CN107475311B - 用于生产脂质的方法和微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于生产用于生物燃料或润滑剂的脂质的方法和在该方法中使用的链霉菌属细菌。该方法包括在包含有机废物或残渣或其混合物作为碳源和/或营养素来源的培养基中培养链霉菌属的细菌细胞，从所述细菌的细胞或培养基中回收脂质，并且使用回收的脂质或其馏分作为生物燃料和/或润滑剂，或作为用于生物燃料和/或润滑剂生产的原材料。此外，在一个方面，本发明提供通过使用根据本公开内容的方法获得的产物。

Description

用于生产脂质的方法和微生物
本申请是申请日为20110524、申请号为201180035778.0的同名申请的分案申请。
本发明涉及用于生产用于生物燃料或润滑剂应用的脂质的方法和可在该方法中使用的微生物菌种。
发明背景
可再生的生物学材料用于生产生物燃料的用途一般通过减少气候变化影响，保证燃料的供应和经济因素推动。然而，食用作物产生燃料而不是进一步将其精炼为食物用于增加人口的用途是伦理上越来越短命的。因此，不能用于喂养人或牛和可以以环境有利方式制造的生物学来源具有增长中的兴趣。
BCC Research(http://www.bccresearch.com/)估计关于液体生物燃料的全球市场在2008年价值$303亿。对于7.2％的化合物年增长率(CAGR)，这在2013年应增至$428亿。对于市场的另一个判断方法是容积。在欧盟的研究报告中考虑的跨越21世纪在2008年生物燃料生产能力总计109亿升生物柴油，和666亿升生物乙醇。超过99％的这种生产视为所谓的第一代生物燃料，包括基于糖和淀粉的生物乙醇，以及基于油料种子和废油的生物柴油。生物柴油可以由油料种子作物、动物性脂肪或再循环的油脂制备。因为已知藻类和一些微生物能够生产和/或累积脂质，所以也提出其作为用于生物柴油的油来源的用途。这些基于微生物的油通常称为单细胞油。Campbell 2008和Strobel等人，2008已描述在不同类型的生物反应器中藻类和真菌的培养条件的最佳化，以使用于生物燃料精炼的脂质和脂肪酸的得率达到最大。
脂质的光合生产的备选选项是利用异养生物，其由有机分子(例如糖)而无需光来生产脂质。使用异养微生物的单细胞油生产方法包含在充气生物反应器中培养微生物，允许细胞累积脂质，收获富含脂质的细胞且从细胞中回收油(Ratledge等人，2005，Meng等人，2009)。
单细胞油已在传统上用作例如健康食品中的专门产物，而不是用作商品化学制品。在这些种类的单细胞油生产方法中，该产物容积相对很小，并且产物是昂贵的。因此，这些方法的成本结构允许利用昂贵的饲料原材料和单元操作。类似种类的生产方法也已对于用于生物柴油生产的脂质生产描述(Ratledge和Cohen 2008；Meng等人2009)。然而，因为该产物是廉价的商品化学制品，所以方法成本不应在专门产物的方法成本水平上。进一步地，通过异养微生物的脂质得率一般极低，小于20％重量百分比的进料糖(Ratledge和Cohen，2008)。
用于在通过异养微生物的脂质生产中使用的较不昂贵的原材料已在某些近期专利公开中提出。WO 2009/034217 A1已描述通过废弃材料和微生物制备石蜡、脂肪酸和醇的发酵方法。WO 2009/046375 A2提出通过使用包含外源基因的重组微生物，将衍生自生物量的多糖转换为单糖或寡糖，且将其转换为生物燃料，所述外源基因允许微生物在作为碳的唯一来源的多糖上生长。US 2009/0064567 A1公开通过使用含纤维素原料作为主要碳源生长原生藻菌界(Stramenophile)的微生物，通过异养发酵的生物油生产。WO2009/011480 A1公开通过微藻和真菌由解聚的纤维素材料的生物油生产。US 2009/0148918 A1公开通过在作为碳源的甘油上培养微藻的脂质制造方法。此外，WO 2009/009391 A2公开通过首先生产醇组合物且将其提供到脂肪酯生产宿主内的脂肪酯生产。WO 2009/063138描述关于用水、酸或碱处理有机材料且研磨的方法。分离沉淀物和滤液且用于在用于脂质生产微生物的培养基中的脂质生产。
因为用于生物燃料的单细胞油生产的经济具有关键的重要性，所以用于生物燃料生产的脂质生产的新成本有效方法仍具有增长中的兴趣。
发明概述
本发明的一个目的是提供用于生产用于生物燃料或用于润滑剂应用的脂质的成本有效的方法。
本发明的另一个目的是提供可以用于所述方法中的新微生物。
在一个方面，本文描述的本发明提供用于生产特别是用于生物燃料或润滑剂用途的脂质的方法。本发明基于链霉菌属(Streptomyces)细菌能够在包含有机废物和/或残渣的培养基上有效生产脂质的发现。
该方法包括在包含有机废物和/或残渣或其混合物作为碳源和/或营养素来源的培养基中培养链霉菌属的细菌细胞。该方法包括从细菌细胞或培养基中回收脂质。脂质或其馏分作为生物燃料和/或润滑剂或作为用于生物燃料和/或润滑剂生产的原材料是有用的。
在本发明的多个实施方案中，培养基可以包含来自工业的有机废物或残渣，包括农业、市政废物或微生物残渣。
此外，培养基可以包含另外的碳源，例如甘油或来自糖或淀粉工业的馏分。
在本发明的一个实施方案中，该方法可以使用未灭菌的培养基。
在本发明的另一个实施方案中，该方法可以使用巴氏灭菌的培养基。
在本发明的一些实施方案中，培养基可以包含脂肪酶抑制剂。脂肪酶抑制剂可以用于延迟或阻碍在该方法中形成的酰基甘油的水解或脂质的降解。
在本发明的一个实施方案中，培养作为分批发酵执行。
在本发明的另一个实施方案中，培养作为分批补料发酵执行。
如本文公开的，该方法产生主要包含TAGs(三酰基甘油)的脂质。一般地，在耗尽的培养基中的TAGs量是至少1g/升培养基。
多个链霉菌属物种可以用于本发明中。物种包含下述，优选地物种可以选自包含下述的组，更优选地物种可以选自下述：玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)、生金链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、Streptomyces milbemycenius和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)。
链霉菌属菌株包含下述，优选地菌株可以选自包含下述的组，更优选地菌株可以选自下述：玫瑰孢链霉菌GAL4111、玫瑰孢链霉菌G011、灰色链霉菌GAL1005、白色链霉菌GAL1001,波赛链霉菌D2、GAL4082、波赛链霉菌P55GAL4081、生金链霉菌GAL1004、变铅青链霉菌GAL1002、天蓝色链霉菌GAL1003、吸水链霉菌GAL4051、除虫链霉菌GAL1006、Streptomyces milbemycinius GAL4211和利迪链霉菌GAL1007。
在本发明的方法中有利的是不产生或仅产生低量生物活性代谢产物的链霉菌属物种或菌株。
在本发明的特定实施方案中，可以使得链霉菌属物种或菌株在生产生物活性代谢产物中缺陷。生物活性代谢产物的例子是例如抗生素试剂，例如脂肽抗生素例如达托霉素或美尔倍霉素，或化学治疗剂例如道诺霉素。
生产低量生物活性化合物或使得在生产生物活性化合物中缺陷的菌株是例如包含下述的菌株，优选地菌株选自包含下述的组，更优选地菌株可以选自下述：玫瑰孢链霉菌GAL4111、玫瑰孢链霉菌G011、灰色链霉菌GAL1005、白色链霉菌GAL1001、波赛链霉菌P55GAL4081和波赛链霉菌D2GAL4082和Streptomyces milbemycinius GAL4211。
在一个方面，本发明提供链霉菌属培养物，其包含
(a)链霉菌属的细菌群体；和(b)包含有机废物或残渣或其混合物作为碳源和/或营养素来源的培养基。
在本发明的另一个方面，本发明提供能够有效脂质生产的遗传修饰的新链霉菌属宿主。
在本发明的一个实施方案中，链霉菌属宿主细胞可以进行遗传修饰，以表达脂质生物合成途径的至少一种基因。特别地，基因可以是编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因和/或编码3-酮脂酰-酰基载体蛋白质合酶III(FabH)的基因。
在本发明的一个实施方案中，链霉菌属宿主细胞可以进行遗传修饰，以表达包含下述的一种或多种基因，优选地选自包含下述的组，更优选地它们可以选自下述
(a)sco0958(SEQ ID NO:1)和/或sco5888(SEQ ID NO:2)；
(b)所述基因在链霉菌属物种中最接近的同系物；
(c)在严格条件下与所述基因或所述同系物中的至少一种杂交的核苷酸序列；
(d)引起与基因产物ID 101096381或ID 101101330具有的相同或等价功能的核苷酸序列；和/或
(e)编码显示与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO:4的至少60％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
特别地，合适的遗传修饰的菌株是包含下述的菌株，优选地选自包含下述的组，更优选地选自下述的菌株：G009、G010、G012、G013、G014、G015、G016、G017和G019。
在本发明的一个特定实施方案中，提供选自G009、G010、G013和G017的新链霉菌属物种。
在一个进一步方面，本发明提供链霉菌属的宿主细胞、培养物或菌株中的任何用于生产脂质，且使用脂质作为生物燃料和/或润滑剂，或作为用于生物燃料和/或润滑剂生产的原材料的用途。
另外，在一个方面，本发明提供通过使用根据本公开内容的方法获得的产物。
借助于本发明获得可观的优点。借助于此处呈现的方法和微生物，可以有效生产用于生物燃料和/或润滑剂，或作为用于生物燃料和/或润滑剂生产的原材料的脂质。本发明的优点可以概括如下：
在本发明中，已惊讶地发现当在包含有机废物和/或残渣的培养基上培养时，链霉菌可以生产大量脂质。有机废物和/或残渣作为碳源和/或营养素来源的用途减少培养基的成本，特别是因为废物和/或残渣是廉价的，且在使用前不需要预处理或仅需要少许预处理。在废物或残渣材料的组分加入培养基之前，它们无需是必须分离、水解(解聚)、纯化和/或灭菌的。
在该方法中通过链霉菌属生产的脂质得率可以进一步通过在培养基中使用脂肪酶抑制剂得到增加。脂肪酶抑制剂能够延迟或阻碍在该方法中形成的酰基甘油的水解或脂质的降解。
如此处描述的方法产生主要包含TAGs(三酰基甘油)的脂质。适合于用于生物燃料生产的化学加工的优选化合物是TAGs。
链霉菌属物种或菌株生产脂质的效率可以进一步通过使得物种或菌株在生产生物活性代谢产物(例如抗生素试剂)中缺陷得到改善。当经修饰的宿主菌株不生产生物活性代谢产物时，它具有更多的生产脂质的能力。
脂质生产的效率可以进一步通过生产遗传修饰的新链霉菌属宿主得到增加，所述链霉菌属宿主可以进行遗传修饰，以表达脂质生物合成途径的至少一种基因。
在下述中，本发明将借助于详述和参考一些工作实施例得到更密切地检查。
附图简述
图1呈现方法方案。
图2描述菌株G009的TLC(薄层色谱法)概况。
图3显示菌株G009在液体TSB培养基中的5天培养中固体和液体馏分中的PMV、细胞质量和脂质分散中的变化。生长周期是细胞裂解发生后约36小时。TAGs的累积在24–48小时的快速生长阶段后立即发生。
图4呈现通过G009在不同培养基中的TAGs累积的例子。从左到右的样品是在0、2、5和7天后的E05-14培养基，在0、2、5和7天培养后的E05-15培养基，标准COD(胆固醇octadecanat)、C(胆固醇)和GTM(甘油三肉豆蔻酸酯)，在0、2、5和7天后的E05-16培养基，在0、2、5和7天培养后的E05-17培养基。
图5呈现通过菌株G017、G016、G013和G011在不同培养基中的TAGs累积的例子。从左到右的样品是浓度为40、20、10和5g/l的GTM标准，在0、1、2和5天培养后的G017样品，在2、3和6天培养后的G016样品，在1、2、5和6天培养后的G013样品，在2、3和6天培养后的G011样品。
发明详述
“生物燃料”指主要衍生自生物量或生物废物的固体、液体或气体燃料，且不同于衍生自史前微生物、植物和动物的有机遗骸的化石燃料。
根据EU指示2003/30/EU，“生物柴油”指由具有待用作生物燃料的柴油品质的植物油或动物油产生的甲酯。更广泛地，生物柴油指长链烷基酯，例如来自具有柴油品质的植物油或动物油的甲酯、乙酯或丙酯。生物柴油还可以由微生物脂质产生，由此微生物脂质可以源于细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。
“可再生的柴油”指通过动物、植物或微生物起源的脂质或其混合物的氢处理产生的燃料，由此微生物脂质可以源于细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。可再生的柴油也可以通过气化和Fischer-Tropsch合成由衍生自生物量的蜡产生。任选地，除了氢处理外，还可以执行异构化或其他加工步骤。可再生的柴油加工还可以用于生产喷气燃料和/或汽油。可再生的柴油的生产已在专利申请EP 1396531、EP1398364、EP 1741767和EP1741768中描述。
生物柴油或可再生的柴油可以与基于矿物油的柴油掺和。合适的添加剂例如防腐剂和抗氧化剂可以加入燃料产品中。
“润滑剂”指当作为表面涂层应用于移动部分时，减少摩擦的物质例如油脂、脂质或油。润滑剂的两种其他主要功能是热量排除和溶解杂质。润滑剂的应用包括但不限于在内燃机中作为机油，在燃料、油驱动的装置例如泵和液压设备中或不同类型的轴承中的添加剂的用途。一般地，润滑剂含有75-100％基础油，并且剩余部分是添加剂。合适的添加剂是例如去污剂、贮存稳定剂、抗氧化剂、抗腐蚀剂、dehazers、反乳化剂、止泡剂、共溶剂和润滑添加剂(参见例如US 7,691,792)。用于润滑剂的基础油可以源于矿物油、植物油、动物油，或源于细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。基础油还可以通过气化和Fischer-Tropsch合成源于衍生自生物量的蜡。粘度指数用于表征基础油。一般地，高粘度指数是优选的。
术语“脂质”指脂肪物质，其分子一般含有脂肪族烃链作为部分，所述脂肪族烃链溶解于非极性有机溶剂，但在水中是弱可溶的。脂质是活细胞中的大分子的必需组。脂质是例如脂肪、油、蜡、蜡酯、固醇、萜类、类异戊二烯、类胡萝卜素、聚羟基烷酸酯、核酸、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、磷脂、糖脂、鞘脂和酰基甘油。
术语“酰基甘油”指甘油和脂肪酸的酯。酰基甘油作为脂肪和脂肪油天然存在。酰基甘油的例子包括三酰基甘油(TAGs，甘油三酯)、二酰基甘油(甘油二酯)和单酰基甘油(甘油单酯)。
本发明涉及使用包含有机废物和/或残渣或其混合物作为碳源和/或营养素来源的培养基，用于通过链霉菌属的有效脂质生产的方法。此外，培养基可以包含其他组分，例如一般用于培养所述微生物的矿物盐。培养在适合于脂质生产的条件下执行。培养一般通过使用搅动和充气在发酵罐中执行。
在本发明的一些实施方案中，有机废物或残渣可以用作唯一的或主要的碳源和/或营养素来源，或在一些实施方案中，用作补充物。废物或残渣可以包含一种或多种不同的废物或残渣或其混合物。
如果废物或残渣是培养基中的“主要碳源和/或营养素来源”，那么它意指在重量的基础上，在培养基中废物的量高于在培养基中纯成分(即糖)的量。
如果废物或残渣馏分用“作补充物”，那么它意指在重量的基础上，在培养基中废物或残渣馏分的量低于在培养基中纯成分(即糖)的量。
在本发明中，已惊讶地发现当在废物和/或残渣材料上培养时，链霉菌属细菌累积大量脂质，且特别是三酰基甘油(TAGs)。
链霉菌属的细菌是制药工业中众所周知的。已知链霉菌通过初级和次级代谢产生小分子、有用的酶和多种其他代谢产物。一般地，好气发酵方法适合于多种链霉菌属物种，因为该方法已在使用这些细菌作为模型生物的许多情况下发展。在现有技术方法中，链霉菌一般在复合培养基中培养，以增强工业上有用的代谢产物例如抗生素的累积。这些发酵方法的成本大量受材料和纯化成本影响。维持发酵不含污染物所需的灭菌是极端耗能的并且灭菌成本很高。此外，当生产大量抗生素时，培养基灭菌所需的能量构成方法中的主要成本类别，尽管它们在大的简单发酵槽中制造。
在本发明中，已惊讶地发现当在废物和残渣材料上培养时，链霉菌可以产生大量脂质。在废物或残渣材料的组分加入培养基之前，它们无需是必须分离、水解(解聚)、纯化和/或灭菌的是值得注意的。因此，在一些实施方案中，废物材料可以加入培养基中，而无需任何分离、水解(机械、化学或酶促)、纯化或灭菌。例如木质纤维素材料可以用于培养和脂质生产中，而无需多糖的水解(解聚)。在其他实施方案中，它可以以粗制形式加入，即包含一些初步纯化，但未纯化至分离组分。此外，废物或残渣可以像这样加入，或取决于材料的结构，它可以以研磨或磨碎的形式加入培养基中。废物和/或残渣也可以以部分或完全纯化、分离和水解(解聚)的形式用于通过链霉菌属的脂质生产。
在本公开内容中，“有机废物或残渣”特指其中组分并未或至少并未完全分离、水解(解聚)和/或纯化的废物材料。与纯成分的使用相比较，无需组分分离、水解(解聚)和/或纯化的废物或残渣材料的使用使得本发明的方法更成本有效。然而，在本发明的一些实施方案中，纯成分可以加上废物材料在培养基中用作碳源。
“非灭菌的有机废物或残渣或者包含有机废物或残渣的培养基”特指并未灭菌的废物或残渣材料或培养基。在一些实施方案中，废物材料或培养基可以是巴氏灭菌的。
灭菌一般意指废物或残渣材料或者包含废物或残渣材料的培养基用高温通常在121℃或更高处理至少15分钟、或至少20分钟，一般在121℃至少20分钟。
“巴氏灭菌法”指废物或残渣材料或者包含废物或残渣材料的培养基在60℃-75℃加热2–30分钟。如本文描述的，即使对于高达200g/l的高含量废物或残渣馏分，在TSA(胰蛋白胨黄豆琼脂)也未检测到活细胞或孢子。在其中使用巴氏灭菌的培养基代替灭菌的培养基的培养中，在链霉菌的生长中未发现差异。培养基可以包含有机废物或残渣或其与纯营养素的组合。
在本发明的一些实施方案中，包含有机废物或残渣的培养基可以像这样使用，在一些实施方案中，无需通过任何方法的灭菌，或无需巴氏灭菌。“非灭菌的”意指在那些实施方案中，具有废物或残渣材料的培养基不通过任何方法灭菌。
在本公开内容中，废物或残渣材料或者包含废物或残渣材料的培养基是未灭菌的，特别地它未用高温例如在121℃灭菌，或它是巴氏灭菌的。
在本公开内容中，“有机废物或残渣”特指来自工业的废物或残渣，包括农业、市政废物或微生物残渣。此类废物或残渣一般(i)未用作用于人或动物的食物，和(ii)以大量形成(一般为全球数千或数百万吨/年)。来自工业的大量有机废物满足这些标准。“有机废物或残渣”指生物可降解的任何废物或残渣材料或馏分。
工业废物或残渣可以包含来自食物或饲料生产的垃圾残渣、有机废物或残渣，例如来自面包店、酿造厂，例如醪、麦芽提取物，屠宰场，例如垃圾残渣、肉或鱼残骸，制糖工业，例如甜菜浆，或木材衍生的纤维素或木质纤维素材料或残渣，或农业残渣例如谷类残渣，例如麸、谷壳、稻草、茎、甘蔗渣，或其他植物例如纤维素作物、柳枝稷、草芦、芒属(Miscanthus)、纤维高粱、纤维蔗，或植物残渣，例如玉米浆(CSL)，或例如来自生物柴油生产的甘油。
市政废物可以包含市政污泥、废纸、机构厨房或家庭的生物废物、庭院的有机废物或食物生产的有机废物。
微生物废物可以包含微生物细胞或细胞碎片(例如乳杆菌、链霉菌)，例如来自基于微生物使用的工业方法，或藻类碎片(例如褐指藻属(Phaeodactylum)、小球藻属(Chlorella)、杜氏藻(Dunaliella)、微拟球藻(Nannochloropsis))。
优选的废物或残渣是来自农业的木质纤维素废物或残渣和来自浆和造纸工业方法的废物或残渣，包括纤维素(能量)作物。
优选的废物或残渣还是来自机构厨房或来自食物或饲料工业的生物废物。
优选的废物或残渣还是微生物废物或残渣，特别是藻类或细菌废物或残渣。有机废物或残渣材料特指链霉菌属可以用于生长和/或用于脂质生产的任何有机废物或残渣。
在本发明的一些实施方案中，有机废物或残渣可以补充有另外的碳源，例如甘油，来自糖或淀粉工业的馏分，糖或淀粉糖浆或纯化的糖或其任何混合物。更具体而言，有机废物或残渣可以补充有来自糖和淀粉工业的粗产物，例如糖糖浆、淀粉糖浆、葡萄糖(右旋糖)糖浆或糖蜜。进一步地，废物可以补充有下述中的单个或混合物：纯化的C6或C5糖例如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖或阿拉伯糖，糖二聚体例如蔗糖或乳糖，或糖聚合物例如纤维素、淀粉或木聚糖。来自糖或淀粉工业的补充物或其他纯化的糖的使用可以增加且加速链霉菌的生长和/或脂质累积。
术语有机废物或残渣还包含术语“废物或残渣馏分”。术语“废物或残渣馏分”指例如作为副(分支)产物产生的废物，或来自生产一些其他产物作为主要产物的工业方法的副(分支)产物。
在本发明的范围内的是单独或以任何组合或混合物的有机废物或残渣的使用。
就培养中的脂质累积而言，使用以10/1-1/2，优选5/1-1/1的比的废物或残渣与淀粉糖浆或糖糖浆是有利的。例如在含有10-50g/l废物与10g/l糖糖浆的培养中发现良好的脂质累积。
此外，如本文描述的，用微生物残渣例如细胞碎片补充工业有机废物或残渣材料对于细胞生长是有利的。如本文描述的，例如在其中特别来自细菌或藻类起源的细胞碎片连同有机废物材料例如CSL(玉米浆)和/或作为培养基补充物的Farmamedia一起使用的培养中发现良好的生长。例如，来自链霉菌或乳杆菌的细菌碎片和/或来自褐指藻属、小球藻属、杜氏藻和微拟球藻的藻类碎片可以用于本发明中。根据本发明对于细胞生长的另一种有利的补充物是黄豆。
淀粉对于脂质累积是有利的。然而，如果将淀粉替换为农业残渣例如蔗渣、麸、谷壳或稻草，那么它在经济上是有利的。藻类或微生物细胞或残渣，例如细菌或藻类碎片、生物废物、肉、CSL、OVR(谷类(大麦)蛋白质饲料)、貂饲料和/或垃圾可以替换在链霉菌发酵中一般有用的基于蛋白质的成分，例如酵母提取物、Farmamedia和/或黄豆。
在培养基中，可以使用广泛规模的废物或残渣。在一些实施方案中，在培养基中废物或残渣的量可以从1g/l到400g/l不等，一般从2g/l到200g/l不等，在一些实施方案中，从20到150g/l不等，在一些其他实施方案中，从50到100g/l不等。已发现链霉菌有效使用废物馏分用于生长，并且当与用纯营养素的培养相比较时，已发现脂质的累积是相似的。
如本文描述的，微生物细胞生长可以通过使用菌丝体生长量(Package MyceliaVolume)(PMV)、细胞质量变化、铺平板、显微镜检查和视觉分析进行跟踪。
用几种废物馏分获得高密度细胞生长。在多个实施方案中，它作为干细胞质量从1到200g/l不等，一般从10到130g/l不等。
对于几种废物馏分的PMV值在标准培养条件下(28℃，150rpm)从1％到80％不等，一般从6％到40％不等。
然而，明确的是即使更高的细胞密度也可以通过相应地调整发酵条件来获得。另一方面，细胞质量不与累积的脂质量直接关联。
在本发明的范围内的还是与纯成分组合的废物材料的使用。
水解或部分水解(解聚)的有机废物或残渣可在本发明中使用。废物或残渣可以通过(热)机械、化学或酶促水解进行水解。例如，废物或残渣材料可以通过合适的酶处理，以消化粗成分。合适的酶是例如纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶。另外，具有消化酶功能且具有累积脂质的能力的链霉菌可以用于本发明中。因此，废物的预加工不是必需的。例如，用于这个目的的合适菌株是属于玫瑰孢链霉菌和白色链霉菌物种的那些。
在本发明的范围内的是分批、分批补料和连续培养。
在具有固体或半固体物质作为原材料(碳源和/或营养素来源)的培养中，由于通过微生物的原材料利用，生物量可以在培养的第一天中减少，接下来的天数中增加。
在本发明的一些实施方案中，如通过衍生自培养的氯仿萃取物的干质量估计的，链霉菌属生产脂质至少0.1g/升、优选至少0.5g/升、更优选至少1g/升、甚至更优选至少5g/升耗尽的培养基，在一些实施方案中，至少10g/升、一般5–30g/升，在一些其他实施方案中，如氯仿萃取物的干质量估计的，10-25g/升直到150g/升。在一些实施方案中，它在1–200g/升的范围中改变，一般为5-100g/升耗尽的培养基。
在本发明的一些实施方案中，TAGs的浓度(滴度)通常为至少0.1g/l(0.1kg/1000升)、优选至少0.5g/l(0.5kg/1000升)、更优选至少1g/升(1kg/1000升)、甚至更优选至少5g/升(5kg/1000升)耗尽的培养基。它通常从0.5到150kg/1000升不等，在一些实施方案中，1-100kg/1000升，在一些其他实施方案中，1-70kg/1000升，一般为约5-50kg/1000升，在一些实施方案中，10-30kg/1000升，在一些其他实施方案中，15-25/kg/1000升耗尽的培养基。
与亲本菌株相比较，通过遗传修饰菌株的TAG生产改善通常为至少10％，一般至少30％，在一些实施方案中，至少50％且甚至100-300％。
“耗尽的培养基”指在微生物的培养中使用且包含通过微生物累积的产物的培养基。耗尽的培养基包含固相例如生物量，如微生物和固体原材料，以及液相。因此，耗尽的培养基包含在微生物细胞内累积的产物和从细胞释放到培养基中的产物。耗尽的培养(或培养)基也可以称为耗尽的培养肉汤。“培养基”通常指在使用前(在接种和培养前)的培养基。
此外，在本发明的多个实施方案中，总脂质的量是按其干细胞质量的重量计至少10％，一般地它是按其干细胞质量的重量计20–60％。
在本发明的多个实施方案中，通过链霉菌产生的脂质馏分主要包含TAGs。这意味着至少30重量％，在一些实施方案中，至少50重量％，在一些其他实施方案中，至少60重量％，再在一些进一步的实施方案中，至少70重量％，再在一些进一步的实施方案中，至少80重量％，或再在一些进一步的实施方案中，至少90重量％的脂质馏分是TAGs。
在纯糖上培养的未经修饰的(亲本菌株)或遗传修饰的菌株特有的脂质概况一般包含约70-95重量％的TAGs和约5-30重量％的寡聚物、二酰基甘油和单酰基甘油和游离脂肪酸。未经修饰的或遗传修饰的链霉菌属菌株的脂肪酸一般包含分支和直链脂肪酸。分支脂肪酸的馏分可以是20-80重量％，且一般为40-70重量％。甲基支链脂肪酸的含量可以是45-50％。测定的大多数脂肪酸是饱和的。
进一步地，链霉菌属脂质还含有一般2-5重量％的角鲨烯或角鲨烯衍生物，其可以用作基础油或用于润滑剂应用的基础油的原材料。
链霉菌的脂质概况已通过Olukoshi和Packter(1994)，Packter和Olukoshi(1995)在文献中报道。
当链霉菌属在包含废物或残渣代替纯糖的培养基上培养时，脂质概况的组成最可能改变，因为脂质萃取可以包含来自废物的脂质(例如膜磷脂被萃取)。
“脂质”在此处一般指在培养过程中由链霉菌属产生的脂质，和在培养基的组分特别是培养基中的废物或残渣材料中含有的脂质。“脂质馏分”指脂质的馏分，例如TAGs或分支脂肪酸或角鲨烯。
在本发明的一些实施方案中，细胞碎片和甚至藻类残渣给出显著数量的由TAGs占优势的脂质。优选的藻类营养素来源和/或碳源是小球藻属和杜氏藻，其在耗尽的培养基中给出最高数量的TAGs。
如本文描述的，链霉菌属菌株在废物馏分(一般超过7天)和基于纯成分的培养基(一般超过5天)中的延长分批培养导致TAGs和一些其他脂质的消失，暗示脂质是降解的。
在本发明的一些实施方案中，脂肪酶抑制剂可以加入培养基中。合适的脂肪酶抑制剂是例如银离子(Lee&Lee，2006)或阳离子物质(Cote和Sharech，2008)。通过使用脂肪酶抑制剂，可以抑制脂质的降解且增强TAGs的累积。如实施例12中所示，即使小浓度的抑制剂例如以浓度0.04-0.06g/l的AgNO3也是有用的。
在本发明的一些实施方案中，培养基的接种通过链霉菌菌丝体或孢子执行。在优选实施方案中，接种通过使用孢子执行。孢子的量可以是107–109孢子/一升(例如5x1012孢子/500升)。
在本发明的一些实施方案中，培养可以在1-21天中、一般在2-14天中、优选在2-6天中执行。在一些实施方案中，脂肪酶抑制剂可以加入培养的中间(或在开始后或在结束前)。
在本发明的多个实施方案中，培养温度通常是20–36℃，一般地它是26-30℃。
在本发明的多个实施方案中，用于脂质生产的链霉菌培养一般在液体培养基中在发酵罐中优选在合适的充气和搅动下执行。混合速度一般从0到800rpm不等，一般为150-600rpm。
因为废物或残渣可能含有脂质，所以追踪观察外部脂质的使用以测定由细菌菌株形成的脂质是合理的。如本文描述的，通过固体质量中的变化和脂质概况中的变化追踪观察外部脂质的利用。显示生物量从培养开始下降直到36-48小时，并且在那之后开始增加。循环时间取决于在使用中的废物的加工程度。然而，当追踪观察培养直到8天时，在培养五天后未发现显著差异。脂质在0样品的上清液中可检测，并且在直到4-5天的固体馏分中增加。在那之后，脂质在细胞馏分中减少，并且部分脂质在上清液中发现，并且可能部分累积的脂质用于代谢。图3证实在8天培养中固体和液体馏分的PMV、细胞质量和脂质的追踪观察。可以得出结论在3天后检测到的脂质衍生自细菌代谢。
测定为供给糖的脂质得率(g脂质/g葡萄糖)在10-55％的范围中改变。该得率基于供给的纯糖进行测定，并且不考虑废物和残渣中包括的糖。来自葡萄糖的脂质得率的理论最大值是33％。然而，在实践中，最大脂质得率是20-22％(Ratledge和Cohen 2008)。因此，高于22％的脂质得率指示脂质由废物残渣材料生成(产生)。
链霉菌属菌株
链霉菌属细菌在此处意指属于链霉菌属的任何物种或菌株。
在本发明的多个实施方案中，优选的物种是包含下述的物种，优选地选自包含下述的组，更优选地选自下述：玫瑰孢链霉菌、灰色链霉菌、白色链霉菌、波赛链霉菌、生金链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、吸水链霉菌、除虫链霉菌、Streptomycesmilbemycenius和利迪链霉菌。最优选的物种选自玫瑰孢链霉菌、灰色链霉菌、白色链霉菌、波赛链霉菌、Streptomyces milbemycinius和生金链霉菌。
更具体而言，链霉菌属菌株包含下述，可以选自包含下述的组，更优选地选自下述：玫瑰孢链霉菌GAL4111、玫瑰孢链霉菌G011、灰色链霉菌GAL1005、白色链霉菌GAL1001、波赛链霉菌D2 GAL4082、波赛链霉菌P55 GAL4081、生金链霉菌GAL1004、变铅青链霉菌GAL1002、天蓝色链霉菌GAL1003、吸水链霉菌GAL4051、除虫链霉菌GAL1006、利迪链霉菌GAL1007。最优选地，菌株选自玫瑰孢链霉菌GAL4111、灰色链霉菌GAL1005、白色链霉菌GAL1001、波赛链霉菌D2 GAL4082、Streptomyces milbemycinius GAL4211和生金链霉菌GAL1004。
已知多个链霉菌物种可以以小量累积三酰基甘油(TAGs)：白色链霉菌(Alvarez和Steinbüchel，2002)；变铅青链霉菌(Packter ND Olukoshi，1995，Alvarez和Steinbüchel，2002)；天蓝色链霉菌(Arabolaza等人，2008，Alvarez和Steinbüchel，2002)；吸水链霉菌(Gesheva等人，1997)；生金链霉菌(
Figure BDA0001403546110000161
和Jílek，1969)；灰色链霉菌(Suutari等人，1992，Alvarez和Steinbüchel，2002)；除虫链霉菌(Kaddor等人，2009；Novák等人1992)；和利迪链霉菌(Nagao等人，1991)。通过
Figure BDA0001403546110000171
等人(2006)的公开物表征涉及在细菌中的中性脂质生物合成中涉及的基因产物。然而，通过使用一般的现有技术发酵方法的脂质生产是相对耗能且因而昂贵的。
在本公开内容中，链霉菌属细菌特指属于链霉菌属的细菌的纯培养物。在一些实施方案中，组合的不同链霉菌属物种或菌株可以顺次或一起培养。此外，在本公开内容中，链霉菌属细菌特指能够天然产生脂质的链霉菌属物种和菌株。在本发明的一些实施方案中，通过将负责脂质生产的核酸序列引入链霉菌属菌株内，且在由链霉菌属宿主识别的调节元件例如启动子下表达这些核酸序列，可以改善链霉菌属物种或菌株的能力。
通过使得宿主菌株在生产内源生物活性产物例如抗生素例如脂肽抗生素中缺陷，也可以改善在脂质生产中使用的链霉菌属物种或菌株。这可以通过本领域众所周知的分子生物学方法执行。有用的方法是例如负责生产生物活性产物的基因的缺失，或多种诱变方法例如定点诱变。
“使得基因缺陷”指链霉菌属宿主缺失或截短特异性基因的遗传修饰，或通过任何合适方法导致基因的表达减少或基因产物的活性减少的链霉菌属宿主的遗传修饰。“失活”意指导致基因产物的活性完全丧失的遗传修饰(通常为缺失)。
可以由链霉菌属菌株生成不产生所需生物活性产物例如抗生素的突变株。突变株可以例如通过随机方法生成，使用化学诱变剂，例如NTG(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)。未能产生抗生素的菌落可以通过合适的测定法例如抗菌测定法进行测试。此外，脂质的累积可以例如通过HPLC进行分析。还通过特定基因的靶向失活，例如生物活性产物的第一种生物合成基因的失活，可以由链霉菌属菌株生成不产生所需生物活性产物例如抗生素的突变株。这通过灭活链霉菌属宿主中的聚酮类化合物生物合成(PKS)基因进行例示。基因产物通过生物标记截短。就抗菌性质的表达研究获得的克隆，且通过HPLC分析美尔倍霉素的生产。
在本发明中，惊讶地发现链霉菌属菌株可以生产显著量的脂质，而无需其脂质合成途径的遗传改造。然而，如上所述，使得宿主生产生物活性产物例如抗生素例如脂肽抗生素缺陷可以是有利的。
在本发明中，惊讶地发现Streptomyces milbemycinius物种能够生产大量脂质。高脂质生产特别由使得生产抗生素美尔倍霉素(是一组大环内酯)缺陷的S.milbemycinius菌株例示。如实施例中所述，S.milbemycinius菌株能够生产脂质20g/l或更多。纯葡萄糖或衍生自淀粉的葡萄糖的转换效率是33％。TAGs的量在所有脂质80-90％的范围中。
在导致本发明的工作的背景中，研究来自多个链霉菌属物种和菌株的链霉菌属菌株的脂质生产。在一些链霉菌属物种和菌株中，脂质合成途径是遗传修饰的。这些实验随后为其中菌株在培养基上培养的实验，其中废物或残渣材料用作碳源和/或营养素来源。通过链霉菌属菌株的脂质生产通过使用11种链霉菌属菌株例示。研究菌株的代谢产物累积，包括脂质馏分，在本文中称为TAGs的三酰基甘油。所有测试的菌株累积可检测数量的TAGs，且令人惊讶的是，11种测试的链霉菌属菌株中的四种是非常快速生长的，在两到三天内给出超过200g/l的湿细胞质量(参见表1)。这些菌株来自物种生金链霉菌、玫瑰孢链霉菌、灰色链霉菌和白色链霉菌。菌株是生金链霉菌GAL1004、玫瑰孢链霉菌GAL4111和衍生自其的突变株G011、灰色链霉菌GAL1005和白色链霉菌GAL1001。将菌株进一步培养且分析TAG生产。另外，验证菌株在贮存过程中保留其生物活性代谢产物的非生产特征的能力。
如本文描述的，11种链霉菌属菌株在一般的培养条件下培养，以增强生长以及次级代谢产物的累积。使用的培养基是TSB、2*TY和E05。在振荡器中的培养条件是28℃、30℃和34℃，伴随150和300rpm的搅动。
培养基的内容物是：
TSB：17g/l酪蛋白胰酶消化物、3g/l大豆粉酶促消化物、2,5g/l右旋糖、5g/l氯化钠、2,5g/l磷酸氢二钾；
2*TY：16g/l胰蛋白胨pepton、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl；
E05：20g/l右旋糖、20g/l淀粉、5g/l farmamedia、2,5g/l酵母提取物、1g/lMgSO4·7H2O、1g/l KH2PO4、3g/l CaCO3、3g/l NaCl。
表1显示在TSB培养基中进行的培养的菌株特征和有关结果。TAGs通过与标准相比较的TLC平板进行估计。
表1.
Figure BDA0001403546110000191
Figure BDA0001403546110000201
通过湿细胞质量和/或作为PMV值测定为能够良好生长且能够在短培养时间内累积可检测水平的脂质的菌株，是用于涉及用于脂质累积的菌株改善的进一步开发和用于发酵条件的开发的优选菌株。
用于增强的油生产的遗传工程菌株
通过将涉及脂质生物合成的基因引入天然具有有效累积脂质的能力的一些链霉菌属宿主内，在本文中例示有效生产脂质的重组宿主(即遗传操纵的菌株GMO)的构建。
原始菌株和携带涉及脂质生物合成的基因的克隆在大量各式各样的废物和残渣材料包括生物废物中培养。出乎意料的是，菌株能够在含有且甚至不含另外碳源的废物或残渣馏分上生长且产生脂质馏分。
培养揭示快速生长周期时间：静止期在24小时内或甚至之前达到，而脂质的累积继续甚至直到其后6天。与亲本菌株相比较，在培养中的干/湿细胞质量通过克隆并未得到显著增加。然而，观察到与亲本菌株相比较在脂质累积中，特别是在主要馏分TAGs中的显著增加，甚至高达300％改善。
如本文描述的，显示对于工业有用的生物燃料发酵方法的合适性质的链霉菌属宿主可以通过任何已知的菌株改善方法进一步改善，例如天然选择、随机诱变和遗传改造。
改善脂质累积的合适基因包含编码涉及脂肪酸生物合成的酶的多种基因。合适的基因特别是编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)(EC 2.3.1.20)的基因和编码3-酮脂酰-酰基载体蛋白质合酶III(FabH)(EC 2.3.1.41)的基因。
编码DGAT功能(EC 2.3.1.20)的基因是例如sco0958(SEQ ID NO:1)，并且编码3-酮脂酰-酰基载体蛋白质合酶III(FabH)(EC2.3.1.41)的基因是例如sco5888(SEQ ID NO:2)。基因sco0958(ID101096381)催化TAGs生物合成中的最后步骤(Arabolaza等人，2008)，并且sco5888(ID101101330)(Li等人，2005)负责脂肪酸生物合成中的第一个延伸步骤。基因sco5888和sco0958源于天蓝色链霉菌。
在本发明的范围内的还是所述基因sco0958和sco5888在多个链霉菌属物种中最接近的同系物。
在保护范围内的还是在严格条件下与所述基因或所述同系物中的至少一种杂交的核苷酸序列。
在本发明的范围内的还是引起与基因产物ID 101096381或ID 101101330相同或等价功能的核苷酸序列。
在本发明的范围内的还是编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列显示与氨基酸序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO:4的至少60％同一性、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、越来越优选至少98％同一性。
在本发明的范围内的是引起与所述基因sco0958(ID101096381)和sco5888(ID101101330)相同功能或等价功能的核苷酸序列。此类核苷酸序列可以是所述基因的片段或衍生物，所述基因在其他链霉菌属物种中最接近的同系物，或与所述基因或所述同系物中的至少一种杂交的核苷酸序列。
杂交优选在严格杂交条件下执行。根据Boehringer Mannheim的手册，用于滤膜杂交的DIG System用户指导，严格条件可以定义为在65℃在低盐浓度、1.5mM柠檬酸钠pH 7.0和0.015NaCl中杂交。
显而易见的是基因的核苷酸序列中的小变动不会显著改变所编码蛋白质的催化性质。例如，核苷酸序列中的许多变化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。此外，氨基酸序列可以具有变动，其不改变蛋白质的功能性质，特别地它们不阻止酶执行其催化功能。核苷酸序列或DNA分子或氨基酸序列中的此类变动称为“功能等价物”，因为它们不会显著改变基因编码具有特定功能例如催化特定反应的蛋白质的功能，或分别地改变蛋白质的特定功能。在本发明的范围内的是功能等价物，分别包括核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或者氨基酸序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO:4的片段或衍生物、或最接近的同系物。
可以筛选能够生产涉及脂质生物合成的酶的链霉菌属，可以测定对多种底物的活性，并且表征酶。可以分离在多种生物中编码涉及脂质生物合成的酶的核苷酸序列，并且氨基酸序列可以与氨基酸序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO:4相比较。本领域技术人员还可以鉴定核苷酸或氨基酸序列中的保守区，并且使用PCR技术克隆基因片段。在测序片段后，例如通过在载体中使用cDNA文库可以获得完整基因。还可以通过核酸杂交鉴定编码酶的核苷酸序列。
标准分子生物学方法可以用于基因的克隆，即DNA的分离和酶处理，大肠杆菌转化，通过在PCR反应中扩增分离包含基因的片段(Coen D M，2001)和用于密码子改变的技术中。使用的基础方法在标准分子生物学手册例如Sambrook等人(1989)以及Sambrook和Russell(2001)中描述。在表达载体中在强启动子下插入核苷酸序列，将载体转移到合适宿主细胞内和在引起所述酶生产的条件下培养宿主细胞。在不同宿主系统中通过重组技术用于蛋白质生产的方法是本领域众所周知的(Gellissen，2005)。
例如通过将来自另一个链霉菌属物种的外源基因或内源基因的另外一个或多个拷贝引入链霉菌属宿主内，可以执行遗传修饰链霉菌属宿主以表达内源或外源基因。基因可以在由链霉菌属宿主识别的启动子下表达。在一些实施方案中，基因可以在导致基因表达增加的另一种启动子下表达。可替代地，链霉菌属宿主可以这样遗传修饰，从而使得基因是更丰富表达的，或基因产物的活性增加。
术语“内源基因”在此处指对于链霉菌属宿主是天然的基因。
术语“外源基因”在此处指对于链霉菌属宿主并非天然的基因。
在其他链霉菌属物种中“天蓝色链霉菌基因最接近的同系物”在此处指在天蓝色链霉菌基因和其他物种的基因的序列比对中具有等同核苷酸的最高百分比的基因；或其蛋白质产物与由天蓝色链霉菌基因编码的蛋白质产物具有等同氨基酸的最高百分比的基因。“最接近的同系物”特别意指与特定天蓝色链霉菌基因(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)或所述基因的产物(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)相比较，具有至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、越来越优选至少98％核苷酸或氨基酸序列同一性的基因或核苷酸序列。
术语“同一性”指从第一个核酸到最后一个核酸或从由相应基因编码的第一个氨基酸到最后一个氨基酸，分别与彼此相比较在两个核酸或氨基酸序列之间的同一性。全长序列的同一性可以通过使用在EMBOSS程序包的Needleman-Wunsch总体比对程序进行测量(European Molecular Biology Open Software Suite；Rice等人，2000)。程序版本可以是2.9.0和参数：EMBLOSUM62，缺口罚分10.0，延伸罚分0.5。
链霉菌属宿主的“遗传修饰”在此处意指通过其修饰链霉菌属宿主的任何遗传修饰方法，以表达特异性内源或外源基因和/或成为一种或多种特异性基因缺陷的。
用于链霉菌属宿主的遗传修饰方法对于本领域技术人员是可获得和众所周知的，并且例如公开于Kieser等人，2000中。
如本文描述的，用于将基因引入链霉菌属宿主内的合适方法是例如原生质体转化。
用于将基因序列一般为例如PCR片段引入宿主菌株内的载体可以在任何载体中选择，所述载体能够将克隆的片段引入宿主菌株内。可以成功地使用整合载体、中等拷贝数以及高和低拷贝数载体，以将片段引入合适宿主内。
用于将核酸片段转移到链霉菌属宿主内的合适载体是例如pIJE486(Ylihonko等人，1996)和pHJL401(Kieser等人，2000)。
最优选的宿主菌株是表1中显示的链霉菌菌株，特别是菌株GAL1001和GAL4111或衍生自所述菌株的任何突变菌株。
然而，使用不能在培养肉汤中累积生物活性化合物的突变菌株用于生物燃料的商业生产是有利的。为了这个目的，最优选的菌株是GAL1001和G011。
如本文描述的，通过使用涉及脂质生物合成的基因遗传修饰玫瑰孢链霉菌GAL4111及其在生产内源生物活性产物中缺陷的衍生物、玫瑰孢链霉菌G011和GAL1001。
存在涉及细菌中的脂质代谢的几种基因。在本公开内容中，已显示分开或组合的基因sco0958和sco5888令人惊讶地增加通过链霉菌累积的TAGs数量。sco0958负责三酰基甘油(TAG)生物合成中的终端反应，是脂肪酸分子的二酰基甘油(DAG)的酯化(Arabolaza等人，2008)。sco5888是编码脂肪酸生物合成的第一个延伸步骤的3-酮脂酰-酰基载体蛋白质(Li等人，2005)。该基因可以使用任何合适的克隆方法进行克隆。根据本发明的一个实施方案，使用同源引物通过PCR由染色体DNA执行克隆。
通过原生质体转化将基因引入所述菌株内。分别或组合携带这些基因的菌株显示增加的TAGs累积。
选择且指定为G009、G010、G013、G014、G015、G012、G016、G017和G019的GMO菌株携带完整的质粒，在几次传代后保留培养性质和脂质累积。
用于累积富含TAGs的脂质馏分的最佳菌株是衍生自GAL1001，指定为G009、G013和G017的克隆。
如本文描述的，载体pIJE486(Ylihonko等人，1996)和pHJL401(Kieser等人，2000)用于将基因sco0958和sco5888引入链霉菌属宿主GAL1001、GAL4111和G011内。在实施例2中，表3显示用于遗传修饰菌株的编码。与亲本菌株相比较，所有菌株都产生更多脂质。培养在范围为20–36℃的温度、从0到800rpm不等的搅动、和pH5-8.5执行。
GMO菌株G009、G010、G013、G014、G015、G012、G016、G017和G019伴随作为对照的其亲本菌株GAL1001、GAL4111和G011在广泛多样的培养基中进行培养。脂质得率估计为(g脂质/g葡萄糖)*100。如分别通过氯仿萃取物的干质量和通过参考标准的TLC分析估计的，亲本菌株GAL1001和G011生产脂质至0.1–0.5g/l的培养肉汤。转化株的细胞馏分的氯仿萃取物给出在5.9–25.2g/l的范围中的质量，而TAG含量估计为3-23g/l。最佳改善通过G009获得。令人惊讶的是，在TLC上的脂质馏分在所有转化株都是非常相似的，并且>70％的可检测脂质在TAG馏分中。
在上述计算中，糖含量在含有玉米浆20g/l、Nutrisoy 10g/l和右旋糖糖浆10g/l的测试培养基中计算为10g/l。培养在烧瓶中在28℃、150rpm执行5天，通过振荡1小时用等体积的氯仿-甲醇(2:1)分别从细胞和上清液中萃取脂质。将氯仿馏分的样品应用于TLC平板上，并且将氯仿馏分蒸发至干燥用于质量测定。
为了使获得的脂质组合物适合于生物燃料制造中的进一步加工，这些化合物的化学性质是关键的。尽管不同形式的脂肪适合于用于生物燃料生产的化学加工，但优选化合物是TAGs。存在除了TLC(薄层色谱法)分析外的进一步表征代谢产物的几种已知方法，例如GC(气相色谱法)。GC分析可以通过标准程序(ISO15304)执行。HPLC可以用于测定菌株的甘油酯脂质概况。例如，亲本菌株(由GAL1001例示)和遗传修饰的菌株(此处由G009例示)特有的脂质概况在表2中给出。
表2.如通过HPLC分析的，衍生自GAL1001和G009的作为百分比值的甘油酯脂质概况。
脂质的性质 GAL1001 G009
TAGs 95 88,6
寡聚物 N.A. 5,2
二酰基甘油 N.A: 4,3
单酰基甘油 N.A. 0,3
游离脂肪酸 5 1,7
*N.A.＝不可用
链霉菌中的大多数脂质由甘油三酯组成。
表3.如通过GC-MS测定的，玫瑰孢链霉菌GAL4111和白色链霉菌GAL1001的脂肪酸分布(来自总脂肪酸的％)的例子。将所述菌株在28℃、150rpm在细胞废物培养基中培养2天；10g/l CSL和50g/l细胞废物(链霉菌的细胞碎片)，无需另外补充物。
Figure BDA0001403546110000261
Figure BDA0001403546110000271
*N.A.＝不可用
链霉菌油是饱和的，并且测定的大多数脂肪酸(～70％)是饱和的。进一步地，链霉菌油含有显著含量的甲基分支脂肪酸(在这种情况下45-50％)。
表4.如通过GC-MS测定的，玫瑰孢链霉菌GAL4111和白色链霉菌GAL1001的脂质组合物的例子
Figure BDA0001403546110000281
*脂肪酸包括酰基甘油和游离脂肪酸
大多数脂质由脂肪酸(包括酰基甘油和游离脂肪酸)组成。脂质还含有角鲨烯(来自总脂质2.5和4.3％)。在GAL4111和GAL1001中的角鲨烯由角鲨烯、四氢角鲨烯、二氢角鲨烯(主要组分)、六氢角鲨烯和八氢角鲨烯组成。
根据本发明，存在培养合适的链霉菌属菌株用于脂质累积的几种备选方案。测试不同条件包括多种碳源和/或营养素来源和生长条件。
为了具有工业上可行的方法，天然累积脂质的菌株例如G009、G013和G017应适合于好气发酵，并且发酵方法应是成本有效的。发酵方法的成本大量受培养基组分、能量消耗、废物成本和人力影响。
尽管可以使用衍生自纯成分的培养基和例如本文描述的那些，TSB、2*TY和E05，但选择无需组分分离、水解和/或纯化的任何废物馏分作为原材料是更成本有效的。要求是在使用中的细菌富含消化酶，以促进通过粗成分包括在废物中的生长。因此，本发明进一步考虑工业废物馏分或纯成分与废物的组合的使用。如本文描述的，用来自工业的广泛多样的有机废物或残渣，包括工业、市政废物和微生物残渣进行全面测试系列。适合于在本发明中用于生成游离糖和待用于来自废物馏分的生长的营养素来源的方法是一般已知的那些，例如使用合适酶用于粗成分的消化。然而，具有这些消化酶功能同时具有用于累积所述脂质的能力的细菌的培养是优选的。用于这个目的的合适菌株因此是玫瑰孢链霉菌和白色链霉菌菌株。优选的菌株是G009、G010、G013、G014、G015、G012、G016、G017和G019与其亲本菌株GAL1001、GAL4111和G011。
本公开内容涉及的菌株且优选地菌株G009、G010、G013和G017可以在有机废物或残渣上培养。衍生自例如前述许多的细胞碎片的使用是非常合适的营养素来源，以成本有效方式生产脂质。在这些培养中，细胞质量中的变化检测为在前两到三天内较低，在接下来的三到四天增加5-20g/l。衍生自这些培养的氯仿萃取物的干质量在7-65g/l的范围中，反映如在TLC上分析的作为3-23g/l的TAGs量。
在本发明的实施方案中描述的单独或组合的所有这些单元操作和原材料在生产用于生物燃料的油中是有效的。在特定优选的实施方案中，该方法使用菌株G009、G010、G013或G017。接种优选通过使用孢子执行。孢子的量有利地是约1010孢子/1升-5*1012孢子/500升。培养优选执行2–6天。培养温度是约28℃。培养作为分批或分批补料发酵执行。合适的搅动在培养过程中使用。此外，推荐使用培养基的巴氏灭菌代替灭菌，以避免高能量消耗。该方法可以例如继续6天，而无任何补充物或脂肪酶抑制剂，例如在培养的第6天时以低浓度加入的银离子。在培养结束时，收获细胞群。它一般是约65kg/500l分批。脂质通过合适方法从细胞生物量或培养肉汤中回收。用基于溶剂的萃取或通过物理散射的得率一般是至少5kg TAGs/1000升耗尽的培养基，一般是10-70kg TAGs/1000升，通常为来自1000l分批的约30kg TAGs。
油的回收
在本发明的多个实施方案中，可以使用本领域已知或未来开发的任何方法从细胞生物量或培养肉汤中回收油或关于油的前体。例如，可以使用过滤或倾析技术使细菌与培养基分离。备选地，用大容积容量的工业规模商业离心机的离心可以用于分离所需产物。
在本发明的一些实施方案中，可以破坏细菌细胞，以促进油和其他组分的分离。可以使用已知用于细胞破坏的任何方法，例如超声处理、渗透压休克、机械剪切力、冷压、热休克、酶催化或自我指导的自裂解。油可以通过用有机溶剂萃取或通过本领域已知或未来开发的任何方法从细胞中回收。
本文公开和请求保护的菌株、方法、培养条件、用于发酵的成分和方法方案涉及支持链霉菌属细菌的大规模和经济培养的技术。这种技术用于支持多种有关产物的工业制造。这种技术可以用于在经济上支持链霉菌的大量培养和收获。
生物燃料的生产
用本文描述的方法生产的脂质可以用作原料用于生产生物柴油、可再生的柴油、喷气燃料或汽油。生物柴油由脂肪酸甲酯组成，并且一般通过转酯作用产生。在转酯作用中，将酰基甘油转换为长链脂肪酸烷基(甲、乙或丙)酯。可再生的柴油指通过脂质的氢处理(氢化作用或氢加工)产生的燃料。在氢处理中，将酰基甘油转换为相应烷烃(石蜡)。烷烃(石蜡)可以进一步通过异构化或其他方法备选方案进行修饰。可再生的柴油方法还可以用于生产喷气燃料和/或汽油。此外，可以执行脂质的裂化以生产生物燃料。进一步地，脂质可以在特定应用中直接用作生物燃料。
链霉菌属脂质对于生物燃料的生产是有利的。链霉菌属脂肪酸一般含有甲基支链脂肪酸，其对于生物燃料和润滑剂应用是有利的。分支脂肪酸具有更广泛的流动性范围，使得其对于低温应用是有利的，并且其低表面张力引起良好铺展性(Gunstone等人2007)。脂肪酸分支改善生物燃料例如生物柴油或可再生的柴油的寒冷性质。链霉菌属油具有相对高饱和度(含有大量饱和脂肪酸)。这种性质尤其对于可再生的柴油方法是优点，因为脂肪酸饱和减少氢化作用中所需的氢量。脂质的高饱和度还可以改善油的稳定性和可贮存性，且减少油贮存中抗氧化剂的需要。进一步地，主要脂肪链长(原文为lenghts，疑为lengths)主要是C14(14碳)到C18(18碳)，这对于柴油应用中的利用是有利的。
用该方法生产的脂质可以用作用于润滑剂(润滑油)的基础油或用作原材料用于生产用于润滑剂的基础油。链霉菌油含有角鲨烯或角鲨烯衍生物(
Figure BDA0001403546110000311
等人1985；Olukoshi和Packter 1994)。尤其地，角鲨烯和角鲨烯衍生物适合于在润滑剂应用中使用。然而，通过链霉菌属的其他脂质同样可以用于润滑剂应用。
包含根据本公开内容生产的脂质组合物的生物燃料可以包含用于生物燃料用途的有利性质。此类性质包括例如脂肪酸分支，其改善寒冷性质。脂肪酸饱和对于可再生的柴油生产是尤其有利的。
保藏的微生物
链霉菌属物种G011菌株根据布达佩斯条约于2009年12月04日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，并且它的登记号是DSM 23182。生物学材料由9Kairiskulmantie 10，20781Kaarina，芬兰的Galilaeus Oy以登记号DSM 23182保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心，Galilaeus Oy授权申请人在本申请和要求本申请优先权的申请/专利中提及上述生物学保藏物，并且将其无保留和不能取消的同意给予依照可应用的国家法律对于公众变得可获得的保藏材料。
如表5中所示，本文呈现的其他菌株显示与在商业培养物保藏中可获得的菌株等同的特征。如表5中列出的菌株首先根据其次级代谢产物(当可获得时)，16SrDNA的部分序列和通过集落形态的比较进行鉴定。在约1,4kb的DNA片段中GAL1001、GAL1002、GAL1003、GAL4051、GAL1004、GAL1005、GAL4111、GAL1006、GAL1007、GAL4081、GAL4082与表5中所示的菌株的相应序列的序列同一性已经是>98％。在比较中使用的序列在Gene Banks中发现。
表5显示菌株的鉴定
Figure BDA0001403546110000321
*关于蒽环生物合成中的第二个和第三个环环化的研究。J.Antibiot(Tokyo)，2003Feb；56(2):143-53
用使用同源引物通过PCR获得的16SrDNA序列鉴定菌株：
UNIfor 5′GGTGGAGCATGTGGTTTA 3′(SEQ ID NO:5)
UNIrev 5′CCATTGTAGCACGTGTGT 3′(SEQ ID NO:6)
本发明的多个实施方案在下文借助于下述编号的条款1-36描述：
1.一种用于生产用于生物燃料或润滑剂的脂质的方法，其包括
-在包含有机废物或残渣或其混合物作为碳源和/或营养素来源的培养基中培养链霉菌属的细菌细胞；
-从细胞或培养基中回收脂质。
2.根据条款1的方法，其中所述有机废物或残渣或其混合物用作主要碳源和/或营养素来源。
3.根据条款1或2的方法，其中在培养基中的废物或残渣量是1g/l-600g/l、一般是1g/l-400g/l、通常是2g/l-400g/l、一般是2g/l-200g/l。
4.根据条款1–3中任一项的方法，其中所述有机废物或残渣包含工业有机废物或残渣、农业有机废物或残渣、市政废物或微生物废物或残渣、或其任何混合物。
5.根据条款1–4中任一项的方法，其中所述培养基包含甘油、来自糖或淀粉工业的馏分、糖或淀粉糖浆或纯化的糖或其任何混合物作为另外的碳源。
6.根据条款1–5中任一项的方法，其中所述废物或残渣与淀粉糖浆或糖糖浆的比是10/1-1/2，优选5/1-1/1。
7.根据条款1–6中任一项的方法，其中在耗尽的培养基中的三酰基甘油量是至少1g/升，优选5g/升。
8.根据条款1–7中任一项的方法，其中所述生产的脂质主要包含三酰基甘油。
9.根据条款1–8中任一项的方法，其中将所述生产的脂质转酯以生产生物柴油，或氢处理以生产可再生的柴油。
10.根据条款1–9中任一项的方法，其中所述培养基是未灭菌的或是巴氏灭菌的。
11.根据条款1–10中任一项的方法，其中所述培养基包含脂肪酶抑制剂。
12.根据条款1–11中任一项的方法，其中所述培养作为分批或作为分批补料发酵执行。
13.根据条款1–10中任一项的方法，其中所述链霉菌属物种选自玫瑰孢链霉菌、灰色链霉菌、白色链霉菌、波赛链霉菌、生金链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、吸水链霉菌、除虫链霉菌、Streptomyces milbemycinius和利迪链霉菌。
14.根据条款13的方法，其中所述链霉菌属物种选自玫瑰孢链霉菌GAL4111、玫瑰孢链霉菌G011、灰色链霉菌GAL1005、白色链霉菌GAL1001、波赛链霉菌D2、GAL4082、波赛链霉菌P55GAL4081、生金链霉菌GAL1004、变铅青链霉菌GAL1002、天蓝色链霉菌GAL1003、吸水链霉菌GAL4051、除虫链霉菌GAL1006、Streptomyces milbemycinius GAL 4211和利迪链霉菌GAL1007。
15.根据条款1–14中任一项的方法，其中所述链霉菌属宿主进行遗传修饰，以表达编码DGAT(EC 2.3.1.20)和/或3-酮脂酰-酰基载体蛋白质合酶III(FabH)(EC：2.3.1.41)的内源或外源基因。
16.根据条款1–15中任一项的方法，其中所述链霉菌属宿主进行遗传修饰，以表达选自下述的一种或多种基因：
(a)sco0958(SEQ ID NO:1)和/或sco5888(SEQ ID NO:2)；
(b)所述基因在链霉菌属物种中最接近的同系物；
(c)在65℃在1.5mM柠檬酸钠pH 7.0和0.015NaCl中与所述基因或所述同系物中的至少一种杂交的核苷酸序列；
(d)引起与基因产物ID 101096381或ID 101101330具有的相同或等价功能的核苷酸序列；
(e)编码显示与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO:4的至少60％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
17.根据条款1–16中任一项的方法，其中使得所述链霉菌属宿主在生产生物活性代谢产物例如抗生素试剂中缺陷。
18.根据条款1–17中任一项的方法，其中所述链霉菌属菌株选自G009、G010、G013、G014、G015、G012、G016、G017和G019。
19.一种用于脂质生产的链霉菌属培养物，其包含
(a)链霉菌属细菌的群体；和
(b)包含有机废物或残渣或其混合物作为碳源和/或营养素来源的培养基。
20.根据条款19的培养物，其中所述有机废物或残渣或其混合物用作主要碳源和/或营养素来源。
21.根据条款20的培养物，其中在耗尽的培养基中的三酰基甘油量是至少1g/升，优选5g/升。
22.根据条款20或21的方法，其中所述生产的脂质主要包含三酰基甘油。
23.根据条款20–22中任一项的培养物，其中所述培养基包含脂肪酶抑制剂。
24.根据条款20–23中任一项的培养物，其中所述培养基是未灭菌的或是巴氏灭菌的。
25.根据条款20–24中任一项的培养物，其中所述链霉菌属物种选自玫瑰孢链霉菌、灰色链霉菌、白色链霉菌、波赛链霉菌、生金链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、吸水链霉菌、除虫链霉菌、Streptomyces milbemycinius和利迪链霉菌。
26.根据条款25的培养物，其中所述链霉菌属物种选自玫瑰孢链霉菌GAL4111、玫瑰孢链霉菌G011、灰色链霉菌GAL1005、白色链霉菌GAL1001、波赛链霉菌D2、GAL4082、波赛链霉菌P55 GAL4081、生金链霉菌GAL1004、变铅青链霉菌GAL1002、天蓝色链霉菌GAL1003、吸水链霉菌GAL4051、除虫链霉菌GAL1006、Streptomyces milbemycinius GAL4211和利迪链霉菌GAL1007。
27.根据条款20–26中任一项的培养物，其中所述链霉菌属宿主进行遗传修饰，以表达脂质合成途径中的至少一种基因。
28.根据条款20–27中任一项的方法，其中所述链霉菌属宿主进行遗传修饰，以表达编码DGAT(EC 2.3.1.20)和/或3-酮脂酰-酰基载体蛋白质合酶III(FabH)(EC：2.3.1.41)的内源或外源基因。
29.根据条款20–28中任一项的方法，其中所述链霉菌属宿主进行遗传修饰，以表达选自下述的一种或多种基因：
(a)sco0958(SEQ ID NO:1)和/或sco5888(SEQ ID NO:2)；
(b)所述基因在链霉菌属物种中最接近的同系物；
(c)在65℃在1.5mM柠檬酸钠pH 7.0和0.015NaCl中与所述基因或所述同系物中的至少一种杂交的核苷酸序列；
(d)引起与基因产物ID 101096381或ID 101101330具有的相同或等价功能的核苷酸序列；
(e)编码显示与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO:4的至少60％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
30.根据条款20–29中任一项的培养物，其中所述链霉菌属宿主在生产生物活性代谢产物例如抗生素试剂中是缺陷的。
31.根据条款20–30中任一项的培养物，其中所述链霉菌属菌株选自菌株G009、G010、G013、G014、G015、G012、G016、G017和G019。
32.一种链霉菌属宿主，其遗传修饰为表达编码DGAT(EC2.3.1.20)和/或3-酮脂酰-酰基载体蛋白质合酶III(FabH)(EC：2.3.1.41)的内源或外源基因，或引起与基因产物ID 101096381或ID 101101330具有的相同或等价功能的核苷酸序列。
33.根据条款32的宿主，其中宿主细胞选自物种玫瑰孢链霉菌、灰色链霉菌、白色链霉菌、波赛链霉菌、生金链霉菌、变铅青链霉菌、吸水链霉菌、除虫链霉菌、利迪链霉菌，优选选自物种玫瑰孢链霉菌、Streptomyces milbemycinius和白色链霉菌。
34.根据条款32或33的宿主，其中所述宿主进行遗传修饰，以表达选自下述的一种或多种基因：
(a)sco0958(SEQ ID NO:1)和/或sco5888(SEQ ID NO:2)；
(b)所述基因在链霉菌属物种中最接近的同系物；
(c)在65℃在1.5mM柠檬酸钠pH 7.0和0.015NaCl中与所述基因或所述同系物中的至少一种杂交的核苷酸序列；
(d)引起与基因产物ID 101096381或ID 101101330具有的相同或等价功能的核苷酸序列；
(e)编码显示与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO:4的至少60％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
35.根据条款32–34中任一项的宿主，其中所述菌株选自菌株G009、G010、G013、G014、G015、G012、G016、G017和G019。
36.一种脂质组合物，其根据条款1–15中任一项生产。
37.根据条款1–15中任一项生产的脂质或脂质组合物或根据条款36的脂质组合物，或脂质或脂质组合物的馏分作为生物燃料和/或润滑剂，或作为用于生物燃料和/或润滑剂生产的原材料的用途。
38.根据条款1–15中任一项生产的脂质或脂质组合物或根据条款36的脂质组合物用于生产生物柴油或可再生的柴油的用途。
39.生物燃料，其包含根据条款1–15中任一项生产的脂质或脂质组合物、或根据条款36的脂质组合物、或脂质或脂质组合物的馏分，和用于生物燃料用途的任选的合适添加剂。
40.润滑剂，其包含根据条款1–15中任一项生产的脂质或脂质组合物、或根据条款36的脂质组合物、或脂质或脂质组合物的馏分，和用于润滑剂用途的任选的合适添加剂。
实施例
如果在正文中并未另外陈述，那么下述用于分析的方法用于涉及实施例的实验中。
方法：
湿细胞质量的检测：通过将10ml培养肉汤的样品放到去皮重的Falcon管中且以4000rpm离心10分钟测量湿细胞质量。在离心后，弃去上清液并且将Falcon管称重，以获得细胞馏分的质量。细胞质量作为克/1升培养肉汤给出。
干细胞质量的检测：将湿细胞群在70℃干燥两天，这之后通过称重测定质量。细胞质量作为克/1升培养肉汤给出。
PMV的检测：通过获得10ml培养肉汤且以4000rpm离心10分钟测量菌丝体生长量，这之后细胞相的体积测量为％数字。
培养物的视觉分析：通过在琼脂平板上分离菌落、研究液体培养物和显微镜检查分析在视觉上分析细菌培养物。
TLC分析：将5μl十倍浓缩的氯仿萃取物吸取到TLC平板(硅胶60F254Merck1.05729)上，并且在己烷:二乙醚:乙酸(80:20:2)中运行。在运行后将液体用碘着色或燃烧至碳。通过将平板浸入50％H2SO4中且将平板在180℃中加热1小时执行液体的燃烧。胆固醇(C)、胆固醇octadecanat(COD)、癸酸、甘油三肉豆蔻酸酯(GTM)和L-α-磷脂酰乙醇胺(原文为phospatidylethanolamine，疑为phospatidylethanolamine)用作TLC上的标准。脂质在TLC平板上视觉上检测为黄色(碘)或黑色(碳)斑点。
TLC斑点的分析：脂质在TLC平板上视觉上检测为黄色(碘)或黑色(碳)斑点。更明确地碘色斑在UV光中可见。将样品斑点与标准相比较，以估计以g/l表示的数量。如果在相同测试运行中的样品之间做出比较，那么基于斑点的强度给出值(-、+/-、+、++、+++或0-3)。
另外，使用Image J程序(http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html)通过图像分析估计TAGs的g/l值。使用从1g/l直到40g/l的浓度规模制备标准曲线，并且针对标准曲线测量培养肉汤中的脂质滴度。
样品萃取：用等体积的氯仿-甲醇(Clf-MeOH；2:1)萃取整个培养肉汤(固体阶段培养)或分开的菌丝体。将管在振荡器中在RT温育1小时。在离心后，从萃取物中取得样品且通过TLC和/或通过GC分析。
干萃取重量的检测：通过使1-5ml萃取物在RT在鼓风中干燥一天来测定干萃取物重量，这之后通过称重测定质量。质量作为克/1升培养肉汤给出。
用于抗生素生产的生物测定法：
将指示剂微生物在TSB肉汤中在+30℃培养过夜。将细胞原种1:100(v/v)稀释至TSB软琼脂。将等量TSB软琼脂(10ml)转移到TSB琼脂平板之上，并且使软琼脂层固化。将突变株和对照培养物或乙酸乙酯萃取(1:1)的小圆盘转移到平板之上。平板在+37℃温育过夜。通过突变株形成的澄清晕圈与对照培养的相应晕圈相比较。
简要的HPLC方法：
设备：
仪器：Agilent 1100-系列色谱系统(A312-319)
检测器：Agilent UV-VIS-检测器(G1315A)
柱：Zorbax SB-C8，4,6*150mm，3,5μm
运行参数：
洗脱剂：洗脱剂A 2000ml PW
洗脱剂B 2000ml MeCN
柱温： 60℃
流速： 1,5ml/分钟
运行时间： 15分钟
注射： 5μl+针洗涤(1：1PW+MeOH)
检测： 240nm
时间 洗脱剂A 洗脱剂B 流动
0,00 31％ 69％ 1,5ml/分钟
10,00 31％ 69％ 1,5ml/分钟
10,01 5％ 95％ 1,5ml/分钟
13,00 5％ 95％ 1,5ml/分钟
13,01 31％ 69％ 1,5ml/分钟
实施例1.就脂肪累积筛选链霉菌
来自当地培养物保藏的链霉菌物种(表1)就在标准培养条件上的生长进行测试，以阐明循环时间、细胞质量和脂质累积。将菌株在一般的肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤TSB(Difco)中在振荡器(100-330rpm，26-34℃)中培养两到三天。发现下述菌株在标准培养条件下给出高细胞质量和以显著数量的脂质累积：GAL4111(玫瑰孢链霉菌)、GAL1005(灰色链霉菌)、GAL1001(白色链霉菌)和GAL4082(波赛链霉菌D2)。
每种菌株的孢子悬液的等分试样或菌丝体的环用于接种250ml锥形瓶中的50mlTSB培养基。允许伴随振荡的温育继续三天，并且在培养的每天例如以24小时间隔获得10ml样品。分析下述特征：湿和干细胞质量的测定、PMV、通过取样的pH追踪观察和视觉分析以限定生长周期、在氯仿中的脂质馏分萃取和氯仿萃取物的TLC分析。
一般的培养条件：
温度：22-36℃
pH：5.0-8.5
搅动：100-330rpm(3/4-1英寸投掷(throw))
接种物形式：营养菌丝体、基内菌丝体、孢子
转移率：0.5–50％
在使用中的标准培养基：TSB、2*TY、E05
TSB是来自Difco的胰蛋白胨大豆肉汤，含有17g/l酪蛋白胰酶消化物、3g/l大豆粉酶促消化物、2.5g/l右旋糖、5g/l氯化钠、2.5g/l磷酸氢二钾；2*TY含有16g/l胰蛋白胨pepton、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl，并且E05含有下述成分：20g/l右旋糖、20g/l淀粉、5g/l farmamedia、2.5g/l酵母提取物、1g/l MgSO4·7H2O、1g/l KH2PO4、3g/l CaCO3、3g/lNaCl。
链霉菌属培养物的特征：
指数生长时间：12-64小时
累积脂质的时间：24-64小时
主要脂质馏分：TAGs
如通过TLC估计的在代谢产物馏分中的TAG含量：20-80％
如通过GC测量的在萃取物中的油含量是25-80％，TAG含量在油馏分中是50-95％
氯仿萃取物的质量：>10g/l的培养肉汤
氯仿萃取物的TAG馏分：10-80％
湿细胞质量：>100g/l
干细胞质量：>8g/l
PMV的范围：6-16％
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：3g/l(最高值的时间3天)
实施例2.遗传修饰的菌株的构建
两种菌株GAL4111和GAL1001用作遗传工程的宿主，尽管相同方法对于GAL1005和GAL4082以及几种其他链霉菌也是有用的。此外，生成达托霉素生产GAL4111的阻断突变株，以阻止培养中的抗生素生产且指定为G011。有趣的是，G011的所有其他培养性质与GAL4111中发现的相同，除了在G011中缺乏脂肽抗生素以可检测数量的累积。G011在与GAL4111相同的培养条件下以相似数量累积TAGs和其他脂质。
如果提及遗传修饰的菌株的构建中的标准方法，那么这些在通过Kieser等人，2000用于链霉菌的链霉菌属手册以及Sambrook和Russell，2001用于大肠杆菌中找到。
质粒构建：
称为sco0958和sco5888的涉及脂肪酸生物合成的基因从天蓝色链霉菌基因组DNA克隆到pIJE486载体内，以分别给出pIJEsco0958和pIJEsco5888。使用相同限制位点将基因克隆到低拷贝数载体pHJL401中，以分别给出pHJLsco0958和pHJLsco5888。基因还在相同构建体中组合，以分别给出pIJEsco5888+0958和pHJLsco0958+5888。使用同源引物通过PCR获得基因sco5888和sco0958：
Figure BDA0001403546110000411
和
Figure BDA0001403546110000421
使用相应的限制位点将通过PCR获得的片段克隆到载体pIJE486内。为了将DNA引入菌株GAL4111和GAL1001内，使用原生质体转化。使用标准PEG辅助的转化方法。将转化混合物在R2YE平板上铺平板且在30℃温育。在过夜温育后，将在水悬液中的20μg/ml硫链丝菌肽涂抹在平板上用于选择含有质粒的菌株。温育继续3-5天，这之后从平板中挑选转化株。
通过标准程序将上述片段连接且克隆到大肠杆菌中，用于转移到链霉菌属物种内。
通过测序验证PCR产物。将转化株的质粒分离且消化，以验证转化的质粒。
如表6中所示，制备下述遗传修饰的菌株且测试增加的脂质累积。
表6.在本发明中使用的克隆指名
编码 质粒 宿主菌株
G009 pIJEsco0958 GAL1001
G010 pIJEsco0958 GAL4111
G013 pIJEsco5888 GAL1001
G014 pIJEsco5888 GAL4111
G015 pIJEsco5888+0958 GAL4111
G012 pIJEsco0958 G011
G016 pHJLsco5888 GAL1001
G017 pHJLsco0958+5888 GAL1001
G019 pHJLsco5888 G011
pIJE486是在链霉菌中复制的高拷贝数质粒(Ylihonko等人，1996)
pHJL401是在链霉菌中复制的低拷贝数质粒(Kieser等人，2000)
实施例3.用于脂质累积的GMO-链霉菌的小规模培养
将菌株G009、G010、G012、G013、G014、G015、G016、G017和G019在如此处描述的条件下培养。宿主菌株G011、GAL4111和GAL1001用作培养中的对照。
一般的培养条件：
温度：22-36℃
pH：5.0-8.5
搅动：0-330rpm
接种物形式：营养菌丝体、基内菌丝体、孢子
转移率：0.5–50％
在使用中的培养基：如实施例1中给出的TSB、E05和如实施例4中所述的不同种类的废物或残渣材料。
通过TLC分析比较TAG的累积与野生型GAL1001和GAL4111的那种。图5证实通过菌株G017、G016、G013和G011在不同培养基中的TAGs累积的例子。在携带基因sco0958的GMO菌株中存在脂质且尤其是TAGs累积中的明确增加，和携带在不同质粒载体中的sco5888的那些克隆(菌株)中存在增加。结果在此处给出：
表7使用的GMO菌株的指名
Figure BDA0001403546110000441
实施例4.培养肉汤的含量：使用废物用于生长
为了在经济、低成本、培养条件下增强最大限度生长和TAGs累积，几种废物和/或馏分用作培养中的碳源和/或营养素来源。令人惊讶的是，根据实施例1和实施例2的所有测试的链霉菌都能够在大范围的废物中生长且累积脂质。废物馏分单独且与糖和与其他营养素组合进行测试。如通过细胞生长和TAGs累积指示的，成功地使用在表8中的下述废物馏分。下述数据衍生自在每种非水解(解聚)的废物(50g/l)+右旋糖糖浆(DX75)(10g/l)中的G009培养。
表8.在本发明中用作碳源和/或营养素来源的材料主要是废物或残渣的指名及其对生长和TAGs累积的影响。
Figure BDA0001403546110000451
*由5天样品–2天样品估计
实施例5.所选菌株在控制条件下的发酵
菌株GAL1001、GAL4111、G009和G010在下述范围中的控制发酵条件下培养：
温度：22-36℃
pH：5.0-8.5
搅动：0–4m/s的尖端速度
充气：0-2vvm
接种物形式：营养菌丝体、基内菌丝体、孢子
传代：0-2种子
转移率：0.5–50％
容积：1.5l工作容积
基础培养基：TSB、2*TY、E05(这些培养基的含量在实施例1中给出，并且几种废物培养基如表9中所示。
表9.在发酵中使用的废物或残渣材料
Figure BDA0001403546110000461
链霉菌属培养物的特征：
指数生长时间：12-64小时
累积脂质的时间：24-64小时
基于TLC的主要脂质馏分：TAGs
如通过TLC估计的在代谢产物馏分中的TAG含量：>8g/l
氯仿萃取物的质量：>15g/l的培养肉汤
氯仿萃取物的TAG馏分：10-80％
湿细胞质量：>200g/l
干细胞质量：>20g/l
PMV％的范围：10-40
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：4g/l(最高值的时间6天)
实施例6a.菌株G009的分批发酵
所述菌株以1.5、20和500升的发酵体积进行培养。下述程序给出可容易重复的发酵方法的详细信息。
接种：孢子或琼脂平板培养物的塞子(plug)
转移率：4％
播种步骤：2
温度：28℃
充气：0.5vvm
搅拌：100-280rpm
反压：0.5巴
在灭菌前的pH：7
循环时间：96小时
达到稳态：24小时(DO在24小时培养后是0)
培养基：如实施例5中给出的几种废物和/或残渣培养基，E05，基础E05培养基的成分和可以用于替换其的材料在此处给出(表10)。
表10.用于替换基础E05培养基材料的成分
Figure BDA0001403546110000481
*＝可堆肥的废物如家庭、面包店、庭院、蔬菜、酿造厂(例如醪)、垃圾或这些的混合物；组成不同
**＝褐指藻属、小球藻属和杜氏藻
***＝任何细胞群，例如乳杆菌和链霉菌
细胞质量(湿)：348g/l
PMV：30％
干燥的氯仿萃取物：28g/l
基于TLC获得的TAGs：23g/l
在氯仿萃取物中的TAGs：82％
进料糖转换为TAGs的比：从40g/l到23g/l＝57.5％(来自废物的额外糖)(该得率仅基于加入的纯糖(右旋糖和淀粉)进行计算)。理论最大值是33％。高于理论最大值的得率意味着脂质由废物材料中包括的糖产生。
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：10.2g/l(最高值的时间6天)
实施例6b.菌株GAL1001的分批发酵
所述菌株以1.5l、20l和500l的发酵体积进行培养。在实施例6a中给出的说明程序给出可容易重复的发酵方法的详细信息。
培养的指示图：
细胞质量(湿)：267g/l
PMV：25％
干燥的氯仿萃取物：10g/l
获得的TAGs：5g/l
进料糖转换为TAGs的比：从40g/l到5g/l＝12.5％
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：2.1g/l(最高值的时间3天)。
实施例7.菌株G009的分批补料发酵
所述菌株以1.5、20和500升的发酵体积进行培养。参数如实施例6a中所述。右旋糖的进料在培养1-2天后(当主要消耗初级葡萄糖时)开始，且继续至培养结束。进料糖的量总共是40g/l，因此加入培养肉汤中的糖总量是60g/l。
在4天发酵中获得的每一升培养肉汤的结果：
细胞质量(湿)：356g/l
PMV：36％
干燥的氯仿萃取物：14g/l
获得的TAGs：6g/l
进料糖转换为TAGs的比：从60g/l到6g/l＝10％通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：3.6g/l(最高值的时间3天)。
该实施例指出分批补料培养可以用于通过链霉菌属的脂质生产中。
实施例8.在肉汤中不同废物的组合；藻类和生物废物
菌株G009在控制条件下在通过组合不同类型的废物制备的肉汤中以下述参数进行培养：
温度：28℃
pH：在培养开始时7
搅动：300rpm
充气：0.5vvm
接种物形式：营养菌丝体、基内菌丝体、孢子
传代：2
转移率：2％
容积：1.5L工作容积
表11.在发酵中使用的废物和/或残渣。
生物废物(面包店和蔬菜(50:50)，含量未确定；10g/l
藻类(杜氏藻)50g/l
主要糖源：蔗渣
糖(总计)40g/l(右旋糖糖浆和淀粉/蔗渣/稻草)
G009培养物的特征：
指数生长时间：97小时
累积脂质的时间：144小时
主要脂质馏分：TAGs
如通过TLC估计的在代谢产物馏分中的TAG含量：>70％％图4证实通过G009在不同培养基中的TAGs累积。
氯仿萃取物的质量：>22g/l的培养肉汤
氯仿萃取物的TAG馏分：68.9％
如通过ImageJ测定的TAGs：15.3g/l
PMV：39％
脂质得率(不含废物的总进料纯糖)：55％
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：4.6g/l(最高值的时间3天)
该实施例指出多种废物和残渣可以在通过链霉菌属的脂质生产中作为混合物提供。超过理论值33％的脂质得率指出使用来自废物的糖。
实施例9.脂质萃取的细菌培养物作为发酵中的营养素来源的再使用
菌株G016、G013和G009在控制条件下在1,5升分批发酵中进行培养。通过过滤收获细胞且通过等体积的氯仿(1:1)萃取。在那之后，将剩余的细胞碎片进一步在60℃干燥10分钟，以去除氯仿残渣，以连同或不连同另外的糖源例如右旋糖糖浆10g/l一起供应给发酵培养基。
温度：22-36℃
pH：5.0-8.5
搅动：0–4m/s的尖端速度
充气：0-2vvm
接种物形式：营养菌丝体、基内菌丝体、孢子
传代：0-2种子
转移率：0.5–50％
容积：0.05-1.5l工作容积
G016培养物的特征：
指数生长时间：20-144小时
PMV：33％
累积脂质的时间：直至72小时
主要脂质馏分：TAGs
如通过TLC估计的在代谢产物馏分中的TAG含量：>80％
氯仿萃取物的质量：27.4g/l
由氯仿萃取物的数量计算的TAGs：14g/l
脂质得率(来自不含废物的总糖)：51％
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：1.6g/l(最高值的时间3天)
G013培养物的特征：
指数生长时间：20-144小时
PMV：33％
累积脂质的时间：直至144小时
主要脂质馏分：TAGs
如通过TLC估计的在代谢产物馏分中的TAG含量：>80％
氯仿萃取物的质量：20.5g/l
由氯仿萃取物的数量计算的TAGs：10g/l
脂质得率(来自不含废物的总糖)：49％
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：2.6g/l(最高值的时间3天)
G009培养物的特征：
指数生长时间：6-50小时
PMV：20％
累积脂质的时间：直至48小时
主要脂质馏分：TAGs
如通过TLC估计的在代谢产物馏分中的TAG含量：>90％
氯仿萃取物的质量：14g/l
由氯仿萃取物的数量计算的TAGs：7.0g/l
脂质得率(来自不含废物的总糖)：50％
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：3g/l(最高值的时间3天)
该实施例指出脂质萃取的链霉菌属细胞可以再用作通过链霉菌属的脂质生产中的营养素来源。
实施例10.培养基的巴氏灭菌
与一般的发酵方案平行，执行无需所使用肉汤的灭菌的培养。将在121℃共20分钟的灭菌替换为对于种子和生产肉汤加温直到60℃10-30分钟和75℃共2-10分钟。通过显微镜检查且通过将100μl样品在TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)平板上铺平板，允许大范围微生物的生长，来每天研究培养物。一般地，即使对于最短的加热时间在培养物中也未发现污染，并且培养类似于灭菌培养基中的平行培养。
接种：孢子或琼脂平板培养物的塞子
转移率：4％
播种步骤：2
温度：28℃
充气：1vvm
搅拌：尖端速度1.3m/s
反压：0.5巴
在灭菌前的pH：7
循环时间：96小时
达到稳态：16小时
培养基：如实施例5中给出的几种废物培养基，E05、20g/l垃圾+20g/l右旋糖糖浆。
结果：
细胞质量(湿)：178g/l
PMV：16％
累积脂质的时间：直至72小时
氯仿萃取物的质量：9g/l
获得的TAGs(通过TLC估计)：5g/l
累积脂质的时间：直至96小时
主要脂质馏分：TAGs
如通过TLC估计的在代谢产物馏分中的TAG含量：>90％
通过Image J的TAGs增加(最高量–零样品)：1.8g/l(最高值的时间6天)
结果指出培养基的灭菌可以替换为培养基巴氏灭菌法用于通过链霉菌属的脂质生产。
实施例11.用于裂解的细胞生长测定
在上文实施例1-7中所述的培养条件下，稳态一般在10-48小时温育中达到。静止期继续约48-72小时，这之后发生细胞裂解。TAGs在延长培养时消失。在衍生自7天培养肉汤的样品中在TLC上仅检测到微量TAGs–如果存在的话。如通过TLC检测的，脂质且尤其是TAGs在培养第4天时已逐步减少。细胞裂解可能已释放脂肪酶的作用，导致TAGs的水解，如在培养实验中可见的。因此，在自裂解或脂肪酶抑制剂加入培养肉汤中之前停止发酵。
实施例12.TAG降解的预防
菌株G009的孢子在1L自来水，pH 7中含有下述原材料的培养基中培养：右旋糖7520g、蔗渣20g、来自面包店和庭院的生物废物(1:1)5或10g、藻类25-50g、MgSO4·7H2O 1g，KH2PO4 1g和CaCO3 3g。培养条件是28℃、300rpm共11天。在培养6天后，0,05g/l AgNO3或含有0,05g/l CaCO3的0.4％的Triton×100溶液。不含所述补充物的烧瓶视为用于脂肪酶抑制剂处理研究的对照。培养在相同条件下再继续5天。
根据本发明中使用的一般取样方案，在培养7、8和11天后取得样品，并且取样结果在此处显示。用两个浓度的藻类碎片和生物废物进行平行培养，并且每种测试条件的上列给出关于更高浓度的两种废物馏分的结果。
表10.脂肪酶抑制剂测试的结果
Figure BDA0001403546110000541
脂肪酶抑制剂的效应在脂质(氯仿萃取物)质量中非常良好地可见，这是轻微增加或固定的。注意到与对照相比较，在TAGs的数量变化中的显著差异。
实施例13.使用化学诱变剂通过随机方法生成非生产突变株
存在由抗生素生产者菌株生成阻断突变株的几种可能性。在这个实施例中，生产称为美尔倍霉素的抗生素的菌株S.milbemycinius GAL4211用于NTG诱变。将菌株在ISP4厚琼脂平板(9cm)上铺平板，并且在30℃温育直至形成孢子。将孢子悬浮至10ml水，且转移至离心管用于平滑地振荡。将孢子的同质悬液通过3cm原棉过滤，并且离心3000rpm，10分钟。将收获的孢子在-80℃贮存于20％甘油中，并且通过在琼脂平板上铺平板合适的稀释物测定孢子滴度用于菌落计数。
在+30℃在7-9的pH缓冲液中通过以1-3mg/ml的不同浓度的NTG(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)处理具有107孢子/ml含量的孢子悬液0.5-1小时。在NTG处理后，将细胞洗涤两次且在ISP4平板上铺平板。在所述条件下观察到的杀死率是90-100％。
如通过抗菌测定法测试的，菌落未能生产抗生素，并且通过HPLC(240和430nm)分析研究脂质累积。
实施例14.通过第一种生物合成基因的靶向灭活生成非生产突变株
使用异源但保守的DNA片段通过PCR克隆聚酮类化合物生物合成(PKS)基因。将片段分离且克隆到在大肠杆菌中复制但在链霉菌中不复制的载体pUC19内。将生物标记－编码安普霉素抗性的基因插入PKS基因中，以引起基因产物的平截。获得的重组pUC19构建体通过缀合引入S.milbemycinius内。就抗菌性质的表达研究克隆且通过HPLC分析美尔倍霉素的生产。通过在液体培养基中和在固体琼脂上的重复培养进行关于特有抗生素美尔倍霉素的不生产的验证。
使用的引物
正向:5’TSGCSTGCTTGCTTCGAYGCSATC-3’(SEQ ID NO：11)
反向：5’TGGAANCCGCCGAABCCGCT-3’(SEQ ID NO：12)
简并引物符号：S＝C或G；Y＝C或T；B＝C、G或T，并且N＝A、T、C或G。
PCR条件：
Figure BDA0001403546110000561
缀合：
对于缀合，将重组pUC19构建体转化到大肠杆菌菌株ET12567/pUZ8002内。将菌落接种到含有kan、cam和apr的3ml LB或2xTY内，并且在30℃、330rpm生长过夜。过夜培养物在含有抗生素的新鲜的LB或2xTY中1:30稀释，并且在30℃生长至0,4-0,6的OD600。用等体积的培养基将细胞洗涤两次且重悬浮至0,1体积的使用的培养基。具有107孢子/ml含量的1ml孢子悬液用等体积的TSB洗涤两次且重悬浮至1ml的TSB。将100μl或250μl孢子悬液加入400μl或250μl大肠杆菌悬液且混合。将100μl悬液在四块MS+10mM MgCl2平板上铺平板，并且在30℃温育16-20小时。通过针对抗生素(安普霉素50mg/l)的抗性选择缀合株(Conjugants)，并且萘啶酸(1mg/平板)用于杀死大肠杆菌。将抗生素重悬浮于灭菌纯净水中且覆盖在平板上。
实施例15.衍生自菌株Streptomyces milbemycenius且累积增加数量的脂质的阻断突变株。
突变株在培养基E05中培养。该菌株在28℃、200rpm在烧瓶中和在200L工作容积的发酵罐中进行培养，使用0,5vvm的充气、搅动250rpm和在28℃。制备一个种子培养，以增强细胞群用于具有10％接种率的200-l培养。在烧瓶或发酵罐中八天培养后，通过振荡在RT将获得的整个培养肉汤用甲醇:氯仿(2:8)萃取2小时。通过TLC就脂质的量研究含有脂质馏分的氯仿相，并且检测到作为最小值的20g/l。纯葡萄糖或衍生自淀粉(40g/l)的葡萄糖(20g/l)的转换效率是33％。TAGs的量在所有脂质80-90％的范围中。细胞质量相对很低，在培养结束时给出10-20％的低PMV值。
GC分析揭示脂质概况是链霉菌属菌株特有的。
实施例15.GMO-菌株的表征
通过关于菌落形态、循环时间和代谢产物生产的研究执行菌株表征。
通过测序验证用于构建GMO菌株的PCR产物。将菌株的质粒分离且消化以验证转化的质粒。
在ISP4和ISP2琼脂平板上以及在具有废物变体的TSB和E05中的深层培养中的菌株特征在此处给出。
G009是携带pIJEsco0958且指定为克隆2的白色链霉菌GAL1001菌株。它不生产可检测数量的生物活性代谢产物，并且如GAL1001，提出由于随机突变，它在生物活性次级代谢产物的生物合成中是被阻断的。菌落形态：在ISP4琼脂上，G009形成具有白色色素的孢子，而在琼脂平板的反侧中；菌落是褐色的，由薄透明区围绕。在丰富的琼脂ISP2中，G009菌落形成黄色基内菌丝体和微黄色的气生菌丝。白色色素的孢子是轻微可见的。在深层培养中的一般形态是团块或分散的菌丝体。菌株也在深层培养中例如在TSB和E05中形成孢子。根据本公开内容的有关特征是与亲本菌株相比较增加的细胞质量，和在多种培养条件下高达30g/l的TAGs累积。菌株的特征在迄今为止测试的高达20次传代中是稳定的。
G013是携带pIJEsco5888的白色链霉菌GAL1001菌株。它不生产可检测数量的生物活性代谢产物，并且如GAL1001，提出由于随机突变，它在生物活性次级代谢产物的生物合成中是被阻断的。在固体和深层培养上的菌落形态非常类似于对于G009描述的那种，尽管生长不如通过G009发现的一样良好。菌落大小略微小于在固体琼脂上在G009培养物中发现的。根据本公开内容的有关特征是在多种培养条件下高达11g/l的TAGs累积。
G016是携带pHJLsco5888的白色链霉菌GAL1001菌株。它不生产可检测数量的生物活性代谢产物，并且如GAL1001，提出由于随机突变，它在生物活性次级代谢产物的生物合成中是被阻断的。在固体和深层培养上的菌落形态非常类似于对于G009描述的那种，尽管生长不如通过G009发现的一样良好，但略微优于通过G013发现的。根据本公开内容的有关特征是在多种培养条件下高达24g/l的TAGs累积。
G011是GAL4111的突变株，并且不生产对于其亲本菌株特有的可检测数量的生物活性代谢产物。基于DNA序列的等同模式、菌落特征和生产少量、几毫克达托霉素类似物/升的能力，GAL4111已鉴定为玫瑰孢链霉菌。菌落形态：在ISP4琼脂上，G011形成具有白色/红色色素的孢子，而在琼脂平板的反侧中，基内菌丝体是微红色至褐色，并且可见围绕这些红色/褐色菌落的薄亮区围绕，指示淀粉酶活性。在丰富的琼脂ISP2中，G011菌落是褐色的，可见具有白色/红色色素的轻微孢子形成。在ISP2上的基内菌丝体是轻微红色的，具有呈褐色的气生菌丝。在深层培养中它提供微红色团块或分散的菌丝体。菌株也在深层培养中例如在TSB和E05中形成孢子。根据本公开内容的有关特征是与亲本菌株相比较增加的细胞质量，和1g/l的TAGs累积。
G012是携带pIJEsco0958的玫瑰孢链霉菌G011菌株，并且如其亲本菌株G011，不生产可检测数量的生物活性代谢产物。菌落形态等同于对于G011描述的那种。然而，生长不如通过G011发现的一样良好。菌落大小略微小于在固体琼脂上的G011培养物中发现的，而菌落无法基于这点进行区分。根据本公开内容的有关特征是12g/l的TAGs累积。
G017是携带pHJLsco0958+5888的玫瑰孢链霉菌G011菌株，并且如其亲本菌株G011，不生产可检测数量的生物活性代谢产物。菌落形态等同于对于G011描述的那种。生长非常类似于通过G011发现的那种。根据本公开内容的有关特征是与亲本菌株相比较增加的细胞质量，和20g/l的TAGs累积。
G019是携带pHJLsco5888的玫瑰孢链霉菌G011菌株，并且类似于其亲本菌株G011，不生产可检测数量的生物活性代谢产物。菌落形态等同于对于G011描述的那种。生长非常类似于通过G011发现的那种。根据本公开内容的有关特征是与对照菌株GAL4111相比较增加的细胞质量，和17g/l的TAGs累积。
G010是携带pIJEsco0958的玫瑰孢链霉菌GAL4111菌株，并且与其亲本菌株GAL4111不同，不生产可检测数量的生物活性代谢产物。菌落形态等同于对于G011描述的那种。然而，生长不如通过G011发现的一样良好。根据本公开内容的有关特征是18g/l的TAGs累积。
G014是携带pIJEsco5888的玫瑰孢链霉菌GAL4111菌株，并且与其亲本菌株GAL4111不同，不生产可检测数量的生物活性代谢产物。菌落形态等同于对于G011描述的那种。生长非常类似于通过G011发现的那种。根据本公开内容的有关特征是与亲本菌株GAL4111相比较增加的细胞质量，和如G017，20g/l的TAGs累积。
G015是携带pIJEsco5888+0958的玫瑰孢链霉菌GAL4111菌株，并且与其亲本菌株GAL4111不同，不生产可检测数量的生物活性代谢产物。菌落形态等同于对于G011描述的那种。生长率非常类似于通过G011发现的那种。根据本公开内容的有关特征是与亲本菌株GAL4111相比较增加的细胞质量，和25g/l的TAGs累积。
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序列表
<110> Neste Oil Oyj
<120> 用于生产脂质的方法和微生物
<130> BP204380
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1860
<212> DNA
<213> 天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1860)
<400> 1
gtgcggtaga tgtgcgaggt ggcccggcgg accgcgatcg cgtcggggtg gtcgacgtcc 60
agctcgtcga gttccttcag tacgtcgagg cagagcgcca gccgttcggg gtcgataccg 120
gggccgtacg cggacgccgc cacctcgtcc gtggtcgccg caccgtcctg tgtcaccgtc 180
atcgccgctg ccgttccctg gtcaccgtcg cggcgctccg ggaggcgacc gctgtcgaac 240
agcggatttt attcagcgcg cggcgtggat ccaaacccgc cggggtcagg gacggcacgc 300
cgtgagcaac gtctccacct cctcggccac cgccacggcg agccggtcga ggtccggcac 360
cgccttcgcg tcggcgagca ggccgtagtg gacccgcccg cggtacgtcg agacggccac 420
cgccagggag tggccgcggg ccagcggggc cagtggatag acctcggtga gcgggtgccc 480
gcccagccgc agcccgaggc tgggcagggg gacgctggtg accaggaggt cgaaccagag 540
ccgggcggcc ccggagacca gtggcccgcc gagccggtgg ccgagcgccg ggacgtggtc 600
ggcgagcagg gcgacggctc cggcgccgcg tccgggcccg gcgtccttgt tgcggtccat 660
ggcggcgcgg accgtgccga ggcgggcgag cgggtcgggg tcgccgaccg gaagcctcat 720
caggtacccg gagagccggt ttccctgggg gtgcgcgctg cgcgggcggc gcctggagac 780
ggggatcagg gcccggggcg cgacgccctc gctgccgtcg ccgcgttcgt ccagccagcg 840
gcgcagggcg cccgcgacga ccgcgatcag tacgtcgttg acggtgccgc cggtggtctt 900
gcggacgtgg tgcacgtcgt cgaggtcgac ggacaccccc gcggtccggc gggtcccgga 960
ggacgcggcg gtgagcgcgg gcgaggaacg cacgtcgagg gtggacaacg ccgcggcggc 1020
accgatgtcc agggcgcgcc cggcgtcgga cagggcgccg cgcagccggt cgggcagggc 1080
gcgcacgtcc ggcaggagtc cgcgcggcgg ctgctcgggg cggggccggg gtgccggcag 1140
gtccatcggg tccaggacac ccgcggccag cgtcagggcg cgcagaccgt cggccagggc 1200
gtggtggaac ttgaacagca cggcgaagga cccgccgtcc gcgcccggca gcacgtgcgc 1260
ctcccacggc ggccgtccgc gttccagggg gcgttccatc aggcgcccgg cccgggcgtg 1320
gaagtccgtg gccggggcgt gcagccgcac gtggtcgagc gggtcgaagc gggggtcggg 1380
ctcgcgggtc gcgccgccga acgcgaacgg ccggcgcagg gccatcggcg gctgccaggt 1440
gtcccggatc ctcatccgca gtccgggcac cgcgggggcg cgggccgcga gcaggtccgc 1500
cgcgagcgcg cccgcggtgg gcgagtcggc ctcgaagacg ccgagcgcgc ccaggtgcat 1560
ggggtgctcg gcggactcga tgttccagaa cgccaggtcg aggggagcga gcggatcggg 1620
agtcaagggc ttgcctcgca aggacgacgc atgggcggtg gatggacaac gggtggacaa 1680
gcagtcaatc gctctccgac gattacggtc aagtacgatc acgctacgca cagttaacaa 1740
gagattaaaa gtcccgcccc tttcgacagg ggcgggactg ctgtgactca tggggcgcct 1800
gtgctcgcgt cggctcaggt cagcggcggc ggcaccgcct ctgtcccggt accccacccg 1860
<210> 2
<211> 1380
<212> DNA
<213> 天蓝色链霉菌
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1380)
<400> 2
cagtgagccg tcagcgcccg gtcaggggcc ccggccagac tcggtgcggc cggggggccc 60
ggattcactc cccacacctg ccggccggca aaccgtccat cacgcgagga gcacacacgt 120
ggtttcccgt ctccgccgcc gcaccaggcc caccgcacac cgcggccgct ccgcgggcgg 180
tgcccggtga cccgggcgtc cgtgctgacc ggcctcggtt cctgtctgcc gtcccggtgc 240
gtcaccaacg cggagctgga gcggacgatg gacacctcgg acgagtggat ccgggcccgt 300
acggggatcg cccagcgcta cgtggccgaa gagggcaccc tcacctccga cctggcggtg 360
ggcgcggccg agcgggcact gaagtccgcc cgcctgacac cggacgagat cgacgcggtc 420
atcgtggcca ccaccactcc ggaccggccc tgcccggcga ccgcgccgac ggtggcggcc 480
cggctgggca ccggcccggt cccggcgttc gacgtgtccg cggtgtgctc cggcttcctc 540
tacggactcg ccacggggtc cggtctgatc gcgtccggag cggcggaacg ggtcctggtc 600
atcggtgcgg agaccttctc ccgcatcctc aacccgcagg accgctccac ctcggtgatc 660
ttcggtgacg gcgccggcgc cgtcgtgctg cgcgccggcg agccggggga gaccggtgcc 720
ctcggcccgc tgcggctggg cagcgacggc accggcgtgg acctgatcac cgtgccggcc 780
ggcggaccgc cgcggccggg cgcggcggca ccggacgatc tcgccgaccg ctacttcacc 840
atggagggca agcgggtctt ctggctcgcc gtccagcgca tgggcgagtg cgcggagagc 900
gtgctcgacc gggcgggctg gcgggtggcg gacgtggact ggctggtcag ccaccaggcc 960
aaccaccgca tcaccgcccg gctcgccgac gagatcggca tcccccgcga gcgcagcgtc 1020
agcaacatcg ccgaggtggg caacaccgcc gccgcctcca tccccctcgc gctcgaccac 1080
gcgcacgccc ggggcaccct ccggcccggc gaccgggtgc tcctcaccgc cttcggcggc 1140
ggcctcacct ggggtgccgc cgccctgacc tggcccgccg tcgatccggt ctgagggcgg 1200
ccggccgggc ccggccgaag cgcgcgcaga cgaccgatga accaaggacg accatgactc 1260
ctcggaaact gatcaccgac tacatcgccg acgcctggat gggcggcgac gccgaaggcc 1320
tggagccgga cacccccatc gcggagctga acatcatcga ctccgccgcc atcttcgacc 1380
<210> 3
<211> 446
<212> PRT
<213> 天蓝色链霉菌
<400> 3
Met Thr Pro Asp Pro Leu Ala Pro Leu Asp Leu Ala Phe Trp Asn Ile
1 5 10 15
Glu Ser Ala Glu His Pro Met His Leu Gly Ala Leu Gly Val Phe Glu
20 25 30
Ala Asp Ser Pro Thr Ala Gly Ala Leu Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ala
35 40 45
Arg Ala Pro Ala Val Pro Gly Leu Arg Met Arg Ile Arg Asp Thr Trp
50 55 60
Gln Pro Pro Met Ala Leu Arg Arg Pro Phe Ala Phe Gly Gly Ala Thr
65 70 75 80
Arg Glu Pro Asp Pro Arg Phe Asp Pro Leu Asp His Val Arg Leu His
85 90 95
Ala Pro Ala Thr Asp Phe His Ala Arg Ala Gly Arg Leu Met Glu Arg
100 105 110
Pro Leu Glu Arg Gly Arg Pro Pro Trp Glu Ala His Val Leu Pro Gly
115 120 125
Ala Asp Gly Gly Ser Phe Ala Val Leu Phe Lys Phe His His Ala Leu
130 135 140
Ala Asp Gly Leu Arg Ala Leu Thr Leu Ala Ala Gly Val Leu Asp Pro
145 150 155 160
Met Asp Leu Pro Ala Pro Arg Pro Arg Pro Glu Gln Pro Pro Arg Gly
165 170 175
Leu Leu Pro Asp Val Arg Ala Leu Pro Asp Arg Leu Arg Gly Ala Leu
180 185 190
Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Asp Ile Gly Ala Ala Ala Ala Leu Ser
195 200 205
Thr Leu Asp Val Arg Ser Ser Pro Ala Leu Thr Ala Ala Ser Ser Gly
210 215 220
Thr Arg Arg Thr Ala Gly Val Ser Val Asp Leu Asp Asp Val His His
225 230 235 240
Val Arg Lys Thr Thr Gly Gly Thr Val Asn Asp Val Leu Ile Ala Val
245 250 255
Val Ala Gly Ala Leu Arg Arg Trp Leu Asp Glu Arg Gly Asp Gly Ser
260 265 270
Glu Gly Val Ala Pro Arg Ala Leu Ile Pro Val Ser Arg Arg Arg Pro
275 280 285
Arg Ser Ala His Pro Gln Gly Asn Arg Leu Ser Gly Tyr Leu Met Arg
290 295 300
Leu Pro Val Gly Asp Pro Asp Pro Leu Ala Arg Leu Gly Thr Val Arg
305 310 315 320
Ala Ala Met Asp Arg Asn Lys Asp Ala Gly Pro Gly Arg Gly Ala Gly
325 330 335
Ala Val Ala Leu Leu Ala Asp His Val Pro Ala Leu Gly His Arg Leu
340 345 350
Gly Gly Pro Leu Val Ser Gly Ala Ala Arg Leu Trp Phe Asp Leu Leu
355 360 365
Val Thr Ser Val Pro Leu Pro Ser Leu Gly Leu Arg Leu Gly Gly His
370 375 380
Pro Leu Thr Glu Val Tyr Pro Leu Ala Pro Leu Ala Arg Gly His Ser
385 390 395 400
Leu Ala Val Ala Val Ser Thr Tyr Arg Gly Arg Val His Tyr Gly Leu
405 410 415
Leu Ala Asp Ala Lys Ala Val Pro Asp Leu Asp Arg Leu Ala Val Ala
420 425 430
Val Ala Glu Glu Val Glu Thr Leu Leu Thr Ala Cys Arg Pro
435 440 445
<210> 4
<211> 335
<212> PRT
<213> 天蓝色链霉菌
<400> 4
Met Thr Arg Ala Ser Val Leu Thr Gly Leu Gly Ser Cys Leu Pro Ser
1 5 10 15
Arg Cys Val Thr Asn Ala Glu Leu Glu Arg Thr Met Asp Thr Ser Asp
20 25 30
Glu Trp Ile Arg Ala Arg Thr Gly Ile Ala Gln Arg Tyr Val Ala Glu
35 40 45
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Leu Ala Val Gly Ala Ala Glu Arg Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Ala Arg Leu Thr Pro Asp Glu Ile Asp Ala Val Ile Val
65 70 75 80
Ala Thr Thr Thr Pro Asp Arg Pro Cys Pro Ala Thr Ala Pro Thr Val
85 90 95
Ala Ala Arg Leu Gly Thr Gly Pro Val Pro Ala Phe Asp Val Ser Ala
100 105 110
Val Cys Ser Gly Phe Leu Tyr Gly Leu Ala Thr Gly Ser Gly Leu Ile
115 120 125
Ala Ser Gly Ala Ala Glu Arg Val Leu Val Ile Gly Ala Glu Thr Phe
130 135 140
Ser Arg Ile Leu Asn Pro Gln Asp Arg Ser Thr Ser Val Ile Phe Gly
145 150 155 160
Asp Gly Ala Gly Ala Val Val Leu Arg Ala Gly Glu Pro Gly Glu Thr
165 170 175
Gly Ala Leu Gly Pro Leu Arg Leu Gly Ser Asp Gly Thr Gly Val Asp
180 185 190
Leu Ile Thr Val Pro Ala Gly Gly Pro Pro Arg Pro Gly Ala Ala Ala
195 200 205
Pro Asp Asp Leu Ala Asp Arg Tyr Phe Thr Met Glu Gly Lys Arg Val
210 215 220
Phe Trp Leu Ala Val Gln Arg Met Gly Glu Cys Ala Glu Ser Val Leu
225 230 235 240
Asp Arg Ala Gly Trp Arg Val Ala Asp Val Asp Trp Leu Val Ser His
245 250 255
Gln Ala Asn His Arg Ile Thr Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ile Gly Ile
260 265 270
Pro Arg Glu Arg Ser Val Ser Asn Ile Ala Glu Val Gly Asn Thr Ala
275 280 285
Ala Ala Ser Ile Pro Leu Ala Leu Asp His Ala His Ala Arg Gly Thr
290 295 300
Leu Arg Pro Gly Asp Arg Val Leu Leu Thr Ala Phe Gly Gly Gly Leu
305 310 315 320
Thr Trp Gly Ala Ala Ala Leu Thr Trp Pro Ala Val Asp Pro Val
325 330 335
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 5
ggtggagcat gtggttta 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 6
ccattgtagc acgtgtgt 18
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 7
atttctagaa aaccgtccat cacgcgag 28
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 8
attaagctta ctagtatggt cgtccttggt tcatc 35
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 9
atttctagaa ctagtgatcg tacttgaccg taatc 35
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 10
attaagcttg ctagccgaac agcggatttt attcag 36
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物, 其中 S 是 C 或者 G; Y 是 C 或者 T; B 是 C, G 或 T
且 N 是 A, T, C 或 G.
<400> 11
tsgcstgctt gcttcgaygc satc 24
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物, 其中 S 是 C 或 G; Y 是 C 或 T; B 是 C, G 是 T
且 N 是 A, T, C 或 G.
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 12
tggaanccgc cgaabccgct 20

Claims (18)

1.一种用于生产用于生物燃料或润滑剂的脂质的方法，其包括：
-在含有以无需进行多糖水解的木质纤维素材料作为碳源和/或营养素来源的培养基中培养链霉菌(Streptomyces)属的细菌细胞；
-从所述细胞或所述培养基中回收所述脂质，其中所述脂质主要含有三酰基甘油，并且其中在耗尽的培养基中的三酰基甘油量是至少5克/升；
其中所述木质纤维素材料包含非灭菌的工业有机废物或残渣、农业有机废物或残渣或其任何混合物；
其中所述链霉菌属宿主被遗传修饰以表达编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
其中所述的被遗传修饰的链霉菌属宿主的三酰基甘油的产量与亲本链霉菌属宿主相比至少提高30％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列为基因sco5888，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含甘油、来自糖或淀粉工业的馏分、糖或淀粉糖浆或纯化的糖或其任何混合物作为另外的碳源。
4.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中将所述生产的脂质转酯以生产生物柴油，或氢处理以生产可再生的柴油。
5.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中所述培养基是未灭菌的或是巴氏灭菌的。
6.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中所述培养基包含脂肪酶抑制剂。
7.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中所述培养作为分批或作为分批补料发酵执行。
8.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中所述链霉菌属物种选自玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)、生金链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、米贝链霉菌(Streptomyces milbemycinius)和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)。
9.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中所述链霉菌属宿主被制成在生产生物活性代谢产物中存在缺陷的宿主。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物活性代谢产物是抗生素试剂。
11.一种用于脂质生产的链霉菌属培养物，其包含：
(a)链霉菌属细菌的群体；和
(b)培养基，所述培养基含有以无需进行多糖水解的木质纤维素材料作为碳源和/或营养素来源，其中所生产的脂质主要含有三酰基甘油，并且其中在耗尽的培养基中的三酰基甘油量是至少5克/升；
其中所述木质纤维素材料包含非灭菌的工业有机废物或残渣、农业有机废物或残渣、或其任何混合物；
其中所述链霉菌属宿主被遗传修饰以表达编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
其中所述的被遗传修饰的链霉菌属宿主的三酰基甘油的产量与亲本链霉菌属宿主相比至少提高30％。
12.根据权利要求11所述的培养物，其中所述编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列为基因sco5888，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
13.根据权利要求11所述的培养物，其中所述培养基包含脂肪酶抑制剂。
14.根据权利要求11所述的培养物，其中所述培养基是未灭菌的或是巴氏灭菌的。
15.根据权利要求11、12和14中任一项所述的培养物，其中所述链霉菌属物种选自玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)、生金链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、米贝链霉菌(Streptomyces milbemycinius)和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)。
16.根据权利要求15所述的培养物，其中所述链霉菌属物种选自玫瑰孢链霉菌、灰色链霉菌、白色链霉菌、波赛链霉菌、生金链霉菌和米贝链霉菌。
17.根据权利要求11、12和14中任一项所述的培养物，其中所述链霉菌属宿主被制成在生产生物活性代谢产物中存在缺陷的宿主。
18.根据权利要求17所述的培养物，其中所述生物活性代谢产物是抗生素试剂。
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