE)中以12,000rpm离心2分钟。将20微升(μL)的上清部分与乙醇以1:49的比例混合。将5微升(μL)得到的混合物部分用于HPLC方法，以如下一段所述进行米诺环素评估。

除非记载了变化或备选的方法，对于本文所述的所有描述测量的米诺环素浓度的实施例使用本段所述的HPLC方法和下一段所述的计算。将5微升(μL)样品注射到高效液相色谱机器(HPLC)(Agilent，Santa Clara，CA)中。HPLC柱(Phenomenex，Inc.Torrance，CA)为C-18柱100×4.6mm，具有5微米(μm)的粒度。HPLC系统还使用保护柱(Phenomenex，Inc.)和由下述组成的移动相：12％(v/v)二甲基甲酰胺(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)的碱溶剂，8％四氢呋喃(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)，18mM EDTA(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)，和0.12M草酸铵(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)。将移动相pH调整为7.1-7.2。HPLC流速为1mL/分钟，柱的温度为40℃，检测波长为280nm，运行时间为至少15分钟。基于外部校准确定溶液中米诺环素的量。这允许计算盐酸米诺环素的浓度。

通过评价4-表-米诺环素的相对浓度变化来定量米诺环素向其差向异构体的降解，4-表-米诺环素的相对浓度以4-表-米诺环素峰面积除以4-表-米诺环素峰面积与活性米诺环素峰面积的和而计算。作为独立的量化，通过评价活性米诺环素的相对浓度来定量稳定性，所述米诺环素的相对浓度以活性米诺环素峰除以在HPLC色谱仪中观察到的所有峰的峰面积而计算。在这一意义上，术语所有峰意指在溶剂峰洗脱后出现的各个峰。溶剂峰通常在前2分钟内洗脱出来，因此，所有峰的测量在2分钟的点起始。本领域技术人员应该清楚，溶剂峰的位置可以变化，并且将相应地调节起始点。

对于该实施例1，得到的浓度描述溶解在最先添加到每个玻璃瓶中的2克溶剂混合物中的浓度。

在图1A和1B中，将得到的盐酸米诺环素的浓度作为溶剂系统中乙醇浓度的函数绘图。因此，这些图表表示对于具有1％桉树脑(图1A)和不含桉树脑(图1B)的组合物，活性米诺环素的溶解度，其作为所述组合物中乙醇重量浓度的函数。结果证明，添加氯化镁显著增加盐酸米诺环素的溶解度，特别是对于单独的乙醇(参见在100％乙醇浓度的数据点)和对于在乙醇与丙二醇混合物中具有高乙醇浓度的组合物。另外，在存在镁盐的条件下，对于乙醇与丙二醇混合物的峰值浓度从约25％乙醇转变为约75％乙醇。

实施例2

DSC测量

进行本实验，以评估相对于盐酸米诺环素与氯化镁各自的熔点，盐酸米诺环素、氯化镁、乙醇和丙二醇混合物的熔点是否存在差异。

通过在涡旋混合器(VORTEX GENIE，Scientific Industries，Inc.Bohemia，NY)中以约3000rpm制备盐酸米诺环素(Euticals S.P.A，Origgio，Italy)与氯化镁(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的1:1比例(w/w)的测试混合物，直到得到均匀的混合物或持续至少3分钟。将干燥的混合物放置在陶瓷研砵中，用不锈钢刮铲人工搅拌，同时逐滴加入由乙醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和丙二醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)按3:1比例(w/w)组成的溶液，至均匀地润湿所述混合物。然后，将湿样品轻轻混合，以在环境条件下提供一致的干燥。

使用用铟校正的Q2000 DSC(TA instruments，New Castle，DE)通过差示扫描量热法(DSC)进行热分析。对于盐酸米诺环素、氯化镁、和干燥的测试混合物进行DSC测量。称重2–7mg的样品，并且使用氮气排气，以10℃/min的加热速率在25℃-250℃范围内在密封的铝盘中进行分析。

干燥的测试物质的熔点与盐酸米诺环素和氯化镁的熔点的比较表明明显的熔点降低，这指示共晶体混合物的形成。

总之，本申请人已经发现，包含四环素类药物、镁源、一元脂肪醇和多元醇的组合物形成共晶体。该共晶体通过下述证明：从所述组合物蒸发溶剂，形成亚稳态沉淀物，用于用差示扫描量热法(DSC)进行评估，并且对于干燥的成分，将所述结果与DSC结果进行比较，从而确定是否获得熔点降低。

实施例3

米诺环素和镁稳定的米诺环素的稳定性

使用实施例1所述的组合物，对于示例性的盐酸米诺环素、氯化镁、乙醇和丙二醇的混合物，评估组分贡献对于药物功效稳定性和差向异构体形成的影响。

在密封玻璃瓶内在室温条件下在暗处存储后第1天和第6天，测量组合物中米诺环素的降解和稳定性。

在表2中，4-表-米诺环素的形成外推至18个月的时间。该外推计算设想对于第1-6天降解机制以相同的数学速率继续。这代表最坏的情形值，并且不考虑组合物内4-表-米诺环素可能与米诺环素达到平衡的事实，使得极高水平的4-表-米诺环素，如99.76％和100％，可能不表示物理现实。在这样的情形中，这些值仅表示在达到平衡之前，差向异构化反应将继续。

图2a和2b是具有1％桉树脑的组合物的作为按重量计的乙醇浓度的函数的活性米诺环素的相对浓度的图表。图2c和2d是不含桉树脑的组合物的作为按重量计的乙醇浓度的函数的活性米诺环素的相对浓度的图表。

表2. 4-表-米诺环素的相对浓度

表3表示，在室温存储1天和6天后，对于每种制剂，由所有峰面积标准化的米诺环素浓度。外推计算设想对于第1-6天降解机制以相同的数学速率继续。

表3.活性米诺环素的相对浓度

丙二醇是吸湿性的，其典型地有助于具有显著量的丙二醇的组合物中四环素类药物的不稳定性。然而，如本实施例所示，证明具有中等量的丙二醇(或其他相似的吸湿性多元醇)的组合物是稳定的，特别是在存在镁盐的条件下。

实施例4

向离体人皮肤的渗透

使用离体皮肤组织进行渗透实验，以确定当包含在包含镁源、一元脂肪醇和多元醇的组合物中并施用到皮肤表面时活性四环素类药物是否以足以得到需要的治疗效果的充分的浓度渗透到皮肤中。对于四名不同的人捐献者评估进入腹部皮肤的渗透。测试化合物包括由盐酸米诺环素、氯化镁、乙醇和丙二醇组成的组合物。

以表4所述的比例，制备乙醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、丙二醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和1,8-桉树脑(Penta International Company，Livingston，NJ)的溶剂混合物。向每种溶剂混合物添加0.5％(w/w)盐酸米诺环素(Euticals S.P.A，Origgio，Italy)和0.5％(w/w)氯化镁(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的等价物。

表4.用于皮肤渗透实验的溶剂混合物

将所述组合物以12mg/cm²的剂量施用到来自四名人捐献者的皮肤样品上。将组织保持在潮湿的环境中，以限制组织变干，并且在32℃温育3-4小时。在温育时间期结束时，用第一干纱布垫、浸有70％异丙醇的纱布垫、最后用干纱布垫将过量的组合物从表面上擦掉。进行胶带剥离，去除角质层的上层。从测试区内采集六(6)毫升钻取活组织检查样品。使用酸化的甲醇从每份活组织检查样品提取米诺环素。按实施例1所述的相同方法，通过高效液相色谱分析上清。

对于每个浓度，四名捐献者样品的平均值显示在图3中。结果证明，当用乙醇替代丙二醇时，渗透效率升高；也证明了良好的向皮肤内的渗透效率。

实施例5

最低抑菌浓度(MIC)测量–疮疱丙酸杆菌

通过测量最低抑菌浓度(MIC)评估米诺环素的抗微生物活性。也对一些其他的物质和组合评估MIC，并且作为米诺环素MIC值的倍数计算相对MIC值。使用临床和实验室标准研究所(the Clinical and Laboratory Standards Institute)所述的肉汤微量稀释法测量MIC，并且表示测试物质完全稀释细菌在生长培养基中的明显生长的最低浓度。

将测试物质溶解在水中，通过两倍连续滴定稀释，共得到11个浓度。通过添加196μL接种了疮疱丙酸杆菌ATCC 6919细菌的肉汤培养基而准备96孔平板。向每个孔中添加测试物质稀释液的4μL等分试样，使每个孔的总体积为200μL。所检测的测试物质浓度在0.0078-16μg/mL范围内。将平板在厌氧条件下在37℃温育2天。通过TECAN INFINITE F50 ELISA微量平板读数仪(Switzerland)，以620nm波长的吸光度模式，读取96孔平板。评价每个孔是发生生长还是被抑制。将生长被抑制的最低浓度记录为MIC。每种测试物质一式两份进行评价。该实验还包括对照：赋形剂对照(水)，不处理的对照(仅培养基)和阳性对照(活性参比药剂，四环素)。

对三种测试物质测量MIC值：1)米诺环素(Euticals S.P.A，Origgio，Italy)，2)无水氯化镁(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，part number M8266)，和3)米诺环素与无水氯化镁1:1.5比例(w/w)的混合物。

结果表明，与氯化镁混合的米诺环素具有0.5微克/毫升的MIC值。单独的米诺环素具有0.125微克/毫升的MIC值。单独的氯化镁在所测试的任意浓度都不抑制生长。

因此，所述结果表明，氯化镁与米诺环素相互作用，从而提高了米诺环素的MIC。另外的HPLC测量表明，这种减少不是由于活性米诺环素经由差向异构化的降解导致。相反，镁表现为与米诺环素强相互作用。

实施例6

米诺环素在油性组织中的优选位置和向表皮组织的渗透的MALDI-TOF证明

局部用药物组合物必须渗透到需要的组织或物质中，从而具有需要的作用。对于皮肤病学疾病，如痤疮，需要渗透到皮肤、皮脂细胞和/或皮脂内。理想地，与从药理学观点来看较不重要的区域相比，在所选的区域内，局部用药物的浓度较高，由此潜在地提高给定剂量的效用并减少副作用。

将局部用米诺环素施用到离体人面部皮肤表面上，并且使用基质辅助的激光脱附/离子化飞行时间(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight，MALDI-TOF)质谱法对皮肤的垂直剖面成像。数据表明，米诺环素不仅确实渗透到皮肤组织中，而且在皮脂腺和在富含皮脂的区域发现较大的浓度。

MALDI-TOF质谱法是包括用紫外线激光对已经用基质物质包覆的组织进行可控性消融的方法。这引起样品的消融和脱附。得到的离子化的颗粒发射到气相质谱仪中，以测量消融物质的质谱特征。消融步骤使用波长为377nm的氮气激光，其被涂覆在皮肤组织样品上的化学机制非常强地吸收。所述激光具有高强度和短脉冲持续时间(～1毫秒)，导致在每个聚焦激光能的位置(x-y方向)的表面基质层的消融。使用控制的x-y移动台(translationstage)可以精确地移动皮肤组织样品。由此，可以产生皮肤组织样品的精确的二维“图像”。

使用飞行时间质谱法允许精确的鉴定所选物质在皮肤组织样品内的每个二维位置处的存在。例如，米诺环素具有约458.4的分子量：电荷比例(即“m/z”)，并且皮脂组分具有约494.36的m/z值。在皮肤内，具有756.1的m/z值的磷脂酰胆碱主要位于皮脂腺内。由此，这些m/z值可以用于利用MALDI-TOF质谱法鉴定皮肤中富含皮脂的区域和皮脂腺位置。这些可以用于评估高米诺环素浓度的位置是否与富含皮脂的区域和/或皮脂腺相关。以这种方式，可以确定在富含皮脂的区域和/或皮脂腺中米诺环素的相对浓度。

将新鲜的人面部皮肤切片在32℃培养箱中在用盐水溶液(0.9％氯化钠溶液)蘸湿的一片纱布上放置30分钟。将一种测试组合物涂覆到皮肤表面上，每单位面积上涂覆控制质量的组合物。将该组织样品在潮湿环境中在32℃温育24小时。在温育时间期结束时，使用第一干纱布垫、浸有70％异丙醇的第二纱布垫、最后用干纱布垫将过量的组合物擦掉。从测试区内采集两份六(6)毫升钻取活组织检查样品。从所述测试区外采集另外两份六(6)毫升钻取活组织检查样品，作为对照。将所述钻取活组织检查样品包裹在铝箔中，并使用液氮冷冻，直到它们准备好用于MALDI-TOF质谱法分析。

在MALDI-TOF质谱法分析之前，使用低温恒温器将冷冻的组织切成12-微米(μm)的垂直切片。取用连续的切片，从而可以在来自MALDI-TOF质谱法分析的图像与用苏木精和曙红(H&E)染色的组织之间进行比较。对于用MALDI-TOF质谱法分析的切片，使用50％乙腈(ACN)喷枪将2,5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液涂敷到组织上。在得到的组织上进行MALDI-TOF质谱法分析(Protea Biosciences，Inc.，Morgantown，WV)，质谱法通过飞行时间质谱仪(ultrafleXtreme，Bruker Daltonics，Inc.，Billerica，MA)以反射阳离子模式进行。

评估两种不同的组合物。第一种组合物包含67.77％(w/w)乙醇(SpectrumChemicals，Gardena，CA)、18.59％(w/w)丙二醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、9.83％(w/w)1,8-桉树脑(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、1.03％(w/w)羟丙基纤维素(Ashland，Inc.，Covington，KY)、1.34％(w/w)ODS-改性二氧化硅(按照美国专利申请号14/532,987中所述的方法制备)、0.99％(w/w)米诺环素碱(Hovione Inter Ltd.，Loures，Portugal)，和0.45％(w/w)氯化镁(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)。

第二种组合物包含68.03％(w/w)乙醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、20.15％(w/w)丙二醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、10％(w/w)1,8-桉树脑(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、1.39％(w/w)羟丙基甲基纤维素(Dow Chemicals，Pittsburg，CA)、0.30％(w/w)米诺环素碱(Hovione Inter Ltd.，Loures，Portugal)和0.13％(w/w)氯化镁(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)。

图4a和5a显示来自对照组织(即，没有涂覆测试组合物的皮肤样品)和第一“治疗的”组织(即，离体涂覆第一测试组合物的皮肤样品)的H&E-染色的皮肤切片。对照组织和第一治疗的组织都来自同一名人捐献者。图4b，4c，5b，和5c显示从在MALDI-TOF质谱法分析过程中收集的数据建立的图像。图4b和4c显示来自对照组织的图像。图5b和5c显示来自第一治疗的组织的图像。图4b和5b显示从对应于458.5的m/z值(其与米诺环素相关)的MALDI-TOF质谱数据建立的图像。在这些图像中，较亮的色调对应于较高的米诺环素浓度。图4c和5c显示从对应于494.36的m/z值(其与皮脂组分相关)的MALDI-TOF质谱数据建立的图像。在这些图像中，较亮的色调对应于较高的皮脂浓度。基于图5a、5b和5c的比较，表明米诺环素渗透到皮肤中，较高浓度的米诺环素位于皮肤的表皮和富含皮脂的区域中，而在对照组织中没有检测到米诺环素。

第二个类似的(非对照)实验通过使用MALDI-TOF质谱法检测m/z值为458.3的米诺环素和m/z值为756.1的磷脂酰胆碱证明了较高的米诺环素浓度与皮脂腺之间的关联性。

由此，结果表明，高浓度皮脂液和/或磷脂酰胆碱的区域与高浓度米诺环素的区域强烈相关。因此，该实验表明，米诺环素渗透到皮肤组织样品内，并且米诺环素强分配到皮肤富含皮脂的区域和皮脂腺中。没有涂覆测试组合物的对照样品没有显示可检测到的米诺环素。

实施例7

米诺环素和镁稳定的米诺环素的渗透和在皮肤富含脂质的部分中的分配

可以利用组织学切片的荧光显微镜检来证明多种四环素类药物在皮肤层和组织结构中的位置。不同的皮肤病学病况或疾病可以受益于药物对皮肤内不同位置的优先靶向。例如，如果四环素类药物被递送到皮脂腺，则可以有利地改善痤疮的治疗。另一方面，如果四环素类药物被递送至表皮，则可以有利地改善银屑病的治疗。

进行两个实验来鉴定所述组合物在皮肤内的位置。制备两种组合物。第一种组合物包含64.89％(w/w)乙醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、17.8％(w/w)丙二醇(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、9.41％(w/w)1,8-桉树脑(Penta InternationalCompany，Livingston，NJ)、0.99％羟丙基纤维素(Ashland，Inc.，Covington，KY)、4.2％(w/w)ODS-改性二氧化硅(按照美国专利申请号14/532,987中所述的方法制备)、0.1％(w/w)偏硫酸氢钠(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)、1.0％(w/w)盐酸米诺环素(RIAInternational，East Hanover，NJ)(约0.86％(w/w)米诺环素游离碱等价物)和1.61％(w/w)氯化镁(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)。第二种组合物包含61.97％(w/w)乙醇、17％(w/w)丙二醇、8.99％(w/w)1,8-桉树脑、0.94％(w/w)羟丙基纤维素、4.0％(w/w)ODS-改性二氧化硅、和0.18％(w/w)偏亚硫酸氢钠、3.84％(w/w)盐酸米诺环素(约3.3％(w/w)米诺环素游离碱等价物)和3.08％(w/w)氯化镁。

将大约50mg/cm²的这些组合物中的每一种涂覆到离体人组织样品上，并且温育24小时。然后，将组合物从皮肤上清除，包埋在最佳切割温度化合物(Optimal CuttingTemperature compound，OCT)中，冷冻，并且使用低温恒温器切片，切成约15微米(μm)厚的横断组织学横切面切片。将该组织学切片用荧光显微镜检查。激发波长范围为340-480nm，发射波长范围为620-700nm。

将第一种组合物涂覆到图6中照亮的组装的上皮肤表面(即角质层)上。显示米诺环素渗透到角质层、有活力的表皮、真皮表皮接合部、真皮、毛囊和皮脂腺中。显微照片的较亮(粉色)区域表示米诺环素的荧光。米诺环素集中在上表皮和皮脂腺中。米诺环素向皮脂腺的这种靶向性递送表明所述组合物对于痤疮治疗是有利的。

第二个实验评价组合物内米诺环素的浓度怎样影响米诺环素的吸收。将第一种和第二种组合物涂覆到皮肤样品上，并且如第一个实验那样温育和制备。然后，将它们与来自同一捐献者的未处理的皮肤组织样品进行比较。荧光显微照片显示在图7a-c中。图7a显示未处理的组织学切片。图7b和7c分别显示来自用第一种和第二种组合物治疗的皮肤的组织学切片。增加的米诺环素浓度表明米诺环素在皮肤内和皮脂腺中剂量依赖性的增加。

这两个实验的结果证明，除了将四环素类药物递送到所有皮肤层中之外，所述四环素类药物被优先递送到皮脂腺和角质层中。这两个结构都富含脂质，这表明四环素类药物向皮肤上和内部的富含脂质的组织的优先递送。由于四环素类药物被优先递送至皮脂腺，并且已知四环素类药物对于痤疮的治疗是有益的(口服服用时)，这些结果证明了所述组合物用于痤疮治疗的用途。

实施例8

体内大鼠重复剂量研究

皮肤刺激和染色

当以高浓度涂覆到皮肤上时，一元脂肪醇(如乙醇)和多元醇(如丙二醇)的混合物可能潜在地是刺激性的，所述高浓度如在包含50-99.9％(w/w)的这两种物质的组合物中，在包含70-99％(w/w)的这两种物质的组合物中，或在包含90-99％(w/w)的这两种物质的组合物中。本实施例评价诸如本文提供的包含四环素类药物和镁源的组合物是否导致此类刺激性。

在用安慰剂制剂或用包含约0.5重量％、1重量％、2重量％或4重量％的米诺环素的四种制剂(如下表5所述)中的一种处理14天后，评估盐酸米诺环素的皮肤吸收和血浆水平。组合物按照表5所述的比例制备。

表5.使用的组合物(所有的百分数以重量列出(即(W/W))

对十只雄性Sprague-Dawley大鼠评价刺激并评分。在实验开始时，将每只大鼠的前腹或后腹上的皮肤片(两个4cm²区域)剃毛，并且将大鼠随机分成5个处理(每组接受表5所列的一种制剂的涂覆(0-B，0.5-B，1-B，2-B，或4-B，分别对应于安慰剂和约0.5％，约1.0％，约2.0％和约4.0％米诺环素等价碱))，以10mg或20mg/测试区域的剂量涂覆。每种组合物每天涂覆到一对大鼠的两个剃毛片中的每一个上，每种组合物共4个测试部位。在14天的时间内，大鼠在每个4cm²的区域接受10mg或20mg的一种组合物(即，2.5mg/cm²或5mg/cm²)。在每次24小时的治疗后，将涂覆部位用2％肥皂液清洁，然后用浸有1x PBS的纱布垫清洁，然后晾干。每天拍摄动物的白光图像，如UV图像一样。观察直至超过72小时。以多至20mg/4cm²区域的量每日涂覆每种组合物(0.5％，1％，2％和4％米诺环素游离碱等价物)没有产生任何明显的红斑、发红、刺激和/或浮肿。在任意处理中，没有观察到异常的重量变化；在血液中也没有检测到米诺环素。由此，关于皮肤刺激性的大鼠体内研究表明在治疗部位处或治疗部位之外没有明显的红斑或浮肿。

另外，在14天的重复涂覆研究结束时，对于任意的大鼠，都没有观察到皮肤染色，并且在实验结束时，将所述组合物从皮肤上润洗掉时，没有观察到残留的荧光。这表明，尽管涂覆的米诺环素的浓度相对高(多至5mg/cm²的组合物)，所述组合物不染色。

最后，确定对于制剂系列的皮肤吸收效率。对于0.5％、2％和4％米诺环素制剂，对10mg/4cm²和20mg/4cm²片计算的效率非常相似(～5-8.5％的效率)。1％的米诺环素制剂在两个处理量都表现出较高的效率，即，对于10mg/4cm²片约为12.9％，对于20mg/4cm²片约为19.6％。对于1％的制剂，10mg/4cm²片组容易满足在皮肤中获得指示治疗剂量的局部浓度的渗透需要。以约5.3μg/cm²，1％制剂和10mg/4cm²片的米诺环素吸收转换为皮肤中的0.95μg/g米诺环素，这至少比抑制疮疱丙酸杆菌所需的最低抑菌浓度(MIC)高一个量级。

实施例9

作为镁浓度的函数的荧光强度

如之前所述，镁有助于组合物内米诺环素的稳定。本实验目的在于确定组合物中镁的最佳水平。可以利用荧光强度来估算近似比例，超出该近似比例添加更多的镁不明显改善稳定性和/或溶解度。进行荧光强度研究来评价镁的浓度，在所述镁的浓度，在添加更多的镁后荧光增加的速率明显和/或突然下降。

77.59％(w/w)无水乙醇、21.2％(w/w)丙二醇、0.76％(w/w)盐酸米诺环素(约0.66％(w/w)的米诺环素FBE)、0.39％(w/w)羟丙基纤维素HF(HPC HF)、0.06％(w/w)偏亚硫酸氢钠的碱溶液。向4mL(3.13g)所述碱溶液中以4.4％(w/w)的浓度加入无水氯化镁，产生具有464.3mmol/kg的氯化镁重量摩尔浓度的溶液。镁与米诺环素之间的摩尔比为30.18。将制备的溶液用碱溶液连续2倍稀释，形成以不同的镁：米诺环素摩尔比包含氯化镁的碱溶液制剂：0，0.47，0.94，1.89，3.77，7.55，15.09和30.18。

荧光测量的结果和在50℃7天后4-表-米诺环素浓度的测量结果显示在表6中。

表6.用于荧光实验的组合物(所有百分数以重量列出(即W/W))

MNC＝米诺环素

使用具有380nm的激发波长的荧光分光光度计测量所得到的组合物中的每一种的荧光强度。以473nm的波长评估荧光发射强度。不含氯化镁的样品的荧光低于测量装置的检测界限。如图8b所示，当镁与米诺环素之间的摩尔比例从0增加至约3.8时，荧光强度急剧增加。对于高于约3.8的摩尔比，作为摩尔比函数的增加速率明显低于对于在约3.8以下的摩尔比相应的增加速率。高于该水平增加氯化镁的量不继续明显增加所述组合物的荧光。由于荧光强度与局部环境中四环素类药物(如米诺环素)的刚性相关，数据表明，当混合物中摩尔比增加至约3.8时，在该组合物中形成的米诺环素-镁复合物变得更加刚性。换言之，超过1:1或2:1的镁：米诺环素摩尔比，米诺环素的结构刚性继续明显提高，并且对于该组合物，直到摩尔比超过约3.8，才达到其初步的平台。因此，对于按照本文的教导构建的其他组合物，3.8:1的摩尔比可能是不同的。

通过监测上文所述的每种制备的样品中的差向异构体形成评估米诺环素的稳定性。在炉子中在50℃强制热降解之前和强制热降解7天后，通过HPLC分析测量差向异构体4-表-米诺环素的量。差向异构体峰面积与差向异构体峰面积和活性米诺环素峰面积的和之间的比例提供每种组合物中米诺环素的稳定性的指示。以对于所述样品在强制热降解之前和之后收集的该比例的差异，计算差向异构体的形成。较高的镁：米诺环素摩尔比对应于较低的差向异构体形成。添加镁高于约3.8的摩尔比减少差向异构体形成。然而，差向异构体形成所减少的量减少较高的摩尔比例。

荧光的量指示四环素类药物的刚性。图8a是在50℃强制降解7天后4-表-米诺环素的浓度变化的图表。4-表-米诺环素浓度的变化指示组合物中米诺环素的稳定性。添加氯化镁多至与米诺环素约3.8:1的摩尔比增加组合物中米诺环素的刚性，并且由此通过减少米诺环素的反应性而提高稳定性。高于该浓度添加氯化镁较少增加稳定性。因此，约3.8:1的摩尔比将是开始所述特定组合物的优化的良好的浓度。

已经提议镁-米诺环素的化学剂量为1:1或2:1。然而，当镁和米诺环素处在形成共晶体的非水性溶剂混合物中时，如在本文所述的局部用组合物中时，这些提议的比例可能不适用。作为镁浓度的函数的米诺环素荧光差异反映化学能水平的差异和离子相互作用的差异。在米诺环素与镁之前形成复合物可以限制差向异构化反映，并且由此促进稳定性。这些方法和结果表明，在所述溶剂系统中，米诺环素与镁离子之间的最佳摩尔比超过2:1。化学计量和精确的比例将取决于组合物中所用的特定组分。

实施例10

6个月的稳定性测量

在室温存储6个月后，检测示例性组合物的多份样品的功效。包含的初始组合物由下述组成：69.36％(w/w)乙醇、17.92％(w/w)丙二醇、9.41％(w/w)1,8-桉树脑、1.0％(w/w)盐酸米诺环素(约0.86％(w/w)米诺环素游离碱等价物)、1.61％(w/w)氯化镁、0.6％(w/w)羟丙基纤维素HF和0.1％(w/w)偏亚硫酸氢钠。对于初始样品和对于在室温条件下在密封小瓶中存储6个月后的样品，使用高效液相色谱测量米诺环素的量。对于初始样品，米诺环素峰在组合物中包含100.0％的米诺环素，并且当通过全部峰面积标准化时，米诺环素表示约97.3％。对于初始样品，当通过全部峰面积标准化时，4-表-米诺环素峰为约0.54％。注意，由于校正曲线的小误差，米诺环素和4-表-米诺环素峰百分比相加超过了100％。存储6个月后，活性米诺环素峰表示在组合物中97.1％的米诺环素，并且当通过全部峰面积标准化时，米诺环素表示约95.0％。因此，这些测量表示在室温存储6个月后，活性米诺环素减少组合物中米诺环素的大约2.9％，并且当通过全部峰面积标准化时，为约2.3％。当通过全部峰面积标准化时，对于在室温存储6个月后的样品的4-表-米诺环素峰为约1.68％，这表示在室温存储6个月后4-表-米诺环素峰增加约1.1％。

实施例11

局部用组合物

表7提供另外的示例性的局部用组合物。所述组合物通过将多种组分如前述混合而制备。如上文提及的，这些示例性的组合物绝不意欲限制本发明人视为其发明的范围。每一列列出了组合物中在每行的左侧列出的组分的重量百分数。每一列加起来总数为100％。

表7.示例性的组合物

实施例12

在离体人面部组织中的米诺环素吸收–定量和定性比较研究

进行皮肤渗透研究以确定并比较离体人面部皮肤组织对在包含1％或4％米诺环素的亲水性液体制剂(分别为BPX-1M和BPX-4M)与美国专利公布号2015/0056149中的亲脂系制剂中的米诺环素的吸收。利用HPLC测量米诺环素的递送，以相对于时间定量测量进入皮肤内的米诺环素的量，并且通过荧光显微镜检来可见地确定米诺环素在毛囊皮脂腺和表皮中的存在。

评价下述局部用制剂。

表8.BPX-1M和BPX-4M制剂

表9.亲脂性制剂

亲脂性制剂记载在美国专利申请公布号20150056149中，组合物244B实施例4部分A。

将人面部皮肤(女性，60岁)从-20℃冰箱中取出并在32℃解冻。去除下皮和脂肪层。并且将皮肤块切成～0.7cm²并放置在以纱布垫内衬的培养皿(以含有0.2％叠氮化钠的0.9％氯化钠水合)上。将皮肤表面吸干。将在-4℃存储的亲水性BPX制剂拿到室温。亲脂性制剂在室温是固体，因此在应用前立即加温(32℃，～3min)至流体液态。使用2.5mg/cm²的剂量。使用移液器，将每种制剂均匀地施用到0.42cm²的目标区域。进行均匀地涂抹，直到变干(～7秒)。将培养皿中的组织不覆盖放置在32℃培养箱中，其中纱布垫保持中度水合。制剂应用持续2和4小时。

表10.应用的量

在每个时间点结束时，将制剂用浸有70％异丙醇的纱布垫去除，然后用干纱布垫吸干。从每个测试部位采集钻取活组织检查样品(6mm)。(皮肤的整个厚度用于每份活组织检查样品。)然后，用500μl酸化的甲醇(将10μl 5N HCl加入到1ml MeOH中)从每份活组织检查样品提取米诺环素，在25℃提取24小时。通过HPLC分析上清(20μl注射，15分钟运行，350nm)。在每份样品中测量完好的米诺环素以及表-米诺环素(4-epi)的峰面积。在提供的处理之间平均捐献者数据。对于Donor data和酸化的甲醇，运行HPLC标准物(0.01，0.1，和1mg/ml)；计算米诺环素碱标准物。

组织学：以上文所述相同的方式制备组织。用移液器均匀地应用对应于50mg/cm²的量(表3)。将培养皿中的组织用石蜡膜盖子盖上在32℃培养箱中放置24小时。在24小时时，轻轻擦掉过量的组合物，并且切下没有应用制剂的皮肤区域。然后将剩余的组织包埋在O.C.T中。切割组织块切片(～12μm)。以每个连续切割的设置之间～100μm的距离连续切割两个切片。载玻片用1x PBS洗涤，然后用甘油滑上盖玻片，以得到荧光图像。

对于亲水性BPX-1M制剂，分别在2和4小时检测5.9μg/cm²和5.3μg/cm²的米诺环素(见图9a)。对于亲脂性的1％制剂，分别在2和4小时检测2.4μg/cm²和2.1μg/cm²的米诺环素(图9a)。在亲脂性安慰剂、BPX安慰剂和未处理的皮肤样品中没有检测到米诺环素。与亲脂性制剂相比，亲水性BPX-1M制剂产生明显更多量的米诺环素。

亲水性BPX-4M制剂在2和4小时分别表现出14.2μg/cm²和13.0μg/cm²的米诺环素(图9b)。对于亲脂性的4％制剂，分别在2和4小时检测3.7μg/cm²和5.8μg/cm²的米诺环素(图9b)。在未处理的皮肤组织中没有检测到米诺环素。类似地，在用亲脂性安慰剂或用BPX-01安慰剂治疗的皮肤组织中没有检测到米诺环素。与亲脂性制剂相比较，亲水性BPX-4M制剂产生明显更多量的米诺环素。在所检测的两个时间点，使用亲水性BPX-1M和亲脂性4％制剂观察到相似的吸收(图10)，尽管所述亲脂质制剂具有是米诺环素药物4倍高的浓度。

在施用之前，在1％的制剂中测量米诺环素差向异构体的浓度，对于BPX-1M制剂和亲脂性制剂，值分别为0.93％和0.86％(图11a)。从治疗的皮肤样品，对于亲水性BPX-1M制剂，在2和4小时时米诺环素差向异构化分别检测为9.7％和10.6％。对于亲脂性1％制剂，在2和4小时时测量，分别确定了37.6％和29.8％的增加的差向异构化值(图11a)。

在施用之前，在4％的制剂中测量米诺环素差向异构体的浓度，对于BPX-1M制剂和亲脂性制剂，值分别为1.08％和0.75％(图11b)。从用亲水性BPX-4M制剂治疗的皮肤样品，在2和4小时时米诺环素差向异构化分别检测为5.1％和4.5％。对于亲脂性4％制剂，在2和4小时时测量，分别确定了7.3％和11.6％的增加的差向异构化值(图11b)。

所述亲水性制剂比所述亲脂性制剂更好地渗透到离体人皮肤中，并且渗透到皮肤中的米诺环素在所述亲水性制剂中不像其在所述亲脂性制剂中那样明显地降解。

与4％的亲脂性制剂(图12A)相比，对于亲水性BPX-4M制剂(图12D)，在角质层、表皮和皮脂腺中观察到荧光强度明显增加。数据显示，米诺环素渗透到疮疱丙酸杆菌所存在的皮脂腺中。为了比较，还显示了关于亲脂性安慰剂(图12B)、没有处理(图12C)和BPX安慰剂(图12E)的荧光强度。

实施例13

体内小型猪7天和20天重复剂量片研究

分别以7天或20天的时间进行小型猪局部施用研究，以评价与包含不同量米诺环素等价碱(安慰剂，0.5％，1％，2％，和4％)的米诺环素制剂的重复剂量应用相关的皮肤和血浆吸收和皮肤毒性。研究使用4只非首次用于免疫的、无抗生素使用的雌性小型猪进行，所述小型猪重20-30kg，12-18月龄。应用的测试制品与实施例8表5所述的相同(即，组合物0-B，0.5-B，1-B，2-B，和4-B)。

在第0天，称重动物并麻醉。将右侧腹和左侧腹区域仔细剪毛并剃毛，标记六个测试的应用部位，每个3cm x 3cm或大致约10cm²。使用正置换移液器(positivedisplacement pipette)局部施用测试制品和对照制品，并且使用金属刮铲涂抹在标记的测试区域。持续剂量给药，直到第6天(组1)和第20天(组2)。在每日剂量给药之前，将治疗部位用肥皂轻轻擦拭，然后用磷酸缓冲盐水(PBS)温和冲洗。每周测量一次体重。

表11：用药位点处理概述

使用改良的Draize评分系统，每天评价用药位点的红斑和浮肿。在第0天剂量给药之前和之后每天拍摄照片。每天肉眼观察皮肤色素沉着。另外，在第0天和剂量给药结束时(组1为第7天，组2为第20天)拍摄UV灯照片。在研究结束时，将动物处死，并且收集用药位点的皮肤组织，以及一个未处理的部位的皮肤组织。

结果：在任意处理都没有观察到异常的体重变化。在整个研究期间没有观察到皮肤刺激，如缺少红斑和浮肿所表明的。在7天或20天治疗疗程内应用的制剂的总量为54.3mg(#151)，91.9mg(#152)，155mg(#251)，和262.5mg(#252)。血浆提取流程的检测下限为1.0ng/ml。在这些分析中，在所分析的任意血浆样品中没有检测到米诺环素。

使用1.0％的制剂，以125mg的应用量在第4天开始观察到所述片短暂和差异性的变黄，并且在实验的持续过程中保持(图1)。125mg的制剂等价于12.5mg/cm²的治疗，其等价于在人中每日应用约5g(假设人脸面积为400cm²)。对于2％和4％的组，观察到变黄，早在治疗的第二天观察到染色。

在所有应用部位，检测到至少1μg/cm²的米诺环素，是在1％、2％和4％制剂组中发现的米诺环素的量的至少2-3倍。米诺环素吸收的增加不是线性的。在20天的处理中，在25mg的应用水平观察到饱和度。7天和20天的组表现出皮肤米诺环素吸收的相似趋势，这表明治疗方案可能接近饱和。

在图像分析(现在所示)中，在0.5％，1％，2％，和4％制剂组中，米诺环素存在于毛囊皮脂腺中。在角质层和毛囊中检测到米诺环素。在4％组中检测到增加量的米诺环素。在7天和20天处理之间没有观察到差异。在本研究中，甚至在0.5％25mg应用组中，观察到至少1.03μg/cm²的米诺环素吸收，这似乎满足在皮肤内获得指示治疗剂量的局部浓度的渗透需要。以～1.03μg/cm²，这转换为在皮肤中0.18μg/g的米诺环素，其至少是高于抑制疮疱丙酸杆菌所需要的MIC的量级。

实施例14

体内大鼠单一剂量研究

皮肤刺激性、药物代谢动力学剂量范围和组织学

在局部施用了包含在含有乙醇和丙二醇(例如，50-99.9w/w％)的溶剂系统中的米诺环素和镁盐的组合物的大鼠中进行皮肤刺激性研究；还评价药物代谢动力学参数。所应用的每种组合物的水含量在0.5％-1％的范围内，如通过Karl Fischer滴定测量的。每种组合物的pH值在3.9-4.4的范围内。评价单一剂量药物代谢动力学参数，并且证明了对局部施用的米诺环素组合物的系统暴露低于有效提供皮肤中的相似药物浓度的口服剂型的系统暴露。

在用如下表12所述的包含约0.5重量％、1重量％、2重量％或4重量％的米诺环素的四种制剂的单次治疗后，评估盐酸米诺环素的血浆水平。

表12.用于研究的米诺环素的局部用制剂(所有的百分数以重量列出(即(W/W))

处理前一天，在二十一只雄性Sprague-Dawley大鼠每一只的肩背区域中的背侧区域上剃毛15cm²的区域，并且将10cm²的区域标记作为应用测试部位。将大鼠随机平均分成7个处理组。每组接受表12所列出的一种组合物(0-B-2，0.5-B，1-B，2-B-2，或4-B)以表13所述的量的应用。对每个处理中的每只大鼠应用所述组合物。在时间T＝0，将所述组合物均匀地施用到每只大鼠上的应用测试部位。

表13.处理组

处理组	应用的组合物编号	每只动物应用的组合物的量
			组1	0-B-2	2.5mg/cm2
组2	0.5-B	2.5mg/cm2
			组3	1-B	2.5mg/cm2
组4	2-B-2	2.5mg/cm2
			组5	4-B	2.5mg/cm2
组6	4-B	5.0mg/cm2
			组7	没有应用组合物	NA

恰好在应用之前和在之后24小时的时间内在下述时间点收集血液采集：应用后10、20和30分钟，1、2、4、6、8、12和24小时。对于每个处理，血浆中米诺环素的平均水平显示在表14中。对于所述分析方法，定量的下限(LLOQ)为10ng/mL。小于LLOQ的值报告为零。当在实验中的上文提及的时间点进行测量时，对于所测试的所有组合物，Sprague Dawley大鼠中的最大血清浓度(C_max)小于550ng/mL，其中在所述实验中，允许所应用的组合物在10cm²面积的剃毛的应用测试部位无辅助地渗透24小时的时间，所述组合物以2.5或5.0mg/cm²的量均匀地应用。

在除一个之外所有的这些组合物中，C_max小于150ng/mL。这些C_max水平有利地与口服消耗的米诺环素的剂量相当，口服消耗的米诺环素剂量有效地在皮肤中获得相同的药物水平，然而由于所述剂量是系统性递送到皮肤的，因此在血液中需要更高的水平。

表14.作为应用测试组合物后的消逝时间的函数的血浆中的米诺环素水平(NG/ML)。

治疗组	0分钟	10分钟	20分钟	30分钟	1小时	2小时	4小时	6小时	8小时	12小时	24小时
												组1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
组2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
												组3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
组4	0	0	12	29	39	36	21	20	16	14	0
												组5	0	0	0	0	124	149	134	61	29	12	0
组6	0	33	129	279	533	434	270	125	62	31	12
												组7	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

使用改良的Draize评分系统评价刺激性。在应用之前和应用之后立即以及在下述时间点进行评价：应用后30分钟，1，3，6和24小时。没有观察到可测量的红斑、发红、刺激和/或浮肿。对于研究的每个时间点和每只大鼠，所述改良的Draize评分为0。这表明所测试的每种组合物都是非刺激性的。

在任意处理组中都没有观察到异常的体重变化。

在24小时时间点后立即将大鼠处死。从大鼠的皮肤采集活组织检查样品，并冷冻或固定在10％福尔马林中，以允许进一步的组织学分析，包括用苏木精和曙红染色。当将用米诺环素治疗的组与用组合物0-B-2治疗的那些组或不用任何组合物治疗的那些组相比较时，在任意皮肤切片上没有观察到明显的变化。

实施例15

体内大鼠多剂量研究皮肤刺激性和药物代谢动力学剂量范围

在局部施用了包含在含有乙醇和丙二醇(例如，50-99.9w/w％)的溶剂系统中的米诺环素和镁盐的组合物的Sprague-Dawley大鼠中进行多剂量毒性动力学研究。评价示例性组合物的潜在的毒性。评价多剂量药物代谢动力学参数，并且证明对局部施用的米诺环素组合物的系统性暴露低于对有效提供皮肤中相似的药物浓度的口服剂型的系统暴露。在研究中每天施用到每只动物的米诺环素的量在0.0-0.5mg/cm²的范围内。在组合物0-B-2，1-B-2，或4-B-2中，米诺环素的浓度为约0％，1％和4％，如表15所述。

表15.研究中所用的米诺环素生物局部用制剂(所有百分数以重量列出(即W/W))

组合物编号	0-B-2	1-B-2	4-B-2
				盐酸米诺环素	0％	1.1％	4.3％
羟丙基纤维素	0.6％	0.6％	0.6％
				氯化镁(无水)	0.6％	1.1％	4.3％
乙醇(无水)	77.59％	75.9％	69.6％
				丙二醇	20.0％	20.0％	20.0％
1,8-桉树脑	1.0％	1.0％	1.0％
				偏硫酸氢钠	0.2％	0.2％	0.2％
D&C Yellow#10	0.01％	0.00％	0.00％

将二十只健康的雄性大鼠和二十只健康的雌性大鼠平均分成四组，每组五只雄性和五只雌性大鼠。在研究开始时大鼠约为8周龄，并且具有280-330克的体重。在研究中，基于表16所述的每只大鼠的组号，将组合物每天施用到每只大鼠上，持续28天。在研究期间，大鼠在各组之间不移动。

将动物单独笼养。除了步骤需要之外，每只大鼠可随意得到水和Lab Diet RodentFeed No.5001的标准饮食。

在第一次应用前一天，使用标准动物修剪工具在肩背的背部区域上剃毛15cm²的区域。将皮肤表明用丙酮轻轻擦拭，以去除皮脂，并确保皮肤清洁。使用无毒的持久性墨水标志器标记出10cm²的区域。套管中充满约150μl 1％肝素盐水溶液。

在每天剂量给药之前，将部位用无水洗发水(Sullivan E-Z Clean)和PBS清洁。在第1-27天，使用正置换移液器应用适当的测试组合物，并且用干净的金属刮铲仔细涂抹在标记的10cm²的区域。然后允许所应用的组合物晾干，并使每只大鼠回到其笼子。

在第一天应用(其标记为第1天)、第十四天应用(其标记为第14天)和第二十八天应用(其标记为第28天)期间，在应用之后，评估盐酸米诺环素的血浆水平。在血浆取样前的每个晚上，使大鼠禁食过夜，可自由饮水。

表16分组

在组1和2中没有观察到明显的皮肤刺激，并且组3和4包括轻微的红斑，在组4中发生更大的刺激发生率和严重性。

在体重或变化、食物消耗、临床病理学参数、总病理学发现或器官重量方面没有测试制品相关的影响。另外，对于任意组，除了血浆中测量的米诺环素水平之外，没有血液学或临床化学上的差异。

在应用的皮肤区域观察并注意到最低至轻度的棘层肥厚(acanthosis)。这些损伤在分布上呈散落状，主要在组4中观察到表皮细胞构成的略微增加和偶发性的基底有丝分裂象。基于这些结果，在雄鼠和雌鼠中，认为没有观察到不利作用的水平(NOAEL)是0.25mg/cm²/天，其对应于6.25mg/cm²/天的包含约4％米诺环素的组合物。

在每日施用所述组合物后，测量在每只动物的血浆中的组合物的毒性动力学特征。对于每个组，在进行评估的每一天(即，第1、14和28天)检测米诺环素。测量血浆中米诺环素剂量依赖性的增加，如表17的数据更详细地描述的。在组1的大鼠中没有以显著的水平检测到米诺环素。在本研究中存在暴露的性别差异，并且归因于毛发密度的差异。

表17.大鼠血浆中的毒性动力学参数总结

如实施例15所述，本研究证明了对哺乳动物重复剂量给药可以以0.0mg/cm²/天-0.5mg/cm²/天范围内，或优选约0.025mg/cm²/天-约0.5mg/cm²/天范围内，或更优选约0.025mg/cm²/天-约0.25mg/cm²/天范围内的米诺环素剂量水平安全地进行。较高剂量的米诺环素允许更积极的治疗。优选高于0.25mg/cm²/天的剂量。为了避免在组4中鉴定的刺激水平，优选小于0.5mg/cm²/天的剂量。

实施例16

体内小型猪多剂量毒性动力学研究

在局部施用了包含在含有乙醇和丙二醇(例如，50-99.9w/w％)的溶剂系统中的米诺环素和镁盐的组合物的小型猪中进行多剂量毒性动力学研究。评价了示例性组合物的潜在的毒性。评价了毒性动力学参数。研究中对每种动物每天应用的每种制剂的量在0.0-12.5mg/cm²范围内。在组合物0-B-2、1-B-2和4-B-2中，米诺环素的浓度为约0％、1％和4％，如在实施例15的表15中所述。

将十五头健康的雄性小型猪和十五头健康的雌雄小型猪随机分成五组，每组三头雄性和三头雌性小型猪。在研究开始时，小型猪约为20周龄，并且具有7.4-10.3千克的体重。在研究中，基于表18所述的每头小型猪的组号，将组合物每天施用到每头小型猪上，持续28天。组1是假(即，非处理)对照组。组1的小型猪经历与组2-5的小型猪相同的流程，不同之处在于在标记的治疗区域没有应用测试组合物。

将动物单独笼养。每头小型猪可自由得到水，并且每天提供两次标准饮食配给量。

在第一次应用前一天以及后续需要时，通过用标准的动物修剪工具紧密修剪毛发而准备每头小型猪的背部区域。在修剪流程过程中要小心，以避免擦伤皮肤。将皮肤表面用浸有无水洗发水(SULLIVAN E-Z CLEAN，Sullivan Supply，Inc.Dunlap，IA)的纱布轻轻擦拭，然后用浸有温(37-43℃)反渗水的纱布擦拭，然后用干纱布擦拭，确保皮肤清洁。按照下式，每周计算一次每头小型猪用于应用的目标表面面积：目标表面面积(单位：平方米)＝[9.5*(体重克数)^2/3]/10,000。用洗不掉的墨水在每头小型猪上标记出相应的区域。该目标表面面积对应于大约15％的全部身体表面面积(Spector，W.S.Handbook of BiologicalData.Philadelphia:W.B.Saunders Co.1956；175)。

在每日剂量给药之前，如前述将部位清洁。在第1-28天，对组2-5的小型猪应用适当的测试组合物，并且使用干净的一次性速率涂药器小心地涂抹在标记的测试区域。然后允许所应用的组合物晾干，并且使每只小型猪回到其笼子中。

在第一天应用(其标记为第1天)、第十四天应用(其标记为第14天)和第二十八天应用(其标记为第28天)期间，在应用之后，评估米诺环素的血浆水平。在血浆取样前的每个晚上，使小型猪禁食过夜，可自由饮水。

在第14天和尸体解剖后，对每头小型猪进行尿分析。在第14天通过笼底排水口收集尿液过夜，并且在尸体解剖时通过囊穿刺(cystocentesis)收集尿液。在它们预定的尸体解剖前一夜，使小型猪禁食过夜。

表18.分组

在研究中评价下述参数和终点：临床变化，皮肤评分，体重，食物消耗，眼科变化，心电图节律，临床病理学参数(包括来自血液学、凝固、临床化学、尿液分析的参数)，毒性动力学参数，总病理学发现，器官重量，和组织病理学特征。

在组1-4中没有观察到不利的临床迹象。在组5中，研究的最后两周期间，在紧接施用剂量后，一些小型猪表现出增加的活动性、喊叫，过度搔痒，和震颤。所述症状在剂量给药后1-3小时内消退。

在组1-3中没有观察到皮肤刺激。在组4和5中，观察到一些皮肤刺激。组5的皮肤刺激平均严重性高于组4，并且包括两例溃疡和一例皲裂。

在体重、食物消耗、眼科变化、心电图节律、临床病理学参数、总病理学发现、器官重量或组织病理学特征方面没有测试制品相关的影响。

在预定的尸体解剖之前没有小型猪死亡。

在每日局部施用所述组合物后，测量每头小型猪的血浆中的毒性动力学特征。测量血浆中米诺环素剂量依赖性的增加，如表19的数据更详细地描述的。在组1-3中在整个取样期间，以及在组4中在第1天，米诺环素在1ng/mL的定量下限以下。

表19.各组的小型猪血浆中的平均毒性动力学参数总结

NC＝由于在定量水平以下，没有计算

在第28天，如前文所述清洁治疗的区域，并且将研究中的小型猪处死。提取皮肤样品以测量在皮肤中存在的米诺环素的水平。

表20.按组在小型猪皮肤中的平均米诺环素水平总结

NC＝在定量水平以下，没有计算

总之，小型猪良好地耐受在本研究中测试的每种组合物的皮肤施用。基于所述结果，在雄性和雌性中，认为没有观察到不利作用的水平(NOAEL)为约0.25mg/cm²/天(对应于0.269mg/cm²/天的盐酸米诺环素)，其对应于6.25mg/cm²/天的包含约4％米诺环素的组合物，并且在28天重复应用后，对应于雄性中25.6ng/mL的Cmax和雌性中15.2ng/mL的Cmax，雄性中408hr*ng/mL的AUC和雌性中273hr*ng/mL的AUC。

如实施例16所述，本研究证明了对哺乳动物重复剂量给药可以以0.0mg/cm²/天-0.5mg/cm²/天范围内，或优选约0.025mg/cm²/天-约0.5mg/cm²/天范围内，或更优选约0.025mg/cm²/天-约0.25mg/cm²/天范围内的米诺环素剂量水平安全地进行。较高剂量的米诺环素允许更积极的治疗。优选至少0.01mg/cm²/天的剂量或至少0.025mg/cm²/天的剂量。为了避免在组5中鉴定的刺激水平，优选小于0.5mg/cm²/天的剂量。

实施例17

体外眼睛刺激测试

在眼球EIT模型中

评价包含在含有乙醇和丙二醇的溶剂系统中的米诺环素、镁盐和偏亚硫酸氢钠的两种组合物的眼睛刺激作用。将这些与不含米诺环素的赋形剂组合物以及阳性对照和阴性对照进行比较。

美国公布了用于分类眼睛作用的“化学品分类和标记的全面协调性系统(Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals，GHS)”(Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals(GHS)；第3章:Serious Eye Damage/Irritation–Second Revised Edition，UnitedNations；No.ST/SG/AC.10/30，Rev 2，2007)。测试的化学品和组合物分类为3大类中的一类：没有眼睛损伤(即，GHS种类“没有种类”)，不可逆的研究损伤(即，GHS种类1)，或可逆的眼睛刺激(即，GHS种类2)。

在我们的研究中，通过下述在MATTEK眼球眼睛刺激(EIT)检验流程(MATTEKEPIOCULAR Eye Irritation Test(EIT)Protocol)中所述的流程(用于预测化学品的急性眼部刺激的EpiOcular^TM眼睛刺激(OCL-200-EIT)(EpiOcular^TM Eye Irritation(OCL-200-EIT)for the Prediction of Acute Ocular Irritation of Chemicals)，ReferenceNo.MK-24-007-0055，MatTek Corporation，Ashland，MA)评价眼睛刺激作用。MATTEK眼球模型是可商购的由正常的人表皮角质形成细胞衍生的人角膜上皮3维模型。测试的终点是通过MTT测定(甲基噻唑基二苯基四唑溴化物)估测细胞存活力。由于最常被组合物损伤的眼睛区域是角膜的外表面，并且该模型模拟角膜的外侧部分，所以该模型常用于评价化学品的眼睛刺激潜力。眼球EIT流程的应用在OECD检验指导号492中详细规定。由此，该检测提供在体内检测中观察到的眼睛刺激或损伤的水平的指示。

如果相对于超纯水的对照样品，MTT细胞存活力大于60％，则将组合物分类为不具有眼睛损伤(即，GHS种类“没有分类的”)。使用乙酸乙酯作为阳性对照。细胞存活力通过经由MULTISKAN SPECTRUM平板读数仪(Thermo Fisher Scientific Oy，Vantaa，Finland)测量的光学密度进行测量。在保持在37℃在5％CO₂气氛中的潮湿的培养箱中暴露于组合物(或对照)30分钟后，检测MATTEK眼球模型的MTT细胞存活力。相对于阴性对照(超纯水)的暴露后细胞存活力，测量细胞存活力等级。阴性对照的平均细胞存活力用来设定对应于100％细胞存活力的值。如果暴露后的细胞存活力小于或等于阴性对照样品相应的平均细胞存活力的60％，则将组合物分类为具有眼睛刺激或损伤(即，GHS种类1或2)。在本研究中，评估了在实施例15的表15中所述的组合物0-B-2、1-B-2和4-B-2。

本研究的结果表明，相对于阴性对照的平均暴露后MTT细胞存活力，对于组合物0-B-2为48％，对于组合物1-B-2为64％，对于组合物4-B-2为49％。由此，确定组合物0-B-2和4-B-2是眼睛刺激性或损伤的(UN GHS种类1或2)，并且组合物1-B-2不引起眼睛损伤(即，UNGHS种类“没有种类”)。

因此，当按照MATTEK眼球EIT流程用MATTEK眼球模型检测时，相对于MTT细胞存活力的初始值，在暴露于所述组合物后，本发明所述的一些组合物具有大于60％的MTT细胞存活力。

实施例18

体内豚鼠皮肤致敏研究

评价包含在含有乙醇和丙二醇的溶剂系统中的米诺环素、镁盐和偏亚硫酸氢钠的组合物的皮肤致敏性潜力。按照表21中所示的各组，本研究使用Hartley衍生的白化病豚鼠。

表21.在皮肤致敏性研究中检测的各个组

十(10)只雄性和10只雌性豚鼠(组2)每周用4-B-2(约4％米诺环素)局部处理一次达连续3周。另外，5只雄性和5只雌性豚鼠的对照组(组1)每周用赋形剂(0-B-2)局部处理一次达连续3周。在大约2周休息期后，进行激发，由此组1和2的豚鼠分别用4-B-2或0-B-2再次处理，之前未处理的(首次用于免疫的)对照豚鼠的激发组(组3)用4-B-2和0-B-2处理。对于之前未处理的(首次用于免疫的)对照豚鼠的激发组，将组合物4-B-2和0-B-2施用到每只测试动物的两个不同的区域上。将组1和2中的测试动物的激发响应与组3中激发对照动物的激发响应进行比较。

在大约1周的休息期后，进行再激发，其中组1、2和4中的动物用适当的物质局部处理，如表21所述。将测试动物(组1和2)中的再激发响应与组4中对照动物的再激发响应进行比较。

本研究中包括α-己基肉桂醛(HCA)阳性独照。该阳性对照由HCA测试组(组5)中的10只豚鼠和HCA对照组(组6)中的10只豚鼠组成。如表21所述处理所述动物，其中HCA测试动物接受在乙醇中的5％w/vHCA用于诱导，和在丙酮中的2.5％与1.0％w/v HCA用于激发。对于激发，将1.0％和2.5％w/v HCA组合物施用到每只测试动物的两个不同的区域上。

在研究过程中，所有的动物都超过了它们开始的重量，这指示动物的良好的健康。在测试和/或赋形剂测试动物中，注意到在激发和再激发剂量施用之间的略微的体重减轻的个别的发现；这些减少是最低限度的，并且因此不被认为与4-B-2或0-B-2组合物的应用相关。在激发施用过程中，对几只动物观察到刺激。在再激发时，没有观察到该刺激。另外，仅有一只在第三次诱导时观察到几乎不能察觉的红斑的测试动物在激发时具有刺激。如果物质导致了致敏性，则在激发和再激发时以及在更多数动物中都将预测到响应。

基于本研究的结果，4-B-2和0-B-2不被认为是豚鼠中的接触致敏剂。如实施例18所述，本研究证明了在不发展致敏反应的前提下，可以以0.1％-4.0％范围内，或优选约0.25％-约2％范围内，或更优选约0.5％-约1.5％范围内的米诺环素剂量水平进行哺乳动物的剂量给药。较高剂量的米诺环素允许更积极的处理。优选至少约0.20％的剂量或至少约1.0％的剂量。

实施例19

抗氧剂对米诺环素和镁稳定的米诺环素的稳定性的影响

对示例性的组合物评价抗氧化剂对药物功效、稳定性和差向异构体形成的影响。在基线和在密封玻璃瓶内在40℃在暗处存储1、2和4周后评价组合物中米诺环素的降解和稳定性。努力使瓶内在每种组合物上方的空白空间(empty space)的量减至最小(至可在典型的实验室环境中实现的程度)，从而减少组合物和空气中的任意水蒸气之间的相互作用。

通过评价4-表-米诺环素的相对浓度的变化，来量化米诺环素向其差向异构体的降解，所述4-表-米诺环素的相对浓度以4-表-米诺环素的峰面积除以4-表-米诺环素峰面积与活性米诺环素峰面积的和来计算。作为独立的定量，通过评价活性米诺环素相对浓度的变化来量化稳定性，活性米诺环素的相对浓度以活性米诺环素峰除以在HPLC层析图中观察到的所有峰的峰面积和计算。对于这些测量，对HPLC使用20分钟的运行时间。

在本实施例中所述的研究中评价的每种组合物包括表22所述的物质。前六种物质，即，盐酸米诺环素，羟丙基纤维素，氯化镁(无水)，乙醇(无水)，丙二醇和1,8-桉树脑，占每种评价的组合物的99.8％。剩余的0.2％由表23列出的抗氧化剂组成或由乙醇(无水)(作为对照)组成。

表22.用于稳定性实验的具有不同抗氧化剂的组合物

所述组合物按下述制备：混合乙醇(无水)、丙二醇、1,8-桉树脑和表23中限定的抗氧化剂或乙醇(无水)，直到充分分散。将氯化镁(无水)和盐酸米诺环素添加到所述混合物中并混合至澄清，或者如果混合物不变澄清，混合15分钟。缓慢加入羟丙基纤维素(KLUCELHF，Ashland Specialty Chemical，Wilmington DE)并混合至澄清，或者如果混合物不变澄清混合15分钟。

表23.用于利用不同抗氧化剂的稳定性实验的抗氧化剂

表24描述了在每种组合物内测量的4-表-米诺环素相对浓度和活性米诺环素相对浓度。测量在基线时和在密闭玻璃瓶中在40℃陈化1周、2周和4周后进行。基于为每种组合物测量的数据，利用计算机程序JMP统计学软件工具(JMP Statistical Software Tool)(SAS Institute，Inc.，Cary，NC)来评价每周的浓度变化，以得到关于每种组合物的线性最小二乘最佳拟合方程。表24中显示了该线性最小二乘最佳拟合方程的斜率，其作为在4周老化期间浓度变化的速率。表24描述了基线测量和关于每周变化的最佳拟合斜率。

表24.对于在40℃4周的陈化研究，4-表-米诺环素和活性米诺环素的相对浓度

优选的组合物表现出低的基线4-表-米诺环素相对浓度和每周少量的或没有4-表-米诺环素相对浓度增加。例如，在一些优选的组合物中，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度小于5.0％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时，每周增加少于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。在一些优选的组合物中，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度小于1.0％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时，每周增加少于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。更优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度小于1.0％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时，每周增加少于0.70％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度在约0.50％-约1.00％范围内，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时，每周以约0.20％-约0.40％范围内的速率增加，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。

优选的组合物表现出高的活性米诺环素相对浓度和每周少量或没有活性米诺环素相对浓度的减少。例如，在一些优选的组合物中，在基线测量时，活性米诺环素的相对浓度为至少95.0％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时，每周减少少于1.50％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。在一些优选的组合物中，在基线测量时，活性米诺环素的相对浓度为至少98.0％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时，每周减少少于1.00％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。更优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度为至少98.50％，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时，每周减少少于0.70％，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。优选地，在基线测量时，4-表-米诺环素的相对浓度在约97.0％-约99.0％的范围内，并且当在密闭玻璃瓶中在40℃经过4周的时间测量时，每周以约0.30％-约1.00％范围内的速率减少，其中所述4周的时间在基线测量后立即开始。

本研究进一步评价了所述组合物在基线时和在密闭玻璃瓶内在40℃陈化4周后之间的颜色差异。包含亚硫酸盐化合物作为抗氧化剂的这四种组合物，即，组合物2-ss，3-sb，17-ps，和1-sbs，在陈化的组合物与基线组合物之间没有明显的颜色差异。其他组合物中的每一种都表现出明显的颜色差异。这些颜色差异的强度不与活性米诺环素相对浓度的降解量相关。例如，组合物5-bht、12-对照和16-ss比组合物8-dtt和4-aa更明显地变黑，尽管与后两种组合物相比，前三种组合物中活性米诺环素相对浓度降解更缓慢。优选的组合物在密闭玻璃瓶中在40℃陈化4周不表现出明显的颜色变化。

在优选的组合物中，在3维RGB空间距离方面，在密闭玻璃瓶中在40℃陈化4周后的颜色变化小于50，或更优选小于20，其中每个值以0-255的范围测量。3维RGB空间内的距离按照下式计算：

距离_RGB＝((ΔR)²+(ΔG)²+(ΔB)²)^0.5。

颜色变化可以使用分光比色计(PANTONE CAPSURE，Model RM200，X-Rite，Inc.，Grand Rapids，MI)进行评价。使用两个显微镜载玻片，并且在载玻片之间放置1mm的隔离物。用移液器分配组合物，以填满要评价区域内载玻片之间的空间。将具有填入的组合物的显微镜载玻片放置在标准无光泽的复印纸的白色部分上。分光比色计放置在上显微镜板上，以使分光比色计的视野充满组合物，并且所述纸作为透过所述组合物的任意光的背景。

已经发现，使用亚硫酸盐化合物作为抗氧化剂的组合物比使用其他抗氧化剂配制的那些组合物显著更稳定。包含含亚硫酸盐的抗氧化剂的每种评价的组合物，即，组合物2-ss，3-sb，17-ps，和1-sbs，表现出至少97.0％的相对活性米诺环素浓度，并且每周表现出的相对活性米诺环素浓度减少小于所检测的所有其他组合物(包括对照组合物，即组合物12-对照)相应的减少。这四种组合物分别包含抗氧化剂亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钾和偏亚硫酸氢钠。这证明了亚硫酸盐化合物具有比一般的抗氧化剂优越的抗氧化剂特性。此外，多种抗氧化剂，包括组合物13-comb1，8-dtt，11-cat，10-pg，15-comb3，4-aa，7-sp，和18-sn中的那些，尽管包含抗氧化剂，实际上增加活性米诺环素的降解速率。由于这些原因，优选的组合物包含选自由下述组成的列表的抗氧化剂：亚硫酸盐化合物，BHT，亚硒酸钠，DL-α生育酚，二硫赤藓糖醇和DL-α-生育酚的组合，以及异抗坏血酸钠。更优选地，组合物包含亚硫酸盐化合物。更优选地，组合物包含选自由下述组成的组的列表的亚硫酸盐：亚硫酸钠，亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钾，和偏亚硫酸氢钠。

实施例20

具有不同水含量和pH的米诺环素和镁稳定的米诺环素的稳定性研究

对于示例性的组合物，评价水含量对药物功效稳定性和差向异构体形成的影响。另外，对于选择的示例性的组合物，在12个月的时间内收集收据，用来评价长期的药物功效稳定性和差向异构体形成。

在基线时和在密封的玻璃瓶内存储后，评价组合物中米诺环素的稳定性和差向异构体形成，所述密封的玻璃瓶保存在关于用于人的药物注册的技术要求的协调的国际会议(International Conference on Harmonisation of Technical Requirements forRegistration of Pharmaceuticals for Human Use(ICH))(Geneva，Switzerland)在其指南“Stability Testing of New Drug Substances and Products(新药物质和产品的稳定性检测)”(日期：2003年2月6日)指定的条件下。评价的测试条件包括下述ICH指定的条件：“长期”(即，25℃和60％相对湿度(RH))，“中间的”(即，30℃和65％RH)，和“加速的”(即，40℃和75％RH)。

在本段中描述的HPLC法和在下一段中描述的计算仅用于本实施例。将20微升(μL)的样品注射到高效液相色谱机器(HPLC)(Agilent，Santa Clara，CA)中。HPLC柱(ThermoScientific)为HYPERSIL BDS C18柱250×4.6mm，粒度为5微米(μm)。HPLC系统还使用保护柱(Phenomenex，Inc.)和由碱溶剂组成的移动相，所述碱溶剂为：12％(v/v)二甲基甲酰胺(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)，8％四氢呋喃(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)，1.8mM EDTA(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和0.12M草酸铵(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)。将移动相的pH调节为7.1-7.2。HPLC流速为1.5mL/分钟，柱温为40℃，检测波长为280nm，运行时间为30分钟。基于外部校正确定溶液中的米诺环素的量。这允许计算盐酸米诺环素的浓度。

通过评价4-表-米诺环素相对浓度的变化量化米诺环素向其差向异构体的降解，所述4-表-米诺环素相对浓度以4-表-米诺环素峰面积除以4-表-米诺环素峰面积与活性米诺环素峰面积的和而计算。作为独立的定量，通过评价活性米诺环素浓度的变化量化稳定性，所述活性米诺环素的浓度变化通过将样品的活性米诺环素峰面积与工作标准物的活性米诺环素峰面积进行比较而计算。作为独立的定量，通过评价活性米诺环素相对浓度的变化进一步量化稳定性，所述活性米诺环素相对浓度以活性米诺环素峰除以在HPLC层析图中观察到所有峰的峰面积和而计算。

用于米诺环素的工作标准物通过将25mg USP盐酸米诺环素RS混合到50mL容量瓶中然后向容量瓶中加水形成50mL溶液而制备。工作标准物避光保存，如果不立即使用存储在冰箱中，并且在制备3小时内使用。工作标准物中活性米诺环素的浓度按照下述等式计算：C＝W*(100％–KF)*(P÷V)，其中C(单位为mg/mL)为活性米诺环素的浓度，W(mg)为盐酸米诺环素的重量，KF(％)为产生溶液添加的水含量的比例，P是米诺环素的功效，并且V(mL)是溶液体积。用于本实施例的米诺环素的功效为0.917，或91.7％。

在本实施例中所述的研究中评价的每种组合物包含表25和26中所述的物质。

表25.用于ICH稳定性实验的组合物。所有的百分数描述按重量计的量(即，W/W)

表26.用于ICH稳定性实验的另外的组合物。所有的百分数描述按重量计的量(即，W/W)

按照下述步骤制备每种组合物：混合乙醇(无水)、丙二醇、1,8-桉树脑和偏亚硫酸氢钠直至充分分散。向混合物中加入氯化镁(无水)和盐酸米诺环素，并且混合至澄清，或者如果混合物不变澄清，混合15分钟。缓慢加入羟丙基纤维素(KLUCEL HF，AshlandSpecialty Chemical，Wilmington DE)，并且混合至澄清。对于增加pH的组合物，即，组合物SS-0001，SS-0002，和SS-0003，加入在乙醇溶液中5％氢氧化钠形式的氢氧化钠。

表25和26中所述的一些组合物包含氢氧化钠，以提高组合物的pH。通过接近中性pH，设计这些pH调节的组合物以被皮肤更好地耐受。表25和26中列出的乙醇表示乙醇(无水)和来自氢氧化钠乙醇溶液的乙醇的总量。可以使用在局部用制剂中安全应用的其他碱来替代氢氧化钠。所述碱的选择对于本领域技术人员是明显的，或者可以无需过度实验即可评价。

表28和27描述了每种组合物中作为活性米诺环素峰的比例的测量的4-表-米诺环素浓度和活性米诺环素的浓度。在基线时和在密闭玻璃瓶内陈化后进行测量。

表27.用于实施例20的组合物的稳定性测试的活性米诺环素浓度。

表28.用于实施例20的组合物的稳定性测试的4-表-米诺环素浓度。

对于在25℃、30℃和40℃的陈化，关于每种组合物的活性米诺环素的相对浓度分别显示在图14A、14B和14C所述的图表中。对于每种组合物，计算这些图表中每条最小二乘最佳拟合线的斜率，以描述组合物内活性米诺环素的降解，并且允许在所述组合物之间的比较。

本研究中的一些组合物包含无水氯化镁，而其他组合物包含氯化镁六水合物。组合物SS-0004至SS-0008与SS-0009至SS-0011之间的主要差异在于，对于前者，氯化镁以无水形式添加，而对于后者，氯化镁以六水合物形式添加。对于后者，这增加了每种组合物中的水含量，并且允许进行用于评价水对组合物的稳定性的影响的方法。

由于氯化镁随标称活性米诺环素含量线性增加，对于具有较高米诺环素浓度的组合物，水含量增加。图15显示组合物SS-0004至SS-0011的每一种中水的量作为标称活性米诺环素含量的函数。水含量通过Karl Fischer滴定法测量。图16显示这些组合物的稳定性，其作为水含量的函数和作为温度的函数。在增加的水含量与增加的降解速率之间存在相关性，如由浓度中活性米诺环素相对浓度的斜率所述的。为了保持稳定的组合物，在优选的组合物中，组合物需要具有少于3.0％、优选少于2.0％、并且更优选少于1.0％的水含量。

组合物SS-0001至SS-0011的pH值在约3.8-约5.0的范围内变化。增加pH(如通过加入碱)的影响可以通过将组合物SS-0001和SS-0002与组合物SS-0004和SS-0005进行比较而看出。SS-0001和SS-0002包含氢氧化钠，相对于未调节的组合物SS-0004和SS-0005，其增加所述组合物的pH。表29显示为不同的陈化条件评估的不同测试组合物计算的斜率。通过分别比较组合物SS-0001和SS-0002的米诺环素的降解速率与组合物SS-0004和SS-0005的降解速率，可以确定组合物的稳定性没有被pH的少量增加大量改变。通过这种方法，可以产生pH在约4.0-约6.0范围内的组合物，并且由于对皮肤降低的刺激，可以是合乎需要的。更优选地，组合物具有约4.5-约6.0、约4.5-约5.5、或约5.0-约6.0的pH范围。

表29.活性米诺环素的相对浓度的最佳拟合线的斜率(以％/月为单位)

	SS-0001	SS-0002	SS-0004	SS-0005
					25℃/60％RH	-0.32	-0.21	-0.22	-0.31
30℃/65％RH	-0.56	-0.41	-0.36	-0.61
					40℃/75％RH	-1.82	-1.40	-1.31	-2.03
陈化之前的pH	4.95	4.70	4.70	4.30

尽管对于这些组合物观察到的趋势没有与本段中基于另外两对组合物所述的那些相矛盾，但是没有进行组合物SS-0003至SS-0007的比较作为pH评价的一部分，原因在于不同量的丙二醇使得评价稳定性差异的原因更困难。

对于组合物内在1％-5％范围内的1,8-桉树脑的量，没有发现活性米诺环素的稳定性显著变化。本实施例中描述了此类组合物的实例。

基于组合物中丙二醇的量，发现活性米诺环素的稳定性变化。用醇替换丙二醇制备的组合物通常使组合物更稳定。然而，丙二醇是有益的，因为其增加盐酸米诺环素的溶解度，当将其局部施用在人皮肤上时，降低组合物的挥发速率，当将其局部施用在人皮肤上时，减缓变干，并且促进米诺环素向皮肤内的渗透。在本实施例中描述了具有不同量的丙二醇的组合物的实例。

实施例21

使用四环素类药物的稳定性研究

对于示例性的组合物，评价四环素类药物的选择对药物功效稳定性和差向异构体形成的影响。在基线时和在密封玻璃瓶中在40℃在暗处存储后评价组合物。对于这些研究中的每一种，努力使瓶内在每种组合物上方的空白空间(empty space)的量减至最小(至可在典型的实验室环境中实现的程度)，从而减少组合物和空气中的任意水蒸气之间的相互作用。

如在本文在中多种其他实施例中的米诺环素一样，通过评价活性四环素相对浓度的变化来量化四环素的药物功效稳定性，所述活性四环素相对浓度以活性四环素峰除以在HPLC层析图中观察到的所有峰的峰面积和计算。为了测量米诺环素和四环素的量，所用的HPLC法检测几乎所有的降解组分，并且因此认为相对活性药物测量是比相对于标准物的峰实际测量药物峰更可靠且更有代表性的检测组合物中活性药物的量的方法。重复的测量已经证实了所述方法的这一评估。对于多西环素，HPLC法没有检测降解的多西环素组分的大部分峰。因此，对于多西环素，相对于多西环素标准物的测量，而不是相对于总峰面积，计算活性多西环素的量。

使用实施例21所述的HPLC法测量四环素和多西环素，但是流速为0.8mL/min，而不是1.0mL/min。

在本实施例所述的研究中评价的组合物的组分列在表30和31中。

表30.具有四环素的用于稳定性实验的组合物。所有的百分数描述按重量计的量(即，W/W)

表31.具有多西环素的用于稳定性实验的组合物。所有的百分数描述按重量计的量(即，W/W)

按照下述步骤制备每种组合物：混合乙醇(无水)、丙二醇、1,8-桉树脑和偏亚硫酸氢钠直至充分分散。向混合物中加入氯化镁(无水)和盐酸四环素或海克酸多西环素，并且混合至澄清，或者如果混合物不变澄清，混合15分钟。缓慢加入羟丙基纤维素(KLUCEL HF，Ashland Specialty Chemical，Wilmington DE)，并且混合至澄清。对于增加pH的组合物，即，在组合物标识符末尾以“-a”命名的组合物，加入在乙醇溶液中5％氢氧化钠形式的氢氧化钠。

表30和31中所述的一些组合物包含氢氧化钠，以提高组合物的pH。通过接近中性pH，设计这些pH调节的组合物以被皮肤更好地耐受。表30和31中列出的乙醇表示乙醇(无水)和来自氢氧化钠乙醇溶液的乙醇的总量。可以使用在局部用制剂中安全应用的其他碱来替代氢氧化钠。所述碱的选择对于本领域技术人员是明显的，或者可以无需过度实验即可评价。

表32描述了在包含四环素的每种组合物中测量的活性四环素的相对浓度。测量在基线时和在密闭玻璃瓶内在40℃陈化后进行。表32的数据证明了在组合物中包含氯化镁或在组合物中包含氯化镁与SMBS降低了四环素的稳定性。对于pH缓冲的组合物和未缓冲的组合物，稳定性降低。对于大部分应用，这些组合物的稳定性不充分，不足以用于不经冷藏的商业分配。此类组合物对于一些具有适当的存储条件的应用是充分稳定的，诸如将所述组合物保持在5℃±3℃的温度。

表32.在40℃陈化研究的活性四环素的相对浓度

表33.用于在40℃的陈化研究的活性多西环素的浓度

表33描述了在包含多西环素的每种组合物中测量的活性多西环素的浓度。测量在基线时和在密闭玻璃瓶内在40℃陈化7天和21天后进行。这些数据证明了在组合物中包含氯化镁或在组合物中包含氯化镁与SMBS提高了多西环素的稳定性。如果需要pH缓冲的组合物，所述数据表明，包含氯化镁对缓冲的组合物比对未缓冲的组合物更有益。在一些应用中，甚至不经冷藏，在一种或多种可用于处理本文所述的皮肤病学病况的这些组合物中，多西环素的稳定性是足够的。

图13A和13B显示了表30和31中的每种组合物在陈化之前(图13A)和在密闭玻璃瓶中在40℃陈化7天后(图13B)的颜色。对于表32和33中所述的一些组合物，在7天的陈化时间期内，发生颜色变化。

基于在本实施例和本文中其他实施例中的数据，由于米诺环素和多西环素比四环素优越的稳定性，米诺环素和多西环素是用在本文所述的组合物中的优选的四环素类药物形式。可以在本文所述的组合物中评价其他四环素类药物，以评价它们的稳定性对于局部用组合物的特定应用的适用性。

实施例22

向离体人皮肤内的渗透：三种四环素类药物的组合物

进行使用离体皮肤组织的渗透实验，以确定三种活性四环素类药物在包含在含有镁源、一元脂肪醇和多元醇的组合物中并且施用到皮肤表面时向皮肤内的渗透效率。对三名不同的人捐献者评价向腹部皮肤的渗透，在研究中，对每名捐献者应用关于每种药物的三种样品，每种组合物共九次测量。测试的四环素类药物包括四环素、米诺环素和多西环素。作为本研究的一部分评估的组合物记载在表34中。

表34.用于皮肤渗透实验的组合物

将所述组合物以约12mg/cm²的剂量施用到来自三名人捐献者的皮肤样品上。将组织保持在潮湿的环境中，以限制组织变干，并在32℃温育3小时。在温育时间期的结束时，使用第一干纱布垫、第二浸有70％异丙醇的纱布垫、最后用干纱布垫将过量的组合物从表面上擦掉。进行胶带剥离，以去除角质层的上层。从测试区内采集六(6)毫升钻取活组织检查样品。使用酸化的甲醇从每份活组织检查样品提取四环素类药物。通过高效液相色谱分析上清。

本研究的结果证明了多西环素、米诺环素和四环素的渗透效率足以超过这些活性药物的每一种的最低抑菌浓度，由此将可用于杀死皮肤上或皮肤内的细菌，如疮疱丙酸杆菌。多西环素和米诺环素表现出壁四环素高的渗透效率。由于这个原因，对于某些应用，多西环素和/或米诺环素比四环素优选。

Claims (70)

1.一种局部用组合物，其包含在非水性溶剂中的米诺环素、镁盐和亚硫酸盐化合物。

2.权利要求1的局部用组合物，其中所述非水性溶剂包含一元脂肪醇和多元醇。

3.权利要求2的局部用组合物，其中所述一元脂肪醇与所述多元醇之间的重量比在1:1-99:1的范围内。

4.权利要求3的局部用组合物，其包含的所述一元脂肪醇的重量百分比大于所述多元醇。

5.权利要求4的局部用组合物，其中一元脂肪醇与多元醇的w/w比按重量计在约2:1-10:1的范围内。

6.权利要求1-5中任一项的局部用组合物，其中米诺环素被溶解在所述非水性溶剂中。

7.权利要求1-6中任一项的局部用组合物，其中所述镁盐与米诺环素的摩尔比在约2:1-100:1的范围内。

8.权利要求1-7中任一项的局部用组合物，其中所述镁盐是氯化镁，或是具有比氯离子更软的平衡离子的米诺环素盐。

9.权利要求1-8中任一项的局部用组合物，其中所述一元脂肪醇选自由下述组成的组：乙醇、异丙醇、丙醇、叔丁醇或它们的组合。

10.权利要求9的局部用组合物，其中所述一元脂肪醇是乙醇。

11.权利要求1-10中任一项的局部用组合物，其包含约0.1重量％-约4重量％的米诺环素。

12.权利要求1-10中任一项的局部用组合物，当在密闭玻璃瓶中在40℃存储4周的时间时，所述局部用组合物表现出每周小于1.0％的4-表-米诺环素的相对浓度的增加。

13.权利要求12的局部用组合物，当在密闭玻璃瓶中在40℃存储4周的时间时，所述局部用组合物表现出每周小于0.70％的4-表-米诺环素的相对浓度的增加。

14.权利要求1-10中任一项的局部用组合物，当在密封容器中在25℃和60％相对湿度存储12个月时，所述局部用组合物包含小于7％的米诺环素降解产物，其中所述降解产物是4-表-米诺环素。

15.权利要求1-14中任一项的局部用组合物，其中所述多元醇是C3-C8二醇或三醇。

16.权利要求15的局部用组合物，其中所述多元醇是丙二醇。

17.权利要求1-16中任一项的局部用组合物，其中所述亚硫酸盐化合物是亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐或偏亚硫酸氢盐。

18.权利要求17的局部用组合物，其中所述亚硫酸盐化合物是包含选自钠、钾、钙和镁的无机阳离子的无机亚硫酸盐。

19.权利要求1-18中任一项的局部用组合物，其包含约0.005重量％-约3.0重量％的所述亚硫酸盐化合物。

20.权利要求19的局部用组合物，其中所述亚硫酸盐选自由亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠组成的组。

21.权利要求1-20中任一项的局部用组合物，其包含少于约3重量％的水。

22.权利要求21的局部用组合物，其包含少于约2重量％的水。

23.权利要求1-22中任一项的局部用组合物，其还包含精油。

24.权利要求23的局部用组合物，其包含0.01-5重量％的1,8-桉树脑。

25.权利要求1-24中任一项的局部用组合物，其包含增稠剂。

26.权利要求25的局部用组合物，其中所述增稠剂是羟丙基纤维素。

27.权利要求1-26中任一项的局部用组合物，其中所述组合物不是乳液剂并且/或者不包含纳米颗粒或微粒。

28.权利要求1-27中任一项的局部用组合物，所述局部用组合物在与水以1:9的重量比混合时具有3-6的有效pH。

29.权利要求28的局部用组合物，所述局部用组合物在与水以1:9的重量比混合时具有约3.8-约5.0的有效pH。

30.权利要求1的局部用组合物，其中所述非水性溶剂包含一元脂肪醇。

31.权利要求1-30中任一项的局部用组合物，其中，当在28天的时间里每日向大鼠施用时，所述组合物是非刺激性的。

32.权利要求1-31中任一项的局部用组合物，其中所述组合物在密封容器内在40℃陈化4周后没有表现出明显的颜色变化。

33.权利要求32的局部用组合物，其中没有明显的颜色变化是在3维RGB空间中距离小于20的颜色变化，其中每个值在0-255的范围测量，并且3维RGB空间中的距离按照下式计算：

距离_RGB＝((ΔR)²+(ΔG)²+(ΔB)²)^0.5。

34.一种局部用组合物，其包含四环素类药物、镁盐、一元脂肪醇和多元醇，其中(i)所述一元脂肪醇与所述多元醇的重量比在1:1-99:1范围内，并且(ii)所述四环素类药物溶解在所述局部用组合物中。

35.权利要求34的局部用组合物，其中所述镁盐与所述四环素药物的摩尔比在2:1–100:1的范围内。

36.权利要求34或35的局部用组合物，其中所述镁盐是氯化镁，或是具有比氯离子更软的平衡离子的镁盐。

37.权利要求34-36中任一项的局部用组合物，其中所述四环素类药物是米诺环素，并且在将所述组合物在密封容器中在25℃和60％相对湿度存储12个月后，所述组合物含有少于7％的米诺环素降解产物，其中所述降解产物是4-表-米诺环素。

38.权利要求34-36中任一项的局部用组合物，其中所述一元脂肪醇选自由下述组成的组：乙醇、异丙醇、丙醇、叔丁醇和它们的组合。

39.权利要求34-38中任一项的局部用组合物，其中所述一元脂肪醇是挥发性的。

40.权利要求34-39中任一项的局部用组合物，其中所述多元醇是C3-C8二醇或三醇。

41.权利要求34-40中任一项的局部用组合物，其中所述多元醇是丙二醇。

42.权利要求34-41中任一项的局部用组合物，其还包含抗氧化剂。

43.权利要求34-42中任一项的局部用组合物，其中所述四环素类药物是米诺环素。

44.权利要求34-43中任一项的局部用组合物，其还包含增稠剂。

45.权利要求44的局部用组合物，其中所述增稠剂是羟丙基纤维素。

46.权利要求34-45中任一项的局部用组合物，其中所述局部用组合物不包含乳液剂。

47.权利要求34-46中任一项的局部用组合物，其中所述局部用组合物不包含纳米颗粒或微粒。

48.权利要求34-47中任一项的局部用组合物，其中所述局部用组合物是非水性的。

49.权利要求48的局部用组合物，其中所述局部用组合物是无水的。

50.权利要求34-49中任一项的局部用组合物，其中所述多元醇不是甘油。

51.权利要求34-49中任一项的局部用组合物，其中所述局部用组合物在以1:9的重量比与水混合时具有3-6的有效pH。

52.权利要求1-51中任一项的局部用组合物，其在25℃具有75-10,000厘泊范围内的粘度。

53.权利要求1-52中任一项的局部用组合物，其中所述组合物是亲水性的。

54.权利要求1-33中任一项的局部用组合物，其中所述非水性溶剂是亲水性的。

55.权利要求1-33中任一项或权利要求34-54中任一项的局部用组合物，其中向离体人面部皮肤的渗透效率分别乘以所述局部用组合物中米诺环素的浓度或所述四环素类药物的浓度超过所述药物针对目标组织或目标体液中的目标细菌的最低抑菌浓度(MIC)。

56.权利要求55的局部用组合物，其中所述目标细菌是疮疱丙酸杆菌(P.acnes)。

57.权利要求1-54中任一项的局部用组合物，其中所述向离体人面部皮肤的渗透效率等于或超过5％。

58.权利要求57的局部用组合物，其中所述向离体人面部皮肤的渗透效率在5％-25％的范围内。

59.权利要求1-54中任一项的局部用组合物，其中所述组合物在施用到在体皮肤区域时在少于60秒内变干。

60.权利要求1-54中任一项的局部用组合物，其中所述组合物在至少2周的使用后防止皮肤变得极度干燥。

61.权利要求34-54中任一项的局部用组合物，其中所述组合物在每日向在体人或大鼠皮肤区域施用达2周时不使皮肤组织染色。

62.权利要求1-54中任一项的局部用组合物，其伴有关于局部应用以治疗皮肤的皮肤病学病况或疾病的使用说明。

63.权利要求62的局部用组合物，其中所述皮肤的皮肤病学病况是痤疮、脓疱病或酒渣鼻。

64.权利要求63的局部用组合物，其中所述痤疮是寻常痤疮。

65.权利要求62的局部用组合物，其中所述使用说明包含对下述的使用说明：每天一至三次将所述组合物施用到外部皮肤表面达约2周至至少约6周时间或直到观察到所述皮肤病学病况或疾病的明显改善。

66.一种治疗皮肤病学病况或疾病的方法，所述方法包括下述步骤：将权利要求1-54中任一项的局部用组合物每天至少一次施用到哺乳动物身体的外部上皮表面达至少1周的时间。

67.一种治疗皮肤病学病况或疾病的方法，其包括将权利要求1-54中任一项的局部用组合物每天至少一次施用到哺乳动物身体的外部上皮表面达至少1个月的时间。

68.权利要求67的方法，其中所述皮肤病学病况或疾病是痤疮或酒渣鼻，并且所述施用步骤包括将所述局部用组合物每天一次或两次施用到皮肤上达6-52周的时间。

69.一种制备局部用组合物的方法，所述方法包括：(i)在非水性溶剂中合并米诺环素、镁盐和亚硫酸盐化合物以形成混合物，并且(ii)搅拌(i)的混合物以形成溶液，米诺环素溶解在所述溶液中。

70.一种用于制备局部用组合物的方法，所述方法包括：(i)将四环素类药物、镁盐、挥发性一元脂肪醇和多元醇合并以形成混合物，并且(ii)搅拌(i)的混合物以形成溶液，所述四环素类药物溶解在所述溶液中。