CN107456471A - 石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用、药物及其制备方法 - Google Patents
石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用、药物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用、药物及其制备方法。石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用。一种用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物，其原料包括石榴皮。一种用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的制备方法，包括：取石榴皮于水溶液中浸泡2‑3小时，将浸泡有石榴皮的溶液煎煮30‑50min后过滤。石榴皮或者石榴皮水煎剂能够有效诱导骨髓间充质干细胞向病损组织迁移、分化，同时石榴皮或者石榴皮水煎剂能够促进SDF‑1蛋白的表达。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用、药物及其制备方法。
背景技术
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是目前研究最多、应用潜力最大的干细胞之一，是研究增殖与分化机理的理想模型。但是，骨髓中MSCs含量极少，临床多采用静脉注射的方式给药，因此静脉注射给药以后，干细胞迁移归巢至损伤组织的多少成为影响干细胞疗效的重要因素。众多的动物整体实验、临床实验、细胞实验研究均表明，移植的MSCs迁移归巢能力不够，严重限制了MSCs的应用研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用、药物及其制备方法，其旨在通过寻找有效诱导骨髓间充质干细胞向病损组织迁移、分化的药物来提高疗效以解决骨髓间充质干细胞移植的低迁移率问题。
本发明提供一种技术方案：
石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用。
进一步地，上述石榴皮的水煎剂在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用。
进一步地，上述石榴皮在提高SDF-1蛋白的表达中的应用。
本发明还提供一种技术方案：
一种用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物，其原料包括石榴皮。
进一步地，上述药物组合物包括石榴皮水煎剂、骨髓间充质干细胞。
进一步地，上述骨髓间充质干细胞以静脉注射的方式给药。
进一步地，上述石榴皮水煎剂的给药方式为口服。
本发明还提供一种技术方案：
一种用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的制备方法，包括：取石榴皮于水溶液中浸泡2-3小时，将浸泡有石榴皮的溶液煎煮30-50min后过滤。
进一步地，上述石榴皮与水溶液的比例为1：15-20。
进一步地，上述将浸泡有石榴皮的溶液煎煮30-50min后，向煎煮后的混合物中加入水再进行煎煮后过滤。
本发明提供的石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用、药物及其制备方法的有益效果是：
石榴皮或者石榴皮水煎剂能够有效诱导骨髓间充质干细胞向病损组织迁移、分化，同时石榴皮或者石榴皮水煎剂能够促进SDF-1蛋白的表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试验例中BMSCs在各组织的分布情况；
图2为试验例中各组大鼠结肠组织SDF-1蛋白表达情况。
具体实施方式
MSCs在骨髓中的含量极低，仅占骨髓单核细胞的0.001％～0.010％，并且干细胞归巢数量少，在损伤区分化和生存率低，中药以其独特的优势在众多诱导MSCs分化实践应用中成为首选。研究表明，传统单味中药或提取物、中药复方同样能有效干预MSCs增殖、分化，如神经细胞、肌成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等。MSCs和中药都具有抗炎和免疫调节作用，在临床治疗众多难治性疾病，即骨伤疾病、心脑血管疾病、神经系统疾病、血液系统疾病、消化系统疾病等。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中应用、药物及其制备方法进行具体说明。
石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用。
石榴皮中的化学成分非常丰富，主要包括鞣质、蜡、树脂、甘露醇、糖、没食子酸、树胶等，其中酚类、鞣质类、黄酮类、安石榴苷等物质具有收敛、止血、驱虫的作用。
进一步地，在本发明的实施例中，将石榴皮的水煎剂在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用。
经过发明人的实验发现，石榴皮能诱导BMSCs的归巢，进行损伤修复。
参与干细胞定向迁移分化与组织修复过程的趋化因子包括基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、干细胞因子、骨桥蛋白(OPN)等。
进一步地，在本发明的实施例中，石榴皮应用于提高SDF-1蛋白的表达中。
基质细胞衍生因子1(Stromal cell derived factor-1，SDF-1)，即CXCL12，最早是从骨髓的基质细胞中分离出来的，后持续由一些细胞分泌产生，如成骨细胞、骨髓基质细胞、肌肉组织和淋巴结的间质细胞等。
发明人的研究发现，石榴皮可以提高SDF-1蛋白的表达，进而抑制BMSCs的凋亡，促进BMSCs归巢增殖。
CXCR4(趋化因子CXC亚组受体-4；chemokine receptor 4)是目前已知的SDF-1特异性受体，表达于多种组织细胞膜表面。SDF-1/CXCR4轴具有抑制BMSCs的凋亡、增加其存活率及增殖活性等作用，对BMSCs迁移到损伤部位至关重要，并体现在BMSCs归巢的各个阶段。
例如，随血液循环到达组织损伤处：SDF-1作为调节BMSCs动员和定向迁移的主要化学引诱物，能够增加细胞的运动能力，并且使BMSCs的30多种基因表达发生显著变化。
承上所述，体外培养过程中SDF-1/CXCR4轴能促进血管新生，上调血管内皮生长因子水平，同时能抑制BMSCs的凋亡，促进其归巢增殖。进一步地，SDF-1与CXCR4特异性结合后通过一系列变化，使BMSCs内的遗传信息发生改变，出现肌动蛋白等迅速聚合的效应，进而诱导BMSCs向损伤处归巢，发挥再生修复的作用。
本发明还提供一种技术方案：
一种用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物，其原料包括石榴皮。
进一步地，上述药物组合物包括石榴皮水煎剂、骨髓间充质干细胞。
进一步地，上述骨髓间充质干细胞以静脉注射的方式给药。进一步地，上述石榴皮水煎剂的给药方式为口服。
BMSCs的移植方式有两种，即局部移植和外周静脉移植。局部腹腔途径移植方法操作简单，创伤性小，对干细胞基本无丢失，可以移植足够数量的干细胞，但是其主要缺点是腹腔内微环境复杂，且细胞植入起始环境差，细胞活力会受到很大影响，干细胞很难存活。外周静脉移植主要是尾静脉注射移植，移植后通过血液循环途径到达受损部位定植，此种方法难度不大，方便可行，然而细胞的静脉注射属于全身给药，经静脉先入体循环，后入肺循环，更有利于干细胞的存活和迁移。
所以，在本发明较佳的实施例中，BMSCs的给药方式为静脉注射；石榴皮水煎剂的给药方式为口服。在本发明的其他实施例中，石榴皮水煎剂的给药剂型可以为多种，例如片剂、胶囊、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂等。
进一步地，在其他实施例中，本发明提供的用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物还包括药学上可接受的载体或辅料。例如稀释剂、吸收剂、湿润剂、粘合剂以及崩解剂等。
本发明还提供一种技术方案：
一种用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的制备方法，包括：取石榴皮于水溶液中浸泡2-3小时，将浸泡有石榴皮的溶液煎煮30-50min后过滤。
进一步地，上述石榴皮与水溶液的比例为1：15-20。
进一步地，上述将浸泡有石榴皮的溶液煎煮30-50min后，向煎煮后的混合物中加入水再进行煎煮后过滤。
具体地，本实施例中的制备方法如下：称取干燥石榴皮原材料50g，在1000mL烧杯中用蒸馏水浸泡2h(液面淹没药材3cm左右)。分煎2次，每次加水量为400ml；煎煮时间为30min，纱布过滤去渣，合并滤液，总煎液持续加热浓缩至476.5mL，即得内含生药量为0.105g/ml的石榴皮水煎液，置冰箱4℃保存备用。用时水浴加温至25℃。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种药物，该药物由以下制备方法制得：
称取干燥石榴皮原材料50g，在1000mL烧杯中用蒸馏水浸泡2h(液面淹没药材3cm左右)。分煎2次，每次加水量为400ml；煎煮时间为30min，纱布过滤去渣，合并滤液，总煎液持续加热浓缩至476.5mL，即得内含生药量为0.105g/ml的石榴皮水煎液，置冰箱4℃保存备用。用时水浴加温至25℃。
实施例2
本实施例提供了一种药物，该药物由以下制备方法制得：
称取干燥石榴皮原材料50g，在750mL烧杯中用蒸馏水浸泡3h。将浸泡有石榴皮的溶液煎煮50min后过滤。将滤液加热浓缩至476.5mL，即得内含生药量为0.105g/ml的石榴皮水煎液，置冰箱4℃保存备用。用时水浴加温至25℃。
实施例3
本实施例提供了一种药物，该药物由以下制备方法制得：
称取干燥石榴皮原材料50g，在750mL烧杯中用蒸馏水浸泡3h。将浸泡有石榴皮的溶液煎煮50min后过滤，向滤渣内加入400mL水煎煮50min后过滤；合并两次过滤得到的滤液。将滤液加热浓缩至476.5mL，即得内含生药量为0.105g/ml的石榴皮水煎液，置冰箱4℃保存备用。用时水浴加温至25℃。
试验例
本试验例采用的药物为实施例1提供的药物。
1.大鼠BMSCs体外分离培养
实验动物：健康SD大鼠，SPF级(No.0029485)，雌雄各半，体重(140±10g)。
1.1BMSCs体外分离、培养及标记
实验动物先适应性饲养一周，脱颈椎处死，完全浸泡于75％酒精中2min，无菌条件下分离大鼠双侧股骨及胫骨，并剥离附着其上的肌肉组织，于膝关节处剪断，置于盛有生理盐水的无菌培养皿中，在超净台内，用酒精、PBS各冲洗2遍，去除两端骨髓，暴露骨髓腔，用5ml注射器吸取含1％的青-链霉素、10％胎牛血清的L-DMEM培养液反复冲洗，至骨髓腔变白，收集冲洗液并用吸管吹打混匀，接种于25cm2培养瓶中，置于37℃，体积分数为5％CO2培养箱中培养。原代细胞培养48h后半量换液，即替换一半培养基，72h全量换液时，轻轻的将培养基弃掉，PBS冲洗一次，去除未贴壁的红细胞等其他细胞，重新加入2ml L-DMEM培养液进行培养，之后每2d换液一次，在倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况。
当细胞紧贴培养瓶壁生长至80％-90％融合，可进行传代培养。首先弃去旧培养基，用无菌D-Hanks缓冲液漂洗2次，再加入1ml0.25％胰酶室温消化1min左右，镜下观察，待细胞形态变圆，胞质回缩，细胞间隙变大，加入等量的10％胎牛血清的L-DMEM培养基终止消化，并用吸管反复吹打，避免产生大量气泡，按1：2比例等量接种于培养瓶中，继续培养，24h后半量换液，48h全量换液，后每2d换液一次，继续观察细胞的形态及生长情况，依次传代记为P1，P2，P3等。
1.2BMSCs的CM-Dil标记
当P3、P4代细胞贴壁生长融合至80％-90％时，用0.25％胰酶于37℃恒温箱内消化1min左右，加培养基终止消化，吸管反复吹打，1000r/min，离心5min，去除上清液，加入PBS，收集BMSCs(1×106L-1)1ml重悬液，加入1g/L CM-DiI(质量浓度为100％DMSO 50μl溶解50μgCM-DiI)5μl，标记浓度达5μmol/L，37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育5min，4℃冰箱放置15min，吸出CM-DiI，用PBS洗涤2次，去除未结合的CM-DiI，即CM-DiI标记完全。
2.实施例1提供的药物(在本实验例中简称药物)诱导BMSCs归巢实验
实验动物：健康SD大鼠，SPF级(No.0029485)，雌雄各半，体重(220±10)g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号：scxk(鲁)20140007
2.1大鼠UC(溃疡性结肠炎)模型制备
采用TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸)灌肠法制备UC大鼠模型，造模前大鼠禁食不禁饮24h，用5％水合氯醛(25g/kg)腹腔注射麻醉，经液体石蜡润滑后，将长约10cm，直径2mm的聚乙烯导管轻缓插入肛门至8cm深左右，并推注造模液(100mg/kgTNBS+等体积50％乙醇，等于0.40ml/100g)，悬挂倒立3-5min，使药液弥散分布于大鼠肠腔，大鼠仰卧归笼，待其自然苏醒，常规饲养。
2.2大鼠分组、BMSCs移植及给药
按照CM-DiI标记BMSCs的方法进行操作，用0.5％台盼蓝染色，计算活细胞数，制备BMSCs(1×106L-1)PBS重悬液，最后移植量为1.0×106个/只。
将造模SD大鼠随机分成4组：模型组、药物组、细胞移植组(BMSCs组、BMSCs+药物组)，每组10只(外加正常组大鼠8只)。造模后第2天，经尾静脉注入1mLPBS细胞悬液，第3天，药物组、BMSCs+药物组均给予药物水煎剂1mL/100g灌胃，正常组、模型组和BMSCs组等量生理盐水灌胃，每天同一时间段给药1次，连续一周。去除各种因素所致死亡的动物数，最后保证至少每组8只大鼠进行统计。
2.3标本采集及处理
(1)末次给药24h后，5％水合氯醛麻醉大鼠。
(2)立即剖取肺、心、肝、脾、胃、小肠、肾、脑、结肠组织，于冰生理盐水中反复冲净残留血液或内容物，再用清洁滤纸轻微吸取水分。
(3)剪取模型组、BMSCs组和BMSCs+药物组以上各组织同一相应部位(结肠组织剪取为溃疡及非溃疡处)，用新鲜配制的4％多聚甲醛固定24h，10％、20％、30％蔗糖梯度脱水，OCT胶包埋后，冰冻切片，荧光倒置显微镜下观察标记BMSCs的细胞数。另一部分结肠组织进行免疫组化检测。
2.4CM-DiI标记的BMSCs在各组织内荧光显微镜下的观察情况
(1)将模型组、BMSCs组及BMSCs+药物组肺、心、肝、脾、胃、小肠、肾、脑、结肠溃疡及非溃疡部位于冰冻切片机上切成10μm连续切片，每组10张/只。
(2)在荧光显微镜下观察，每张切片上随机选取5个非重叠视野(×100倍)，分别计数CM-DiI标记BMSCs在不同实验组、不同组织间细胞数差异。
2.4免疫组化法检测SDF-1的表达
2.4.1具体染色步骤：
(1)冰冻切片10um，室温放置24h。
(2)抗原修复：于切片上滴加5％硼氢化钠的PB液(0.01M，pH6.0)5min；PBS冲洗5min×2次。
(3)用3％H2O2孵育30min，消除内源性过氧化物酶的活性；PBS清洗5min×2次。
(4)滴加5％BSA封闭液，湿盒内37℃孵育30min，甩去封闭液，不洗；滴加一抗SDF-1稀释液(按1：100稀释)，将切片置于湿盒中4℃冰箱过夜，或37℃孵育抗体2小时左右。阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。
(5)若4℃冰箱过夜，则37℃复温45min。PBS清洗5min×4次。
(6)滴加过氧化物酶标记羊抗兔IgG(H+L)稀释液(按1：500稀释)，37℃孵育30min，PBS清洗5min×4次。
(7)DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)，室温显色，镜下控制反应时间，一般在2-10分钟，蒸馏水充分洗涤以终止反应。
(8)脱水：将切片按顺序依次放入85％乙醇2min，95％乙醇5min×2次、无水乙醇5min×2次。
(9)透明、封片：将切片放入二甲苯5min×2次后，中性树胶封片，显微镜观察。
2.4.2结果判断
在Image pro-plus6.0(IPP)图像分析系统中，运用免疫组化法对结肠组织中SDF-1的染色强度进行半定量分析。每张切片在倒置相差显微镜高倍镜(×400)下自切片染色的中心区域随机选取3个不同视野，进行观察，即呈棕黄色颗粒为阳性，并拍照记录。用Image-proplus(IPP)6.0图像分析软件，对选取视野内阳性部分进行Area(面积)、IOD(累积光密度)分析，计算各组Density mean(平均光密度)值(Density mean＝IOD/Area，Densitymean值越高则表达越强)。
数据统计方法
所有数据采用SPSS17.0统计软件进行处理并分析，结果使用均数±标准差(x±s)表示。荧光显微镜细胞计数中，对测量结果进行双因素析因设计资料的方差分析，其他数据统计采用单因素方差分析，对各组数据行方差齐性检验，如果方差齐性检验的P值>0.05，说明方差齐，各组间比较使用LSD-t检验，如果方差不齐则使用Tamhane法进行各组数据比较，当P<0.05时认为差异有统计学意义。
3.实验结果
3.1BMSCs在大鼠体内各组织荧光显微镜下的观察情况
3.1.1肺、肝、脾及胃的荧光观察
对BMSCs组和BMSCs+药物组的肺、肝、脾、胃冰冻切片上均可见镜下CM-DiI标记的呈现橙红色荧光细胞，偶可见细胞呈团状分布。而模型组的以上各组织偶可发现数量极少且强度极弱的荧光，初步怀疑是组织内源性BMSCs在绿色的激发光下产生的自带荧光。BMSCs分布的细胞数量在这些组织间有一定的差异，即肺＞脾＞肝＞胃(F＝30.077，p＜0.01)。同一组织在不同实验组间的细胞数的差异无统计意义(F＝1.528，P＞0.05)(见表1)。
表1 BMSCs移植后各组大鼠不同组织中的细胞计数情况
3.1.2肠道局部荧光分布情况
在小肠与结肠内，BMSCs组与BMSCs+药物组均可在镜下观察到呈橙红色荧光的BMSCs，结肠内溃疡灶细胞数明显多于小肠，将其位置记录并与光镜下同视野的肠道组织标本相对照，发现细胞主要分布于结肠的黏膜和黏膜下层，外膜亦多见，模型组的肠道粘膜亦发现数量极少且强度极弱的荧光。统计结果表2显示，移植各组溃疡部位阳性细胞数明显高于非溃疡部位(P<0.01)；与BMSCs组相比，BMSCs+药物组的溃疡部位及非溃疡部位的细胞数增加(F＝260.611，P<0.01)。
表2 BMSCs移植后大鼠肠道中的细胞计数情况
注：各组溃疡部位与非溃疡部位比较，☆☆P<0.01；与BMSCs组比较，▼▼P<0.01。
3.1.3肾、心、脑的荧光观察
实验结果发现，在这几个组织内的荧光细胞数明显低于以上组织，其中肾内的细胞数高于心、脑，而后两种组织内几乎不含。BMSCs组与BMSCs+药物组内移植细胞在各主要脏器内的分布如图1所示。
3.2SDF-1在结肠的表达
免疫组化结果显示，SDF-1阳性表达呈棕黄色颗粒状。在正常结肠组织中，SDF-1弱表达，切片中偶可见到稀疏散在的棕黄色组织。在模型组及各治疗组结肠组织中，SDF-1的阳性表达主要位于肠道黏膜及黏膜下层，部分组织的外膜也有表达。这与荧光显微下观察到的结果一致。
药物组、BMSCs组与BMSCs+药物组平均光密度值依次增高，BMSCs组显著高于药物组(P<0.01)，而与药物组、BMSCs组相比，BMSCs+药物组明显增高，有统计意义(P<0.01)。统计结果如表3、图2所示。
表3各组大鼠结肠组织SDF-1蛋白表达平均光密度值
注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与药物组比较，★★P<0.01；与BMSCs组比较，▲▲P<0.01。
综上，本实验在UC大鼠模型尾静脉注射BMSCs后，利用荧光显微镜对离体肺、肝、脾、胃、小肠、结肠、肾、心、脑等组织的冰冻切片观察CM-DiI标记的BMSCs橙红色点状荧光在各组织的分布，发现主要集中在肺、肝、脾中，且肺＞脾＞肝，同一组织在不同实验组内所分布细胞数差异不明显。胃、小肠内的BMSCs差异不大，都少于结肠，肾内的荧光细胞数明显低于以上组织，心、脑两种组织内几乎不含。结肠组织中的细胞主要分布于黏膜、黏膜下层及外膜，移植各组溃疡部位阳性细胞数高于非溃疡部位，BMSCs+药物组溃疡灶明显多于BMSCs组，说明本发明实施例1提供的药物能诱导BMSCs定植于结肠中。
本试验例将体外纯化培养并荧光染料CM-DiI标记的第三代BMSCs移植到模型体内，联合本发明实施例1提供的药物进行治疗，观察该药物对外源性BMSCs在UC模型大鼠体内各组织间迁移能力的影响。BMSCs+药物组结肠溃疡处细胞数明显增多，表明该药物能诱导BMSCs的归巢，进行损伤修复。
SDF-1在结肠处阳性表达的位置与普通光镜下损伤处、荧光显微镜下细胞聚集处相吻合，BMSCs组中，SDF-1表达增高，能促进表面表达CXCR4的BMSCs顺着SDF-1的浓度差迁移到结肠受损处，进行组织修复。BMSCs+药物组能加强这一效果。
说明石榴皮或者石榴皮水煎剂能够有效诱导骨髓间充质干细胞向病损组织迁移、分化，同时石榴皮或者石榴皮水煎剂能够促进SDF-1蛋白的表达。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.石榴皮在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述石榴皮的水煎剂在制备促进骨髓间充质干细胞迁移药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述石榴皮在提高SDF-1蛋白的表达中的应用。
4.一种用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物，其特征在于，所述药物组合物的原料包括石榴皮。
5.根据权利要求4所述的用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物，其特征在于，所述药物组合物包括石榴皮水煎剂、骨髓间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞以静脉注射的方式给药。
7.根据权利要求5所述的用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物，其特征在于，所述石榴皮水煎剂的给药方式为口服。
8.一种用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的制备方法，其特征在于，包括：取石榴皮于水溶液中浸泡2-3小时，将浸泡有所述石榴皮的溶液煎煮30-50min后过滤。
9.根据权利要求8所述的用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的制备方法，其特征在于，所述石榴皮与所述水溶液的比例为1：15-20。
10.根据权利要求8所述的用于促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的制备方法，其特征在于，将浸泡有所述石榴皮的溶液煎煮30-50min后过滤，向滤渣中加入水再进行煎煮后过滤，合并滤液。
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