CN107653201B - 一种胞内劳森菌分离方法 - Google Patents

Abstract

一种猪胞内劳森菌的分离培养方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下步骤：病料的采集与处理；小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养；分离细菌培养。本发明具有以下有益效果：本发明所改变了传统的病料处理方法，省去了以往繁琐的操作步骤，提出了一种新的细菌分离液，大大缩短了细菌的分离时间；提出了应用胎鼠的肠上皮原代细胞用来培养细菌，为胞内劳森菌提供了一个模拟体内的体外培养环境，增加了分离细菌的成功率；应用微需氧产气袋进行培养，解决了价格昂贵的智能多气培养箱的问题，大大降低了细菌分离成本。

Description

一种胞内劳森菌分离方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种胞内劳森菌的分离方法。

背景技术

胞内劳森菌(LI)是猪增生性肠炎（PPE）的主要病原，LI宿主多而广，能够感染猪、兔、马、仓鼠、大鼠、豚鼠、猴、小鼠等动物，主要寄生在动物的回肠、结肠、盲肠等部位可引起高度增生。目前，PPE呈世界规模流行，感染率高，在国内呈现逐年增加趋势，猪死亡率虽然不高，但严重降低猪对饲料的利用率而提高生产成本，部分感染病猪并不表现出明显的临床症状，呈现隐性感染，生产上容易被忽视，同时该病具有流行性广和危害性大等特点，为了更好的预防和控制PPE，研究LI的分离鉴定就显的非常重要。

LI是一种严格的胞内寄生细菌，而且生存条件要求苛刻，对于LI的分离培养也是一个世界性的难题，常规的培养基难以满足，只能用细胞来分离培养，目前成功分离到的胞内劳森菌不足20株。传统的LI分离方法，步骤多，操作麻烦，分离成功率较低，周期一般较长，鉴于此，我们提出了一种高效、方便、快捷分离LI的方法，对于预防和控制PPE具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种胞内劳森菌分离方法的技术方案，为胞内劳森菌的诊断及研究提供依据。

所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取患有增生性肠炎典型症状的疑似病猪的回肠，用pH为3.0-5.0的PBS溶液进行洗1-3次，刮取回肠黏膜1-10g，置于匀浆器内进行匀浆，再加入2-10 ml细菌分离液中，充分混匀，置于室温环境下5-20min，然后按100-500g离心5-10min，取上清，依次通过5.0、1.2、0.45um滤器进行过滤，滤液置于-20℃保存；

2）取小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养；

3）将步骤1）得到的胞内劳森菌分离物用10%FBS的HDMEM细胞培养液按1:5-1:10稀释，加入到汇合度为30%-50%小鼠的肠上皮原代细胞中，之后将细胞瓶置于微需氧产气袋中培养，气体有效浓度为8%-15% O₂、5%-10%CO₂，培养3-5d，每天更换一次新的培养液。

所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于所述的步骤1）中细菌分离液通过以下步骤得到：

取海藻糖1-10 g、磷酸二氢钾0.1-0.5 g、氯化钾0.5-3 g、氯化钠1-8 g、谷胱甘肽5-20 mg、亚硒酸钠40-50 umol 、万古霉素50-100 mg、新霉素10-50 ug、两性霉素B 0.5-2mg；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，并且用0.1M的HCL溶液调pH至3.0-5.0，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于所述的步骤2）中小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养具体为：

取胚胎期17-19d的胎鼠小肠，去除肠系膜，用PBS溶液清洗5-8次，以洗掉肠内容物和肠黏膜表面的黏液，将肠管剪成0.8-1mm³的组织块，加入5-10 ml 0.25%胰酶消化液进行消化10-20 min，用含有10%FBS细胞培养液终止消化，并吹打均匀，按1000r/min离心8-15min，弃去上清，再用培养液重悬沉淀，移至培养瓶中，置于37℃ 5%的CO₂培养箱中，每30-40h换液一次，最后贴壁的细胞即为小鼠的肠上皮细胞。

所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤得到：

取氯化钠6-10 g、氯化钾0.05-0.5 g、磷酸氢二钠1-1.2 g、磷酸二氢钾0.1-1g、

氯化钙0.05-0.2 g和含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2 g；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，用0.1mol/L的盐酸溶液调至pH值5.0-7.0，再经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明所提出的一种猪胞内劳森菌的分离方法，改变了传统的病料处理方法，省去了以往繁琐的操作步骤，提出了一种新的细菌分离液，大大缩短了细菌的分离时间；

2、本发明所提出的一种猪胞内劳森菌的分离方法，提出了应用胎鼠的肠上皮原代细胞用来培养细菌，为胞内劳森菌提供了一个模拟体内的体外培养环境，增加了分离细菌的成功率；

3、本发明所提出的一种猪胞内劳森菌的分离方法，提出了一种新的细菌分离液，增加了分离细菌的成功率；

4、本发明所提出的一种猪胞内劳森菌的分离方法，应用微需氧产气袋进行培养，解决了价格昂贵的智能多气培养箱的问题，大大降低了细菌分离成本。

附图说明

图1为分离细菌的抗酸染色图；

图2为分离细菌的姬姆萨染色图；

图3为分离细菌的Warthin -Starry镀银染色；

图4为LI的PCR鉴定结果；

图5为接种细菌的培养物荧光图；

图6为正常细菌培养物荧光图。

图4中：1-阴性对照；2-阳性对照；3-所分离的毒株；M-DL1000bp。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1：病料的采集与处理

取取患有增生性肠炎典型症状的疑似病猪的回肠（约5cm），用PH为5.0的PBS溶液进行洗3次，之后轻轻刮取回肠黏膜5g，置于匀浆器内进行匀浆，然后加入5ml细菌分离液中，充分混匀，置于室温环境下10 min，然后按300g离心5min，取上清，依次通过5.0、1.2、0.45um滤器进行过滤，滤液置于-20℃保存。

实施例2：小鼠肠上皮原代细胞制备

取胚胎期17-19d的胎鼠小肠，去除肠系膜，用PBS溶液清洗5次，以洗掉肠内容物和肠黏膜表面的黏液，将肠管剪成1mm³的组织块，加入5ml 0.25%胰酶消化液进行消化10min，用含有10%FBS细胞培养液终止消化，并吹打均匀，按1000r/min离心8min，弃去上清，再用培养液重悬沉淀，移至培养瓶中，置于37℃ 5%的CO2培养箱中，每30h换液一次，最后贴壁的细胞即为小鼠肠上皮细胞。

实施例3：细胞接种

将胞内劳森菌分离物用10%FBS的HDMEM细胞培养液按1:5稀释，加入到汇合度为30%小鼠的肠上皮原代细胞中，之后将细胞瓶置于微需氧产气袋（购买于日本三菱）中培养，气体有效浓度为8% O₂、8%CO2，每天更换一次新的培养液，共培养4d，收取细菌培养液。

上述的实施例中细菌分离液通过以下步骤得到：

取海藻糖1-10 g、磷酸二氢钾0.1-0.5 g、氯化钾0.5-3 g、氯化钠1-8 g、谷胱甘肽5-20 mg、亚硒酸钠40-50 umol 、万古霉素50-100 mg、新霉素10-50 ug、两性霉素B 0.5-2mg；将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，并且用0.1M的HCL溶液调pH至3.0-5.0，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

PBS溶液通过以下步骤得到：

取氯化钠6-10 g、氯化钾0.05-0.5 g、磷酸氢二钠1-1.2 g、磷酸二氢钾0.1-1g、

氯化钙0.05-0.2 g和含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2 g；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，用0.1mol/L的盐酸溶液调至pH值5.0-7.0，再经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

试验例：猪胞内劳森菌的分离鉴定

1材料

1.1 猪胞内劳森菌的分离

按本发明实施例1-3分离。

1.2 DMEM基础培养基、胎牛血清购于GIBCO公司。

1.3 抗酸染色试剂盒，购于广州维格斯生物科技有限公司；姬姆萨染色试剂盒，购于江苏省南京凯基生物科技发展有限公司；Warthin -Starry镀银染色试剂盒。

1.4 猪胞内劳森菌单克隆抗体、兔抗鼠荧光抗体，均购于Bio-X Diagnostics。

1.5 猪胞内劳森菌阳性菌株，购于勃林格殷格翰。

1.6 PCR相关试剂，购于大连宝生物公司。

2 方法

2.1 染色鉴定试验

2.1.1 抗酸染色试验

取1-2滴由实施例3分离的细菌液加到载玻片上，进行涂片，待自然干燥后进行火焰固定，滴加石炭酸复红染色液染色，用3%盐酸酒精进行脱色处理，滴加亚甲基蓝染液复染，待玻片干燥后置于100倍油镜下进行观察。

2.1.2 姬姆萨染色试验

取1-2滴由实施例3分离的细菌液加到载玻片上，进行涂片，待自然干燥后进行火焰固定，滴加姬姆萨染色液，保持染色 10min，最后用流水冲洗染液至无色，待玻片干后置于100倍油镜下进行观察。

2.1.3 Warthin -Starry镀银染色试验

取1-2滴由实施例3分离的细菌液加到载玻片上，进行涂片，待自然干燥后滴加染色固定液（ 10%冰乙酸）固定3 min；然后用蒸馏水冲洗 3 min，待涂片干燥；滴加银染色液染色5 min，再用蒸馏水脱洗1 min；待涂片干燥后，滴加显色液显色 5 min，用蒸馏水脱洗1 min；待涂片干燥滴加终止液 5%冰乙酸，反应 3 min，用吸水纸吸干玻片，置于100倍油镜下进行观察。

2.2 PCR鉴定试验

本试验根据GenBank发表的LI基因序列，应用Oligo 6.0及Primer5.0等软件，设计出一对引物，

上游引物（P1）：5’- CAGCACGGAGTGTTTGACAG-3’，

下游引物（P2）：5’- TGATGTAGGCCAACGTGGTT-3’，扩增片段为449 bp。

利用DNA抽提试剂盒提取细菌DNA，以细菌DNA为模板进行PCR反应，采用25ul体系：PCR Master Mix 12.5ul，上、下游引物各1ul，模板DNA 1ul，ddH2O 8.5 ul，反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s ，55℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 5min，并将产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照记录结果，同时设阴阳性对照。

2.3 免疫荧光鉴定试验

将在腔玻片上已培养5d的小鼠肠上皮细胞，弃去培养液，取下载玻片，并用PBS洗涤两次。将腔玻片放入玻片槽中，加入2ml冷丙酮至完全淹没玻片，置于冰盒内下感作10min，并用PBS对玻片进行封闭（浸没玻片即可），37°C孵育30min；用PBS洗3次，每次3min；在玻片上滴加按1:20已稀释好的一抗（鼠抗胞内劳森菌单克隆抗体），至完全浸没表层细胞，37℃湿盒中孵育l h；取出玻片后，用PBS洗3次，滴加稀释好的二抗（兔抗鼠荧光抗体）至完全浸没表层细胞，转移至湿盒后于37℃孵育30min；取出玻片，PBS洗3次，每次3min。甩干玻片，滴一滴封片剂，用盖玻片盖上，荧光显微镜观察结果。

3 结果

3.1 染色鉴定试验

将所分离的细菌，通过几种染色鉴定方法，置于100倍油镜下进行观察，抗酸染色，菌体被染成红色（见图1）；姬姆萨染色，菌体被染成浅红色（见图2）；Warthin -Starry镀银染色，菌体被染成黑色（见图3）。

3.2 PCR鉴定结果

以所分离的猪胞内劳森菌为模板，PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，置于紫外灯光下观察，并用凝胶成像系统拍照。由图1可见，所分离细菌扩增结果与预期结果相符，均为449bp。

3.3 免疫荧光鉴定试验

应用猪胞内劳森菌单克隆抗体对接种细菌的细胞培养物和未接种细菌的对照细胞培养物进行间接免疫荧光试验，结果表明，接种细菌的细胞培养物在其胞浆和细胞膜上出现绿色闪亮荧光(见图5)；正常的细胞未见有绿色荧光(见图6)。

4 结论

综上所述，本发明所提出的猪胞内劳森菌的分离方法，病料的处理方法简单方便，还为猪胞内劳森菌的培养提供一种新的细胞，大大缩短细菌的分离鉴定时间和提高了分离细菌纯度，对于PPE的及时预防和诊断提供重要依据。

Claims (2)

1.一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取患有增生性肠炎典型症状的疑似病猪的回肠，用pH为3.0-5.0的PBS溶液进行洗1-3次，刮取回肠黏膜1-10g，置于匀浆器内进行匀浆，再加入2-10 ml细菌分离液中，充分混匀，置于室温环境下5-20min，然后按100-500g离心5-10min，取上清，依次通过5.0、1.2、0.45um滤器进行过滤，滤液置于-20℃保存；

2）取小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养；

3）将步骤1）得到的胞内劳森菌分离物用10%FBS的HDMEM细胞培养液按1:5-1:10稀释，加入到汇合度为30%-50%小鼠的肠上皮原代细胞中，之后将细胞瓶置于微需氧产气袋中培养，气体有效浓度为8%-15% O₂、5%-10%CO₂，培养3-5d，每天更换一次新的培养液；

上述的步骤1）中细菌分离液通过以下步骤得到：

取海藻糖1-10 g、磷酸二氢钾0.1-0.5 g、氯化钾0.5-3 g、氯化钠1-8 g、谷胱甘肽5-20mg、亚硒酸钠40-50 umol 、万古霉素50-100 mg、新霉素10-50 ug、两性霉素B 0.5-2 mg；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，并且用0.1M的HCL溶液调pH至3.0-5.0，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用；

上述的步骤2）中小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养具体为：

取胚胎期17-19d的胎鼠小肠，去除肠系膜，用PBS溶液清洗5-8次，以洗掉肠内容物和肠黏膜表面的黏液，将肠管剪成0.8-1mm³的组织块，加入5-10 ml 0.25%胰酶消化液进行消化10-20 min，用含有10%FBS细胞培养液终止消化，并吹打均匀，按1000r/min离心8-15min，弃去上清，再用培养液重悬沉淀，移至培养瓶中，置于37℃ 5%的CO₂培养箱中，每30-40h换液一次，最后贴壁的细胞即为小鼠的肠上皮细胞。

2.如权利要求1所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤得到：

取氯化钠6-10 g、氯化钾0.05-0.5 g、磷酸氢二钠1-1.2 g、磷酸二氢钾0.1-1g、

氯化钙0.05-0.2 g和含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2 g；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，用0.1mol/L的盐酸溶液调至pH值5.0-7.0，再经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

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