CN118109399B - 一种促进间充质干细胞的成软骨分化试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促进间充质干细胞的成软骨分化试剂盒及其应用，属于细胞培养领域。本发明发现将白芨多糖可以明显增强间充质干细胞的成软骨分化诱导效果，当白芨多糖与间充质干细胞成软骨诱导分化试剂联用时，能大幅度提升干细胞的成软骨分化比例，特别是与赛百慷公司货号为iCell‑MSCYD‑003的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂联用时，能显著提高增强间充质干细胞的成软骨分化，能显著提高细胞的Collagen II mRNA、ACAN mRNA和SOX9 mRNA的表达水平。本发明能大幅度提升间充质干细胞的成软骨分化，在间充质干细胞成软骨分化上具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种促进间充质干细胞的成软骨分化试剂盒及其应用。
背景技术
白芨多糖 (Bletilla striata polysaccharide,BSP)是从传统中药白及中提取得到的甘葡聚糖，具有抗炎、促凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等生物学活性。它还具有功能缓释性、局部滞留性、自身降解性、无刺激性、无毒副作用、资源丰富、廉价易得等特性，因此被广泛应用于药物和食品制造。
Collagen II、ACAN和SOX9是干细胞成软骨分化的重要指标,目前通过检测Collagen II mRNA、ACAN mRNA和SOX9 mRNA的表达水平，来判断成软骨分化情况，Collagen II mRNA、ACAN mRNA和SOX9 mRNA表达水平越高，干细胞成软骨分化程度越高。（DOI: 10.1016/j.cytogfr.2018.10.002以及DOI: 10.1016/j.biomaterials.2020.120539）
目前未见白芨多糖可以明显增强间充质干细胞的成软骨分化的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进间充质干细胞的成软骨分化试剂盒及其应用。
本发明提供了一种促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒，它包括白芨多糖和赛百慷公司的货号为iCell-MSCYD-003的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒。
本发明还提供了一种上述的促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒在促进间充质干细胞的成软骨分化中的用途。
进一步地，所述白芨多糖终浓度为25-200μg/mL。
进一步地，所述白芨多糖终浓度为25-75μg/mL，优选地所述白芨多糖终浓度为50μg/mL。
进一步地，所述试剂盒是增加充质干细胞Collagen II mRNA表达水平的试剂。
进一步地，所述试剂盒是增加充质干细胞ACAN mRNA表达水平的试剂。
进一步地，所述试剂盒是增加充质干细胞SOX9 mRNA表达水平的试剂。
本发明还提供了一种采用上述的促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒促进间充质干细胞的成软骨分化的培养方法，包括以下步骤：
1）采用赛百慷公司的货号为iCell-MSCYD-003的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒，配制成软骨诱导分化培养基，并加入白芨多糖，制备得到完全培养基，
2）使用完全培养基培养间充质干细胞，诱导滑膜间充质干细胞成软骨分化。
进一步地，步骤1）中白芨多糖终浓度为50ug/ml。
进一步地，步骤2）培养条件为5%CO2，37℃恒温培养，每2天更换完全培养基。
本发明有益效果，本发明提供了一种促进间充质干细胞的成软骨分化试剂盒及其应用，本发明发现将白芨多糖可以明显增强间充质干细胞的成软骨分化诱导效果，当白芨多糖与间充质干细胞成软骨诱导分化试剂联用时，能大幅度提升干细胞的成软骨分化比例。特别是与赛百慷公司货号为iCell-MSCYD-003的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂联用时，与仅使用iCell-MSCYD-003试剂相比，能显著提高增强间充质干细胞的成软骨分化，以及显著提高间充质干细胞的Collagen II mRNA、ACAN mRNA和SOX9 mRNA的表达水平。本发明能大幅度提升间充质干细胞的成软骨分化，在间充质干细胞的成软骨分化上具有广泛的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为各组细胞孵育第7天的甲苯胺蓝染色结果图。
图2为各组细胞孵育第14天的甲苯胺蓝染色结果图。
图3为各组细胞孵育第21天的甲苯胺蓝染色结果图。
图4为各组细胞孵育第7天的免疫荧光染色结果图。
图5为各组细胞孵育第14天的免疫荧光染色结果图。
图6为各组细胞孵育第21天的免疫荧光染色结果图。
图7为各组细胞在第7、14、21天时collagen II mRNA基因表达结果图。（* p<0.05；** p<0.01）。
图8为各组细胞在第7、14、21天时ACAN mRNA基因表达结果图。（* p<0.05；** p<0.01）。
图9为各组细胞在第7、14、21天时SOX9 mRNA基因表达结果图。（* p<0.05；** p<0.01）。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒购买自：https://icellbioscience.com/product-general-cn-medium_serum_additive/iCell-MSCYD-003/。
本发明主要实验试剂：
本发明主要主要实验仪器：
实施例1、本发明促进间充质干细胞的成软骨分化试剂盒
一、实验方法
（一）诱导细胞分化分组
1、新鲜分离的原代大鼠滑膜间充质干细胞采用配套培养基扩培传代，并分别接种于六孔培养板，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，诱导细胞成软骨分化，实验分为4组，具体如下：
1) 滑膜间充质干细胞常规诱导分化组（单纯诱导组）：采用间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒（赛百慷，iCell-MSCYD-003），配制单纯诱导组培养基，待6孔板中接种细胞汇合度达80%左右，吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入提前配制好的单纯诱导组培养基，置于5%CO2，7℃恒温细胞培养箱中培养，每2天更换单纯诱导组培养基，诱导滑膜间充质干细胞成软骨分化；
2)滑膜间充质干细胞成软骨诱导联合加药组（诱导+药组）：采用间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒（赛百慷，iCell-MSCYD-003），配制成软骨诱导分化培养基，并在培养基中加入白芨多糖，制备得到诱导分化+药组培养基，其中白芨多糖终浓度为50ug/ml；待6孔板中接种细胞汇合度达80%左右，吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入提前配制好的诱导分化+药组完全培养基，置于5%CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养，每2天更换新鲜诱导分化+药组培养基，诱导滑膜间充质干细胞成软骨分化；
3) control细胞对照组（对照组）：采用赛百慷（PriMed-iCell-012）原代间充质干细胞培养体系，配制原代间充质干细胞培养基，待6孔板中接种细胞汇合度达80%左右，吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入原代间充质干细胞培养基，置于5%CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养，每2天更换原代间充质干细胞培养基，培养滑膜间充质干细胞；
4) 滑膜间充质干细胞培养加药组（对照+药组）：采用赛百慷（PriMed-iCell-012）原代间充质干细胞培养体系，配制原代间充质干细胞培养基，加入白芨多糖，得到对照+药组培养基，其中白芨多糖终浓度为50ug/ml；待6孔板中接种细胞汇合度达80%左右，吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入对照+药组培养基，置于5%CO2，37℃恒温细胞培养箱中培养，每2天更换对照+药组培养基，培养滑膜间充质干细胞；
1-4组细胞诱导分化培养过程中，每隔2天换液一次，上述4组细胞分别于培养诱导成软骨分化7天，14天及21天收样，进行后续实验检测。
（二）检测方法
1、甲苯胺蓝染色
（1）细胞分组诱导分化结束后，吸弃细胞培养上清，1×PBS润洗1~2次，室温固定30min。
（2）吸弃细胞固定液，1×PBS润洗2次。沿孔壁缓慢加入甲苯胺蓝染色液，室温染色30min。
（3）吸出染色液，1×PBS润洗，去掉浮色。
（4）显微镜下观察细胞染色并拍照。
2、免疫荧光检测Collagen II
（1）破膜：吸去 PBS，在细胞孔板里滴加 200ul 免疫染色通透液(Saponin)，室温破膜15 min，将细胞孔板置于摇床上，用PBS洗涤 3 次，每次 5min。
（2）血清封闭: 在细胞孔板里滴加 200ul 3% BSA 均匀覆盖细胞， 室温封闭20min。
（3）加一抗：轻轻吸掉封闭液，在细胞孔板里滴加 200 ul 用 PBS 稀释好的一抗(1:200) ，细胞培养板平放于湿盒内 ，于4 ℃ 过夜孵育。
（4）加二抗：将细胞孔板置于摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。稍甩干后在细 胞孔板里滴加 200ul 与一抗相应种属的二抗 (1:500) ，37℃ 避光孵育 30min。
（5）DAPI 复染细胞核：将细胞孔板置于摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。稍 甩干后在细胞孔板里滴加 200ul DAPI 染液，室温避光孵育 5min。
（6）封片：将细胞孔板置于摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。爬片稍甩干后用 抗荧光淬灭封片剂封片。
（7）镜检拍照：爬片于荧光显微镜下观察并采集图像。 (DAPI 紫外激发波长 330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；CY3 红光激发波长 510-560 ，发射波长 590nm ，发红光) 。
3、qPCR检测Collagen II，ACAN, SOX9目的基因表达
本发明选取间充质干细胞向成软骨分化的重要指标ACAN、SOX9、CollagenⅡ，通过qPCR 检测白芨多糖对间充质干细胞向成软骨诱导分化后ACAN mRNA、SOX9 mRNA、Collagen ⅡmRNA的影响，进行分析。
（1）RNA提取
a)收取细胞沉淀，加入 1ml TRIzol 裂解。
b)加入 0.2mL 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温放置 5 分钟。
c)4℃ 12000rpm 离心 10 分钟，取上清（约 500ul）加入到另一 EP 管中。
d)加入 0.5mL 预冷的异丙醇，温和混匀，冰上孵育 30 分钟。
e)4℃ 12000rpm 离心 15 分钟，弃去上清。
f)加入 1mL 预冷的 75℅乙醇。4℃ 12000rpm 离心 5 分钟，弃上清。
g)重复步骤 f。
h)室温干燥 RNA 沉淀，加入20-50 μL DEPC 水, -80℃保存备用。
（2）cDNA合成
a)去除基因组 DNA 反应：在 0.2mL EP 管中，加入总 RNA（质量为 1µg）、5×gDNAEraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，DEPC 水补足至 10μL， 轻轻混匀、点动离心。
b)PCR 仪上 42℃加热 2min，立即冰浴 1min。
c)在上述 EP 管中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix1.0μL 、 RNase Free dH2O 4.0μL 、 RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase 4.0μL。
d)37℃，15min；85℃，5s 。
e)取出上述反应液，即为 cDNA，-20℃ 保存备用。
（3）荧光定量 PCR
取出 cDNA 作为荧光定量的模板，反应体系如下：
| 体系 | 体积 |
| 2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX） | 10uL |
| Forward Primer（10uM） | 0.4uL |
| Reverse Primer （10uM） | 0.4uL |
| cDNA | 3uL |
| RNase Free water | 6.2uL |
| Total | 20uL |
b)反应条件如下：
c)目的基因引物序列信息如下：
（4）数据处理
PCR扩增后，实时荧光定量PCR仪自动分析结果，根据阴性对照调整阈值和基线以确定各个标本的Ct值，并根据熔解曲线确定该Ct值是否有效。将结果导出，采用2-△△CT法分析目的基因在对照组和各测定组之间的表达差异，计算公式如下：△Ct= Ct目的基因－Ct内参，再求得对照组△Ct的平均值，记为△Ct对照平均，用各组的△Ct分别减去△Ct对照平均，求得△△Ct值，即△△Ct=△Ct样本－△Ct对照平均，再计算各组2-△△CT值，即为各组中基因的相对表达量。
二、实验结果
1、甲苯胺蓝染色结果
成软骨细胞外基质会被甲苯胺蓝染成蓝紫色，蓝紫色面积越多，间充质干细胞分化为成软骨细胞的程度越高。图1-图3为各组细胞孵育第7天、14天、21天的甲苯胺蓝染色结果图。
实验结果表明，各组细胞孵育第7天、14天、21天时，单纯诱导组及诱导分化+药组可见间充质干细胞分化成软骨细胞，且诱导分化+药组相对单纯诱导组成软骨细胞生成明显更多。
2、免疫荧光染色
Collagen II是成软骨细胞外基质重要的组成，图4-图6为各组细胞孵育第7天、14天、21天的免疫荧光染色检测Collagen II的表达结果，其中红色的荧光就是Collagen II阳性表达。
实验结果表明，各组细胞孵育第7天、14天、21天时，Collagen II在诱导分化+药组中表达最高，在对照组最低，和对照＋药组相比对照组表达更高， 诱导分化+药组相比单纯诱导组Collagen II表达更高。
3、荧光定量PCR检测结果
荧光定量PCR检测Collagen II mRNA、ACAN mRNA和SOX9mRNA表达水平结果如图7-图9所示，图7为各组细胞在第7、14、21天时collagen II mRNA基因表达结果图，图8为各组细胞在第7、14、21天时ACAN mRNA基因表达结果图，图9为各组细胞在第7、14、21天时SOX9 mRNA基因表达结果图。
从图7可以看出，各组细胞在第7、14、21天时Collagen II mRNA在对照组表达最低，在第7天和14天对照+药组相对对照组有显著差异，但是第21天时对照+药组相对对照组没有明显差异。在第7、14、21天时，诱导分化+药组相对单纯诱导组的Collagen II mRNA表达水平均显著增加。
从图8可以看出，在第7、14、21天时对照+药组相对对照组没有明显差异。在第7、14、21天时，诱导分化+药组相对单纯诱导组的ACAN mRNA表达水平显著增加。
从图9可以看出，各组细胞在第7、14、21天时SOX9 mRNA对照+药组相对对照组没有明显差异。第7、14、21天时，诱导分化+药组相对单纯诱导组在SOX9 mRNA表达水平显著增加。
实验结果表明，当白芨多糖与赛百慷公司货号为iCell-MSCYD-003的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂联合使用时，与仅使用iCell-MSCYD-003试剂相比，能显著提高增强间充质干细胞的成软骨分化，以及显著提高间充质干细胞的Collagen II mRNA、ACAN mRNA和SOX9 mRNA的表达水平。
综上，本发明提供了一种促进间充质干细胞的成软骨分化试剂盒及其分化培养方法，本发明发现将白芨多糖可以明显增强间充质干细胞的成软骨分化诱导效果，当白芨多糖与间充质干细胞成软骨诱导分化试剂联用时，能大幅度提升干细胞的成软骨分化比例，缩短分化时间。特别是，当白芨多糖与赛百慷公司货号为iCell-MSCYD-003的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂联用时，与仅使用iCell-MSCYD-003试剂相比，能显著提高增强间充质干细胞的软骨分化，以及显著提高间充质干细胞的Collagen II mRNA、ACAN mRNA和SOX9 mRNA的表达水平。本发明能够显著增强间充质干细胞的成软骨分化比例，并有效缩短分化所需时间，研究人员能够更快速地获得大量的软骨细胞，从而为软骨缺损的治疗和软骨组织的研究提供强有力的支持,本发明在间充质干细胞成软骨分化的科研领域中具有广阔的应用前景。
Claims (10)
1.一种促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒，其特征在于，它包括白芨多糖和赛百慷公司的货号为iCell-MSCYD-003的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒。
2.权利要求1所述的促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒在促进间充质干细胞的成软骨分化中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述白芨多糖终浓度为25-200μg/mL。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述白芨多糖终浓度为50 μg/mL。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒是增加间充质干细胞Collagen II mRNA表达水平的试剂。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒是增加间充质干细胞ACAN mRNA表达水平的试剂。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒是增加间充质干细胞SOX9 mRNA表达水平的试剂。
8.一种采用权利要求1所述的促进间充质干细胞的成软骨分化的试剂盒促进间充质干细胞的成软骨分化的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）采用赛百慷公司的货号为iCell-MSCYD-003的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒，配制成软骨诱导分化培养基，并加入白芨多糖，制备得到完全培养基，
2）使用完全培养基培养间充质干细胞，诱导滑膜间充质干细胞成软骨分化。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1）中白芨多糖终浓度为50μg/ml。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2）培养条件为5%CO2，37℃恒温培养，每2天更换完全培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410542210.7A CN118109399B (zh) | 2024-04-30 | 一种促进间充质干细胞的成软骨分化试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118109399A CN118109399A (zh) | 2024-05-31 |
| CN118109399B true CN118109399B (zh) | 2024-07-05 |
Family
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105085938A (zh) * | 2015-08-28 | 2015-11-25 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法 |
| CN108926674A (zh) * | 2018-09-04 | 2018-12-04 | 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 | 一种骨延长术后帮助恢复的中药配方及熬制方法 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105085938A (zh) * | 2015-08-28 | 2015-11-25 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法 |
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