CN107475144A - 一种潘多拉菌及其使用方法 - Google Patents

一种潘多拉菌及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是为了开发处理汽油类石油烃的微生物法，提供了一种潘多拉菌及其使用方法。该菌为潘多拉菌(Pandoraea sp.)JWJ‑06，简称潘多拉菌JWJ‑06，保藏编号CGMCC No.13558。所述的潘多拉菌的使用方法为采用所述潘多拉菌降解有机化合物或者含有有机化合物的废水，所述的有机化合物为汽油类石油烃，正十六烷，甲苯或其中两种或三种的混合物。该潘多拉菌对正十六烷、单环苯系物和汽油类石油烃的降解作用好，可较快较完全的降级正十六烷、单环苯系物和汽油类石油烃，为解决汽油或其它石油烃类的环境污染问题提供了新思路。

Description

一种潘多拉菌及其使用方法
技术领域
本发明属于环境污染治理领域，特别涉及一种降解石油烃的潘多拉菌及其使用方法。
背景技术
随着工业的不断发展，石油被作为主要能源之一以及主要原材料之一，应用于各行各业。但石油在开采、运输、加工等使用过程当中，由于泄露和错误排放等问题，使得土壤、河流、地下水、海洋等被石油污染，对生态环境带来了污染。
对石油烃类污染修复技术主要有物理法、化学法和微生物法。与物理修复、化学修复相比较，微生物修复技术是一种发展较为成熟的技术，且具有安全、高效、低成本、操作简单且不产生二次污染的优势，是一种环境友好型的污染处理技术。
汽油是一种复杂混合物，属于石油烃类中的一种，一般来说，原油中C4-C12的组份为汽油(沸点35～220℃)，是轻质石油产品之一。汽油类石油烃主要成分包括烃类化合物(直链烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳香烃等)和非烃类化合物(含硫化合物、含氧化合物、含氮化合物)，烃类化合物所占比例较大(95％以上)。随着全国机动车保有量以每年平均12％的速度的逐年递增，汽油的使用量越来越大，带来的环境污染风险也越来越大。
因此，有必要对汽油类石油烃的微生物法进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的是为了开发处理汽油类石油烃的微生物法，提供了一种潘多拉菌及其使用方法。该潘多拉菌对正十六烷、单环苯系物和汽油类石油烃的降解作用好，可较快较完全的降解正十六烷、单环苯系物和汽油类石油烃，为解决汽油或其它石油烃类的环境污染问题提供了新思路。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案之一为，一种潘多拉菌(Pandoraeasp.)JWJ-06，简称潘多拉菌JWJ-06，保藏编号CGMCC No.13558，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间2017年01月11日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的技术方案之二为，上述潘多拉菌的无机盐培养基，其配比为，MgSO4·7H2O：0.5g～0.7g，无水CaCl2：0.1g～0.15g，KH2PO4：0.26～0.35g，NH4NO3：0.76～1.03g，FeCl3·6H2O：0.005～0.02g，加入蒸馏水至1000mL；培养基的pH值范围为6～8。
本发明的技术方案之三为，上述潘多拉菌的使用方法，即采用所述潘多拉菌JWJ-06降解有机化合物或处理含有有机化合物的废水，具体步骤为：
1)将待处理的有机化合物或含有所述有机化合物的废水与含有所述潘多拉菌JWJ-06的无机盐培养基混合；
其中，所述的有机化合物为汽油类石油烃，正十六烷，甲苯中的一种或多种；
所述有机化合物与培养基的体积比为(0.35～1.2)：100；
所述含有有机化合物的废水与培养基的体积比为(0.35～20)：100，其中，废水中的有机化合物与培养基的体积比为(0.35～1.2)：100；
所述每mL无机盐培养基中接种5～45×106个潘多拉菌JWJ-06；
2)将步骤1)中的含有所述潘多拉菌JWJ-06的混合溶液置于摇床上，于28℃～32℃下培养72h～120h，并保持培养基的pH值为6～8，使无机盐培养基中的潘多拉菌JWJ-06降解有机化合物。
本发明的技术方案之四为，上述潘多拉菌的选育方法，包括如下步骤：
1)取采自抚顺石化公司石油三厂水净化车间的曝气池或生物膜水样，作为筛选目标菌的来源；
2)配制选育培养基
无机盐选育培养基：MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.02g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，FeCl3 0.05g，加蒸馏水至1000mL，pH＝7；
甲苯液体培养基：无机盐选育培养基加入适量甲苯；
正十六烷液体培养基：无机盐选育培养基加入适量正十六烷；
正十六烷固体培养基：在无机盐选育培养基的基础上，加入适量琼脂和正十六烷；
将上述培养基灭菌处理；
3)菌种的分离
通过两种途径分离目标菌：
3.1)液体培养基分离：将水样加入到正十六烷液体培养基中，摇床培养，待培养基浑浊后转接，经过数次培养筛选，最后用涂布法接种于正十六烷平板固体培养基中，从中挑选出生长好的菌株；
3.2)平板直接分离：将水样用涂布法接种于正十六烷固体培养基中，再将平板放于恒温培养箱中培养，从中挑选出生长快、生长好的菌种；
4)菌种的纯化
将步骤3)挑选的菌种采用正十六烷固体培养基平板划线法纯化；筛选出长势好的单菌落；
5)高效石油烃类降解菌的筛选
将步骤4)筛选的单菌落菌种分别接种到含甲苯或正十六烷的液体培养基中，培养数天后，以菌种对甲苯、正十六烷的降解率来评价菌株的降解能力，从而筛选出高效的有机化合物降解菌潘多拉菌JWJ-06。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明筛选出一株高效的有机化合物降解菌潘多拉菌(Pandoraea sp.)JWJ-06，该菌种对烷烃、烯烃、单环苯系物和正十六烷均有良好的降解能力，在72h～120h内，对汽油类石油烃，正十六烷，甲苯或其中两种或三种的混合物降解率为46.5～87％。
具体实施方式
以下实施例中所用的潘多拉菌(Pandoraea sp.)JWJ-06的选育方法为：
1)取采自抚顺石化公司石油三厂的水净化车间曝气池水样或生物膜水样，作为筛选高效石油烃降解菌的来源。
2)配制选育培养基
无机盐选育培养基：MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.02g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，FeCl3 0.05g，加蒸馏水至1000mL，pH＝7。
甲苯液体培养基：无机盐选育培养基加入0.2％(v/v)甲苯。
正十六烷液体培养基：无机盐选育培养基加入0.5％(v/v)正十六烷。
正十六烷固体培养基：在无机盐选育培养基的基础上，加入琼脂15g/L，正十六烷1.5mL/L。
以上培养基灭菌条件：121℃条件下灭菌30min。
3)菌种的分离
通过两种途径分离石油烃类的高效降解菌：
3.1)液体培养基分离：将正十六烷液体培养基200mL放入锥形瓶中，在无菌条件下加入上述水样5mL，在30℃，120r/min条件下摇床培养3天，正十六烷液体培养基明显变混浊，此后3天转接一次，不断重复该过程经过21天的培养筛选，最后用涂布法接种于正十六烷平板固体培养基中，从中挑选出生长好的菌株；
3.2)平板直接分离：将正十六烷固体培养基制成平板，在无菌条件下接1mL的上述污水样用涂布法接种于正十六烷固体培养基中；将平板倒放于30℃恒温培养箱中培养，从中挑选出生长快、生长好的菌种。
4)菌种的纯化
菌种纯化选择的是正十六烷固体培养基平板划线法；
将步骤3)挑选的菌种进行平板划线。为了得到更加纯化的菌株，反复用正十六烷固体培养基的平板转接纯化多次，直到纯化完全。根据菌种在正十六烷固体培养基中的生长状况，筛选出长势好的单菌落，并编号。
5)高效石油烃类降解菌的筛选
将步骤4)筛选的单菌落菌种分别接种到含一定浓度的甲苯、正十六烷的液体培养基中，培养数天，30℃恒温振荡培养相应的天数，含空白样。以菌种对甲苯、正十六烷降解率来定量评价菌株的降解能力，从而筛选出高效的有机化合物降解菌潘多拉菌JWJ-06。
筛选出的潘多拉菌JWJ-06的形态学如下：
菌体形态为球形，菌体大小为1.25微米；菌落形态为圆形，菌落大小为1～1.5mm，颜色呈现白色。
培养学如下：
革兰氏染色呈阴性，好氧异养菌，不运动。
生理特性如下：
接触酶实验呈阳性反应；利用葡萄糖可发酵产酸、产气；油脂实验呈阴性反应；甲基红实验呈阴性反应；乙酰甲基醇实验呈阳性反应；硝酸盐还原实验呈阳性反应；产硫化氢实验为阴性反应。
以下实施例中采用的无机盐培养基，其配比为，MgSO4·7H2O：0.5g，无水CaCl2：0.02g，KH2PO4：1g，NH4NO3：1g，FeCl3·6H2O：0.05g，加入蒸馏水至1000mL；培养基的pH值范围为6～8。
实施例1
在无菌条件下，将0.5mL汽油加入100mL无机盐培养基中，再接种入微生物潘多拉菌JWJ-06，菌种初始接种总量为1.25×107个；再将培养基置于在摇床上，摇床转速120rad/min，保持培养基的pH值为6～8，温度30±1℃，培养时间120h后，测得汽油降解率为53.2％。
实施例2
在无菌条件下，将0.35mL汽油加入100mL无机盐培养基中，再接种入微生物潘多拉菌JWJ-06，菌种初始接种量为2×107个；再将培养基置于在摇床上，摇床转速100rad/min，保持培养基的pH值为6～8，温度29±1℃，培养时间96h后，测得汽油降解率为62.0％。
实施例3
在无菌条件下，将1.2mL汽油加入100mL无机盐培养基中，再接种入微生物潘多拉菌JWJ-06，菌种初始接种量为5×106个；再将培养基置于在摇床上，摇床转速120rad/min，保持培养基的pH值为6～8，温度29±1℃，培养时间108h后，测得汽油降解率为46.5％。
实施例4
在无菌条件下，将20mL含有汽油类石油烃的废水加入100mL无机盐培养基中，经检测，废水中汽油类石油烃的体积含量为4％，再接种入微生物潘多拉菌JWJ-06，菌种初始接种浓度为4.5×107个；再将培养基置于在摇床上，摇床转速120rad/min，保持培养基的pH值为6～8，温度30±1℃，培养时间120h后，测得汽油降解率为56.3％。
实施例5
在无菌条件下，将1.2mL正十六烷加入100mL无机盐培养基中，再接种入微生物潘多拉菌JWJ-06，菌种初始接种量为4.5×107个；再将培养基置于在摇床上，摇床转速100～120rad/min，保持培养基的pH值为6～8，温度29±1℃，培养时间72h后，测得正十六烷降解率为87.0％。
实施例6
在无菌条件下，将1.2mL甲苯加入100mL无机盐培养基中，再接种入微生物潘多拉菌JWJ-06，菌种初始接种量为4.5×107个；再将培养基置于在摇床上，摇床转速100～120rad/min，保持培养基的pH值为6～8，温度29±1℃，培养时间72h后，测得甲苯降解率为82.0％。
实施例7
在无菌条件下，将0.4mL甲苯、0.4mL正十六烷和0.4mL汽油加入100mL无机盐培养基中，再接种入微生物潘多拉菌JWJ-06，菌种初始接种量为4.5×107个；再将培养基置于在摇床上，摇床转速100～120rad/min，保持培养基的pH值为6～8，温度29±1℃，培养时间120h后，测得甲苯降解率为80.7％，正十六烷降解率为85.5％，汽油降解率为56.1％。

Claims (9)

1.一种潘多拉菌，其特征在于，所述潘多拉菌为潘多拉菌JWJ-06，保藏编号CGMCCNo.13558。
2.一种权利要求1所述的潘多拉菌的无机盐培养基，其特征在于，其配比为，MgSO4·7H2O：0.5g～0.7g，无水CaCl2：0.1g～0.15g，KH2PO4：0.26～0.35g，NH4NO3：0.76～1.03g，FeCl3·6H2O：0.005～0.02g，加入蒸馏水至1000mL；培养基的pH值范围为6～8。
3.一种权利要求1所述的潘多拉菌的使用方法，其特征在于，采用所述潘多拉菌JWJ-06降解有机化合物。
4.一种权利要求1所述的潘多拉菌的使用方法，其特征在于，采用所述潘多拉菌JWJ-06处理含有有机化合物的废水。
5.根据权利要求3或4所述的一种潘多拉菌的使用方法，其特征在于，采用所述潘多拉菌JWJ-06降解有机化合物或处理含有有机化合物的废水，包括如下步骤：
1)将待处理的有机化合物或含有有机化合物的废水与含有所述潘多拉菌JWJ-06的无机盐培养基混合；
2)将步骤1)中的含有所述潘多拉菌JWJ-06的混合溶液置于摇床上，于28℃～32℃下培养，并保持培养基的pH值为6～8，使无机盐培养基中的潘多拉菌JWJ-06降解有机化合物。
6.根据权利要求5所述的一种潘多拉菌的使用方法，其特征在于，所述有机化合物与培养基的体积比为(0.35～1.2)：100；
所述含有有机化合物的废水与培养基的体积比为(0.35～20)：100，其中，废水中的有机化合物与培养基的体积比为(0.35～1.2)：100；
所述每mL无机盐培养基中接种5～45×106个潘多拉菌JWJ-06。
7.根据权利要求5所述的一种潘多拉菌的使用方法，其特征在于，步骤2)中所述的培养时间为72h～120h。
8.根据权利要求5所述的一种潘多拉菌的使用方法，其特征在于，所述的有机化合物为汽油类石油烃，正十六烷，甲苯中的一种或多种。
9.一种权利要求1所述的潘多拉菌的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取采自抚顺石化公司石油三厂水净化车间的曝气池或生物膜水样，作为筛选目标菌的来源；
2)配制选育培养基
无机盐选育培养基：MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.02g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，FeCl30.05g，加蒸馏水至1000mL，pH＝7；
甲苯液体培养基：无机盐选育培养基加入适量甲苯；
正十六烷液体培养基：无机盐选育培养基加入适量正十六烷；
正十六烷固体培养基：在无机盐选育培养基的基础上，加入适量琼脂和正十六烷；
将上述培养基灭菌处理；
3)菌种的分离
通过两种途径分离目标菌：
3.1)液体培养基分离：将水样加入到正十六烷液体培养基中，摇床培养，待培养基浑浊后转接，经过数次培养筛选，最后用涂布法接种于正十六烷平板固体培养基中，从中挑选出生长好的菌种；
3.2)平板直接分离：将水样用涂布法接种于正十六烷固体培养基中，再将平板放于恒温培养箱中培养，从中挑选出生长快、生长好的菌种；
4)菌种的纯化
将步骤3)挑选的菌种采用正十六烷固体培养基平板划线法纯化，筛选出长势好的单菌落；
5)目标菌的筛选
将步骤4)筛选的单菌落菌种分别接种到含甲苯或正十六烷的液体培养基中，培养数天后，以菌种对甲苯、正十六烷的降解率来评价菌种的降解能力，从而筛选出有机化合物降解菌潘多拉菌JWJ-06。
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