CN115074284B - 一种互生微生物组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种互生微生物组合及其应用。本发明分离得到一种可降解石油的寡氮菌E5，其属于潘多拉菌属，本身具备一定降解石油的能力。本发明进一步提供潘多拉菌E5和固氮菌PJ 12的组合，将这两种菌株组合后，可以有效提高潘多拉菌E5降解石油的能力，具体在降解石油中的各类烷烃和芳香烃的效率上显著提高。本发明提供的潘多拉菌E5和固氮菌PJ 12组合依靠两者间的协同基质可以实现氮素需求的供给，形成持续稳定的碳氮交互微环境，同时还进一步提高了石油降解效率，在针对石油污染的微生物修复领域具有重要意义。

Description

一种互生微生物组合及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种互生微生物组合及其应用。

背景技术

石油污染是指石油开采、运输、装卸、加工和使用过程中，由于泄漏和排放石油引起的污染。例如输油管线腐蚀渗漏污染土壤和地下水源，不仅造成土壤盐碱化、毒化，导致土壤破坏和废毁，而且其有毒物还可能通过农作物尤其是地下水进入食物链系统，造成更大的危害。而对于石油污染的区域，由于石油烃大量进入环境造成的C/N失衡对于污染区域的生物修复效率产生较大阻碍。

现有技术中，寻找外源氮肥的天然替代者，是生物修复的研究热点。微生物固氮是一种广泛应用的生物技术，可作为无机氮改良的替代方法，并克服修复过程中的营养缺乏。将固氮菌引入污染土壤后，通过生物固氮作用为石油降解微生物提供所需的氮，是补充氮素的重要候选者。固氮菌的这一特性使得此微生物群落适合于原位石油生物修复，而不需要补充外源氮素，是修复石油污染环境的优势菌种资源。但是固氮菌虽然可以固氮，其主要作用还是在于满足自身的生长需求，因此应用仍然受限。

发明内容

为了解决现有技术的技术问题，本发明提供一种互生微生物组合及其应用，通过组合潘多拉菌E5和固氮菌PJ12，可以有效修复石油污染环境。

第一方面，本发明提供一种互生微生物组合，包括潘多拉菌E5和固氮菌PJ12。

潘多拉菌E5公开于“李方玲,张雅坤,梁立宝,王小通,杜显元,王磊.石油污染环境中固氮和寡氮营养细菌的分离鉴定及其特性.微生物学报,2022,62(2):661-671。是其中表3涉及的Pandoraea sp.E5。

固氮菌PJ12保藏编号为CGMCC No.14659，公开于专利CN2018102987868。

本发明将在石油污染条件下具有高效固氮能力的固氮菌Azotobacter sp.PJ 12和能适应石油污染低氮环境的寡氮菌Pandoraea sp.E5进行复配，构建和培育适应贫氮环境的高效降解菌株组合，两种菌株相互协作，有效提高了固氮酶活性和降解石油的能力，在降解石油污染物方面，具有良好、积极的应用前景。

进一步地，所述潘多拉菌E5和所述固氮菌PJ12的菌落数比为(1000～3000)：(1～3)。

进一步地，所述互生微生物组合中，所述潘多拉菌E5的总活菌数为10⁷～10⁸cfu/g；所述固氮菌PJ 12的总活菌数为10⁵～10⁶cfu/g。

本发明进一步提供所述互生微生物组合在促进固氮菌生长中的应用。

本发明进一步提供所述互生微生物组合在降解石油中的应用。

本发明进一步提供所述互生微生物组合在降解C₁₇-C₃₆的长链烷烃和芳香烃中的应用。

本发明进一步提供所述互生微生物组合在石油污染土壤的修复中的应用。

本发明具备如下有益效果：

本发明组合寡氮石油降解菌E5和固氮菌PJ 12，提供了一种互生组合，依靠菌株之间的互作机制实现氮素需求的供给，形成持续稳定的碳氮交互微环境，补偿了氮限制，并消除了石油污染土壤生物修复中对外源氮的需要。此外，两个菌株还存在协同作用，在提高固氮菌PJ 12的固氮酶活性的基础上，还具备较高的石油降解能力，对于C₁₇-C₃₆和芳烃组分的去除率分别为65.93％和76.15％，在针对石油污染的环境修复领域具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的石油环境中寡氮菌E5-phe(a)和固氮菌PJ12-nifH(b)拷贝数。

图2为本发明实施例2提供的菌株E5和PJ12单培养及共培养状态下烷烃降解情况。

图3为本发明实施例2提供的菌株E5和PJ12单培养及共培养状态下芳香烃降解情况。

图4为本发明实施例3提供的单培养和共培养状态下固氮菌PJ12的固氮酶活。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的培养基，包括(均为配置1L培养基所需的量，其中固体培养基琼脂含量为15g/L)：

LB培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，去离子水1L，pH 7.0。

GMCY培养基：葡萄糖10g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaMoO₄·2H₂O 0.001g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，酵母提取物0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，麦芽浸粉0.5g，去离子水1L，pH 7.0。

改良无氮培养基：K₂HPO₄ 1g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O0.2g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.001g，葡萄糖10g，去离子水1L，pH 7.0。

无机盐培养基：向改良无氮培养基中添加0.7g(NH₄)₂SO₄。

实施例1本发明所述互生组合的菌株共培养

寡氮菌E5的最适生长培养基是LB培养基，固氮菌PJ 12的最适生长培养基是GMCY培养基。在150rpm和30℃的条件下，富集培养至对数期后，8000rpm 5min离心收菌，并用无菌水洗涤3次，制成接种菌悬液。

将菌悬液单独接种或混合接种至三角瓶中，每个三角瓶中含有30mL以1％石油为唯一碳源的无氮液体培养基。调整每个菌株的初始细胞密度OD₆₀₀为0.2。以不接菌的培养基为对照。

由于寡氮菌E5和PJ 12两菌株的菌落形态无明显区分，活菌计数法不适用了解其生长状态。因此，本发明采用RT-qPCR的方法，于1、3、5、8、10、12、14天，利用菌株特有基因(E5-phe、PJ12-nifH)的拷贝数来表征菌株生长状态。

1、全基因组DNA提取

使用北京艾德莱生物科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(产品编号：DN1201)。(如果样品中含有石油，需在收菌后用灭过菌的滤纸吸去石油，防止石油膜的存在影响DNA的提取效率)。所提取的DNA溶液取1μL用Nanodrop微量分光光度计测试浓度和纯度，剩余样品保存于-20℃冰箱中待用。

2、实时荧光定量PCR检测基因表达水平

(1)E5-phe和PJ12-nifH基因的扩增

固氮酶基因nifH PCR扩增(nifH-360bp)

PCR扩增体系(25μL)：2×Taq PCR Mix预混液12.5μL、nifH-PolF 1μL、nifH-PolR1μL、DNA模板2μL和ddH₂O 8.5μL

PCR反应条件：预变性95℃4min；变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s，35个循环；延伸72℃10min；保存4℃。

苯酚羟化酶phe PCR扩增(phe-206bp)

PCR扩增体系(25μL体系)：2×Taq PCR Mix预混液12.5μL、phe-F 1μL、phe-R 1μL、DNA模板2μL、ddH₂O 8.5μL。

PCR反应条件：预变性95℃10min；变性95℃1min，退火60℃1min，延伸72℃2min，30个循环；延伸72℃10min，保存4℃。

经琼脂糖凝胶电泳检测，证明得到PCR产物。

(2)PCR产物胶回收

胶回收试剂盒采用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(产品编号：AP-GX-50)，具体步骤参照试剂盒说明书。

(3)连接和转化

连接：

连接体系(10μL)：pMD-18T 1μL、DNA 150ng-350ng、Solution I 5μL和ddH₂O(补至10μL)。

将上述反应体系混合均匀后，在16℃条件下反应30min。

转化：

(1)将10μL连接体系全部加入融化好的50μL感受态细胞E.coli DH5α中，轻轻混匀，冰上静置30min；

(2)放入42℃金属浴热激90s，切勿摇动。后迅速至于冰中静置5min；

3、蓝白斑阳性克隆筛选

(1)将转化反应后的菌液涂布到含有抗性的LB平板上，37℃培养12-16h，进行蓝白斑筛选；

(2)挑取单克隆作为模板，使用目的基因的引物进行菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的条带送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序，序列比对无误后确定阳性克隆。

4、质粒提取

质粒提取使用广州美基(Magen)生物科技有限公司的质粒快速小提试剂盒(产品编号：P1001-02)，具体步骤详见说明书。

5、实时荧光定量PCR标准曲线制作

首先将提取出的质粒采用Nanodrop超微量分光光度计测定其OD₂₆₀值，并根据以下公式计算得到质粒浓度，式中各值的含义如表2-7所示。

c＝N×D₂₆₀×50×10^-6/M_r×6.02×10²³

M_r＝n×660

表1质粒浓度公式中各参数的含义

参数	含义
		c	质粒的浓度，copies·mL-1
N	测量吸光度值时质粒稀释的倍数
		50×10-6	OD260＝1.0的质粒以g·Ml-1
Mr	质粒的相对分子质量，g·mol-1
		6.02×1023	阿伏伽德罗常数值
n	质粒所含碱基对数，bp
		660	碱基对的平均相对分子质量

根据计算得到的质粒浓度将提取的质粒DNA分别稀释10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9，制成标准溶液。质粒DNA浓度和拷贝数之间的换算由http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html自动完成。将上述标准溶液作为模板进行实时定量PCR，PCR扩增结束后以Ct值为横坐标、lg(拷贝数)为纵坐标绘制标准曲线。

含2种基因片段的质粒标准溶液浓度范围及标准曲线如表2-8所示。

表2质粒标准溶液浓度范围及标准曲线

6、实时荧光定量PCR检测基因表达水平

于1、3、5、8、10、12天提取样品DNA，利用nifH、phe基因各自的引物扩增基因片段，实验设置3个重复。将DNA模板换成不同的DNA样品，PCR结束后利用标准曲线和各样品的Ct值计算目的基因拷贝数。

具体方法如下：

PCR扩增体系(10μL)：SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ5μL、PCR Forward Primer(10μM)1μL、PCR Reverse Primer(10μM)1μL、DNA模板1μL、ddH₂O 2μL。

两步法反应程序如下:

第一步

第二步Melting Cure分析

95℃ 15s，

60℃ 1min，

95℃ 15s。

结果表明：如图1所示，当固氮菌PJ12与寡氮菌E5复配后基因拷贝数明显增加，表明共培养能够促进菌株在无氮源添加石油污染环境中的生长能力。

实施例2互生组合石油降解率分析

将寡氮菌、固氮菌、固氮菌和寡氮菌组合分别接种于无氮源添加的1％石油污染物中，培养15天后，以正己烷为溶剂萃取石油中的烷烃，苯和二氯甲烷1:1作溶剂萃取石油中的芳香烃，之后利用气相色谱仪分析石油烃各组分降解情况。

1、培养基中残留石油的提取

(1)将摇床中培养至取样时间点的三角瓶取出，加入10mL正己烷抽提培养物中的石油，转移至50mL分液漏斗中；

(2)适量正己烷清洗三角瓶，将萃取液合并至分液漏斗中。充分震荡后静置，待有机相与水相完全分层后，弃掉下层水相，将上层有机相倒入干净平皿中；

(3)5mL正己烷充分润洗分液漏斗残余有机相；

(4)用枪头小心吸取有机相至离心管中，避开残余水相和杂质；

(5)将有机相定容至10mL，取1mL加入安捷伦进样瓶中，用于分析烷烃组分含量；

(6)再取1mL于安捷伦进样瓶中，干燥挥发掉正己烷溶剂后，加入苯和二氯甲烷1:1的有机溶剂，用于分析芳香烃组分含量。

2、气相色谱(GC)检测方法：

色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为N2。氢气30ml/min，空气250ml/min，氮气尾吹流量30ml/min。

烷烃程序：进样口温度为300℃，FID检测器温度为250℃，不分流。升温条件：起始温度50℃，保持5min，以40℃/min升温到230℃，以20℃/min升温到320℃，保持20min(自动进样1μL)。

芳香烃程序：进样口温度为250℃，FID检测器温度为300℃，不分流。升温条件：起始温度40℃，保持2min，以10℃/min升温到100℃，以15℃/min升温到250℃，以20℃/min升温到345℃，保持3.25min(自动进样1μL)。

表3 E5和PJ12单培养或共培养状态下石油烃降解率

结果表明：如图2和图3所示，固氮菌PJ12与寡氮菌E5的互生组合有效的促进了对石油烃的降解，其中对长链烷烃的降解率达到65％左右，而对芳香烃的降解率提高到76.15％(表3)。说明，寡氮菌E5和固氮菌PJ12共培养可以有效提高石油烃降解能力。

实施例3互生组合中固氮菌固氮酶活性检测

1、固氮菌培养

(1)将固氮菌PJ 12分别单培养或者与寡氮菌Pandoraea sp.E5共培养于三角瓶中。每个三角瓶中含有100mL无氮液体培养基，并添加1％石油为唯一碳源；

(2)于1、3、5、7、9、11、13、16、19天取菌液1mL于5mL的厌氧血清瓶中；

(3)利用气体置换装置，将血清瓶中的空气置换为惰性气体氩气；

(4)使用气体发生器，利用电石和水制备乙炔气体。用注射器向每个血清瓶中充入10％(V/V)乙炔，30℃培养24h后利用气相色谱仪测试血清瓶中的乙烯含量。

2、固氮酶活性测定(乙炔还原法)

(1)打开气体发生器(GCS-300)，首先打开H₂和AIR开关，气体流量稳定在40mL/min时，打开N₂开关使气体流量稳定在30mL/min后，开启气相色谱仪(GC522)；

(2)按气相色谱仪上的“起始”键，仪器逐渐升温，柱箱温度需升温至70℃；

(3)打开电脑软件，依次点击：online-通道1-数据采集-查看基线，此时基线平稳；

(4)待“准备”灯亮起后点火，此时基线突升，进行零点校准(每一次进样前都需要零点校准)；

(5)使用微量进样器手动进样100μL，点击采集数据，出峰后记录峰面积和保留时间(乙烯出峰时间3min左右)；

固氮酶活(nmoL C₂H₄)的计算公式为：

结果表明：固氮酶活性动态检测中发现，固氮菌与寡氮菌复配后，固氮酶活在早期均高于单培养(图4)，其中固氮菌PJ12在共培养的第1天具有最高的固氮酶活性(2629nmolC₂H₄)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种互生微生物组合，其特征在于，所述微生物为潘多拉菌（Pandoraea sp.）E5和固氮菌（Azotobacter sp.）PJ12；所述固氮菌PJ12的保藏编号为：CGMCC No.14659。

2.根据权利要求或1所述的互生微生物组合，其特征在于，所述互生微生物组合中，所述潘多拉菌E5和所述固氮菌PJ12的菌落数比为（1000~3000）：（1~3）。

3.根据权利要求2所述的互生微生物组合，其特征在于，所述互生微生物组合中，所述潘多拉菌E5的总活菌数为10⁷~10⁸ cfu/g；所述固氮菌PJ12的总活菌数为10⁵~10⁶cfu/g。

4.权利要求1-3任一项所述的互生微生物组合在促进所述互生微生物组合中固氮菌PJ12生长中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的互生微生物组合在降解石油中的应用。

6.权利要求1-3任一项所述的互生微生物组合在降解C₁₇-C₃₆的长链烷烃和芳香烃中的应用。

7.权利要求1-3任一项所述的互生微生物组合在石油污染土壤的修复中的应用。