CN104312944A - 一种微生物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种微生物制剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104312944A
CN104312944A CN201410495939.XA CN201410495939A CN104312944A CN 104312944 A CN104312944 A CN 104312944A CN 201410495939 A CN201410495939 A CN 201410495939A CN 104312944 A CN104312944 A CN 104312944A
Authority
CN
China
Prior art keywords
preparation
oil
bacterium
microbial preparation
gs3c
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410495939.XA
Other languages
English (en)
Inventor
党志
李静华
郭楚玲
何丽媛
易筱筠
卢桂宁
杨琛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201410495939.XA priority Critical patent/CN104312944A/zh
Publication of CN104312944A publication Critical patent/CN104312944A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2103/00—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated
    • C02F2103/34—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from industrial activities not provided for in groups C02F2103/12 - C02F2103/32
    • C02F2103/36—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from industrial activities not provided for in groups C02F2103/12 - C02F2103/32 from the manufacture of organic compounds
    • C02F2103/365—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from industrial activities not provided for in groups C02F2103/12 - C02F2103/32 from the manufacture of organic compounds from petrochemical industry (e.g. refineries)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种微生物制剂及其制备方法和应用，该微生物制剂由烷烃降解菌GS3C、菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3B三菌株组成或者由其中的GS3C和GP3B两菌株组成；所述GS3C、GY2B、GP3B已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为CCTCC NO:M207169、CCTCC NO:M206019、CCTCC NO:M207167。本发明所提供的微生物制剂可在石油污染水体和土壤生物修复中应用；水体中降解石油，其去除率可达69.2％，且对石油中的烷烃和芳烃类化合物都有较强的降解能力。以不灭菌的玉米秸秆为载体固定混合菌Gmix3，水体培养3d对石油的去除率达到98.2％。

Description

一种微生物制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一种混合菌株微生物制剂及其制法和应用。
背景技术
石油是人类生产和生活中不可缺少的重要能源和工业原料。随着石油的广泛应用，石油的开采、冶炼、加工、运输、储存等过程中的泄漏，以及含油废水废物的排放，造成了严重的环境污染。大量的石油及其加工品进入水体，导致水体缺氧，破坏生态系统平衡，若进入土壤，则破坏土壤结构，影响土壤通透性，导致土壤肥力下降，同时还能直接损害植物根部，阻碍根的呼吸与吸收，影响作物生长甚至死亡，从而直接影响人类生产和生活。石油中的多环芳烃(PAHs)具有严重的致癌变、致突变、致畸变“三致”作用，可在作物中积累，不仅影响粮食质量和产量，还可通过食物链危害生物和人类健康。因此,对石油污染水体和土壤进行治理，是摆在我们面前急需解决的问题。
生物修复技术以处理成本低、无二次污染等优势，逐渐成为治理石油污染的重要方法。石油是由饱和烃、芳香烃类化合物和少量的沥青质、树脂类等组成的复杂混合物，而单菌株往往只能代谢一种或几种有限的石油组分。混合菌群之间的共生、协同等作用可以使混合菌对石油的降解效果往往高于单株菌。目前对菌群构建的研究只是把分离得到的单菌种简单随意地组合成菌群，很难达到预期的目标。因此，利用可降解石油不同组分(烷烃和芳香烃)的优势菌种间的协同作用，可以优化组合出高效的降解菌群。
投加高效降解菌进行实地修复时，常常受到各种因素(土壤理化性质、环境因素、生物物种间竞争和捕食等)的干扰，导致投加菌数量迅速降低、无活性或者死亡，影响对石油的修复效果。
固定化微生物技术采用物理或化学手段将游离细胞(微生物)固定在多孔性的载体上，使微生物高度密集并保持其生物活性功能，减少外界不利因素对微生物的干扰，能有效改善传统生物修复技术的不足，有利于对石油污染的实地生物修复。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效石油降解菌群的构建方法及其固定化方法和应用。本发明针对上述现有石油污染生物修复技术所面临的问题，设计降解机理互补、协同作用好的混合菌剂，并将其固定化，对石油污染的水体和土壤进行修复应用。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种微生物制剂，由烷烃降解菌GS3C(Burkholderia cepacia)、菲降解菌GY2B(Sphingomonas sp.)和芘降解菌GP3B(Pandoraea pnomenusa)三菌株组成或者由其中的GS3C和GP3B两菌株组成；所述GS3C于2007年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌洛枷山，武汉大学，邮编:430072)，保藏编号为CCTCC NO:M207169；GY2B于2006年2月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M206019；GP3B于2006年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M207167。
将所述菌株混合制成固定化微生物制剂。
所述固定化微生物制剂的制备：将所述菌株混合后进行扩大培养，得到的扩大培养液再与载体进行混合培养，即得到固定化微生物制剂，所述载体为农业废弃物。
上述微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将单菌株在石油培养基中梯度驯化培养；
(2)驯化过的单菌株利用富集培养基扩大培养，离心洗涤，用无菌水配置OD600为0.5的菌悬液；
(3)将单菌株的菌悬液等体积混合，即得到微生物制剂。上述制备方法还包括如下步骤：
(a)将微生物制剂按体积百分数2％～6％的量接入2000mg/L的石油培养基，调节pH为7，30℃培养5～7天，即得混合菌的扩大培养液；
(b)将扩大培养液与载体按质量比1:1～3:5混合均匀，30℃下共培养3天，即制得固定化微生物制剂。
所述的石油培养基的配制方法：5.0mL磷酸盐缓冲液，浓度22.5g·L-1的MgSO4水溶液3.0mL，浓度36.4g·L-1的CaCl2水溶液1.0mL，浓度0.25g·L-1的FeCl3水溶液1.0mL，1.0mL微量元素溶液，2000mg石油，调pH为7.0，蒸馏水定容至1L；
所述的富集培养基为：10g蛋白胨，5g牛肉膏，5g NaCl，调pH为7.0，蒸馏水定容至1L。
所述磷酸盐缓冲液的配方为8.5g·L-1KH2PO4，21.75g·L-1K2HPO4·H2O，33.4g·L-1Na2HPO4·12H2O，5.0g·L-1NH4Cl；
所述微量元素溶液的配方为39.9mg·L-1MnSO4·H2O，42.8mg·L-1ZnSO4·H2O，34.7mg·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O，所述的石油为轻质油，密度为：0.863g·(cm3)-1。
所述的载体经如下预处理：载体为玉米秸秆、稻草秸秆或木屑，经风干，机械破碎，过0.2-0.9mm孔径的筛网，水洗至无色，60℃烘干12h以上。
所述的梯度驯化：依次增加石油的浓度为：500mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L；同时，逐渐减少单菌株相应的原始碳源浓度(其中GS3C菌的正十六烷：1500mg/L、1000mg/L、500mg/L和0；GY2B菌的菲：100mg/L、50mg/L、10mg/L和0，GP3B菌的芘：15mg/L、10mg/L、5mg/L和0)。
所述的微生物制剂在石油污染水体和土壤生物修复中的应用。微生物制剂的添加量为2～6％(w/w)。在土壤生物修复中的应用中，作为优选方案，还同时加入2～6％(w/w)的表面活性剂量和/或0.5～1％(w/w)的无机复合肥剂量。所述表面活性剂为阴-非离子混合表面活性剂SDS-TX100，摩尔比为2:1，配置的添加液中TX100浓度为2.9mmol/L，SDS浓度为5.8mmol/L。
所述烷烃降解菌GS3C，其原始碳源为十六烷；菲降解菌GY2B，其原始碳源为菲；芘降解菌GP3B，其原始碳源为芘。
本发明相对于现有技术的有益效果和优点:
(1)本发明所提供的微生物制剂由烷烃降解菌GS3C、菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3B经石油驯化和重组构建而成的高效石油降解菌群，可降解石油不同组分的优势菌株优化组合构建功能菌群，能更有效地和广泛地降解石油组分；其最佳混合比为1:1:1，最佳条件为：温度30℃，初始pH值7.0，接种量4％，石油初始浓度2000mg/L，水体中降解石油5d，其去除率达69.2％，且对石油中的烷烃和芳烃类化合物都有较强的降解能力。以不灭菌的玉米秸秆为载体固定混合菌Gmix3，水体培养3d对石油的去除率达到98.2％。将固定化混合菌剂Gmix3以2％(w/w)分3次加入石油污染浓度为13754.5mg/kg的土壤中60天可将石油去除53.0％。
(2)利用的固定化载体价格低廉，废物回收利用，加入土壤后，不仅可保护和稳定微生物，而且膨松土壤使得更多氧分子进入，吸附部分有机物与微生物充分接触，从而有利于微生物降解土壤中石油各组分，实现对石油污染土壤的生物修复。
附图说明
图1各单菌株降解石油的GC-MS谱图；
图2组合的混合菌降解石油的GC-MS谱图；
图3构建的高效石油降解菌群Gmix3降解石油的离子碎片图；
图4构建的高效石油降解菌群Gmix3的最佳生长和降解条件；
图5构建的高效石油降解菌群Gmix3降解水体中石油的动力学曲线图；
图6构建的高效石油降解菌群Gmix3降解石油过程中的GC-MS谱图；
图7秸秆固定化Gmix3与未固定化Gmix3对石油的降解效率对比图；
图8构建的高效石油降解菌群Gmix3及其固定化菌剂的电子显微镜照片，a未灭菌玉米秸秆，b灭菌玉米秸秆，c固定化前的混合菌Gmix3，d玉米秸秆固定化Gmix3，e玉米秸秆与Gmix3简单混合；
图9构建的高效石油降解菌群Gmix3的固定化制剂去除水体中石油的动力学曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1
优化最佳菌株组合
菌株组合优化包括以下步骤：
a)石油组分降解单菌株在无机盐培养基中梯度驯化培养；所述的梯度驯化：依次增加碳源—石油—的浓度为：500mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L；同时，逐渐减少单菌株相应的原始碳源浓度，其中GS3C菌的正十六烷：1500mg/L、1000mg/L、500mg/L和0；GY2B菌的菲：100mg/L、50mg/L、10mg/L和0，GP3B菌的芘：15mg/L、10mg/L、5mg/L和0；
所述的无机盐培养基的配制方法：5.0mL磷酸盐缓冲液(8.5g·L-1KH2PO4，21.75g·L-1K2HPO4·H2O，33.4g·L-1Na2HPO4·12H2O，5.0g·L-1NH4Cl)，3.0mL MgSO4水溶液(22.5g·L-1)，1.0mL CaCl2水溶液(36.4g·L-1)，1.0mL FeCl3水溶液(0.25g·L-1)，1.0mL微量元素溶液(39.9mg·L-1MnSO4·H2O，42.8mg·L-1ZnSO4·H2O，34.7mg·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O)，调pH为7.0，蒸馏水定容至1L。
所述的石油为轻质油，密度为：0.863g·(cm3)-1。
b)驯化过的单菌株利用富集培养基扩大培养，离心洗涤，用无菌水配置OD600为0.5的菌悬液；所述的富集培养基：10g蛋白胨，5g牛肉膏，5g NaCl，1L蒸馏水，调pH为7.0；
c)将单菌株的菌悬液按表1所述的不同组合等体积混合，分别按4％(体积百分数)的总量接入2000mg/L的石油培养基(上述无机盐培养基中添加2000mg/L的石油)，调节pH为7，30℃培养，测量其在5天后对石油的去除率和石油组分去除情况，以得到降解效果最佳的混合菌剂。
不同组合的菌株5天对石油的去除率如表1所示，不同组合的菌株5天对石油组分去除情况如图1～图3所示。
结果如下：
(1)不同组合的菌株5天对石油的去除率
四种单菌株(其中：GP3A为Pseudomonas，于2006年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M207166)经过长期的驯化后都能以石油为唯一碳源进行生长繁殖，对石油的去除率都达到30％以上。
但是，把可以利用石油的单菌株随意进行组合后，不一定有好的降解效果。有些组合的菌株对石油的降解效果比单菌株差，但是构建的混合菌组G3和G8效果最佳，比单菌株的去除率提高近30％，分别命名为Gmix2和Gmix3。如表1所示。高效石油降解菌群Gmix2和Gmix3包含了能利用石油组分中的烷烃类化合物的菌株(烷烃降解菌GS3C)和芳烃类化合物的菌株(菲降解菌GY2B和芘降解菌GP3B)，这些菌通过共代谢作用，可以在降解过程中产生协同效应来提高对石油的去除。
表1
(2)不同组合的菌株5天内对石油组分的去除情况
GS3C能基本去除石油中的直链烷烃化合物，GY2B对芳烃类化合物有很好的降解效果。GP3B对烷烃类和芳烃类化合物的降解效果一般，如图1所示。将降解效果较好的混合菌组G1、G3(Gmix2)、G8(Gmix3)和G11培养液中的残油进行GC-MS分析，如图2所示，这四组混合菌均包含有烷烃降解菌GS3C，能将石油中的直链烷烃类化合物基本去除，剩余一些难降解的支链烷烃。同时又含有芳烃类降解菌株，有利于混合菌对石油的完全去除。其中G8(Gmix3)对石油的总去除率最高，且对芳烃类化合物的降解效果显著，对萘同系物的去除率达到99.22％，对菲同系物的去除率达到86.02％，如图3所示。混合菌G8(Gmix3)中包含有对芳烃类化合物有强降解能力的鞘氨醇单胞菌GY2B，在混合体系中GY2B依然发挥了其降解特性。综上所述，烷烃类降解菌GS3C和芳烃类降解菌GY2B和GP3B可共生且协同降解石油组分中的烷烃类和芳烃类化合物，有利于对石油组分的完全降解。
实施例2
高效石油降解菌群Gmix3的最佳生长和降解条件
分别测试了高效石油降解菌群Gmix3中三株菌的不同比例、环境温度、培养液初始pH、接种量和不同初始石油浓度对石油的去除率和菌的生长量的影响，优化出高效石油降解菌群Gmix3的最佳降解条件为：三株菌的最佳混合比为1:1:1(OD600为0.5的母液)；最适生长条件为：温度30℃，培养液初始pH值7.0，接种量4％，石油初始浓度2000mg/L。在最佳条件下，水体中降解石油5d，其去除率达69.2％，且对石油中的烷烃和芳烃类化合物都有较强的降解能力。如图4所示。
实施例3
高效石油降解菌群Gmix3降解石油随时间的变化。
混合菌Gmix3在培养初期生长缓慢，进入对数期后，对石油的降解效果逐步增强。第4d时，混合菌的生长量激增，对石油的去除率达到了68.04％。第5天石油去除率达到最大值69.2％。此后微生物生长进入稳定期和衰亡期，老龄菌增多，幼龄菌减少，反应体系中的菌体活性减弱，并且剩余的石油组分较难被生物降解，混合菌对石油的降解速率越来越低。如图5所示。
GC-MS图谱显示，如图6所示，随着降解时间的增加，混合菌Gmix3对石油的去除效果越来越明显。在降解初期第1天时，混合菌Gmix3对石油去除效果不明显。到第3天时，谱图中优势峰为姥鲛烷峰(pristane)(35.30min)和植烷峰(40.26min)，按总峰面积计算去除率达到62.48％，大部分碳数C﹤20的直链烷烃类化合物被去除，混合菌对长链烷烃化合物的降解效果较差。第5天时，直链烷烃类化合物已经被基本去除，去除率达到83.15％，剩余一些难降解的支链烷烃类如姥鲛烷、植烷等。此后随着降解天数的增加，混合菌对石油的降解速率越来越低。
实施例4
高效石油降解菌群Gmix3的固定化制剂与未固定化的对比及其电子显微镜结构。
固定化微生物制剂的制备，包括以下步骤：
(1)石油组分降解单菌株在石油培养基中梯度驯化培养；所述的梯度驯化：依次增加石油的浓度为：500mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L；同时，逐渐减少单菌株相应的原始碳源浓度，其中GS3C菌的正十六烷：1500mg/L、1000mg/L、500mg/L和0；GY2B菌的菲：100mg/L、50mg/L、10mg/L和0，GP3B菌的芘：15mg/L、10mg/L、5mg/L和0；
所述的石油培养基的配制方法：5.0mL磷酸盐缓冲液(8.5g·L-1KH2PO4，21.75g·L-1K2HPO4·H2O，33.4g·L-1Na2HPO4·12H2O，5.0g·L-1NH4Cl)，3.0mLMgSO4水溶液(22.5g·L-1)，1.0mL CaCl2水溶液(36.4g·L-1)，1.0mL FeCl3水溶液(0.25g·L-1)，1.0mL微量元素溶液(39.9mg·L-1MnSO4·H2O，42.8mg·L-1ZnSO4·H2O，34.7mg·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O)，2000mg石油，调pH为7.0，蒸馏水定容至1L。
所述的石油为轻质油，密度为：0.863g·(cm3)-1。
(2)驯化过的单菌株利用富集培养基扩大培养，离心洗涤，用无菌水配置OD600为0.5的菌悬液；所述的富集培养基：10g蛋白胨，5g牛肉膏，5gNaCl，1L蒸馏水，调pH为7.0；
(3)将单菌株的菌悬液等体积混合，即为本发明的高效微生物制剂；
(4)扩大培养：将高效微生物制剂按4％(体积百分数)的量接入2000mg/L的石油培养基，调节pH为7，30℃培养5天，即可得高效石油降解菌群的扩大培养液；
(5)固定化制剂：载体(玉米秸秆/稻草秸秆)经风干，机械破碎，过0.2-0.9mm孔径的筛网，自来水洗涤至无色，60℃烘干12h以上；将上述扩大培养液与载体(玉米秸秆/稻草秸秆)按质量比3:5混合均匀，30℃下共培养3天，即为高效石油降解菌群的固定化制剂。
(6)以20～30g/L(载体干重)的菌剂量加入石油培养基中(石油初始浓度为2000mg/L)并以相同质量的玉米秸秆、稻草秸秆分别和高效石油降解菌群Gmix3简单混合配成载体与菌液的混合物，以只有游离状态的Gmix3为对照，置于30℃、转速为180r/min的摇床振荡培养3d，测其石油去除率。
如图7所示，采用稻草/玉米秸秆固定化混合菌Gmix3的效果高于未固定化过的游离菌Gmix3，也高于稻草/玉米秸秆与Gmix3的简单混合物。稻草/玉米秸秆对石油有一定的分散作用，同时还能将石油吸附到秸秆表面。只加入秸秆的石油培养基，石油都分散到溶液中形成大量的油/水界面，有利于界面上石油的生物降解。经过固定化的混合菌Gmix3表现了很强的石油去除效果，比未固定化的游离混合菌Gmix3提高了近40％，稻草秸秆固定化Gmix3第3天的石油去除率达到了90％～95％，玉米秸秆固定化Gmix3第3天的石油去除率达到了95％～98％。混合菌经过固定化后，大量微生物被吸附到秸秆内的空隙中形成高浓度菌群，而培养基中还有少量悬浮的微生物，两部分微生物同时对石油进行降解，使得石油的去除效果得到很大的提升。秸秆是否经过灭菌处理对石油的去除效果也有一定的影响。不灭菌的效果都比灭菌的效果要好。秸秆类物质一般含有约16％～25％的木质素，它是纤维素的外围基质，起着赋予纤维机械强度以及保护纤维素免遭破坏的作用。但是在温度为120℃，压力维持在0.1～0.15MPa的高温高压状态下灭菌30分钟后，部分木质素受到了高温蒸汽的破坏，秸秆上的吸附位减少，对石油和混合菌的吸附能力下降，影响了对石油的去除效果。
由扫描电子显微镜图8所示，未灭菌的秸秆表面经过破碎机而造成部分碎裂，暴露出秸秆内部紧密排列的中空纤维素管，秸秆内的木质素未被破坏，仍能支撑起秸秆内多片层结构的中空纤维素管，使秸秆具有较大的比表面积，较多的吸附位点，有利于吸附混合菌Gmix3进行表面吸附固定化，秸秆内的中空纤维素管还有利于底物和代谢产物的扩散，为维持微生物正常生理代谢提供了足够的空间和氧气。秸秆与Gmix3的混合物因未进行固定化，秸秆表面吸附的微生物量较少且吸附得不牢固，容易被冲洗下去。经过固定化的混合菌Gmix3能吸附在中空纤维素管内部以及秸秆的缝隙间，混合菌菌体密度明显未固定化中的高，而且混合菌成团状生长，菌体形态均匀表面光滑。
总之，采用秸秆固定化混合菌Gmix3的效果高于未固定化过的游离菌Gmix3，也高于秸秆与Gmix3的简单混合物。不灭菌的秸秆作为载体固定混合菌Gmix3后，既利用了秸秆对石油的分散和吸附作用，又充分利用了混合菌对石油的生物降解作用，促进石油的去除效果，能更有效的把石油从环境中清除。
实施例5
高效石油降解菌群Gmix3固定化制剂对水体中石油的降解情况。
以20～30g/L(载体干重)的高效石油降解菌群的固定化菌剂量加入石油培养基中(石油初始浓度为2000mg/L)，置于30℃、转速为180r/min的摇床振荡培养，不同时间点取样测其石油去除率。
如图9所示，玉米秸秆固定化Gmix3对石油的去除率随着时间的增加而逐渐增大。在降解1d后，对石油的去除率已经达到了84.39％，比游离混合菌Gmix3在1d时的去除率提高了近60％，显著强化了混合菌的降解速率。降解3d后，对石油的去除率达到了93.81％，此后随着时间的增加对石油的去除效果趋于平缓。以玉米秸秆为例，但不仅限于玉米秸秆。
实施例6
高效石油降解菌群Gmix3固定化制剂对土壤中石油的降解情况。
采用正交实验设计，利用高效石油降解菌群Gmix3固定化制剂对石油污染土壤进行修复实验，将Gmix3固定化制剂投加总量、菌剂投加次数、表面活性剂用量和无机复合肥量设置为四个因素，每个因素三个水平。实验用土壤为某炼油厂附近实际污染的土壤，pH为4.1～4.3，有机质含量约为4％，C:N:P为116:4:1，属于砂质粘壤土。实验在尺寸为170mm/120mm/150mm的盆钵中进行，每个盆钵装1.5kg的土，置于实际环境条件：温度27℃-34℃；相对湿度40％-70％。高效石油降解菌群Gmix3固定化制剂含有总菌量约2.98×108c.f.u./g载体(此处为木屑，但是不仅局限于木屑)。菌剂投加时间点分别为初始、第7天和第14天。表面活性剂为阴-非离子混合表面活性剂SDS-TX100，摩尔比为2:1，配置的添加液中TX100浓度为2.9mmol/L，SDS浓度为5.8mmol/L。无机复合肥为恩泰克稳定性长效复合肥，氮磷钾比例：22:7:11，总养分≥40％(含硝态氮)，属于硫酸钾型复合肥，相应剂量的三分二磨碎后直接加入土壤作为缓释肥，剩下的三分之一溶于水溶液注入土壤作为速效肥。每2～3天翻耕土壤并补水至20％左右。2个月后，测量总石油烃的变化。
如表2所示，石油去除效果最佳的条件为2％(w/w)的石油降解菌群Gmix3固定化制剂分3次加入，且加入6％(v/w)的SDS-TritonX-100(摩尔比为2:1)，60天可将酸性土壤中的总石油烃浓度从13754.5mg/kg降低至6464.6mg/kg，去除了53％。当土壤中的C:N:P为116:4:1时，无需加入无机复合肥，因为无机复合肥含有一定盐成分，不利于微生物的生长繁殖。制剂投加量和投加次数对去除土壤中的石油均有显著性的影响。
表2
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂由烷烃降解菌GS3C(Burkholderia cepacia)、菲降解菌GY2B(Sphingomonas sp.)和芘降解菌GP3B(Pandoraea pnomenusa)三菌株组成或者由其中的GS3C和GP3B两菌株组成；所述GS3C、GY2B、GP3B已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为CCTCC NO:M207169、CCTCC NO:M206019、CCTCC NO:M207167。
2.根据权利要求1所述的微生物制剂，其特征在于，将所述菌株混合制成固定化微生物制剂。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述固定化微生物制剂的制备：将所述菌株混合后进行扩大培养，得到的扩大培养液再与载体进行混合培养，即得到固定化微生物制剂，所述载体为农业废弃物。
4.权利要求1～3任一项所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将单菌株在石油培养基中梯度驯化培养；
(2)驯化过的单菌株利用富集培养基扩大培养，离心洗涤，用无菌水配置OD600为0.5的菌悬液；
(3)将单菌株的菌悬液等体积混合，即得到微生物制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
(a)将微生物制剂按体积百分数2％～6％的量接入2000mg/L的石油培养基，调节pH为7，30℃培养5～7天，即得混合菌的扩大培养液；
(b)将扩大培养液与载体按质量比1:1～3:5混合均匀，30℃下共培养3天，即制得固定化微生物制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
所述的石油培养基的配制方法：5.0mL磷酸盐缓冲液，浓度22.5g·L-1的MgSO4水溶液3.0mL，浓度36.4g·L-1的CaCl2水溶液1.0mL，浓度0.25g·L-1的FeCl3水溶液1.0mL，1.0mL微量元素溶液，2000mg石油，调pH为7.0，蒸馏水定容至1L；
所述的富集培养基为：10g蛋白胨，5g牛肉膏，5g NaCl，调pH为7.0，蒸馏水定容至1L。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
所述磷酸盐缓冲液的配方为8.5g·L-1KH2PO4，21.75g·L-1K2HPO4·H2O，33.4g·L-1Na2HPO4·12H2O，5.0g·L-1NH4Cl；
所述微量元素溶液的配方为39.9mg·L-1MnSO4·H2O，42.8mg·L-1ZnSO4·H2O，34.7mg·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O，所述的石油为轻质油，密度为：0.863g·(cm3)-1。
8.根据权利要求4～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的载体经如下预处理：载体为玉米秸秆、稻草秸秆或木屑，经风干，机械破碎，过0.2-0.9mm孔径的筛网，水洗至无色，60℃烘干12h以上。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的梯度驯化：依次增加石油的浓度为：500mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L；同时，逐渐减少单菌株相应的原始碳源浓度，其中GS3C菌的正十六烷：1500mg/L、1000mg/L、500mg/L和0；GY2B菌的菲：100mg/L、50mg/L、10mg/L和0，GP3B菌的芘：15mg/L、10mg/L、5mg/L和0。
10.权利要求1～3任一项所述的微生物制剂在石油污染水体和土壤生物修复中的应用。
CN201410495939.XA 2014-09-24 2014-09-24 一种微生物制剂及其制备方法和应用 Pending CN104312944A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410495939.XA CN104312944A (zh) 2014-09-24 2014-09-24 一种微生物制剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410495939.XA CN104312944A (zh) 2014-09-24 2014-09-24 一种微生物制剂及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104312944A true CN104312944A (zh) 2015-01-28

Family

ID=52368262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410495939.XA Pending CN104312944A (zh) 2014-09-24 2014-09-24 一种微生物制剂及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104312944A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475144A (zh) * 2017-04-11 2017-12-15 辽宁科技大学 一种潘多拉菌及其使用方法
CN109052656A (zh) * 2018-07-13 2018-12-21 中国地质科学院水文地质环境地质研究所 一种活性炭粉-降解菌组合物及地下水修复技术
CN110511890A (zh) * 2019-08-23 2019-11-29 北京大学 一种原油降解微生物功能互补的配伍方法及其指导配伍的原油降解菌群
CN111440756A (zh) * 2020-05-22 2020-07-24 西安文理学院 一种利用嗜热菌处理石油污水的方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475144A (zh) * 2017-04-11 2017-12-15 辽宁科技大学 一种潘多拉菌及其使用方法
CN109052656A (zh) * 2018-07-13 2018-12-21 中国地质科学院水文地质环境地质研究所 一种活性炭粉-降解菌组合物及地下水修复技术
CN109052656B (zh) * 2018-07-13 2021-04-16 中国地质科学院水文地质环境地质研究所 一种活性炭粉-降解菌组合物及地下水修复技术
CN110511890A (zh) * 2019-08-23 2019-11-29 北京大学 一种原油降解微生物功能互补的配伍方法及其指导配伍的原油降解菌群
CN111440756A (zh) * 2020-05-22 2020-07-24 西安文理学院 一种利用嗜热菌处理石油污水的方法
CN111440756B (zh) * 2020-05-22 2023-05-26 西安文理学院 一种利用嗜热菌处理石油污水的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100405895C (zh) 一种无土栽培复合基质及其制备方法
CN107282628A (zh) 一种修复农田污染土壤的复合改良剂及其制备方法
CN109652088A (zh) 一种土壤修复生物炭改良材料
CN101717301B (zh) 一种胶囊型微生物肥料及制备方法
CN109536173B (zh) 一种同时修复重金属和草甘膦的复合材料及其制备方法
CN105272621A (zh) 凹凸棒土负载芽孢杆菌复合生物活性材料的制备及应用
CN101724582A (zh) 一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法
CN103205382A (zh) 一种用于净化河道污水的微生物菌剂及其制备方法
CN103773722B (zh) 耐盐并具有低温生物脱氨功能的枯草芽孢杆菌及其应用
CN101362596A (zh) 生态型碳减排的系统化方法
CN1802926A (zh) 一种防治设施栽培连作障碍的双重调控剂及其制备方法
HUE030268T2 (en) Microorganism fermentation processes and preparations
KR101782135B1 (ko) 동물 사체 처리 방법
CN104774772B (zh) 一种具有增肥效果的秸秆腐解菌剂及其应用
CN101244955A (zh) 一种生物肥及其制备方法
CN102296043B (zh) 高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物
CN104312944A (zh) 一种微生物制剂及其制备方法和应用
CN102653754A (zh) 一种去除土壤中残留农药的微生物固定化颗粒的制备方法
CN110950707A (zh) 一种沙化土壤改良剂及其制备方法
CN108048371A (zh) 一种多功能农业土壤修复菌剂及其制备方法和应用
CN108048111A (zh) 微生物多功能土壤改良剂及其制备方法
CN104152432A (zh) 石油烃降解菌载体材料及制备方法及用途
CN1820572A (zh) 荒漠化土地快速恢复剂
CN106903151A (zh) 利用秸秆实现堆肥化修复污染土壤的方法
CN103621210A (zh) 一种提高潮土有效磷含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150128

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication