FI123960B - Menetelmä lipidin tuottamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä lipidin tuottamiseksi 5 Keksintö koskee menetelmää lipidin tai lipidiseoksen tuottamiseksi eloperäisistä raaka-aineista patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaisesti. Keksintö koskee myös menetelmällä tuotetun seoksen käyttöä lipidin tai lipidiseoksen tuottamiseen patenttivaatimuksen 17 mukaisesti ja menetelmällä tuotetun lipidin tai lipidiseoksen käyttöä biopolttoaineena patenttivaatimuksen 18 mukaisesti.

10

Tausta

Fossiilisista raaka-aineista valmistettujen liikennepolttoaineiden käyttö on tunnetusti erit-15 täin suurimittakaavaista j a kulutus j atkuvasti kasvavaa. Siten fossiilisten energialähteiden riittävyys, ympäristövaikutukset ja kestävän kehityksen näkökulma ovat aiheellisesti nousseet keskeisiksi globaalisiksi haasteiksi. Tässä viitekehyksessä uusiutuvat vaihtoehtoiset liikennepolttoaineiden raaka-aineet ovat nousseet kasvavan kiinnostuksen kohteeksi.

20 Eräs askel kohti uusiutuviin luonnonvaroihin perustuvaa polttoainetuotantoa on pyrkiä korvaamaan eloperäisillä materiaaleilla edes osittain fossiilisia raaka-aineita. Tässäkin lähestymistavassa on nähtävissä varsin vaikeasti ratkaistavia ongelmia. Suhteutettuna nykyiseen fossiilisten raaka-aineiden kulutukseen, tarvittavan eloperäisen raaka-aineen määrä on erittäin suuri, mikäli sillä halutaan korvata edes osa fossiilisista raaka-aineista. Useissa co o 25 yhteyksissä on jo voitu havaita, että yksipuolinen j a laajamittainen eloperäisen luonnonva- ό ran käyttö tai viljelyalan valtaaminen tähän tarkoitukseen voi aiheuttaa luonnon monimuo- toisuudelle ja elintarvikkeiden alkutuotannon tasapainolle vaikeasti ratkaistavia seurauksia, x Teknologisena haasteena on myös eloperäisen materiaalin muuttaminen muotoon, jossa CL.

sitä voidaan käyttää energiatehokkaasti liikennepolttoaineiden tuotantoon.

5 30 m o Erityisen otollinen raaka-ainelähde liikennepolttoaineisiin olisi eloperäinen rasva, erityises-

CM

ti triasyyliglyseroli, koska sen energiasisältö on huomattavasti esimerkiksi vastaavien hiilihydraattien tai alkoholien energiasisältöä korkeampi. Lisäksi se on tunnetuin ja suhteellisen tehokkain kemiallisin prosessein muutettavissa liikenne-polttoaineen komponentiksi, 2 kuten dieselpolttoaineeksi, biodieseliksi. Rajoittavana tekijänä on kuitenkin luonnon rasva-raaka-ainevarantojen vähäisyys. Nykyisiin luonnon rasvaresursseihin perustuen ei ole toteutettavissa kuin korkeintaan marginaalista teollista biopolttoainetuotantoa. Rasvavaranto-jen kasvattaminen edellyttää siten varsin merkittävää lisäystä rasvakasvien peltoviljelyssä.

5 Tämän kaltainen suuri peltoviljelyn tuotantosuunnan muutos rasvakasvien suuntaan vaikuttaa puolestaan varsin vahvasti elintarviketalouden tasapainoon globaaleilla markkinoilla. Tämä, vielä spekulatiivisella asteella oleva tarve, ilmenee jo tällä hetkellä voimakkaana elintarvike- ja rehuraaka-aineiden hintojen kohoamisena.

10 Luonnostaan uusiutuvien eloperäisten massojen kokonaismäärä on varsin suuri, hiili-määränä mitattuna merkittävästi suurempi kuin fossiilisen hiilen vuosittainen käyttö liikennepolttoaineena. Pääosa näistä uusiutuvista massoista, noin 60 %, koostuu kuitenkin yhdisteistä, jotka ovat vielä runsaasti happea sisältäviä ja joiden polttoarvo on siten melko alhainen.

15

Aikaisemmin tunnetun tekniikan perusteella on tiedossa, että hiilihydraattien suhteellisen alhaisen energiapitoisuuden hyödyntäminen korkeaenergisemmiksi, pelkistyneempää hiili-vetyketjua sisältäviksi yhdisteiksi on jo teoriassa ja etenkin tunnettuina kemiallisina sovellutuksina, kuten kaasutustekniikkana, erittäin energiaintensiivinen prosessi (R. Agrawal, 20 N. R. Singh, F. H. Ribeiro and W. N. Delgass 2007. "Sustainable fuel for the transportation sector", PNAS 104: 4828-4833ja WO 2006/117317), jossa kokonaishyöty suhde syötön ja saannon välille jää alhaiseksi. Vastaava perusongelma liittyy myös tunnetun tekniikan mukaisiin bioteknisiin prosesseihin, joilla hiilihydraattien sisältämiä heksoosisokereita muutetaan kor- kea-energisemmiksi yhdisteiksi. Esimerkkinä tästä on alkoholien, etenkin etanolin tuotto, co o 25 jota on kuvattu mm. julkaisuissa US 2002/0185447 , US 5637502 ja WO 03/038067.

CvJ

ό ^ Uusien teknologisten ratkaisujen tarve on edellä kuvatun perusteella suuri, etenkin sellais- co x ten ratkaisujen, joilla maapallon uusiutuvaa eloperäistä hiilihydraattivarantoa olisi mahdol-

CC

lista muuntaa korkeamman energiasisällön omaaviksi yhdisteiksi. Erityisen tärkeätä olisi o 5 30 ratkaista, miten hiilihydraatteja voitaisiin muuttaa korkeamman energiasisällön omaaviksi

iD

o yhdisteiksi, kuten rasvoiksi, jotka olisivat paremmin sovellettavissa liikennepolttoainekäyt- 00 töön tai tämän käytön raaka-aineeksi.

3

Yhteenveto 5 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tuoda uusi ratkaisu ongelmaan, miten eloperäistä biomateriaalia olisi mahdollista muuntaa korkeamman energiasisällön omaaviksi yhdisteiksi.

Erityisesti esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tuoda ratkaisu ongelmaan, miten muut-10 taa eloperäisestä biomateriaalista saatavat hiilihydraattikomponentit biodieseltuotantoon soveltuvaksi lipidiksi.

Täsmällisemmin sanottuna esillä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosissa.

15

Keksinnön mukaiselle käytölle on puolestaan tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksessa 17 ja 18.

Esillä oleva keksintö perustuu havaintoon, että käsiteltäessä biomassaa eri tavoin selluloo- 20 sa- ja hemiselluloosajakeiden talteenottamiseksi, kyseisiin jakeisiin ilmestyi mikro- organismikasvustoa sitä nopeammin, mitä pidemmälle selluloosa-ja hemiselluloosajakeet olivat pilkkoutuneet. Yllättäen kävi ilmi, että edellä kuvatuissa hiilihydraattijakeissa kasvoi myös mikro-organismeja, joilla oli ATP-sitraattilyaasientsyymi (EC 2.3.3.8, aikaisemmin EC 4.1.3.8), jonka avulla organismit keräsivät soluihinsa lipidiä, erityisesti triasyyliglyse-co o 25 rolia. Näiden havaintojen pohjalta syntyi keksintö käsitellä biomateriaalia siten, että sen ö sisältämä selluloosa ja hemiselluloosa erottuvat muusta biomateriaalista ja hydrolysoituvat -r- siten, että hydrolyysituotteet soveltuvat lipidiä keräävien mikro-organismien kasvattami- co x seen ja lipidintuottoon j a käyttää näin muodostunutta lipidiä biodieselin valmistuksen raa-

CL

ka-aineena.

o ra 30

LO

o Eri lähteistä peräisin olevasta eloperäisestä raaka-aineesta voidaan keksinnön kuvauksen ^ mukaisesti tuottaa lipidiä syntetisoivien mikro-organismien hyödynnettäviksi soveltuvia hiilihydraatteja, ja/tai voidaan tuottaa hiilihydraattijakeita, joista voidaan tuottaa lipidiä mikro-organismien avulla. Tällaisia hiilihydraatteja saadaan esillä olevan keksinnön 4 mukaisesti tuotettua etenkin sellaisista biomateriaaleista, jotka sisältävät hemiselluloosaa, selluloosaa, tärkkelystä tai ei-tärkkelyspolysakkarideja. Mikro-organismien hyödynnettäviksi soveltuvia hiilihydraatteja ovat erityisesti mono-ja oligosakkaridit, jotka käsittävät sekä heksoosi-, että pentoosisokereita. Hiilihydraatit voivat olla myös polymeerisissä muo-5 doissa, jos lipidiä tuottava mikro-organismi on valittu siten, että se kykenee käyttämään hiilihy draattipoly meerej ä.

Puuaines eri muodoissaan käsittää uusiutuvan biomassan suurimman varannon. Puun käyttö, erityisesti sen mekaaninen, termomekaaninen käsittely tai muu puusta tapahtuva 10 mekaanisen massan valmistus tai tuotto, on laajamittakaavaista ja prosessina runsaasti hiilihy draattipitoista sivuvirtaa tuottavaa. Näille puunjalostusteollisuuden sivujakeille on löydetty vain vähäistä taloudellista lisäarvoa ja useissa yhteyksissä ne aiheuttavat kustannuksia, koska niiden aikaansaama ympäristökuormitus pitää eliminoida. Teknologisena haasteena tämän kaltaiset sivuvirrat ovat erityisen ongelmallisia. Sivuvirrat ovat tilavuudeltaan 15 suuria, mutta niiden hiilihydraattipitoisuus on tyypillisesti alhainen. Laimeina vesipohjaisina hiilihydraattiliuoksina ne soveltuvat heikosti prosesseihin, jotka tähtäävät liuoksessa olevien hiilihydraattien hyödyntämiseen kemiallisin keinoin.

Niinpä esillä olevan keksinnön tarkoituksena on myös tuoda ratkaisu ongelmaan, miten 20 voidaan käyttää hyväksi suurimittakaavaiset teolliset biomateriaalia sisältävät sivuvirrat, jotka nykyisellään edellyttävät kustannuksia vaativia puhdistustoimenpiteitä tai jäävät nykyisin prosessein kokonaan hyödyntämättä, mutta joissa kuitenkin on potentiaalia energianlähteenä.

co o 25 Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä käsitellään eloperäistä lähtöainetta, ö joka sisältää selluloosaa, hemiselluloosaa, näitä molempia, näiden seosta tai näiden pilk- ^ koutumistuotteita tai valinnaisesti näihin materiaaleihin kytkeytynyttä tärkkelystä tai ei- x tärkkelyshiilihydraattia. Lähtöaine voi olla esikäsitelty mekaanisesti, termomekaanisesti,

CL

fysikaalisesti, kemiallisesti, biologisesti tai näiden käsittelyjen yhdistelmillä tai se voi sora 30 veltua käytettäväksi sellaisenaan. Sen sisältäessä hiilihydraatteja polymeerisessä muodos- o sa, sitä edullisesti käsitellään vedellä tai hapon tai emäksen vesiliuoksella tai näiden yhdis-

C\J

telmillä. Näiden esillä olevan kuvauksen mukaisten alkukäsittelyjen jälkeen seos jaetaan suodokseen ja kiintoainekseen eli sakkaan (kuvio 1) ja suodos tai kummatkin jakeet ote- 5 taan talteen. Lähtöaineen vedellä tai hapon ja emäksen vesiliuoksella tai näiden yhdistelmillä tapahtuva käsittely on edullista uusia ja yhdistää suodoksia keskenään sakan erotuksen jälkeen. Emästä sisältävässä käsittelyssä saatava suodos, joko sellaisenaan tai edellä kuvatun kierrätyksen jälkeen, on edullista johtaa seokseen, jossa suoritetaan lähtöai-5 neen happokäsittely liukoisen monosakkaridin määrän kasvattamiseksi. Mitä tahansa näissä käsittelyissä syntyvää suodosta, tai lähtöainetta sellaisenaan, tai lähtöaineen ja suodok-sen tai suodosten yhdistelmiä käytetään mahdollisten esikäsittelyjen, kuten neutraloinnein, värinpoiston ja suodatuksen jälkeen yksisolulipidin tuottamiseen. Suodoksia voidaan myös yhdistellä, laimentaa tai väkevöidä sopivan monosakkaridipitoisuuden ja koostumuksen 10 saavuttamiseksi yksisolulipidiä tuottaville mikro-organismeille.

Kustakin lähtöaineen käsittelyvaihtoehdosta syntyy koostumukseltaan vaihteleva sakka riippuen siitä, suoritetaanko käsittely vedellä, happoliuoksella vai emäsliuoksella. Sakat voidaan haluttaessa johtaa mekaaniseen jauhatukseen, josta saadaan uudelleen suodos ja 15 sakka. Suodosta käytetään yksisolulipidin tuottamiseen ja sakkaa käsitellään haluttaessa edullisesti vahvalla hapolla. Happokäsittelyn tuloksena syntyy uudelleen suodos, joka voidaan johtaa yksisolulipidin tuotantoon. Sakka voidaan vielä käsitellä happamissa olosuhteissa jauhamalla. Tämän käsittelyn tuloksena syntyvää suodosta käytetään yksisolulipidin tuottamiseen ja sakka poistetaan ja edullisesti poltetaan tai käytetään biopolttoaineen tai 20 sen esiasteen tuotantoon muilla menetelmillä. Kutakin suodosjaetta tai lähtöainetta voidaan käyttää sellaisenaan tai eri yhdistelminä yksisolulipidin tuottamiseksi. Edellä kuvatuista menetelmävaiheista saatuja sakkoja voi käsitellä uudelleen esillä olevassa kuvauksessa esitettyjen aiempien tai myöhempien menetelmävaiheiden avulla.

co o 25 Kuvauksen mukainen menetelmä tuo ratkaisun ongelmaan, miten biomassan hiilihydraatti- ό en sisältämiä heksoosi- ja pentoosimonosakkarideja voidaan saattaa asteittain pienempiin, runsaammin monomeerisiä sokeriyksiköitä sisältäviin jakeisiin, joita lipidiä syntetisoivat x mikro-organismit voivat tehokkaammin hyödyntää lipidin tuottamiseksi. Minkä tahansa

CL

prosessivaiheen yhteydessä, jossa liukenematon aines erotetaan liukoisesta aineksesta, sara 30 kasta, ja jossa siten syntyy suodos, suodoksen sisältämää heksoosi- ja pentoosisokeria voi- o daan käyttää yksisolulipidin tuottamiseen sellaisenaan tai tarvittavien esikäsittelyjen jäi-

CVJ

keen suodosten seoksina yksisolulipidin tuottoon.

6

Keksinnön kokonaisvaltaisena etuna on, että siinä voidaan soveltaa yksinkertaisia ja jo teollisessa käytössä olevia prosesseja ja yksikköoperaatioita energiatehokkaasti ja ympäristöystävällisesti tuottamaan energiarikasta kemiallista yhdistettä, lipidiä, biologista alkuperää olevista vähemmän energiaa sisältävistä yhdisteistä, kuten 5 heksoosi- ja pentoosimonosakkarideista tai näiden muodostamista oligomeereistä sekä edellisten seoksista.

Menetelmän hyödynnettävyys korostuu erityisesti siten, että siinä muodostuvat käymiskelpoiset sokerit, joko sellaisenaan tai osittain, ovat luontaisesti mikrobiologisesti 10 käytettävissä myös muiden yhdisteiden, kuten alkoholien tuottamiseen.

Keksinnön erityisenä etuna on, että se soveltuu paitsi puun mekaanisen ja termo-mekaa-nisen käsittelyn sivu- tai päävirtojen hyödyntämiseen myös muiden hiilihydraatteja vapauttavien biomateriaalien hyödyntämiseen lipidin tuottamiseksi.

15

Keksintö koskee myös menetelmää lipidin tai lipidiseoksen muodostamiseksi seoksesta, joka on menetelmän mukaisesti syntynyt kierrättämällä termomekaanisessa käsittelystä syntynyttä kuitua uudelleen emäs- tai happokäsittelyillä.

20 Muita eloperäisiä ja laajamittaisesti vaikeasti hyödynnettäviä raaka-aineita, joita voidaan käsitellä esillä olevan kuvauksen mukaisesti heksoosi- ja pentoosisokereiksi tai näiden muodokstamiksi oligomeereiksi ja näistä mikro-organismien avulla lipidiksi, ovat kierrä- tyskuitu, jota saadaan esimerkiksi sanomalehtipaperin kierrätyksestä, sokeri-juurikkaista saatava juurikasleike ja viljojen, esimerkiksi kauran, akanat ja korret, ja muu samankaltai-co o 25 nen peltoviljelykasvien vähempiarvoinen osa, sahanpuru, hierre, olki ja turve, etenkin vä- ό häisesti maatunut turve. Muita tähän mennessä lähes kokonaan hyödyntämättä jääneitä i eloperäisiä materiaaleja ovat soistunut tai vedenalainen bio-massa, biomassa sellutehtaan x laskeumavesialueilta j a aktiivilietelaitoksiin menevä biomassa yhdyskuntaj ätevedestä tai

CL

kaatopaikalle tai polttoon menevä muu eloperäinen yhdyskuntajäte. Myös näitä eloperäisiä cö 30 materiaaleja voidaan käsitellä menetelmän eri suoritusmuotoja vaihdellen siten, että näiden o materiaalien sisältämät hiilihydraatit saadaan käyttökelpoisiksi mikro-organismeille yk- C\] sisolubiomassanja -lipidin tuottamiseksi. Esimerkiksi yhdyskuntajätevettä voitaisiin käsitellä esillä olevan menetelmän avulla, jolloin etuna mm. olisi se, että haitalliset mikrobit kuolisivat käsittelyssä.

7

Esillä olevassa keksinnössä keskeistä on, että hiilihydraatteja sisältävää biomateriaalia, riippumatta sitä, mistä eloperäisestä aineksesta se on peräisin, käsitellään siten, että hiilihydraateista saadaan monomeerisiä heksoosi- ja pentoosisokereita tai niiden oligomeerejä, 5 jotka soveltuvat yksisolulipidin tuotantoon.

Esillä olevan keksinnön varsin merkittävä etu on se, että keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan biopolttoaineiden suurtuotannon tarpeiden mittasuhteisiin ovat käyttökelpoisia lipidiä tuottavien mikro-organismien solumassan ja lipidin tuotannossa.

10

Olemassa olevaan tekniikan tasoon nähden nyt kuvattava keksintö taijoaa läpimurto-tekniikan, jossa yhdistyy sekä selluloosaa että hemiselluloosaa sisältävien biomateriaalien muuttaminen käymiskelpoisiksi heksoosi- ja pentoosi sokereiksi. Keksintö mahdollistaa samoin suoritusmuodoin myös näiden biomateriaalien sisältämien tärkkelyksen ja ei-15 tärkkelyspolysakkaridien monosakkaridiyksikköjen hyödyntämisen käymiskelpoisiksi sokereiksi yksisolulipidien tuottamiseen. Keksintö on erityisesti toteutettavissa siten, että sitä voidaan soveltaa teollisessa mittakaavassa materiaaleihin, jotka ovat alkuperältään uusiutuvaa luonnonvaraa tai näiden vähempiarvoisia sivuvirtoja, jotka ovat syntyneet teollisuuden tai yhdyskuntien toimesta. Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan 20 käsitellä hallitusti selluloosaa ja hemiselluloosaa sisältävää materiaalia siten, että niitä muodostuu yksisolulipidien esiasteita, joita voidaan käyttää turvallisten mikro-organismien toimesta yksisolulipidien tuotantoon.

Seuraavaksi keksintöä kuvataan tarkemmin oheisten piirustusten ja yksityiskohtaisen seli-δ 25 tyksen avulla.

CvJ J

ό δ

X

X

Q.

o δ m o o

CvJ

8

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuviossa 1 on kuvattu keksinnön mukaisen menetelmän pääsuoritusvaiheet.

Kuviossa 2 on kuvattu heksoosi-ja pentoorisokereiden käyttö sellaisenaan tai yhdistelminä 5 solumassan ja lipidin tuottoon.

Kuviossa 3 on kuvattu hiivojen kasvua ja lipidin tuottoa kasvatusalustalla, johon oli lisätty hiililähteeksi ja lipidin tuottamiseksi akanasta alkaalisella käsittelyllä ja siitä saa saadun suodoksen 10 % happohydrolyysillä syntynyttä seosta.

Kuviossa 4 on kuvattu hiivojen kasvua kasvatusalaustalla, johon oli lisätty kaupallisesti 10 hankittua pentoosisokeria hiilenlähteeksi.

Menetelmän yksityiskohtainen kuvaus 15 Hiilihydraateilla” tarkoitetaan orgaanisia molekyylejä, joihin sisältyy aldehydi-, happo- tai ketoryhmä ja näiden lisäksi useita hydroksyyliryhmiä. Hiilihydraattien piiriin kuuluvat siten yhdisteet, joita kuvataan termeillä monosakkaridi, oligosakkaridi, polysakkaridit, sokeri, selluloosa, hemiselluloosa, tärkkelys ja ei-tärkkelyshiilihydraatti.

20 ’’Selluloosa” on pitkäketjuinen polysakkaridi, jonka primäärirakenne koostuu glukoosin β-1-4-sidoksilla muodostuneesta polymeeristä.

co g ’’Tärkkelys” on pitkäketj uinen polysakkaridi, joka koostuu pääasiassa a-1-4-ja a-1-6 glu- c\j & koosiyksiköistä.

Z 25 co x ”Ei-tärkkelyspolysakkaridilla tarkoitetaan hiilihydraattia, j oka molekyylin rakenteessa

CC

tärkkelykselle tyypilliset α-Ι-4-sidokset puuttuvat tai ovat harvinaisia. Ei-tärkkelys-o cö polysakkaridi on esimerkiksi inuliini tai arabikumi.

m o o 30 ’’Käyttökelpoisella sokerilla” tarkoitetaan tässä sokereita, joilla mikro-organismit kykenevät lisääntymään ja joista lipidiä ja alkoholeja tuottavat mikro-organismit kykenevät tuottamaan lipidiä tai alkoholeja.

9 ”Hemiselluloosa” tarkoittaa yhdisteryhmää, joka koostuu useista eri heksoosi- ja pen-toosiokereista, kuten galaktoosista, mannoosista, glukoosista, ksyloosista ja arabinoosista.

5 ’’Monosakkaridi” on hiilihydraattien monomeerinen yksikkö, (C-H20)n, joka tyypillisesti koostuu 3 - 9:stä hiiliatomista ja jolla on stereokemiallisia eroavuuksia yhdessä tai useammassa hiiliatomissa. Näitä ovat heksoosit, kuten glukoosi, galaktoosi, mannoosi, fruktoosi, joissa on 6 hiiliatomia ja pentoosit, kuten ksyloosi, riboosi ja arabinoosi, joissa on 5 hiiliatomia.

10 ’Oligosakkaridilla” tarkoitetaan hiilihydraattia, joka on muodostunut kahdesta tai useammasta monosakkaridista O-glykosidisillä sidoksilla.

’’Pentoosisokerilla” tarkoitetaan viisi hiiliatomia sisältävää monosakkaridia.

15 ’’Heksoosisokerilla” tarkoitetaan kuusi hiiliatomia sisältävää monosakkaridia.

’’Hydrolyysillä” tarkoitetaan hiili-hiili-, hiili-happi-, hiili-typpi-, tai hiili-rikkisidoksen purkautumista joko veden, hapon tai emäksen vaikutuksesta riippumatta siitä, osallistuuko ve-20 si reaktioon. Entsymaattisessa hydrolyysissä vastaavat reaktiot tapahtuvat entsyymien katalysoimana. Hydrolyysi on esimerkiksi reaktio, jossa hiilihydraattien monosakkaridien välinen O-glykosidinen sidos tai proteiinien aminohappojen välinen peptidisidos purkautuu.

’’Vesi- happo- tai emäskäsittelyllä” tarkoitetaan tässä yhteydessä sitä, että eloperäistä mateet 25 riaalia joko sellaisenaan tai siitä johdettua tuotetta uutetaan, käsitellään mekaanisesti, ter- ό momekaanisesti tai suoritetaan näiden käsittelyjen yhdistelmiä veden, hapon tai emäksen i- läsnä ollessa, co 1 2 3 4 5 2

CC

3

CL

4 ’’Eloperäisellä lähtöaineella” tarkoitetaan esillä olevassa kuvauksessa mitä tahansa elävän 5 30 organismin tuottamaa orgaanista ainetta. Eloperäistä lähtöainetta kutsutaan esillä olevassa o kuvauksessa myös biomateriaaliksi.

c\j 10 ’’Peltokasvilla, tarkoitetaan kasvia, jota hyötytarkoituksessa istutetaan tai siemennetään sitä varten valmisteltuun maaperään.

Termi ’’lipidi” tarkoittaa rasva-ainetta, jonka molekyylin osana on yleensä alifaattinen hii-5 livetyketju, joka liukenee orgaanisiin liuottimiin, mutta on veteen heikkoliukoinen.

Xue et ai:n julkaisussa (”A new method for preparing raw material for biodiesel production”, Process Biochemistry 41 (2006) 1699-1702) kuvataan orgaanisten jätevesien hyödyntämistä.

10

Xu et ai:n julkaisussa (’’High quality biodiesel production from a microalga Chlorella pro-tothecoides by heterotrophic growth in fermenters”, Journal of Biotechnology, 126(4), 2006, 499-507) kuvataan levän hyödyntämistä.

15 Esillä olevassa keksinnössä mikro-organismeissa muodostuvat lipidit ovat pääosin tri- di-tai monasyyliglyseroleja, tai steroliestereitä, mutta soluissa voi myös muodostua muita lipidejä, kuten fosfolipidejä, vapaita rasvahappoja, steroleja, polyprenoleja, sfingolipidejä, glykolipidejä j a difosfatidyyliglyserolia.

20 Keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena voi olla selluloosaa, hemiselluloosaa ja mahdollisia sideaineita sisältävää biomassaa, edullisesti puumassaa, joka on syntynyt mekaanisen tai termomekaanisin menetelmin tai muilla fysikaalisilla menetelmillä tai kemiallisesti, entsymaattisesti tai mikrobiologisesti tai näiden menetelmien yhdistelmillä. Keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena voi ilman menetelmän muuntelua olla myös sellai-eo o 25 siä kasvimateriaaleja, jotka sisältävät tärkkelystä, kuten esimerkiksi peruna, sen osat, vilja- ö kasvien siemenet, vastaavasti maissi ja riisi, sokerijuurikas sekä sen lisäksi juurikasleikkeet T- niiden sisältämät ei-tärkkelyspolysakkaridit mukaan lukien. Lähtöaineeksi soveltuvat myös x kasvinosat, jotka sisältävät ei-tärkkelyspolysakkarideja, kuten β-glukaania.

CL

O

oo 30 Menetelmä soveltuu myös yksisoluorganismeista peräisin olevat hiilihydraattien, kuten r-' g alginaatin käyttöön lähtöaineena. Edellä kuvattujen lähtöaineiden koostumukseen voi kuu-

CNJ

lua myös vaihtelevia määriä proteiinia ja lipidiä, jotka voivat myös toimia lipidiä syntetisoivien mikro-organismien kasvun ja lipidin tuoton lähtöaineina.

11

Keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena voi olla myös esimerkiksi sanomalehtipaperin kierrätyksestä saatava kierrätyskuitu, juurikasleike ja viljojen, esimerkiksi kauran akanat, sahanpuru, hierre, turve ja olki. Muita keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoisia lähtöaineita ovat esimerkiksi soistunut tai vedenalainen bio-massa, biomassa sel-5 lutehtaan laskeumavesialueilta ja aktiivilietelaitoksiin menevä biomassa yhdyskuntajätevedestä tai muu biologista aineosaa sisältävä yhdyskuntajäte, jonka nykyinen käyttömuoto on polttaminen, kompostointi tai muu menetelmä, joka johtaa jätteen sisältämän hiilen kokonaisvaltaiseen vapautumiseen hiilidioksidina.

10 Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukainen menetelmä käsittää ainakin yhden vaiheen, jossa eloperäisestä materiaalista menetelmän mukaisesti saatu suodos, suodosten yhdistelmä, eloperäinen materiaali sellaisenaan tai jonkin näistä yhdistelmä, johdetaan seokseen, jossa seoksessa tapahtuu lipidin tuotanto. Menetelmän suoritus-vaihtoehto voidaan valita sen perusteella, minkälainen monosakkaridikoostumus on edullinen suodoksessa tai suo-15 dosten yhdistelmissä mikro-organismin kasvattamiseksi ja lipidin tuottamiseksi. Täten suodokset valitaan edullisesti joukosta, joka on syntynyt käsittelyillä (i) vesi, (ii) hapon vesiliuos, (iii) emäksen vesiliuos, ja 20 sen jälkeen erottamalla kuitua sisältävä sakka j a kuituvapaa suodos.

Valinnaisesti tehdään sakalle uudelleen yhden tai useamman kerran jonkin kohtien (i), (ii) tai (iii) käsittely tai käsittelyt, ja/tai valinnaisesti tehdään saadulle sakalle mekaaninen tai termomekaaninen jauhatus ja erotetaan sakka ja suodos.

S 25

(M

ö Riippuen siitä, mitä biomateriaalia käytetään ja mitä monosakkarideja halutaan, bio- ^ materiaalia käsitellään veden, hapon tai emäksen vesiliuoksen, edullisesti hapon tai x emäksen vesiliuoksen avulla. Käsittely voidaan tehdä tarvittaessa myös useampaan ker-

CL

taan. Samaa biomateriaalia voidaan käsitellä myös useammalla eri liuoksella peräkkäin oö 30 ja veteen voidaan lisätä yhdisteitä, jotka tehostavat hiilihydraattien erottamista ja hydroly- r-- o soitumista.

o C\1

Seuraavassa luettelossa ryhmässä I lueteltuja lähtöaineita voidaan käsitellä vedellä tai jos käsittelytulosta halutaan tehostaa, veden ja hapon seoksella.

12

Ryhmän II biomateriaaleja käsitellään edullisesti hapon vesiliuoksella.

Ryhmän III biomateriaaleja käsitellään edullisesti emäksen vesiliuoksella. Kun sakka ja 5 suodos on otettu talteen, suodosta voidaan käsitellä uudelleen hapolla.

Ryhmä I

puun mekaanisesta, termomekaanisesta, entsymaattisesta tai mikrobiologisesta käsittelystä tai näiden käsittelyjen yhdistelmistä tai peltokasveista peräisin oleva biomateriaali.

10

Ryhmä II

kierrätyskuitu, juurikasleike, akana, olki, lese, viljan jyvä, kokonainen peltokasvi, peltokasvi, TMP- massa, MDF-massa tai tärkkelystä tai ei-tärkkelyspolysakkarideja sisältävä lähtömateriaali 15

Ryhmä III

sahanpuru, hierre, akana, olki ja puuvartiset kasvinosat, TMP-massa, MDF-massa, juurikasleike, peltokasvi, joka voi sisältää vaihtelevia määriä tärkkelystä.

20 Käsittelyjä voidaan tehostaa lisäämällä esimerkiksi yhtä tai useampaa entsyymiä käsittely-liuokseen, edullisesti vedellä tehtävään käsittelyliuokseen.

Seuraavassa vaiheessa saatetaan lipidiä tuottava mikro-organismi kosketuksiin minkä ta-hansa suodoksista tai niiden yhdistelmän kanssa kasvatusalustalla ja annetaan mikro-o 25 organismisoluj en tuottaa lipidiä, j a otetaan lipidit talteen.

ό ^ Biomateriaalin edellä kuvatuista käsittelyvaiheista saatavaa kuitua sisältävää sakkaa voi- x daan käsitellä lisäksi menetelmällä, jossa jauhetaan kuitua sisältävää sakkaa mekaanisesti j a erotetaan kuitua sisältävä sakka ja kuituvapaa suodos.

δ 30 m o Tämän lisäksi mekaanisesta jauhatuksesta saatua kuitua sisältävää sakkaa voidaan käsitellä

C\J

vahvalla hapolla ja erottaa kuitua sisältävä sakka ja kuituvapaa suodos.

13

Happokäsittelyn jälkeen sakka voidaan kierrättää uudelleen myös takaisin mekaaniseen jauhatukseen.

Tämän lisäksi biomateriaalia voidaan hapottaa ja jauhaa mekaanisesti tai termo-5 mekaanisesti ja erottaa kuitua sisältävä sakka ja kuituvapaa suodos.

Mistä tahansa edellä kuvatuista käsittelyistä saatavaa suodosta voidaan lisätä lipidiä tuottavien mikro-organismien kasvatusalustaan.

10 Sokerien kokonaismäärä suodoksissa on tyypillisesti 0,5 - 10 p-%. Näistä biomassan ja lipidintuotannossa käyttökelpoisia sokereita on tyypillisesti vähintään 0, 5 p-%, edullisesti vähintään 3 p-%, edullisemmin 4-5 p-%. Esimerkiksi biomateriaalin jauhamisen ja uudelleen uuttamisen avulla sokereita voidaan irrottaa biomateriaalista lisääjä näin saadaan nostettua sokereiden määrä edullisemmalle tasolle. Sokerien määrä on edullisesti kuitenkin 15 alle 30 p-%, edullisemmin alle 20 p-%.

Lähtöaine sisältää mikro-organismien biomassan ja lipidintuotannossa käyttökelpoisia sokereita vähintään 0,5 - 1 p-%, enintään 20 - 30 p-%, edullisesti 4-5 p-%.

20 Lipidiä tuottamaan kykeneviä mikro-organismeja voidaan kasvattaa siten, että ne tuottavat ensin biomassaa ja sitten lipidiä tai yhtä aikaa sekä biomassaa että lipidiä.

Biomateriaalin alkuperästä ja siihen kohdistetusta käsittelytavasta riippuen (vesi-, happo-, emäskäsittely) voidaan saada heksoosimonosakkarideja, pentoosimonosakkarideja tai mo-co o 25 lempiä erilaisissa suhteissa kuten on esitetty kuviossa 2. Joistain biomateriaaleista voidaan ό saada pääasiassa heksoosisokereita, toisista taas pääasiassa pentoosisokereita. Valitsemalla lipidiä tuottamaan kykenevä mikro-organismi sopivasti, pääasiassa heksoosi sokereita sisäl-x tävää suodosta voidaan käyttää solumassan tuottamiseen ja sen jälkeen pääasiassa pen- toosisokereita sisältävää suodosta lipidin tuottamiseen solumassaan. Vaihtoehtoisesti lipi-ra 30 deitä voidaan tuottaa solumassaan heksooseista. Solumassaa ja lipideitä voidaan tuottaa o heksooseista. Vastaavasti valitsemalla lipidiä tuottamaan kykenevä mikro-organismi sopi- c\] vasti, pääasiassa pentoosisokereita sisältävää suodosta voidaan käyttää solumassan tuottamiseen ja sen jälkeen pääasiassa heksoosi sokereita sisältävää suodosta lipidin tuottamiseen solumassaan. Vaihtoehtoisesti lipideitä voidaan tuottaa solumassaan pentooseista tai solu- 14 massaa ja lipideitä voidaan tuottaa pentooseista. Sekä solumassaa että lipideitä voidaan tuottaa myös pentoosien ja heksoosien seoksesta.

5 Biomateriaalin käsittely

Biomateriaalia käsitellään keksinnön edullisten suoritusmuotojen mukaisesti tyypillisesti seuraavalla tavalla: 10 Lähtöaine uutetaan edullisesti 90 - 100°C lämpötilassa. Happouuton edullinen toteutus-muoto on käyttää 5 - 10 % mineraalihappoa, kuten rikkihappoa, tai orgaanista happoa, kuten sitruunahappo tai etikkahappo, ja emäsuutossa edullisesti 0.5 - 2.0 M NaOH:a. Käsittelyaika voi vaihdella laajoissa rajoissa, edullisesti se on 1 - 10 tuntia, tyypillisesti 2-8 tuntia, sopivimmin 2-4 tuntia. Vesiuuttoon voidaan edullisesti yhdistää muitakin käsittelyjä, 15 kuten käsittelyt entsyymeillä, mikro-organismeilla, hapettavilla tai pelkistävillä kemikaaleilla tai näiden käsittelyjen yhdistelmillä.

Uutossa syntyvää sakkaa voidaan jauhaa menetelmän mukaan mekaanisesti edullisesti 100-210 °C, tyypillisesti 150 - 200 °C lämpötilassa, edullisesti 2-20 minuuttia, tyypilli-20 sesti 5-11 minuuttia. Paine on edullisesti 6-8-bar. Syntynyt massa suodatetaan, suodos käsitellään yllä kuvatulla tavalla yksisolulipidin tuottoon soveltuvaksi.

Sakka voidaan johtaa happokäsittelyyn vahvalla hapolla, joka on edullisesti käsittely 40-72 % rikkihapolla, sopivasti 65 - 70 % rikkihapolla. Normaalisti käsittelyaika on o 25 2 - 8 tuntia, edullisesti 2-4 tuntia. Menetelmä on toteutettavissa millä tahansa hapolla, o jolla saadaan aikaan protonikatalyyttinen hydrolyysi. Sopivia happoja ovat esimerkiksi vahvat mineraalihapot, forforihappo, rikkihappo tai rikin, typen, kloorin, bromin ja jodin g happihapot.

CL

O

g 30 Hydrolyysitulos jaetaan suodokseen, joka käsitellään yksisolulipidin tuottoon soveltuvaksi r».

§ ja sakka voidaan johtaa laimeaan happoliuokseen, edullisesti 5 - 10 % rikkihappoliuokseen c\j ja suorittaa jauhatus 170 - 200 °C lämpötilassa ja 6-10 bar paineessa, 10-20 minuuttia.

15

Seos jaetaan suodokseen ja sakkaan, joista edellistä käsitellään yksisolulipidin tuottoon soveltuvaksi ja sakka voidaan poistaa.

Menetelmän edellä kuvattu suoritusmuoto tähtää lähtömateriaalissa olevan hiili-hydraatin 5 kokonaiskäyttöön yksisolulipidin tuottamiseen. Menetelmää voidaan kuitenkin lähtömateriaalin uuttamistavasta lähtien toteuttaa myös vain valituilta osin, esimerkiksi haluttaessa käyttää sakan kuitumateriaalia myös muihin tarkoituksiin. Keksinnön mukaiselle menetelmälle tunnusomaista on, että se edullisesti käsittää edellä kuvatut vaiheet kokonaisuudessaan, mutta ei rajoitu menetelmän osan tai osien suorittamisesta perusmenetelmästä poik-10 keavassa laajuudessa tai yksikköoperaatiojärjestyksessä ja näiden operaatioiden tuottamien monosakkaridijakeiden käyttämiseksi yksisolulipidin tuottamiseen. Kuvauksen mukaiseen menetelmään voidaan liittää myös prosessivaihe, jossa lähtöaineesta saatuja monosakkari-dia sisältäviä jakeita käytetään lipidin tuottamisen lisäksi yksisolubiomassan tai etanolin tuottamiseen.

15

Seuraavassa kuvauksessa esitetään joitain keksinnön edullisten suoritusmuotojen mukaisia menetelmiä. Samoja menetelmiä voidaan soveltaa myös muille kuin kuvauksessa esitetyille raaka-aineille.

20 I.

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti puukuituja, joka käsittää jauhettua puuta, TMP-massaa, sahajauhoa tai hioketta ja käsitellään seuraavien osavaiheiden mukaisesti: $2 A. 100 g puukuitua uutetaan litrassa vettä 90-100 ° C 2- 4 tunnin ajan, edullisesti 2 o ^ 25 tuntia. Suodatetaan sakka eroon liuoksesta ja liuos otetaan talteen. Hiilihydraat- o V tisaanto liuoksessa vaihtelee 2-5 %:n välillä puukuitujen valmistustavasta riippu- 00 en, ollen korkean käsittelylämpötilan (yli 170 ° C) TMP kuidulle tyypillisesti 4-5 £ %. o 2} B. Hiilihydraatti saannon lisäämiseksi kuitujaetta hydrolysoidaan litrassa 5-10 % N- o 30 happoa (edullisesti 5 %), pH noin 1 (esim. mineraalihappoa), 90 - 100 0 C lämpöti-

C\J

lassa 2-4 tunnin ajan, edullisesti 2 tuntia. Jäljellejäänyt sakka erotetaan liuoksesta, liuos otetaan talteen.

16 C. Sakasta edullisesti valutetaan ylimääräinen happo pois ja jauhetaan uudestaan kui-duttimessa (esim. siipi- tai levyjauhain). Sakan lämpötilaa on edullista nostaa esi-höyryttämällä yhden minuutin ajan ja säilyttää lauhde seoksessa. Nostetaan lämpötilaa 150 - 200 0 C, edullisesti 170 0 C paineen ollessa 6-8 baaria (siipijauhain).

5 Jauhamisaika valitaan puun mukaan 2 ja 15 minuutin väliltä. Suodatetaan sakka eroon liuoksesta ja liuos otetaan talteen.

D. Sakkajakeeseen lisätään vahvaa, 40 - 72 % happoa (rikkihappo), annetaan imeytyä 2-4 tunnin ajan, edullisesti 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Valutetaan ylimääräinen happo pois ja sakka jauhetaan uudestaan kuiduttimessa (esim. siipi- tai levyjau- 10 hain). Sakan lämpötilaa on edullista nostaa esihöyryttämällä minuutin ajan laske matta sen jälkeen lauhdetta pois. Nostetaan lämpötila 150 - 200 0 C, edullisesti 170 0 C paineen ollessa 6 - 8baaria (siipijauhain). Jauhamisaika valitaan puun mukaan 2 - 15 minuutin väliltä. Seos suodatetaan, sakka erotetaan liuoksesta. Liuos otetaan talteen ja sakka käytetään polttoaineeksi.

15

Mistä tahansa osavaiheista A-D saatavaa liuosjaetta voidaan jatkokäsitellä värin-poistomenetelmillä, pH:n säädöin ja muilla mikro-organismin kasvua edistävillä toimenpiteillä, kuten vettä poistamalla, käyttää näin saatuja liuoksia mikro-organismin kasvualustassa 20 ja sallia mikro-organismin tuottaa lipidiä. Lähtöaineeksi käytetystä kuidusta saadaan osavaiheiden A-D yhdistelmällä 40 - 65 % alkuperäisestä puukuitumateriaalista liukoiseen muotoon. Liuenneet hiilihydraatit käsittävät glukoosi-, galaktoosi-, mannoosi-, ksyloosi- ja arabinoosiyksiköitä, näiden keskinäisten osuuksien ollessa käytetylle puulajille ” tyypillisiä, o ™ 25 o ” II.

X

£ Keksinnön erään toisen edullisen suoritusmuodon mukaisesti otetaan 100 g puukuituja, ° jauhettua puuta, kierrätyskuitua, TMP-massaa, sahajauhoa tai hioketta, uutetaan litrassa 4- oo 30 8 % alkaliliuosta, edullisesti 1 M NaOH:a lämpötilassa 90-100 C° 2- 4 tunnin ajan, edulli- o £j sesti 3 tuntia. Suodatetaan sakka eroon liuoksesta huoneenlämpötilassa ja kummatkin ja- keet otetaan talteen. Hiilihydraattisaanto liuoksessa on lähtöaineiden kuitujen käsittelystä riippuen välillä 5 - 8 %. Tätä liuosta on edullista käsitellä jollakin seuraavista osavaiheista: 17 A. Uuttoliuosta käytetään sellaisenaan uudelleen seuraavan kuituerän uuttamiseen edellä kuvatulla tavalla ja liuos otetaan talteen.

5 B. Uuttoliuos happohydrolysoidaan jonkun edellisen suoritusmuodon kohtien B-D mukai sesti siihen liuenneiden ligniinin ja oligo-ja polysakkaridien käsittelemiseksi.

C. Kohdan A mukaisesti kierrätetty uuttoliuos käytetään suoritusmuodon I kohdan B mukaisesti.

10

Emäskäsittelyssä talteen otettu sakka on edullista käsitellä monosakkaridisaannon lisäämiseksi jollakin seuraavilla menetelmillä tai niiden yhdistelmillä: D. Sakka käsitellään edellisen suoritusmuodon I jonkun kohtien B, C, D tai näiden 15 kaikkien mukaisesti. Seos suodatetaan, liuos neutraloidaan ja sekä sakka että liuos ote taan talteen.

E. Suoritusmuodon II kohdasta A jäljelle jäänyttä sakkaa käsitellään uudelleen emäksellä, edullisesti olosuhteissa, joissa seosta jauhetaan 2 -8 minuutin, edullisesti 6 mi- 20 nuutin ajan 4-10 barin, edullisesti 8 baarin paineessa, lämpötilan ollessa 170 C°. Suodatetaan, liuos neutraloidaan ja otetaan talteen. Tällä lisäjauhatuksella voidaan liukenevan materiaalin määrä nostaa 27 % iin alkuperäisestä lähtöaineen kuitujen määrästä.

Kustakin osavaiheesta A - E syntynyt hiilihydraattipitoinen liuos, joka käsittää glukoosi-,

CO

0 25 galaktoosi-, mannoosi-, ksyloosi- ja arabinoosiyksiköitä käsitellään mikro-organismien li- ό pidituotolle soveltuvaan muotoon esimerkiksi värinpoistolla, pH:n säädöllä tai poistamalla ^ liuoksesta vettä ja käytetään mikro-organismin kasvatusalustana tai sen osana ja sallitaan 1 mikro-organismin tuottaa lipidiä.

CL

O

ra 30

LO

o m.

o CM .....

Keksinnön erään kolmannen edullisen suoritusmuodon mukaisesti otetaan puukuituja, jauhettua puuta, TMP-massaa, sahajauhoa, hioketta, kierrätyskuituja (tai neutraloitua uutetta edellä kuvatun kohdan B mukaisesti valmistettuna), hydrolysoidaan 5- 10 % väkevyisellä 18 hapolla (edullisesti 5%), lisäämällä kyseistä happoa (esim. Mineraali-happoa) 1 litra 100 g hydrolysoitavaa materiaalia kohti, pH:ssa noin 1, käyttämällä 90-100 °C lämpötilaa 2- 4 tunnin ajan, edullisesti 2 tuntia. Suodatetaan sakka eroon liuok-sesta. Hiilihydraatteja oli liuoksessa 4 -14 % lähtöaineen kuitujen määrästä laskettuna. Sakka voidaan käyttää kuitui-5 na tai jatkokäsitellä monosakkaridisaannon lisäämiseksi edellä esitetyn ensimmäisen suori tusmuodon kohtien C tai D tai molempien mukaisesti. Liuos erotetaan sakasta, neutraloidaan, suodatetaan ja käytetään joko sellaisenaan tai väkevöitynä mikro-organismin kasvualustaan tai sen osaksi ja sallitaan mikro-organismin tuottaa lipidiä.

10 IV.

Keksinnön erään neljännen edullisen suoritusmuodon mukaisesti otetaan 100 g puu-kuituja, jauhettua puuta, TMP-massaa, sahajauhoa, hioketta tai suoritusmuodon I kohdista A - C tai suoritusmuodon II kohdasta A jäänyttä sakkaa, lisätään 5- 10 % happoa pH noin 15 1 (esim. mineraalihappoa) annetaan imeytä 2- 4 tunnin ajan edullisesti 2 tuntia. Valutetaan ylimääräinen happo pois ja sakka jauhetaan uudestaan kuiduttimessa (esim. siipi- tai levy-jauhin). Sakan lämpötilaa edullisesti nostetaan esihöyryttämällä minuutin ajan, eikä lauh-detta lasketa pois. Nostetaan lämpötila 150- 200 °C edullisesti 170 °C paineen ollessa 6-8 baaria (siipijauhin). Jauhamisaika valitaan puun mukaan 2- 15 minuutin väliltä. Suodate-20 taan sakka eroon liuoksesta. Jäännössakka voidaan käyttää polttoaineena tai jauhaa uudestaan edellä kuvatulla tavalla monosakkaridisaannon lisäämiseksi liuoksessa. Liuos neutraloidaan, suodatetaan ja käytetään sellaisenaan tai väkevöitynä ja käytetään suoritusmuotojen I - III kuvaamalla tavalla.

co δ 25 c\j ό V.

Keksinnön erään viidennen edullisen suoritusmuodon mukaisesti otetaan 100 g puukuituja, x jauhettua puuta, TMP-massaa, sahajauhoa, hioketta tai jotakin suoritus-muotojen I-IV mu- kaista jäännössakkaa, lisätään vahvaa 40- 72 % happoa (esim. rikkihappo) annetaan imey-δ 30 tyä 2- 4 tunnin ajan, edullisesti 2 tuntia huoneen lämpö-tilassa. Valutetaan ylimääräinen o happo pois ja sakka jauhetaan uudestaan kuiduttimessa (esim. siipi- tai levyjauhin). Sakan

C\J

lämpötilaa voidaan nostaa esihöyryttämällä minuu-tin ajan, eikä lauhdetta lasketa pois. Nostetaan lämpötila 150- 200 0 C edullisesti 170 0 C paineen ollessa 6-8 baaria (siipijauhin). Jauhamisaika valitaan puun mukaan 2-15 minuutin väliltä. Hiilihydraatti seos suo 19 datetaan ja sakka erotetaan liuoksesta. Lähtöaineena käytetystä sakasta liukenevan aineksen osuus on välillä 40-65 %. Jäännössakka voidaan käyttää polttoaineena tai jauhaa uudestaan monosakkaridi-saannon lisäämiseksi. Liuos neutraloidaan ja suodatetaan ja käsitellään jonkin suoritusmuodon I-IV mukaisesti.

5

Vaihtoehtoisesti sakkaan imeytetään huoneen lämpötilassa väkevää rikkihappoa 40 - 72 % 1-3 tunnin ajan edullisesti 1,5 tuntia. Tämän jälkeen happo laimennetaan 5 %:seksi ja keitetään normaalipaineessa 4 tuntia 100 0 C:ssa. Jatkokäsittely kuten edellä.

10

Lipidien tuotto mikro-organismien avulla

Esillä oleva keksintö mahdollistaa eri osavaiheiden tuottamat suodokset yhdistämällä lähtöaineen sisältämän hiilihydraatin sekä heksoosi- että pentoosimonosakkaridien 15 kokonaisvaltaisen käytön lipidiksi ja yksisolumassaksi mikrobiologisella prosesseilla. Kutakin talteen otettua suodosta voidaan esikäsittelyin, kuten pesun, neutraloinnin, värinpoiston tai muun jälkikäsittelytoimenpiteen jälkeen, käyttää sellaisenaan tai valinnaisesti yhdistettynä eri vesipitoisiin jakeisiin yksisolulipidin tuottamiseen. Keksintöön kuuluvan lähtöaineen käsittelytavoista johtuen keksintöä voidaan soveltaa myös etanolin tuot-20 tamiseen.

Suodos eli vesipitoinen jae, tai mikä tahansa suodosten yhdistelmä, lisätään mikro-organismin kasvualustalle, johon on tai johon siirrostetaan mikro-organismia ja annetaan mikro-organismin tuottaa lipidiä. Lipidi otetaan talteen mikro-organismi-massana tai lipidi 0 25 erotetaan kyseisestä massasta ja lipidi sekä siitä erotettu mikro-organismimassa otetaan ό talteen. Lipidit voidaan ottaa talteen tunnetuilla menetelmillä joko erottamalla ne soluista tai rikkomalla solut. Lipidi voidaan uuttaa solumurskeesta orgaanisella liuottimella. Kek- 1 sintöön soveltuvia lipidin talteenottomenetelmiä kuvataan esimerkiksi Z. Jacobin julkai-

CL

sussa: Yeast Lipids: Extraction, Quality Analysis, and Acceptability, Critical Reviews in oo 30 Biotechnology, 12(5/6); 463-491 (1992). Eräs edullinen menetelmä lipidien talteen ottami- o seksi on faasierotus. Mikro-organismiin muodostuneen lipidin käsittely rasvahappojen es-

CVJ

tereiksi voi tapahtua myös ilman edeltävää mikro-organismisolujen hajotusta ja sitä seu-raavaa rasvan eristysvaihetta.

20

Esillä olevan keksinnön edullinen suoritusmuoto koskee menetelmää lipidin tai lipidiseok-sen muodostamiseksi eloperäisen lähtöaineen käsittelyssä syntyvästä hiilihydraatti seoksesta, joka käsittää heksoosi- ja pentoosisokereita monomeerisissä tai oligomeerisissä muodoissa, jonka menetelmän mukaan hiilihydraattipitoinen seos lisätään vesipitoiseen kasva-5 tusalustaan, jolla kasvatetaan lipidiä tuottavaa mikro-organismia, täydennetään alustaa kasvun edellyttämillä ravintoaineilla, suoritetaan kyseisen organismin siirrostus alustaan, kasvatetaan organismia ja sallitaan sen tuottaa lipidiä, otetaan solumassa talteen, ja erotetaan lipidi tai lipidiseos soluista tai käytetään rasvaa sisältävät solut tai niiden osat sellaisenaan.

10

Keksinnön mukaisella menetelmällä saavutetaan erityinen joustavuus lipidin tuottamiseen mikrobiologisesti. Sekä heksoosi- että pentoosi sokereita sisältävä jae on luontainen hiili-lähde useille lipidiä tuottaville mikro-organismeille. Menetelmän etuna on siten myös, että mikro-organismin valinta voidaan tehdä laajoissa rajoissa, kuten lipidin tuottokyvyn, bio-15 massan tuoton, kasvatustavan tai kasvatusolosuhteiden perusteella. Mikro-organismin muut aineosat kuin lipidi, voidaan käyttää energiataloudellisesti usealla eri tavalla siten keksinnön mukaisen prosessin kokonaistaloudellisuutta parantaen. Edullisia lipidivapaan mikro-organismimassan käyttötapoja on hydrolyysi ja kierrätys lipidiä tuottavan mikro-organismin kasvualustaan tai käyttö rehuna tai ravintoaineena. Mikro-organismi valitaan 20 luonnollisista tai geneettisesti muunnelluista rasvaa keräävistä mikro-organismeista, edullisesti hiivoista, homeista, bakteereista ja levistä, edullisemmin hiivoista ja homeista, sopi-vimmin hiivoista. Olennaista on, että käytettävä mikro-organismi kykenee tuottamaan lipidiä heksoosi- tai pentoosisokereista tai molemmista. Keksinnön piiriin kuuluvat siten kaikki mikro-organismit, joiden lipidin kerääminen perustuu niiden sisältämään

CO

o 25 ATP:sitraattilyaasiaktiivisuuteen (EC 2.3.3.8).

i o

Keksintöön soveltuvat lipidiä syntetisoivat hiivasuvut käsittävät seuraavia sukuja: x Candida, Yarrowia, Lipomyces, Rhodotorula ja Cryptococcus, joihin kuuluvia ksyloosi-

CL

pentoosi sokeria lipidiksi syntetisoivia kantoja ovat esimerkiksi Candida curvata (D) ro 30 (Evans, C.T. ja Ratledge,1983. A comparison of the oleaginous yeast, Candida curvata, o grown on different carbon sources in continuous and batch culture, Lipids 18 623-629),

C\J

Rhodotorula gracilis (Yoon, S., Rhim, J., Choi, S., Ryu, D. ja Rhee, J. 1982. Effect of Carbon and Nitrogen Sources on Lipid Production of Rhodotorula gracilis, J. Ferment. Tech-nol. 60, 243-246) j a Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gram- 21 inis,Lipomyces starkeyi, Lipomyces lipofer, Candida lipolytica, Cryptococcus, Cryptococcus albidus, Trichosporon cutaneum ja Trichosporonpullulans (Fall, R., Phelps, P. ja Spindler, D. 1984, Bioconversion of Xylan to Triglycerides by Oil-Rich Yeasts, Appi. Environ. Mircobiol. 47, 1130-1134) sekä arabinoosi-pentoosisokeria lipidiksi syntetisoiva 5 kanta Lipomyces starkeyi (Naganuma, T., Uzuka, Y. ja Tanaka K. 1985. Physiological Factors Affecting Total Cell Number and Lipid Content of the Yeast, Lipomyces starkeyi, J. Gen. Appi. Microbiol. 31, 29-37).

Vastaavasti keksintöön soveltuvat rasvaa keräävät homesuvut käsittävät seuraavia: 10 · Mortierella • Mucor

Vastaavasti rasvaa keräävät bakteerisuvut käsittävät seuraavia: • Rhodococcus 15 · Oscillatoria

Samoin rasvaa keräävät mikroleväsuvut käsittävät seuraavia: • Crypthecodiniumi • Ulkenia 20 · Schizochytrium

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan lipidien synteesiin käytetään mikro-organismeja, jotka syntetisoivat soluihinsa rasvahappoja sisältävää lipidiä määränä, joka co edullisesti on 12- 65 paino-% solujen kuivapainosta.

° 25 i Y Keksinnön erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan kasvatusalustaan käytetään ravin- cö teinä keksinnössä muodostuvaa lipidivapaata biomassaa mikro-organismille soveltuvalla g tavalla käsiteltynä. Kasvatusalustaa voidaan näiden komponenttien lisäksi täydentää käy- o tettävälle mikro-organismille edullisilla komponenteilla. Tuottaakseen lipidiä mikroin 30 organismi yleisesti tarvitsee muun muassa hiililähteen, jonka se esillä olevassa keksinnössä o saa lähtöaineesta, typpilähteen, kuten epäorgaanisen ammoniumsuolan (esim. ammonium- sulfaatti) tai orgaanisen typpilähteen (esim. aminotyppi, hiivauute, tai hydrolysoitu solumassa), ja hivenainelähteen, kuten fosfaatti-, sulfaatti-, kloridi-, vitamiini- tai kationiläh- 5 22 teen (esim. Mg-, K-, Na-, Ca-, Fe- tai Cu-ionilähteen), jolloin näitä komponentteja tarvittaessa voidaan lisätä alustalle. Sovellettaessa esillä olevan keksinnön menetelmää, solujen lipidipitoisuus on edullisesti 40 p-%, edullisimmin 65 p-%.

Biopolttoaineen valmistus

Mikro-organismiperäisen lipidin sisältämä rasvahappoesteri voidaan käsitellä biodiesel-polttoaineeksi soveltuvaksi millä tahansa tunnetulla menetelmällä. Eräs edullinen tapa on 10 suorittaa vaihtoesteröinti lyhytketjuisten alkoholien, edullisesti metanolin, kanssa rasvahapon alkoholiesteriksi.

Vaihtoesteröinnillä tapahtuvassa biodieselin valmistuksessa syntyvä energiataloudellisesti vaikeasti hyödynnettävä epäpuhdas, alkoholisia yhdisteitä, kuten glyserolia tai esteröimä-15 töntä rasvahappojen suolaa sisältävä sivuvirta voidaan käyttää uudelleen yksisolulipidin tuottamiseen, joka yksisolulipidi on käytettävissä sellaisenaan tai kierrätettävissä muuhun biologista alkuperää olevaan glyserolipidiä sisältäviin materiaaleihin.

20 Keksinnön etuja

Keksinnön etuihin kuuluu, että menetelmään tarvittava laitteisto on yksinkertainen ja siihen liittyvä teknologia valmistuksen ja käytön osalta tunnettua. Keksinnön mukainen menetelmä ei ole sidottu tuotantomittakaavaan, vaan se on helposti skaalattavissa käsiteltävän

CO

o 25 lähtöaineen hiilihydraattipitoisuuden ja määrän mukaiseksi. Menetelmän suorittaminen li- ό pidin tuottamiseksi ei edellytä energiaa vaativaa lämmitystä, paineistettuja yksikköoperaa- i tioita eikä happo-, emäs- tai entsyymikatalyyttien lisäksi muita kemiallisia katalyyttejä.

x Menetelmä edellyttää vain sellaisten kemikaalien käyttöä tai biomateriaalin prosessointia, jotka ovat liitettävissä keksinnön mukaisen menetelmän sisäiseen kiertoon. Menetelmä ei o ra 30 myöskään edellytä kustannuksia kasvattavaa veden poistoa käymiskelpoisten sokerien liu- o oksista, sillä laimeat hiilihydraattiliuokset soveltuvat sellaisenaan käytettäviksi mikro- c\j organismin kasvualustaan tai kasvualustana. Menetelmän kokonaistaloudellisuutta parantaa se, että siinä syntyvää lipidivapaata biomassaa voidaan sisäisen kierron lisäksi käyttää moniin eri tarkoituksiin, kuten yksittäisten eloperäisten aineosien tuottamiseen, rehuna tai 23 rehun raaka-aineena tai täydentävänä kasvatusalustana mikro-organismin tuottamiseen. Menetelmää on sovelias myös yksisolubiomassan ja etanolin tuottamiseen.

Tunnetun tekniikan ratkaisuissa on kuvattu etanolin tuottoon mikrobiologisia vaiheita 5 sisältäviä menetelmiä, joissa käytetään raaka-aineena hiilihydraattipitoisia materiaaleja sellaisenaan tai monosakkarideiksi muutettuina. Patenttihakemusjulkaisussa US 2002/0185447 ja patentissa US 5637502 kuvataan myös hiilihydraattien käsittelymenetelmiä, kuten käsittelyä hapolla tai emäksellä, joiden käsittelyjen jälkeen seuraa alkoholikäy-minen. Kummatkin mainitut menetelmät rajoittuvat mikrobiologisen käsittelyn osalta eta-10 nolin tuottoon, johon käytetään polysakkarideista muodostettua heksoosisokeria. Patentti hakemusjulkaisussa US 2003/0096385 tuotetaan prenyylialkoholia (alkoholin geranyyli- ja famesyylisohdannaisia) mikro-organismeilla.

Patenttihakemusjulkaisu WO 03/038067 kuvaa menetelmän, jolla sieniin kuuluvan mikro-15 organismin perimän muuntelulla voidaan saada aikaan organismi, joka kykenee hyödyntämään pentoosisokereita. Julkaisussa tähdätään yksinomaan etanolin tuottoon.

Keksintö tuo uuden ratkaisumahdollisuuden erityisesti selluloosa-ja paperiteollisuudessa tapahtuvan puun termomekaanisten prosessien merkittävämmän vesipitoisen sivuvirran 20 hyötykäyttämiseksi erityisesti liikennepolttoaineen raaka-aineeksi. Keksinnöllä voidaan laskea puun mekaanisen massan valmistuksessa syntyvän hiilihydraattipitoisen sivuvirran biologista kuormittavuutta ja siten jäteveden käsittelyn energia-kustannuksia. Keksintö on konkreettisessa muodossa lipidintuottoprosessi, joka tarjoaa ympäristöystävällisin ratkaisun siihen, miten esimerkiksi laimeaa, TMP-prosesseista tai niitä vastaavista puun mekaa-

CO

o 25 nisistä käsittelyistä syntyvistä hiilihydraatteja sisältävistä vesipitoisista jakeista tuotetaan ό liikennepolttoaineen, biodieselin, raaka-ainetta.

cö x Menetelmä tarjoaa myös suoritusvaihtoehtoja muiden lähtömateriaalien hyötykäyttöön.

CL

Menetelmän mukaisesti lähtöaineena voidaan käyttää kierrätyskuituja, kuten paino- oö 30 paperia, pakkausmateriaalia ja niihin verrattavia selluloosapohjaisia materiaaleja.

r-- o o C\1 24

Tunnettuun, tekniikkaan verrattuna keksintö täten täyttää kestävän kehityksen periaatteet, kasvattamalla lipidiraaka-aineen saatavuutta ja vähentämällä eloperäisen lipidin kokonaistarvetta muista lähteistä. Keksintö siten parantaa uusiutuviin luonnonvaroihin perustuvien biopolttoaineiden raaka-aineiden satavuutta ja luo edellytykset niiden tuotantokustannusten 5 saattamiseksi kuluttajien hyväksymälle loppukäyttäjätasolle.

Lähtöaineen kokonaiskäytön kannalta keksintö ei rajoitu pelkästään sen sisältämän hiilihydraatin kokonaiskäyttöön. Menetelmä sisältää myös vaiheet, jotka mahdollistavat puuaineksessa olevan uuteaineen sisältämien lipidikomponenttien talteenoton. Käsiteltäessä 10 lähtöainetta vedellä suodoksesta erottuu lipidikomponenttia, joka voidaan ottaa vesiliuoksesta talteen alan ammattilaisen tuntemilla menetelmillä. Lähtöaineen happokäsittelyn tuloksena uuteaineen lipideistä syntyy vapaita rasvahappoja, jotka erotetaan suodoksesta liukenemattomina maa-alkalimetallisuoloina, kuten Ca' -suoloina, ja jotka sakan erottamisen jälkeen vaihtoesteröidään alkoholiestereiksi. Vastaavasti, lähtöaineen emäsuutto 15 tuottaa uuteaineesta rasvahappojen suolaa, joka on vesiliukoinen ja siten sekoittuneena su-odokseen. Keksinnössä kyseinen suola muutetaan veteen liukenemattomaan suolan muotoon, kuten Ca++-suolaksi, ja erotetaan sakka vesifaasista ja käytetään rasvahappoalkoho-liesteridien valmistukseen.

20

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu havainnollistamaan keksintöä, eikä niitä tule pitää tätä keksintöä millään tavalla rajoittavina. Keksintö ei myöskään millään tavoin rajoitu käytettyihin mikro-organismikantoihin. Keksinnön voi toteuttaa paitsi käytettyjen kantojen myös muiden saman lajin tai suvun kantojen avulla. Lipidejä tuottavia mikro-organismeja on

CO

0 25 yleisesti saatavissa ja niitä löytyy useista kantakokoelmista, esimerkiksi ATCC, DSM jne.

ö Lipidejä tuottavia mikro-organismeja ja lipidien tuottoprosesseja mikro-organismeilla ^ (myös levillä) on kuvattu kirjallisuudessa, esimerkiksi teoksissa Single Cell Oils, toim. Z.

1 Cohen ja C. Ratledge, AOCS Press, 2005 ja Microbial Lipids, toim. C. Ratledge ja S.G.

CL

Wilkinson, voi. 1 ja 2, Academic Press, 1988.

ra 30

LO

r-- o o C\1 25

Esimerkit Esimerkki 1 5 Puukuituja, jauhettua puuta, TMP-massaa, sahajauhoa ja hioketta, 100 g kutakin, pidettiin 1 litrassa kiehuvaa vettä, 90-100 °C, 2 tunnin ajan. Liuokset suodatettiin erilleen kuitu-aineksista (myöhemmin sakka). Sakat otettiin talteen ja käsiteltiin eri vaihtoehdoin mo-nosakkaridisaannon lisäämiseksi jonkin esimerkeissä 4 tai 5 esitetyn vaihtoehdon mukaisesti. Liuosten hiilihydraattisaannot vaihtelivat välillä 2-6 % lähtöaineesta riippuen, ollen 10 tyypillisesti 4 %, kun lähtöaineena käytettiin korkeassa lämpötilassa (yli 170 °C) jauhettua kuusikuitua. Osa liuoksista käytettiin ilman edeltävää haihdutusta uudelleen seuraavien kuituerien uuttamiseen ja osa liuoksista konsentroitiin haihduttamalla kunnes saavutettiin noin 20 paino-%:n kuiva-ainepitoisuudet. Konsentroidut suodokset otettiin talteen yk-sisolulipidin tuottamiseksi. Liuenneet hiilihydraatit olivat uutetulle puulajille tyypillisiä 15 j akautuen heksooseiksi j a pentooseiksi.

Esimerkki 2 20 Puukuituja, jauhettua puuta, kierrätyskuitua, TMP-massaa, sahajauhoa ja hioketta, lisättiin kutakin yhteen litraan 5 % alkaliliuosta (NaOH) ja sekoitettiin 90 - 100 °C:ssa 3 tunnin ajan. Tehtiin suodatukset normaalilämpötilassa ja sakat otettiin jatkokäsittelyyn monosak-karidien tuottamiseksi esimerkin 4 mukaisesti. Uuttoliuokset käsiteltiin siten, että kustakin liuoksesta osa käytettiin uudelleen seuraavan kuituerän käsittelemiseen, osa neutraloitiin

CO

o 25 ja osa johdettiin hydrolysointiin esimerkin 4 mukaisesti, koska emäksisiin uuttoliuoksiin ό oli liuennut jonkin verran ligniiniä sekä oligo- ja polysakkarideja. Kuvatulla emäs- ^ käsittelyllä eri lähtöaineista saatuihin liuoksiin oli jäänyt keskimäärin 5 % lähtöaineen pai- x nosta.

X

CL

O

cö 30 Alkuperäisessä emäskäsittelyssä saatuja sakkoja käsiteltiin myös uudelleen emäksellä o toistaen aiempi emäskäsittely ja jauhettiin 6 minuutin ajan 8 baarin paineessa, lämpö- <m tilassa 170 °C. Tällä lisäjauhatuksella voitiin emäsliuokseen liukenevan materiaalin määrä 26 nostaa keskimäärin 27 % iin alkuperäisistä lähtöaineiden määristä. Liuoksista tuli mustia ja ne neutraloinnin, hydrolysoinnin ja konsentroinnin jälkeen käsiteltiin värin poistamiseksi aktiivihiilellä ja ioninvaihtajalla. Seokset otettiin talteen ja käytettiin yksisolulipidin tuottamiseksi.

5

Esimerkki 3

Puukuituja, jauhettua puuta, TMP-tai MDF-massaa, sahajauhoa, hioketta, kierrätyskuituja 10 ja neutraloitua uutetta esimerkin 2 mukaisesti valmistettuna, 100 g kutakin, hydrolysoitiin yhdessä litrassa 5 % mineraalihappoa, pH 1, 90-100 °C:ssa 3 tunnin ajan. Sakat suodatettiin eroon liuoksista. Liuoksissa oli monosakkarideja keskimäärin 10 % lähtöaineen määristä. Kutakin liuosta käsiteltiin siten, että osa neutraloitiin, suodatettiin ja konsentroitiin haihduttamalla kunnes saavutettiin noin 20 paino-%:n monosakkaridien määrä ja konsent-15 roidut liuokset otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi. Osaa liuoksista käytettiin sellaisenaan uudelleen seuraavien lähtöaine-erien hydrolysoimiseen kuten tässä esimerkissä on kuvattu. Sakat käsiteltiin edelleen monosakkaridisaannon lisäämiseksi seuraavan esimerkin 5 mukaisesti.

20

Esimerkki 4

Puukuituja, jauhettua puuta, TMP-, MDF-massaa, sahajauhoa, hioketta, olkea, viljan kuorta ja esimerkkien 1-3 mukaista sakkaa, 125 g kutakin, lisättiin rikkihappoliuokseen, co o 25 jonka pitoisuus oli 10 % ja annettiin hapon imeytä 2 tuntia. Ylimääräinen happo valutettiin ό pois ja seokset johdettiin siipijauhimeen, lämpötilaa nostettiin esihöyryttämällä 11 minuu- i tin ajan laskematta lauhdetta pois, jonka jälkeen lämpötila nostettiin 160 °C:een ja paine x 8 baariin ja suoritettiin jauhatus siipijauhimella. Seoksen jauhamisaika valittiin kuusi- Q_ kuiduille 11 minuutiksi. Jauhamisen jälkeen sakat erotettiin liuoksista. Kukin sakka cö 30 jaoteltiin niin, että osa käytettiin polttoon ja osa jauhettiin uudestaan monosakkari- h*.

o disaannon lisäämiseksi seuraavan esimerkin 5 mukaisesti. Vastaavasti liuokset c\j neutraloitiin, suodatettiin ja konsentroitiin haihduttamalla kunnes saavutettiin noin 20 % monosakkaridikonsentraatiot. Nämä liuokset otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi.

27

Esimerkki 5 5 ID. Puukuitua, jauhettua puuta, TMP-massaa, sahajauhoa, hioketta, olki- ja viljakuitua sekä esimerkkien 1-4 mukaisia jäännössakkoja, 125 g kutakin, lisättiin 40 % rikki-happoliuokseen ja annettiin imeytä 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Ylimääräinen happo valutettiin pois ja sakat jauhettiin siipikuiduttimessa siten, että sakkojen lämpötilaa nostettiin esihöyryttämällä 11 minuutin ajan laskematta lauhdetta pois. Lämpötila nostettiin sen 10 jälkeen 170 °C:een ja paine 8 baariin. Sopivin jauhamisaika oli olki- ja viljakuiduille 11 minuuttia. Sakat erotettiin liuoksista. Liuenneen aineksien osuudet olivat keskimäärin yli 50 % lähtöaineesta. Liuokset neutraloitiin, suodatettiin ja konsentroitiin haihduttamalla ja otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi. Sakat eli jäännöskuidut johdettiin osin polttoon ja osin jauhettiin uudestaan tämän esimerkin mukaisesti monosakkari di saannon 15 lisäämiseksi.

Edellä kuvattuihin lähtöaineisiin imeytettiin erikseen myös väkevää rikkihappoa (72 %), käsittelyaika 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen happo laimennettiin 5 %:seksi ja keitettiin normaalipaineessa 4 tuntia 100 °C:ssa. Jatkokäsittelyjä syntyneiden jakeiden 20 käyttö tapahtui, kuten edellä.

Esimerkki 6 co o 25 Akanasta, oljesta ja viljan kuorista voidaan tuottaa yksisolulipidin tuottamiseen soveltuvaa ό monosakkaridia hydrolysoimalla suoraan 5 %:lla hapolla tai impregnoida väkevämmällä ja hydrolysoida 5 %:ssa liuoksessa tai käsitellä ensin emäksellä ja hydrolysoida erikseen he-x miselluloosa ja selluloosa kuten edellisissä esimerkeissä on esitetty. Näihin käsittelyihin

CL

voidaan yhdistää käsittelyt impregnoinnilla hapolla tai emäksellä ja näitä seuraavilla tois-o ra 30 tuvilla jauhatuksilla siipi- tai levyjauhimessa termomekaanisen massan aikaan saamiseksi, o Tässä esimerkissä kuitenkin akanaa, olkea ja viljan kuorta (125 g kutakin) esihöyrytettiin

C\J

11 minuuttia 8 bar paineessa ja käsiteltiin siipijauhimessa 170 °C:n lämpötilassa termomekaaniseksi massaksi. Syntyneet termomekaaniset massat hydrolysoitiin 5 % hapossa (rik- 28 kihappo) yhden litran tilavuudessa 90 -100 °C:ssa normaalipaineessa 4 tuntia. Suodatettiin liuososat eroon ja neutraloitiin. Tämän jälkeen liuokset konsentroitiin ja otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi. Monosakkaridien saanto oli keskimäärin 50 % lähtöaineesta. Suodatuksesta jääneet sakat käsiteltiin uudelleen hiilihydraatti saannon kasvatta-5 miseksi termomekaanisesti, esimerkin 5 mukaisesti ja osa johdettiin poltettavaksi.

Esimerkki 7 10 Akanaa, olkea tai viljan kuorta (16 kg kutakin) kutakin käsiteltiin 100 litrassa 90 - 100 °C alkaliliuosta (1,2 M NaOH) 4 tuntia. Seos jaettiin sakaksi ja liuokseksi. Syötetyistä lähtö-materiaaleista meni liuoksiin keskimäärin 49-57 % kuiva-ainetta. Alkaaliset liuokset tehtiin rikkihapolla 5 %:seksi hapon suhteen ja hydrolysoitiin kuten esi-merkissä 6. Syntyi pääasiassa ksyloosin ja arabinoosin seoksia, joissa oli myös hieman glukoosia ja galaktoosia.

15 Liuosten monosakkaridipitoisuudeksi muodostui 23 - 33 % syötetystä lähtöaineesta. Liuosten värillisyyttä lievennettiin aktiivihiilikäsittelyllä ennen kuin ne otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi.

Suodatuksessa saadut sakat kyllästettiin 5 % hapossa (rikkihappo) ja jauhettiin siipijauhi- 20 messa 11 minuuttia 6 bar paineessa ja 150 °C:n lämpötilassa. Sakat hajosivat liukoisiksi hiilihydraateiksi, pääosin glukoosiksi ja galaktoosiksi, jotka neutraloinnin ja suodatuksen jälkeen otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi. Osia happohydro-lyysin jälkeisissä suodatuksissa jääneistä sakoista jauhettiin vielä uudestaan ja hydrolysoitiin sen jälkeen 10 %:sessa hapossa esimerkin 4 mukaisesti. Näiden käsittelyjen jälkeen saatiin liuoksia, joissa co o 25 oli monosakkarideja yhteensä 55-65 % lähtöaineesta. Liuokset otettiin talteen yksisolulipi- ό din tuottamiseksi.

cö x

X

CL

Esimerkki 8 o δ 30 uo o Höyrykuivattua juurikasl ei kettä kaadettiin saaviin j a päälle kaadettiin kiehuvaa vettä niin c\j paljon, että vesi peitti juuri kasi eikkeen alleen. Annettiin liuoksen jäähtyä ennen veden de-kantoimista eroon kiintoaineesta. Veteen oli liuennut kuiva-ainetta 3,6 mg/ml. Vesijae 29 käytettiin osin uuden erän käsittelyyn ja osin konsentroinnin jälkeen otettiin talteen yk-sisolulipidin tuottamiseksi. Saatua kiinteää jaetta, sakkaa, jonka kuiva-aine oli 16,7%, punnittiin 748 g, mikä vastaa kuiva-aineena 125 g kuivattua juurikasleikettä, kyllästettiin 0.4 M fosforihapolla (H3PO4.500 ml) 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Ylimäärä 5 happoliuosta valutettiin pois ja esihöyrytettiin 11 min ajan ennen termo-mekaanisen jauhamisen aloitusta. Seos jauhettiin siipijauhimella 11 minuuttia. Jauhamisen aikana paine oli 8 baaria ja lämpötila aluksi 172 °C ja 162 °C kun 10 minuuttia jauhatusaikaa oli kulunut. Seos laskettiin pois jauhimesta ja suodatettiin. Liuososa, 2,26 litraa, sisälsi kuiva-ainetta 2,75 %. Jauhatukseen syötetystä kuiva-aineesta 50 % oli suodatuksen jälkeen 10 liuoksessa. Liuoksessa tavattiin enimmäkseen monosakkarideja, glukoosia, galaktoosia, arabinoosia ja ksyloosia. Lisäksi havaittiin vähäisiä määriä oligosakkarideja molekyyli-painoalueella 500- 3000 ja korkeamman molekyylipainon omaavia yhdisteitä. Liuososa neutraloitiin, konsentroitiin ja otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi.

15 Edellisestä juurikasleikkeen käsittelystä saatua kiinteää kuitumassaa, sakkaa (125 g kuiva-ainetta) kyllästettiin 15 %:ssa suolahapossa 4 tuntia huoneenlämpötilassa. Ylimäärä happo-liuosta valutettiin pois ja jauhettiin massa uudelleen samoissa olosuhteissa. Suodatusvai-heen jälkeen havaittiin, että liuosmuotoon tuli monosakkarideja lisää 28 %. Sakka meni poistoon.

20

Esimerkki 9 Lähtöaine oli termomekaanisesti käsiteltyä kuusikuitua, jota punnittiin 46,8 g (tilavuudelta δ 25 taan noin 1 litra) ja lisättiin päälle 0,2 N NaOH, johon lisättiin edelleen 5,6 g Na2CC>3 ja

CNJ

ό 1,3 g MgSCL 6H20 (500 ml). Seos lämmitettiin 50 °C:een, jolloin saatiin liuokseen vähäi- siä määriä glukoosia, ksyloosia, galaktoosia, arabinoosia, mannoosia ja lisäksi oligomeere- x ja. Liuoksen pH oli noin 11, se suodatettiin ja pestiin vedellä. Pesuja suodos yhdistettiin ja □_ liuos haihdutettiin 320 mkksi. Liuenneen aineen määrä oli 4,5 % (kuiva-aine) lähtöainees-o δ 30 ta. Monosakkaridien määrän kasvattamiseksi liuokseen lisättiin happoa, jolloin syntyi sak- o kaa. Sakka erotettiin liuoksesta, jota jälkimmäistä otettiin talteen ja käytettiin yksisolulipi-

C\J

din tuottamiseksi. Sakka hydrolysoitiin monosakkarideiksi 5 %:ssa hapossa, kuten esimerkissä 3 on kuvattu. Hydrolyysin avulla sakan massasta syntyi 1 % monosakkarideja, jotka 30 siirtyivät liuokseen ja jotka väripoiston jälkeen otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi.

5 Esimerkki 10

Termomekaanisesti käsiteltyä kuusikuitua punnittiin 45 g (noin 1 litra) lisättiin päälle 0,2 N NaOH, johon lisättiin 5,6 g Na2CC>3 ja 1,3 g MgSC>4 6H2O (500 ml). Seos lämmitettiin 50 °C:een, suodatettiin ja sakka pestiin vedellä. Yhdistettiin pesu-ja suodosliuokset. Mo-10 nosakkaridien määrän kasvattamiseksi yhdistettyyn suodokseen lisättiin happoa ja hydrolysoitiin esimerkki 3:n mukaisesti. Neutraloinnin jälkeen syntynyt hydrolyysitulos otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi. Pesty sakka puristettiin 300 mkksi ja lisättiin 1 litra sitraattipuskuria, pH 4,8, ja lisättiin sellulaasientsyymiä. Seokseen syntyi oligomeerejäja glukoosia. Entsyymikäsiteltyä seosta sekä sellaisenaan että siitä erotettuna suodoksena, 15 liuoksena, otettiin talteen ja käytettiin yksisolulipidin tuottamiseksi.

Esimerkki 11 20 Otettiin 125 g kauran akanaa ja se jauhettiin termomekaanisesti 2 min, 170 °C:ssa ja paineessa 8 baaria. Käsittelyn jälkeen sakka suodatettiin eroon liuoksesta. Liuos otettiin talteen käytettäväksi yksisolulipidin tuottoon. Sakkaa otettiin 7 g:n erä (kuitua) ja se tehtiin 19 %:ksi rikkihapon suhteen ja refluksoitiin 4 tuntia. Analyysi osoitti, että käsittelyn tuloksena saatiin liuokseen monosakkarideja 56 % lähtöaineesta, eniten ksyloosia, mannoosia,

CO

o 25 glukoosia galaktoosia, ja arabinoosia. Liuos otettiin talteen käytettäväksi yksisolulipidin ό tuottamiseen.

cö

X

cc

CL

Esimerkki 12 o 5 30 m o Punnittiin 400 g kauran akanaa ja lisättiin 3 litraa vettä ja 200 g NaOH. Seosta pidettiin

CVJ

90 - 96 C lämpötilassa sekoituksessa 2 tuntia. Seos suodatettiin kankaan läpi ja erotettiin kuidut. Suodososa (50 ml) neutraloitiin ja sen pH säädettiin 4.8:aan sitraattipuskurilla 31 (40 ml) lisätään multifect ksylanaasia (10 ml) ja termostoitiin seos 50 °C:een. Liuokseen vapautui sokereita, joista ksyloosia oli 25.2 % ja arabinoosia 11.8 %. 50 tunnin reaktioajan jälkeen liuoksessa on myös oligomeerejä. Koko seos otettiin talteen käytettäväksi yksisolu-lipidn tuottamiseen.

5

Esimerkki 13

Juurikasleikettä, 125 g, kyllästettiin 0.4 M rikkihapolla ja valutettiin ylimäärä happoa pois 10 12 tunnin kuluttua. Leike siirrettiin siipijauhimeen, jossa sitä esihöyrytettiin 4 min ja jau hettiin 150 °C:ssa 6 baarin paineessa 11 minuuttia. Seos neutraloitiin ja lisättiin sitruuna-happoa kunnes pH laski 4:ään. Lisättiin 10 ml pektinaasia 4450 U eli 178 mg/ml proteiinia (Sigma) ja annettiin reaktion edetä 25 °C:ssa 24 tuntia. Reaktion jälkeen seoksesta osa otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi ja osa suodatettiin. Suodatuksesta saatu sakka pa-15 lautettiin takaisin jauhatusvaiheeseen ja tämän käsittelyn seurauksena saatu liuososa käsiteltiin aktiivihiilellä, 2 g /litra, ja johdettiin sitten anioninvaihtokol onniin. Kolonnista saatava monosakkaridiliuos haihdutettiin 20 %:n pitoisuuteen kuiva-aineen suhteen, otettiin talteen yksisolulipidin tuottamiseksi.

20

Esimerkki 14

Kauran akanaa käsiteltiin esimerkin 7 mukaisesti, jolloin saatiin seos, jossa oli glukoosia 23,8 g/L, ksyloosia 93,3 g/L, arabinoosia 37,1 g/L ja galaktoosia 9,0 g/L. Tätä seosta lisät-co o 25 tiin kasvualustaksi lipidiä syntetisoiville hiivoille Yarrowia lipolytica ATCC 20373 ja ό Rhodotorula glutinis TKK 3031 sellaisenaan, 1:1 laimennettuna ja vastaavana laimennok- i sena, joka oli täydennetty 11 g/L glukoosilla. Kasvatusaika oli 68 tuntia, lämpötila 28 °C, x ravistelu 250 rpm ja kasvatustilavuus 50 ml. Kuviosta 3 havaitaan, että hiivat kykenivät

CL

kasvamaan ja syntetisoimaan lipidiä ilman tarvetta muiden ravinteiden lisäämiseen.

5 30 m N- o o

C\J

32

Esimerkki 15

Kolmea hiivaa, Rhodotorula glutinis, Yarrowia lipolytica ]a Kluyveromyces marxianus (Anam. Candida kefyf) ATCC 42265, kasvatettiin pelkästään ksyloosi hiililähteenä.

5 Kasvualusta sisälsi ksyloosia 20 g/L, hiivauutetta 10 g/L ja peptonia 20 g/L. Kasvatus suoritettiin 50 ml:n tilavuudessa ja 25 °C:ssa ravistellen 200 rpm. Kuvio 4 osoittaa kaikkien kolmen kannan kykenevän käyttämään pentoosisokeria hiililähteenä.

co δ

(M

ö δ

X

DC

CL

O

δ

LO

r-- o o C\1

Claims (18)

1. Menetelmä lipidin tai lipidiseoksen muodostamiseksi eloperäisestä lähtöaineesta, joka käsittää polysakkaridia valittuna joukosta selluloosa, hemiselluloosa, tärkkelys, 5 näitä kaikkia, näiden jotain seosta tai näiden pilkkoutumistuotteita, joka menetelmä käsittää sen, että lähtöainetta käsitellään aineella, joka on valittu joukosta (i) vesi, (n) happo, ja (iii) emäs, 10. onka j älkeen erotetaan ensimmäinen sakka j a suodos, tunnettu siitä, että mainituista käsittelyistä saadulle sakalle tehdään mekaaninen tai termomekaaninen jauhatus ja erotetaan toinen sakka ja suodos, ja valinnaisesti tehdään toiselle sakalle yhden tai useamman kerran jonkin kohtien (i), (ii) tai (iii) mukainen käsittely tai käsittelyt ja/tai jauhatus, ja otetaan näin saatu sakka (tai sakat) talteen, ja 15 - saatetaan lipidiä tuottava mikro-organismi kosketuksiin jonkin saadun suodoksen tai useamman saadun suodoksen tai minkä tahansa näistä suodoksista ja lähtöaineesta saadun yhdistelmän kanssa kasvatusalustalla, jolloin mikro-organismisolut alkavat tuottaa lipidiä, ja otetaan lipidit talteen. 20

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä käsitellään sakkaa lisäksi menetelmällä, joka käsittää yhden tai useamman seuraavista vaiheista: - käsitellään jotakin patenttivaatimuksen 1 mukaan erotettua sakkaa vahvalla hapolla o ja erotetaan näin saatu sakka ja suodos, ja 25. hapotetaan ja jauhetaan mekaanisesti tai termomekaanisesti jotakin edellisen T- vaiheen mukaan tai patenttivaatimuksen 1 mukaan erotettua sakkaa ja erotetaan co x näin saatu sakka ja suodos, tai valinnaisesti käsitellään jonkin edellisen vaiheen tai cc patenttivaatimuksen 1 mukaan erotettu sakka yhden tai useamman kerran uudelleen o mainituilla käsittelyillä valinnaisessa järjestyksessä, ja erotetaan näin saatu sakka ja m ^ 30 suodos. o C\l

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaine on peräisin puun mekaanisesta tai termomekaanisesta käsittelystä tai peltokasvista.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5 lähtöaine käsitellään vedellä tai hapon vesiliuoksella.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaine on peräisin lähteestä, joka on valittu joukosta kierrätyskuitu, juurikasleike, akana, olki, lese, viljan jyvä, kokonainen viljakasvi, peltokasvi, TMP-ja MDF-massa. 10

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1, 2 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaine käsitellään hapon vesiliuoksella.

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaine on 15 peräisin lähteestä, joka on valittu joukosta sahanpuru, hierre, akana, olki, TMP-massa, MDF-massa, juurikasleike, peltokasvi, joka ei sisällä olennaista määrää tärkkelystä.

8. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaine käsitellään emäksen vesiliuoksella. 20

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaine on peräisin lähteestä, joka on valittu joukosta soistunut tai vedenalainen biomassa, biomassa sellutehtaan laskeumavesialueelta, biomassa yhdyskuntajätteestä ja o yhdyskuntajätevedestä, ό 25 T-

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että co x lähtöaine sisältää mikro-organismien biomassan ja lipidintuotannossa käyttökelpoisia cc sokereita vähintään 0,5 - 1 p-%, enintään 20-30 p-%, edullisesti 4-5 p-%. o oö m o o c\j

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1 vaiheen (i), (ii) tai (iii) tai patenttivaatimuksen 2 käsittely tehdään yhden tai useamman kerran.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsiteltäessä lähtöainetta emäksellä kohdassa (iii), saatu sakka käsitellään uudelleen hapon vesiliuoksella ja erotetaan näin saatu sakka ja suodos.

13. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsiteltäessä 10 sakkaa vahvalla hapolla, näin saatu sakka jauhetaan uudelleen mekaanisesti.

14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biomateriaalin käsittelyliuokseen lisätään yhtä tai useampaa entsyymiä joukosta sellulaasi, ksylanaasi ja pektinaasi. 15

15. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mistä tahansa menetelmävaiheesta saatua suodosta jatkokäsitellään menetelmillä, jotka tekevät suodoksen paremmin soveltuvaksi mikro-organismien kasvattamiseen, kuten värinpoistomenetelmillä, säätämällä pH ja/tai poistamalla tai lisäämällä vettä. 20

16. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöainetta esikäsitellään mekaanisesti, termomekaanisesti, fysikaalisesti, kemiallisesti, biologisesti tai näiden käsittelyjen yhdistelmillä. CO δ (M ö 25

17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukaisella menetelmällä tuotetun, eloperäisen T- lähtöaineen käsittelyssä syntyvän hiilihydraattiseoksen käyttö lipidin tai lipidiseoksen co x tuottamiseen mikro-organismilla, joka käyttää lipidin synteesiin sitruunahappoa ja DC ATP-sitraattilyaasientsyymiä. o δ LO q 30

18. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukaisella menetelmällä tuotetun lipidin tai o ^ lipidiseoksen käyttö biopolttoaineen valmistamisen raaka-aineena.