CN107687987B - 一种采用重量法测定人参总皂苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用重量法测定人参总皂苷的方法，主要包括如下步骤：(A)将人参根茎烘干、粉碎，采用甲醇‑氨水的混合水溶液处理回流提取得到提取液；(B)将提取液蒸发溶剂干燥后的残渣进行纯化，计算总皂苷的质量百分比含量，即可。本发明实施例的测定人参总皂苷的方法，具有操作简便，重复性好的优点，既能保证测定结果的一致性，又能满足缺乏仪器购置经费的中小企业开展人参皂苷检测工作，避免使用毒性较大的有机试剂，安全环保，更有利于维护操作人员的身体健康，操作时间短，工序简单，填补了相关测定方法的技术空白，形成了比较标准的操作流程，所需的配套设备成本低，适于广泛推广应用，非常值得借鉴。

Description

一种采用重量法测定人参总皂苷的方法

技术领域

本发明涉及人参根茎中人参总皂苷的提取测定领域，具体而言，涉及一种采用重量法测定人参总皂苷的方法。

背景技术

人参(学名：Panax ginseng，又称为亚洲参，在中国东北土名“棒槌”)是具有肉质的根，可药用。人参属于五加科，主要生长在东亚，特别是寒冷地区。人参是亚洲常见药材，北中美洲也普遍使用花旗参，许多草药铺和超市都能找到各式人参饮片及萃取物保健产品，用于愈后恢复、增强体力、调节荷尔蒙、降低血糖和控制血压、控制肝指数和肝功能保健等。人参根部所含皂苷是其有效成分，中国长白山野参皂苷成分较高，但取得不易，价格高昂。

人参是五加科人参属植物，它与三七、西洋参等著名药用植物是近亲。属于多年生草本；主根肉质，圆柱形或纺锤形，须根细长；根状茎(芦头)短，上有茎痕(芦碗)和芽苞；茎单生，直立，先端渐尖，边缘有细尖锯齿，上面沿中脉疏被刚毛。伞形花序顶生，花小；花菩钟形，具5齿；花瓣5，淡黄绿色；.雄蕊5，花丝短，花药球形；子房下位，2室，花柱1，柱头2裂。浆果状核果扁球形或肾形，成熟时鲜红色；种子2个，扁圆形，黄白色。

人参皂苷是人参的主要活性成分，具有调节中枢神经系统的作用，改善心血管及造血系统的作用，调节内分泌系统的作用，提高免疫力，抗疲劳，以及抗癌等诸多药理活性。对于人参的质量评价，人参皂苷的含量是必测的质量指标。

目前，人参中皂苷的测定方法主要为高效液相色谱法和比色法，其中高效液相色谱法主要用于人参中单体皂苷的测定，比色法主要用于人参中总皂苷的测定，上述两种方法均属于化学方法。但是化学方法的测定过程引入不确定度的环节较多，测定结果差异较大。

相比来说，重量法显现出了非常大的优势，因为重量法无需配制标准溶液，避免了标准品称量及配制溶液的误差，无需通过仪器测定，结果由分析天平直接读取，方法精密度更高，重现性更好。

现有技术中，国际食品法典委员会(CAC)颁布的人参制品国际标准中，以水饱和正丁醇提取物作为评价人参总皂苷的指标，该方法属于重量法，用水饱和正丁醇回流提取，然后用水萃取除糖，乙醚脱脂，称重。

但是，通过对CAC方法的研究，发现该方法存在重复性不好，皂苷提取不完全等缺陷：1.水饱和正丁醇提取皂苷效率较低；2.回流提取需反复过滤，重复多次，结果精密度较差；3.丙二酰基人参皂苷极易转化，且萃取过程中在水层分配系数较高，无法保证测定结果的稳定性；4.乙醚脱脂后直接倒出，极不易于操作，对结果准确度影响比较大。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用重量法测定人参总皂苷的方法，具有操作简便，重复性好的优点，既能保证测定结果的一致性，又能满足缺乏仪器购置经费的中小企业开展人参皂苷检测工作，避免使用毒性较大的有机试剂，安全环保，更有利于维护操作人员的身体健康，操作时间短，工序简单，填补了相关测定方法的技术空白，形成了比较标准的操作流程，所需的配套设备成本低，适于广泛推广应用，非常值得借鉴。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明实施例提供了一种人参根茎中人参皂苷的提取方法，主要包括如下步骤：

(A)将人参根茎烘干、粉碎，采用甲醇-氨水的混合水溶液处理回流提取得到提取液；

(B)将提取液蒸发溶剂干燥后的残渣进行纯化，计算总皂苷的质量百分比含量，即可。

人参皂苷是人参的主要活性成分，具有调节中枢神经系统的作用，改善心血管及造血系统的作用，调节内分泌系统的作用，提高免疫力，抗疲劳，以及抗癌等诸多药理活性。对于人参的质量评价，人参皂苷的含量是必测的质量指标。

目前，人参中皂苷的测定方法主要为高效液相色谱法和比色法，其中高效液相色谱法主要用于人参中单体皂苷的测定，比色法主要用于人参中总皂苷的测定，上述两种方法均属于化学方法。但是化学方法的测定过程引入不确定度的环节较多，测定结果差异较大。

相比来说，重量法显现出了非常大的优势，因为重量法无需配制标准溶液，避免了标准品称量及配制溶液的误差，无需通过仪器测定，结果由分析天平直接读取，方法精密度更高，重现性更好。

现有技术中，国际食品法典委员会(CAC)颁布的人参制品国际标准中，以水饱和正丁醇提取物作为评价人参总皂苷的指标，该方法属于重量法，用水饱和正丁醇回流提取，然后用水萃取除糖，乙醚脱脂，称重。

但是，通过对CAC方法的研究，发现该方法存在重复性不好，皂苷提取不完全等缺陷：1.水饱和正丁醇提取皂苷效率较低；2.回流提取需反复过滤，重复多次，结果精密度较差；3.丙二酰基人参皂苷极易转化，且萃取过程中在水层分配系数较高，无法保证测定结果的稳定性；4.乙醚脱脂后直接倒出，极不易于操作，对结果准确度影响比较大。

本发明为了解决现有技术中存在的诸多技术问题，提供了一种采用重量法测定人参总皂苷的方法，该方法具有操作简单易行，重复性好、准确度高，操作时间短，工序简单，稳定性高，所涉及到的溶剂均可以直接回收，不需要后续单独处理，操作精密度比较高，可广泛应用，填补了相关方法的技术空白，扩充了人参的药用价值的适用面，也更加利于人参的市场推广度，进而可创造一定的经济效益。

本发明具体的操作步骤(A)中，先对人参的根茎进行烘干、粉碎，甲醇-氨水的混合水溶液过滤、回流提取得到提取液。

其中，烘干的温度最好控制在40-55℃，更优为45℃，一般烘干48h以上即可以满足要求，在上述条件下可以将人参表面的水分完全蒸发干净，不会影响到后续的测定结果。

优选地，人参烘干后，粉碎的目粒度控制在60目以上，更优为70-100目，除此之外还可以为80目、90目、120目等。将人参粉碎研磨成粉状后在后续进行提取过程中，更有利于人参总皂苷的充分浸提。

在进行选材时，对人参的优质选择有利于后续检测步骤的顺利实施，在进行挑选时，人参最好选择5年以上生的新鲜白参，无坑洞，无虫眼的人参根茎作为原材料。

此外，当人参的样品为人参浸膏时，实际操作时称取2.5g样品，精确到1mg，用水溶解再测定。当样品为人参提取物粉时，实际操作时称取1.5g样品，精确到1mg，用水溶解再测定。

优选地，甲醇-氨水的混合水溶液处理的步骤包括：将粉碎的人参根茎放于滤纸筒中置于索氏提取器中，添加所述甲醇-氨水的混合水溶液。

优选地，采用甲醇-氨水的混合水溶液作为溶剂对人参根茎进行浸提，每克的人参根茎添加甲醇-氨水的混合水溶液20-50ml，更优地为30-40ml。

优选地，甲醇-氨水的混合水溶液中，氨水的体积百分比含量为3-5％之间，更优为4％，甲醇的体积比百分比含量70-90％之间，更优地为80％。

为了使得人参在浸提过程中，能够充分与甲醇-氨水的混合水溶液混合均匀，先采用甲醇-氨水的混合水溶液进行浸泡4-12h，添加甲醇-氨水的混合水溶液后要进行回流提取，回流提取的温度控制在90-100℃之间，提取时间控制在8-12h之间。

在本发明步骤(B)中，是对回流提取得到的提取液进行进一步纯化，纯化的具体操作步骤最好按照如下步骤进行：纯化的步骤包括：将干燥后的残渣用二氯甲烷萃取，静置至分界面清晰，弃去下层二氯甲烷，收集水层至蒸发皿中，水浴蒸干，加水洗涤残渣，合并洗涤液离心，上清液加入已处理的固相萃取小柱，当样品全部流过固相萃取小柱，去掉注射器针头，用200-400mL水洗脱样品中水溶性杂质，换100-200mL的甲醇洗脱，即可。

上述步骤中，所采用的固相萃取小柱一般是自行制作而成的，具体制作方法包括：将玻璃柱或塑料柱的底部加一层筛板，然后倒入8-12ml的反相聚合物，在上层再加一层筛板，用50-100ml甲醇冲洗固相萃取柱，即可，并且为了净化所用的萃取柱，在使用之前最好采用200-300ml的水将甲醇进行置换。

另外，上述萃取柱中所用的反向聚合物最好选用NM200反向聚合物。

优选地，加水洗涤残渣，合并洗涤液离心10min以上，离心的速率控制在8000rpm以上。

最后，在小的萃取柱上面为了使用方便一般会安装一个针头，当样品全部流过固相萃取小柱，去掉注射器针头，水洗脱样品，换100mL 80％甲醇再洗脱样品后，用铝制称量皿收集醇洗液，水浴蒸干，进行水浴干燥，干燥的温度控制在90℃以上，更优地为100℃，直至完全蒸干为止。

对干燥得到的产品采用重量差的方法进行结果计算：将称量皿与进行所述干燥后物质的总质量减去所述称量皿的质量之后，与所述人参根茎的质量两者的质量百分比。

实际操作情况下，比如铝制称量皿和残渣干燥后的质量为5.7149，铝制称量皿的质量为5.5136，试样的质量为5.004，则

该人参样品中

误差：在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的5％。

本发明通过对烘干、粉碎以及纯化、干燥等步骤进行限定，使得整个提取步骤中工序简单，生产周期短，并且通过试验条件的设计摸索出了一条最为适宜人参总皂苷的测定方法，将各个操作参数均控制在了比较适宜的范围内，操作方便，适应了当代人参根茎中人参总皂苷测定方法的发展需求。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种采用重量法测定人参总皂苷的方法，具有操作简便，重复性好的优点，既能保证测定结果的一致性，又能满足缺乏仪器购置经费的中小企业开展人参皂苷检测工作，避免使用毒性较大的有机试剂，安全环保，更有利于维护操作人员的身体健康，操作时间短，工序简单，填补了相关测定方法的技术空白，形成了比较标准的操作流程，所需的配套设备成本低，适于广泛推广应用，非常值得借鉴；

(2)本发明通过对烘干、粉碎以及纯化、干燥等步骤进行限定，使得整个提取步骤中工序简单，生产周期短，并且通过试验条件的设计摸索出了一条最为适宜人参总皂苷的测定方法，将各个操作参数均控制在了比较适宜的范围内，操作方便，适应了当代人参根茎中人参总皂苷测定方法的发展需求。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

人参根茎中人参总皂苷的测定方法如下：

1)先将人参根茎烘干，粉碎，过60目筛，称取5g样品，精确到1mg，用滤纸包好，将滤纸筒置于索氏提取器中，加入100ml甲醇-氨水的混合水溶液(氨水体积百分比含量为3％，甲醇体积百分比含量为70％)，90℃回流提取8h；

2)纯化：收集提取溶液至蒸发皿中，水浴蒸干，共加入50mL水分次洗涤残渣，合并洗涤液至分液漏斗中，用50mL二氯甲烷萃取1次，静置至分界面清晰，弃去下层二氯甲烷，收集水层至蒸发皿中，水浴蒸干，共加入15mL水分次洗涤残渣，合并洗涤液，8000rpm离心10min，上清液加入已处理的固相萃取小柱，重复上述操作1次，当样品全部流过固相萃取小柱，去掉注射器针头，用300mL水临洗样品，换100mL 80％甲醇洗脱样品；

3)称重：用已知重量的铝制称量皿收集醇洗液，水浴蒸干，转至烘箱中90℃干燥，至恒重；

结果计算：

若铝制称量皿和残渣干燥后的质量为5.7149，铝制称量皿的质量为5.5136，试样的质量为5.004，则

该人参样品中

误差：在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的5％。

实施例2

人参根茎中人参总皂苷的测定方法如下：

1)先将人参根茎45℃烘干，粉碎，过70目筛，称取2.5g样品，精确到1mg；

2)固相萃取柱制备：该固相萃取柱为2×20cm的塑料柱或玻璃柱，在柱底加一层筛板，倒入8-12mL NM200反相聚合物，在上层加一层筛板，用50-100mL甲醇冲洗固相萃取柱，使用前，用200-300mL水将甲醇替换，然后在固相萃取小柱安装注射器针头，待上样；

3)纯化：将人参侵膏分次溶于50mL水中，合并溶液至分液漏斗中，用50mL二氯甲烷萃取1次，静置至分界面清晰，弃去下层二氯甲烷，收集水层至蒸发皿中，水浴蒸干，共加入15mL水分次洗涤残渣，合并洗涤液，9000rpm离心10min，上清液加入已处理的固相萃取小柱，重复上述操作1次，当样品全部流过固相萃取柱，去掉注射器针头，用300mL水淋洗样品，换100mL 80％甲醇洗脱样品；

4)称重：用已知重量的铝制称量皿收集醇洗液，水浴蒸干，转至烘箱中100℃干燥，至恒重；

结果计算：

若铝制称量皿和残渣干燥后的质量为6.7625，铝制称量皿的质量为5.6374，试样的质量为2.5045，则

该人参样品中

误差：在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的5％。

实施例3

人参根茎中人参总皂苷的测定方法如下：

1)先将人参根茎55℃烘干，粉碎，过100目筛，称取1.5g样品，精确到1mg；

2)固相萃取柱制备：该固相萃取柱为2×20cm的塑料柱或玻璃柱，在柱底加一层筛板，倒入8-12mL NM200反相聚合物，在上层加一层筛板，用50-100mL甲醇冲洗固相萃取柱，使用前，用200-300mL水将甲醇替换，然后在固相萃取小柱安装注射器针头，待上样；

3)纯化：称取样品后共加入50mL水分次溶解样品并合并于分液漏斗中，用50mL二氯甲烷萃取1次，静置至分界面清晰，弃去下层二氯甲烷，收集水层至蒸发皿中，水浴蒸干，共加入15mL水分次洗涤残渣，合并洗涤液，11000rpm离心15min，上清液加入已处理的固相萃取小柱，重复上述操作1次，当样品全部流过固相萃取柱，去掉注射器针头，用300mL水淋洗样品，换100mL 80％甲醇洗脱样品；

4)称重：用已知重量的铝制称量皿收集醇洗液，水浴蒸干，转至烘箱中105℃干燥，至恒重；

结果计算：

若铝制称量皿和残渣干燥后的质量为6.3564，铝制称量皿的质量为5.6374，试样的质量为1.5041，则

该人参样品中

误差：在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的5％。

实施例4

人参根茎中人参总皂苷的测定方法如下：

1)先将人参根茎50℃烘干，粉碎，过80目筛，称取1.5g样品，精确到1mg，用滤纸包好，将滤纸筒置于索氏提取器中，加入45ml甲醇-氨水的混合水溶液(氨水体积百分比含量为4％，甲醇体积百分比含量为80％)，95℃回流提取10h；

2)固相萃取柱制备：该固相萃取柱为2×20cm的塑料柱或玻璃柱，在柱底加一层筛板，倒入8-12mL NM200反相聚合物，在上层加一层筛板，用50-100mL甲醇冲洗固相萃取柱，使用前，用200-300mL水将甲醇替换，然后在固相萃取小柱安装注射器针头，待上样；

3)纯化：收集提取溶液至蒸发皿中，水浴蒸干，共加入50mL水分次洗涤残渣，合并洗涤液至分液漏斗中，用50mL二氯甲烷萃取1次，静置至分界面清晰，弃去下层二氯甲烷，收集水层至蒸发皿中，水浴蒸干，共加入15mL水分次洗涤残渣，合并洗涤液，10000rpm离心15min，上清液加入已处理的固相萃取小柱，重复上述操作1次，当样品全部流过固相萃取柱，去掉注射器针头，用300mL水淋洗样品，换100mL 80％甲醇洗脱样品；

4)称重：用已知重量的铝制称量皿收集醇洗液，水浴蒸干，转至烘箱中105℃干燥，至恒重；

后续计算过程与实施例3一致。

误差：在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的5％。

比较例1

通过采用国际食品法典委员会(CAC)颁布的人参制品国际标准的方法进行检测后，误差：在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的15％。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (15)

1.一种采用重量法测定人参总皂苷的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(A)将人参根茎烘干、粉碎，采用甲醇-氨水的混合水溶液处理回流提取得到提取液；

(B)将提取液蒸发溶剂干燥后的残渣进行纯化，计算总皂苷的质量百分比含量，即可；

所述步骤(A)中，甲醇-氨水的混合水溶液中氨水的体积百分比含量为3-5％之间；

所述步骤(B)中，纯化的步骤包括：将干燥后的残渣用二氯甲烷萃取，静置至分界面清晰，弃去下层二氯甲烷，收集水层至蒸发皿中，水浴蒸干，加水洗涤残渣，合并洗涤液离心，上清液加入已处理的固相萃取小柱，当样品全部流过固相萃取小柱，去掉注射器针头，用200-400mL水洗脱样品中水溶性杂质，换100-200mL的甲醇洗脱，即可；

所述固相萃取小柱的制备方法包括：将玻璃柱或塑料柱的底部加一层筛板，然后倒入8-12ml的反相聚合物，在上层再加一层筛板，用50-100ml甲醇冲洗固相萃取柱，即可；

所述固相萃取小柱使用前先采用200-300ml的水将甲醇替换；

所述反相聚合物为NM200反相聚合物。

2.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，粉碎的目粒度控制在60目以上；烘干的温度为40-55℃。

3.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，粉碎的目粒度控制为70-100目；烘干的温度为45℃。

4.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，甲醇-氨水的混合水溶液处理的步骤包括：将粉碎的人参根茎放于滤纸筒中置于索氏提取器中，添加所述甲醇-氨水的混合水溶液。

5.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，甲醇-氨水的混合水溶液中氨水的体积百分比含量为4％。

6.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，甲醇-氨水的混合水溶液中甲醇的体积比百分比含量70-90％之间。

7.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，甲醇-氨水的混合水溶液中甲醇的体积比百分比含量为80％。

8.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，提取温度控制在90-100℃之间；提取时间控制在8-12h之间。

9.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，每克的人参根茎添加甲醇-氨水的混合水溶液20-50ml。

10.根据权利要求1所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(A)中，每克的人参根茎添加甲醇-氨水的混合水溶液为30-40ml。

11.根据权利要求9所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，加水洗涤残渣，合并洗涤液离心10min以上，离心的速率控制在8000rpm以上。

12.根据权利要求11所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，离心的速率为9000-11000rpm之间。

13.根据权利要求1-11任一项所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，纯化后进行水浴干燥，干燥的温度在90℃以上。

14.根据权利要求1-11任一项所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，纯化后进行水浴干燥，干燥的温度为100℃。

15.根据权利要求1-12任一项所述的测定人参总皂苷的方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所述总皂苷的质量百分比含量的计算方法包括：将称量皿与进行所述干燥后物质的总质量减去所述称量皿的质量之后，与所述人参根茎的质量两者的质量百分比。