CN107353327A

CN107353327A - 植酸酶在黑曲霉中表达

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Publication number: CN107353327A
Application number: CN201710741963.0A
Authority: CN
Inventors: 白挨玺; 李峰; 卞芙蓉; 朱继东; 孙艳; 徐红
Original assignee: Nanjing Bestzyme Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Nanjing Bestzyme Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2017-11-17
Also published as: EP3604542A4; EP3604542A1; JP7160829B2; US11339397B2; JP2020511995A; CN110582573A; CN110582573B; US20210032637A1; WO2018177402A1

Abstract

本发明公开了植酸酶在黑曲霉中表达。优化的大肠杆菌植酸酶基因，具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。包含所述大肠杆菌植酸酶基因的表达盒、重组表达载体、重组菌。本发明人发现，对于大肠杆菌植酸酶或其突变体的基因，优选经密码子优化后合成人工基因，在米曲霉TAKA淀粉酶信号肽连接后，构建的表达盒导入到黑曲霉中进行表达，能够在培养基上清获得大量的分泌表达的植酸酶。

Description

植酸酶在黑曲霉中表达

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及来源于革兰氏阴性菌的植酸酶，尤其是大肠杆菌植酸酶，在丝状真菌中，特别是黑曲霉中的高效表达。

背景技术

植酸酶(Phytase),即肌醇六磷酸磷酸水解酶(myo-Inositol hexakisphosphatephosphohydrolase)，属于正磷酸单酯磷酸水解酶,催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸，在某些情况下可将植酸水解为游离的肌醇。植酸在谷物、豆类、油料等作物种子中含量最为丰富，高达1％～3％，占植物总磷含量的60％～80％。但植酸中的磷不能被直接吸收利用，必须在消化道内先水解为无机磷酸盐。研究表明，单胃动物(猪、鸡、鸭、鹅等)因为缺乏植酸酶而对植酸中磷的利用率很低。同时，植酸强烈电负性导致其通常与二价或三价阳离子，如Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺⁺等形成不溶性盐类，阻碍小肠对矿物质的吸收。还会与蛋白质，氨基酸以及脂肪酸等形成络合物，影响他们的吸收利用，植酸还会与胃蛋白酶、胰凝乳酶、胰蛋白酶等结合，降低消化酶活性。因此，在单胃动物饲料中添加植酸酶可提高动物饲料中磷的利用率，降低动物排泄物中的磷含量，同时能提高蛋白和饲料能量利用率。

商业化的植酸酶主要来源于黑曲霉(如US5436156所述)，大肠杆菌(如US7432098所述)，柠檬酸细菌属(如US20100261259所述Citrobacter braakii菌)，布氏杆菌(如US8143046所述的Buttiauxella sp.菌)等。这些植酸酶由于来源不同，导致他们具有不同的耐酸耐热性质。Nielsen等(J Agric Food Chem.2015,63(3):943-50)比较了商业化的植酸酶性质，结果显示大肠杆菌植酸酶显示出最好的特性。市场化的大肠杆菌植酸酶都是用酵母表达的，如裂殖酵母和毕赤酵母，其中中国市场的植酸酶绝大部分由毕赤酵母生产。由于植酸酶主要用于饲料和食品等领域，而毕赤酵母在表达蛋白时，需要以甲醇为碳源进行诱导表达，因此商品化的植酸酶彻底去除甲醇原料是困难的，具有潜在的安全隐患。此外，由于甲醇的易燃易爆特性，使得运输和生产时都需要特殊的安全防护，增加了生产成本。同时，对生产环境提出更高要求，对生产工人也有一定潜在危害。因此使用毕赤酵母生产食品和饲料添加剂并不是优选的。丝状真菌作为细胞工厂生产有价值的产品(如酶)为人们熟知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于‘通常认为安全的’(Generally Recognized As Safe，GRAS)的特征而被广泛用于表达宿主，发酵过程中不会产生有毒物质，且发酵原料全部为粮食及其副产品(如豆粕，玉米浆等)。因此工业上更加青睐黑曲霉和米曲霉用于生产酶。研究发现，利用黑曲霉表达革兰氏阴性菌来源的植酸酶是困难的，如US20100261259描述了利用米曲霉、黑曲霉和酵母表达Citrobacter braakii(革兰氏阴性菌)植酸酶，米曲霉和酵母能够很好地分泌表达所述植酸酶，而黑曲霉却几乎无法表达上述植酸酶。如上所述，来源于革兰氏阴性菌大肠杆菌的植酸酶和其突变体具有更好的特性，因此利用GRAS的黑曲霉表达是值得期待的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的信号肽。

本发明的另一目的在于提供一种经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体的基因。

本发明的又一目的在于提供一种经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列。

本发明的还一目的在于提供一种在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

在一方面，本发明提供一种在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的信号肽，其特征在于，所述信号肽选自米曲霉TAKA淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。

在本发明的一个实施方案中，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

在本发明的一个实施方案中，所述丝状真菌选自黑曲霉。

在本发明的一个实施方案中，所述大肠杆菌植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的另一实施方案中，所述大肠杆菌植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.15或SEQ ID NO.17所示。

在另一方面，本发明提供一种经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体的基因，其具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；或具有与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。

在又一方面，本发明提供一种经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列，其具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；或具有与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，所述经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列如SEQ ID NO.14所示。

在本发明的另一实施方案中，所述经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明还一方面提供一种在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其特征在于，将米曲霉TAKA淀粉酶与编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列连接，然后将含有所述序列的表达盒导入到丝状真菌中进行表达，其中所述米曲霉TAKA淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

在本发明的一个实施方案中，其中所述米曲霉TAKA淀粉酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。

在本发明的一个实施方案中，其中所述丝状真菌选自黑曲霉。

在本发明的一个实施方案中，其中大肠杆菌植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，大肠杆菌植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.17所示。

在本发明的一个实施方案中，其中编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列未经密码子优化。

在本发明的另一个实施方案中，其中编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列经密码子优化。

在本发明的又一实施方案中，其中经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；或具有与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列如SEQ ID NO.14所示。

在本发明的一个优选实施方案中，经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列如SEQ ID NO.16所示。

包含所述大肠杆菌植酸酶基因的表达盒、重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌。

为了构建大肠杆菌植酸酶表达盒，需要特定的启动子，终止子，信号肽序列及调控序列：如5’UTR，3’UTR等。

启动子可以是黑曲霉内源启动子：如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α-葡萄糖苷酶启动子等；也可以是外源启动子：如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子；也可以是启动子变体：如黑曲霉中性淀粉酶启动子变体；本发明优选黑曲霉糖化酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶启动子变体。

与启动子3’末端连接的可以是调控序列：如合适的前导序列(5’UTR)，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区，如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列；

为了分泌表达特定蛋白，需要信号肽序列介导，在本发明中米曲霉TAKA淀粉酶信号肽对于大肠杆菌植酸酶是优选的。

优选的终止子从如下酶的基因获得：黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

特定的基因在与启动子，调控序列，信号肽序列及终止子相连接后形成表达盒。通过常规方法导入到黑曲霉基因组中，可以随机插入到基因组中，也可以定点整合到某个或多个基因座上。可选的基因座有gla(糖化酶)，amya(中性淀粉酶)，amyb(中性淀粉酶)，aa(酸性淀粉酶),agda(α葡萄糖苷酶)，agdb(α葡萄糖苷酶)。

所述表达盒优选地可以与一个或多个选择性标记连接，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞或菌株。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦)乙酰转移酶)、hyg(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉的amdS和hyg。

所述表达盒优选地可以与一个或多个反向选择标记(负选择标记)连接。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶),hsvTK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)。

所述的重组表达载体为将上述的大肠杆菌植酸酶基因或包含该基因的表达盒插入表达载体得到的。

所述的重组菌为将上述的重组表达载体导入目的宿主菌得到的，优选的宿主菌为黑曲霉。

上述的大肠杆菌植酸酶基因在提高大肠杆菌植酸酶表达量中的应用。

上述的表达盒、重组表达载体、重组菌、在提高大肠杆菌植酸酶表达量中的应用。

一种制备大肠杆菌植酸酶的方法，将上述的转基因重组菌发酵培养得到大肠杆菌植酸酶。

本发明中将DNA片段导入到黑曲霉体内的方法为本领域常规方法。

密码子优化是指利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子对基因的重新设计。关于密码子优化详细描述可查看Joshua B.Plotkin和Grzegorz Kudla所论著的文章(Nat Rev Genet.2011；12(1):32–42.)。密码子优化已广泛用于异源表达系统中。

本发明的有益效果：

本发明人发现，对于大肠杆菌植酸酶或其突变体的基因，优选经密码子优化后合成人工基因，在与米曲霉TAKA淀粉酶信号肽连接后，构建的表达盒导入到黑曲霉中进行表达，能够在培养基上清获得大量的分泌表达的植酸酶。

附图说明

图1 pHphtk质粒图谱。

图2 pGla-Phy-Phy质粒图谱。

图3 pGla-Gla-Phy质粒图谱。

图4 pGla-Amy-Phy质粒图谱。

图5 pGla-Phy-PhyOPT质粒图谱。

图6 pGla-Gla-PhyOPT质粒图谱。

图7 pGla-Amy-PhyOPT质粒图谱。

图8 pGla-Amy-PhyM1质粒图谱。

图9 pGla-Amy-PhyM2质粒图谱。

具体实施方式

实施例1 pHphtk质粒的构建

该质粒包含以下3部分，由南京金斯瑞生物科技有限公司构建完成，质粒图谱见图1。

(1)pUC57质粒XbaI-PciI双酶切后得到的2305bp片段；

(2)hph基因表达盒，序列见SEQ ID NO.18；

(3)HSV-tk表达盒，序列见SEQ ID NO.19。

实施例2不同信号肽介导的大肠杆菌植酸酶整合质粒构建

将大肠杆菌植酸酶表达盒整合到黑曲霉糖化酶基因座以进行表达，使用糖化酶启动子和糖化酶终止子。分别构建pGla-Phy-Phy,pGla-Gla-Phy和pGla-Amy-Phy质粒，使用不同的信号肽序列包括大肠杆菌植酸酶信号肽(SEQ ID NO.5)，黑曲霉糖化酶信号肽(SEQ IDNO.10)，米曲霉TAKA淀粉酶信号肽(SEQ ID NO.12)分别与野生型大肠杆菌植酸酶序列Phy(SEQ ID NO.3)连接后置换黑曲霉糖化酶基因。来源于大肠杆菌ATCC 8739的植酸酶序列Phy(SEQ ID NO.3)由南京金斯瑞生物科技公司合成，Phy信号肽DNA序列由南京金斯瑞生物科技公司合成，黑曲霉糖化酶信号肽(SEQ ID NO.10)和米曲霉TAKA淀粉酶信号肽(SEQ IDNO.12)由引物通过PCR引入到Phy序列上。整合质粒构建方法如下：将pHphtk质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；以黑曲霉(来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC2462)基因组为模板，通过Gla-5'-F和Gla-5'-R，Gla-3'-F和Gla-3'-R分别扩增糖化酶基因侧翼5'和3'序列，每个片段长2000bp。利用Phy-Phy-F和Phy-Phy-R扩增野生型大肠杆菌植酸酶序列Phy(SEQ ID NO.1)。将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段、3'片段和Phy片段通过Gibson Master Mix Kit(E2611，New EnglandBiolabs)进行重组，得到整合质粒pGla-PepWT，经测序确认序列，质粒图谱见图2。利用Gla-Phy-F和Phy-Phy-R为引物，以Phy片段为模板，PCR扩增获得Gla-Phy片段，此片段引入了黑曲霉糖化酶信号肽序列，将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段、3'片段和Gla-Phy片段通过Gibson Master Mix Kit进行重组，得到整合质粒pGla-Gla-Phy，经测序确认序列，质粒图谱见图3。利用Amylase-Phy-F和Phy-Phy-R为引物，以Phy片段为模板，PCR扩增获得Amylase-Phy片段，此片段引入了米曲霉TAKA淀粉酶信号肽序列。将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段、3'片段和Amylase-Phy片段通过Gibson Master Mix Kit进行重组，得到整合质粒pGla-Amy-Phy，经测序确认序列，质粒图谱见图4。糖化酶基因5'端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.20，其3'端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.21。Phy-Phy,Gla-Phy和Amy-Phy分别见SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24。

相关引物序列如下：

实施例3密码子优化后的大肠杆菌植酸酶整合质粒构建

分别构建pGla-Phy-PhyOPT,pGla-Gla-PhyOPT和pGla-Amy-PhyOPT质粒，使不同的信号肽序列(包括大肠杆菌植酸酶信号肽，黑曲霉糖化酶信号肽，米曲霉TAKA淀粉酶信号肽)分别与密码子优化后的大肠杆菌植酸酶序列PhyOPT(SEQ ID NO.8)连接后置换黑曲霉糖化酶基因。来源于大肠杆菌ATCC 8739的植酸酶序列经密码子优化后，见SEQ ID NO.8,由南京金斯瑞生物科技公司合成。同样地，对Phy信号肽也进行了优化，如SEQ ID NO.9所示。整合质粒构建方法如下：将pHphtk质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；以黑曲霉(来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC2462)基因组为模板，通过Gla-5'-F和Gla-5'-R，Gla-3'-F和Gla-3'-R分别扩增糖化酶基因侧翼5'和3'序列，每个片段长2000bp。利用Phy-PhyOPT-F和Phy-PhyOPT-R扩增优化的大肠杆菌植酸酶序列PhyOPT，引物上引入了经优化后的Phy信号肽序列，将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段、3'片段和Phy片段通过Gibson Master Mix Kit(E2611，New EnglandBiolabs)进行重组，得到整合质粒pGla-Phy-PhyOPT，经测序确认序列，质粒图谱见图5。利用Gla-PhyOPT-F和Phy-PhyOPT-R为引物，以PhyOPT片段为模板，PCR扩增获得Gla-PhyOPT片段，此片段引入了黑曲霉糖化酶信号肽序列，将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段、3'片段和Gla-PhyOPT片段通过Gibson Master Mix Kit进行重组，得到整合质粒pGla-Gla-Phy，经测序确认序列，质粒图谱见图6。利用Amylase-PhyOPT-F和Phy-PhyOPT-R为引物，以PhyOPT片段为模板，PCR扩增获得Amylase-PhyOPT片段，此片段引入了米曲霉TAKA淀粉酶信号肽序列。将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段、3'片段和Amylase-PhyOPT片段通过Gibson Master Mix Kit进行重组，得到整合质粒pGla-Amylase-PhyOPT，经测序确认序列，质粒图谱见图7。糖化酶基因5'端侧翼2kbDNA序列见SEQ ID NO.20，其3'端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.21。Phy-PhyOPT,Gla-PhyOPT和Amy-PhyOPT表达盒序列分别见SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27。

相关引物序列如下：

实施例4密码子优化后的大肠杆菌植酸酶突变体整合质粒构建

专利US7432098描述了大肠杆菌植酸酶突变体NOV9X，具有更优秀的耐热性，更加适合应用于饲料领域。与本发明中的大肠杆菌植酸酶相比较，NOV9X有9个氨基酸突变。为了验证NOV9X在米曲霉TAKA淀粉酶信号肽介导下是否可以高效表达，我们在PhyOPT的基础上，引入17个碱基突变从而获得NOV9X的DNA序列，如SEQ ID NO.14所示，与密码子优化后的大肠杆菌植酸酶成熟肽DNA序列相比(SEQ ID NO.8)，有98.6％的序列一致性。由南京金斯瑞生物科技公司合成,其编码的成熟肽序列如SEQ ID NO.15所示。在NOV9X进一步引入43个碱基突变形成NOV9XM，如SEQ ID NO.16所示，与密码子优化后大肠杆菌植酸酶成熟肽DNA序列相比(SEQ ID NO.8)，有95.9％的序列一致性。由南京金斯瑞生物科技公司合成,其编码的成熟肽序列如SEQ ID NO.17所示。构建pGla-Amy-PhyM1和pGla-Amy-PhyM2质粒，从而将Amy-NOV9X以及Amy-NOV9XM分别整合到黑曲霉糖化酶基因座。整合质粒构建方法如下：将pHphtk质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；以黑曲霉(来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC2462)基因组为模板，通过Gla-5'-F和Gla-5'-R，Gla-3'-F和Gla-3'-R分别扩增糖化酶基因侧翼5'和3'序列，每个片段长2000bp。利用Amylase-PhyOPT-F和Phy-PhyOPT-R为引物，以NOV9X和NOV9XM分别片段为模板，PCR扩增获得Amylase-PhyM1和Amylase-PhyM2片段，上述两个片段引入了米曲霉TAKA淀粉酶信号肽序列。将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段、3'片段和Amylase-PhyM1片段通过Gibson Master Mix Kit进行重组，得到整合质粒pGla-Amylase-PhyM1，经测序确认序列，质粒图谱见图8。将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段、3'片段和Amylase-PhyM2片段通过Gibson Master Mix Kit进行重组，得到整合质粒pGla-Amylase-PhyM2，经测序确认序列，质粒图谱见图9。糖化酶基因5'端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.20，其3'端侧翼2kb DNA序列见SEQ ID NO.21。Amy-PhyM1和Amy-PhyM2表达盒分别见SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29。

相关引物序列如下：

实施例5各表达盒整合到黑曲霉中

本实施例出发菌株为AND4L，是由CICC2462菌株经敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因后获得的。黑曲霉基因敲除/敲入方法可参考专利CN 103937766A或CN104962594A实施例中公开的技术方法实现。本实施例中PhyPhyOPT和PhyM整合到糖化酶基因座中与CN 104962594A实施例使用相同方法实现，即参照Delmas(Appl EnvironMicrobiol.2014,80(11):3484-7)等人描述的方法。具体地，利用环状DNA载体，包含有gla5’及3’侧翼序列，选择标记，反向选择标记(或称为负向选择标记)，以及大肠杆菌复制序列,即实施例1到实施例4所述的质粒。将环状载体转入到黑曲霉中，通过正向选择获得重组菌株，再经过反向选择标记获得基因敲除/敲入菌株。

采用原生质体转化法将pGla-Phy-Phy、pGla-Gla-Phy、pGla-Amy-Phy、pGla-Phy-PhyOPT、pGla-Gla-PhyOPT、pGla-Amy-PhyOPT、pGla-Amy-PhyM1和pGla-Amy-PhyM2分别导入，具体操作步骤如下：

原生质体的制备：在营养丰富的TZ液体培养基(牛肉膏粉0.8％；酵母浸膏0.2％；蛋白胨0.5％；NaCl 0.2％；蔗糖3％；pH5.8)中培养黑曲霉菌丝体。通过mira-cloth(Calbiochem公司)从培养液中过滤菌丝体并用0.7M NaCl(pH5.8)洗涤，菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1％(Sigma)、蜗牛酶1％(Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2％的酶解液(pH5.8)中，30℃，65rpm酶解3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤，得到的滤液经3000rpm，4℃温和离心10min后，弃上清；附着在管壁上的原生质体用STC溶液(1M D-Sorbitol、50mM CaCl₂、10mM Tris，pH7.5)洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的STC溶液中。

分别将环状pGla-Phy-Phy、pGla-Gla-Phy、pGla-Amy-Phy、pGla-Phy-PhyOPT、pGla-Gla-PhyOPT、pGla-Amy-PhyOPT、pGla-Amy-PhyM1和pGla-Amy-PhyM2质粒10μl(浓度为：100ng/μl)加入到100μl原生质体悬浮液中混匀后室温放置25min；然后分3次共加入900μl PEG溶液，混匀后室温放置25min；3000rpm，常温离心10min，弃上清，原生质体附着于管壁上，将其重悬于1ml STC溶液中。把该悬浮液与预先降温至45℃左右的TB3培养基(酵母浸膏0.3％、酸水解酪蛋白0.3％、蔗糖20％、琼脂0.7％)混合并铺平板；待平板凝固后放入34℃培养箱中培养；24h后在平板上再铺一层含300ng/μl潮霉素(Hygromycin)的TB3固体培养基(琼脂1％，其余成分同上)，继续将平板置于34℃培养箱中培养4-5天后，长出上层培养基的转化子称为整合转化子。随机挑取几个整合转化子分别传代于含300ng/μl潮霉素的TB3固体培养基上，34℃恒温培养3天后，收集菌丝体用液氮冷冻后研磨粉碎，然后用真菌基因组提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取整合转化子基因组DNA，最后对整合转化子基因组DNA进行PCR鉴定，鉴定引物为Pep-5test-F与Pep-5test-R、Pep-3test-F与Pep-3test-R，PCR产物经测序后确认整合到糖化酶基因座。

相关引物序列如下：

将确认的阳性转化子挑取适量碎菌丝放于含1ml无菌水的离心管中，涡旋振荡使之形成菌丝悬液，取100μl涂布于含10μM 5-F2dU(5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷，厂家：Sigma)的TB3固体平板上，34℃恒温培养4-5天，即有敲除转化子长出。转化子在10μM 5-F2dU平板上传两代(防止转化子不纯)后，在300ng/μl潮霉素平板上应不能生长；然后对敲除转化子基因组DNA进行PCR鉴定，引物序列及基因组提取方法同上。使用Pep-5test-F和Pep-3test-R进行PCR鉴定，阳性转化子产物应为5.5kb，而阴性转化子为6.3kb。阳性转化子经PCR产物测序后确认，从而得到AND4L-Phy-Phy、AND4L-Gla-Phy、AND4L-Amy-Phy、AND4L-Phy-PhyOPT、AND4L-Gla-PhyOPT、AND4L-Amy-PhyOPT、AND4L-Amy-PhyM1和AND4L-Amy-PhyM2菌株。

实施例6菌株摇瓶发酵

将实施例5中获得的AND4L-Phy-Phy、AND4L-Gla-Phy、AND4L-Amy-Phy、AND4L-Phy-PhyOPT、AND4L-Gla-PhyOPT、AND4L-Amy-PhyOPT、AND4L-Amy-PhyM1和AND4L-Amy-PhyM2菌株分别接种至含50ml YPG培养基(2g/L酵母提取物，2g/L蛋白胨，10％的葡萄糖)的摇瓶中，34℃，220rpm培养六天，取上清进行聚丙烯酰胺变性电泳(SDS-PAGE)。查看各菌种表达情况，具体见表1。

表1各菌株表达情况

菌株	信号肽	序列是否优化	表达情况
				AND4L-Phy-Phy	大肠杆菌植酸酶	未优化	无表达
AND4L-Gla-Phy	黑曲霉糖化酶	未优化	无表达
				AND4L-Amy-Phy	米曲霉TAKA淀粉酶	未优化	轻微表达
AND4L-Phy-PhyOPT	大肠杆菌植酸酶	优化	无表达
				AND4L-Gla-PhyOPT	黑曲霉糖化酶	优化	无表达
AND4L-Amy-PhyOPT	米曲霉TAKA淀粉酶	优化	大量表达
				AND4L-Amy-PhyM1	米曲霉TAKA淀粉酶	优化	大量表达
AND4L-Amy-PhyM2	米曲霉TAKA淀粉酶	优化	大量表达

从表1可以看出，大肠杆菌植酸酶或其突变体的DNA经密码子优化后，在米曲霉TAKA淀粉酶信号肽介导下，在上清中达到良好表达水平，而其他信号肽序列并未有蛋白表达。未优化的序列在米曲霉TAKA淀粉酶信号肽介导下，表达量也非常低，证明了DNA序列的优化对于表达也至关重要。优化后的序列分别引入17个和50个突变后也可以达到良好表达。

序列表

<110> 南京百斯杰生物工程有限公司

<120> 植酸酶在黑曲霉中表达

<150> 2017102034735

<151> 2017-03-30

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1329

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atgtcagata tgaaaagcgg aaacatatcg atgaaagcga tcttaatccc atttttatct 60

cttctgattc cgttaacccc gcaatctgca ttcgctcaga gtgagccgga gctgaagctg 120

gaaagtgtgg tgattgtcag tcgtcatggt gtgcgtgctc caaccaaggc cacgcaactg 180

atgcaggatg tcaccccaga cgcatggcca acctggccgg taaaactggg ttggctgaca 240

ccgcgcggtg gtgagctaat cgcctatctc ggacattacc aacgccagcg tctggtagcc 300

gacggattgc tggcgaaaaa gggctgcccg cagtctggtc aggtcgcgat tattgctgat 360

gtcgacgagc gtacccgtaa aacaggcgaa gccttcgccg ccgggctggc acctgactgt 420

gcaataaccg tacataccca ggcagatacg tccagtcccg atccgttatt taatcctcta 480

aaaactggcg tttgccaact ggataactcg aacgtgactg acgcgatcct cagcagggca 540

ggagggtcaa ttgctgactt taccgggcat cggcaaacgg cgtttcgcga actggaacgg 600

gtgcttaatt ttccgcaatc aaacttgtgc cttaaacgtg agaaacagga cgaaagctgt 660

tcattaacgc aggcattacc atcggaactc aaggtgagcg ccgacaatgt ctcattaacc 720

ggtgcggtaa gcctcgcatc aatgctgacg gagatatttc tcctgcaaca agcacaggga 780

atgccggagc cggggtgggg aaggatcacc gattcacacc agtggaacac cttgctaagt 840

ttgcataacg cgcaatttta tttgctacaa cgcacgccag aggttgcccg cagccgcgcc 900

accccgttat tagatttgat caagacagcg ttgacgcccc atccaccgca aaaacaggcg 960

tatggtgtga cattacccac ttcagtgctg tttatcgccg gacacgatac taatctggca 1020

aatctcggcg gcgcactgga gctcaactgg acgcttcccg gtcagccgga taacacgccg 1080

ccaggtggtg aactggtgtt tgaacgctgg cgtcggctaa gcgataacag ccagtggatt 1140

caggtttcgc tggtcttcca gactttacag cagatgcgtg ataaaacgcc gctgtcatta 1200

aatacgccgc ccggagaggt gaaactgacc ctggcaggat gtgaagagcg aaatgcgcag 1260

ggcatgtgtt cgttggcagg ttttacgcaa atcgtgaatg aagcacgcat accggcgtgc 1320

agtttgtaa 1329

<210> 2

<211> 442

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

Met Ser Ala Met Leu Ser Gly Ala Ile Ser Met Leu Ala Ile Leu Ile

1 5 10 15

Pro Pro Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr Pro Gly Ser Ala Pro Ala

20 25 30

Gly Ser Gly Pro Gly Leu Leu Leu Gly Ser Val Val Ile Val Ser Ala

35 40 45

His Gly Val Ala Ala Pro Thr Leu Ala Thr Gly Leu Met Gly Ala Val

50 55 60

Thr Pro Ala Ala Thr Pro Thr Thr Pro Val Leu Leu Gly Thr Leu Thr

65 70 75 80

Pro Ala Gly Gly Gly Leu Ile Ala Thr Leu Gly His Thr Gly Ala Gly

85 90 95

Ala Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu Ala Leu Leu Gly Cys Pro Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Val Ala Ile Ile Ala Ala Val Ala Gly Ala Thr Ala Leu Thr

115 120 125

Gly Gly Ala Pro Ala Ala Gly Leu Ala Pro Ala Cys Ala Ile Thr Val

130 135 140

His Thr Gly Ala Ala Thr Ser Ser Pro Ala Pro Leu Pro Ala Pro Leu

145 150 155 160

Leu Thr Gly Val Cys Gly Leu Ala Ala Ser Ala Val Thr Ala Ala Ile

165 170 175

Leu Ser Ala Ala Gly Gly Ser Ile Ala Ala Pro Thr Gly His Ala Gly

180 185 190

Thr Ala Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Leu Ala Pro Pro Gly Ser Ala

195 200 205

Leu Cys Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ser Cys Ser Leu Thr Gly

210 215 220

Ala Leu Pro Ser Gly Leu Leu Val Ser Ala Ala Ala Val Ser Leu Thr

225 230 235 240

Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Pro Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Ala Gly Gly Met Pro Gly Pro Gly Thr Gly Ala Ile Thr Ala Ser

260 265 270

His Gly Thr Ala Thr Leu Leu Ser Leu His Ala Ala Gly Pro Thr Leu

275 280 285

Leu Gly Ala Thr Pro Gly Val Ala Ala Ser Ala Ala Thr Pro Leu Leu

290 295 300

Ala Leu Ile Leu Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gly Leu Gly Ala

305 310 315 320

Thr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Pro Ile Ala Gly His Ala

325 330 335

Thr Ala Leu Ala Ala Leu Gly Gly Ala Leu Gly Leu Ala Thr Thr Leu

340 345 350

Pro Gly Gly Pro Ala Ala Thr Pro Pro Gly Gly Gly Leu Val Pro Gly

355 360 365

Ala Thr Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ser Gly Thr Ile Gly Val Ser Leu

370 375 380

Val Pro Gly Thr Leu Gly Gly Met Ala Ala Leu Thr Pro Leu Ser Leu

385 390 395 400

Ala Thr Pro Pro Gly Gly Val Leu Leu Thr Leu Ala Gly Cys Gly Gly

405 410 415

Ala Ala Ala Gly Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Pro Thr Gly Ile Val

420 425 430

Ala Gly Ala Ala Ile Pro Ala Cys Ser Leu

435 440

<210> 3

<211> 1233

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

cagagtgagc cggagctgaa gctggaaagt gtggtgattg tcagtcgtca tggtgtgcgt 60

gctccaacca aggccacgca actgatgcag gatgtcaccc cagacgcatg gccaacctgg 120

ccggtaaaac tgggttggct gacaccgcgc ggtggtgagc taatcgccta tctcggacat 180

taccaacgcc agcgtctggt agccgacgga ttgctggcga aaaagggctg cccgcagtct 240

ggtcaggtcg cgattattgc tgatgtcgac gagcgtaccc gtaaaacagg cgaagccttc 300

gccgccgggc tggcacctga ctgtgcaata accgtacata cccaggcaga tacgtccagt 360

cccgatccgt tatttaatcc tctaaaaact ggcgtttgcc aactggataa ctcgaacgtg 420

actgacgcga tcctcagcag ggcaggaggg tcaattgctg actttaccgg gcatcggcaa 480

acggcgtttc gcgaactgga acgggtgctt aattttccgc aatcaaactt gtgccttaaa 540

cgtgagaaac aggacgaaag ctgttcatta acgcaggcat taccatcgga actcaaggtg 600

agcgccgaca atgtctcatt aaccggtgcg gtaagcctcg catcaatgct gacggagata 660

tttctcctgc aacaagcaca gggaatgccg gagccggggt ggggaaggat caccgattca 720

caccagtgga acaccttgct aagtttgcat aacgcgcaat tttatttgct acaacgcacg 780

ccagaggttg cccgcagccg cgccaccccg ttattagatt tgatcaagac agcgttgacg 840

ccccatccac cgcaaaaaca ggcgtatggt gtgacattac ccacttcagt gctgtttatc 900

gccggacacg atactaatct ggcaaatctc ggcggcgcac tggagctcaa ctggacgctt 960

cccggtcagc cggataacac gccgccaggt ggtgaactgg tgtttgaacg ctggcgtcgg 1020

ctaagcgata acagccagtg gattcaggtt tcgctggtct tccagacttt acagcagatg 1080

cgtgataaaa cgccgctgtc attaaatacg ccgcccggag aggtgaaact gaccctggca 1140

ggatgtgaag agcgaaatgc gcagggcatg tgttcgttgg caggttttac gcaaatcgtg 1200

aatgaagcac gcataccggc gtgcagtttg taa 1233

<210> 4

<211> 410

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Ser

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ser Asn Val Thr Asp Ala Ile

130 135 140

Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn

165 170 175

Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln

210 215 220

Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala

275 280 285

Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

atgtcagata tgaaaagcgg aaacatatcg atgaaagcga tcttaatccc atttttatct 60

cttctgattc cgttaacccc gcaatctgca ttcgct 96

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

Met Ser Asp Met Lys Ser Gly Asn Ile Ser Met Lys Ala Ile Leu Ile

1 5 10 15

Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr Pro Gln Ser Ala Phe Ala

20 25 30

<210> 7

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtccgaca tgaagtccgg taacatctcc atgaaggcca tcctgatccc cttcctgtcc 60

ctgctgatcc ccctgacccc ccagtccgcc ttcgcccagt ccgagcccga gctcaagctc 120

gagtccgtcg tcatcgtctc ccgccacggt gtccgcgccc ccaccaaggc cacccagctc 180

atgcaggacg tcacccccga cgcctggccc acctggcccg tcaagctcgg ttggctcacc 240

ccccgcggtg gtgagctcat cgcctacctc ggtcactacc agcgccagcg cctcgtcgcc 300

gacggtctcc tcgccaagaa gggttgcccc cagtccggtc aggtcgccat catcgccgac 360

gtcgacgagc gcacccgcaa gaccggtgag gccttcgccg ccggtctcgc ccccgactgc 420

gccatcaccg tccacaccca ggccgacacc tcctcccccg accccctctt caaccccctc 480

aagaccggtg tctgccagct cgacaactcc aacgtcaccg acgccatcct ctcccgcgcc 540

ggtggttcca tcgccgactt caccggtcac cgccagaccg ccttccgcga gctcgagcgc 600

gtcctcaact tcccccagtc caacctctgc ctcaagcgcg agaagcagga cgagtcctgc 660

tccctcaccc aggccctccc ctccgagctc aaggtctccg ccgacaacgt ctccctcacc 720

ggtgccgtct ccctcgcctc catgctcacc gagatcttcc tcctccagca ggcccagggt 780

atgcccgagc ccggttgggg tcgcatcacc gactcccacc agtggaacac cctcctctcc 840

ctccacaacg cccagttcta cctcctccag cgcacccccg aggtcgcccg ctcccgcgcc 900

acccccctcc tcgacctcat caagaccgcc ctcacccccc acccccccca gaagcaggcc 960

tacggtgtca ccctccccac ctccgtcctc ttcatcgccg gtcacgacac caacctcgcc 1020

aacctcggtg gtgccctcga gctcaactgg accctccccg gtcagcccga caacaccccc 1080

cccggtggtg agctcgtctt cgagcgctgg cgccgcctct ccgacaactc ccagtggatc 1140

caggtctccc tcgtcttcca gaccctccag cagatgcgcg acaagacccc cctctccctc 1200

aacacccccc ccggtgaggt caagctcacc ctcgccggtt gcgaggagcg caacgcccag 1260

ggtatgtgct ccctcgccgg tttcacccag atcgtcaacg aggcccgcat ccccgcctgc 1320

tccctctaa 1329

<210> 8

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagtccgagc ccgagctcaa gctcgagtcc gtcgtcatcg tctcccgcca cggtgtccgc 60

gcccccacca aggccaccca gctcatgcag gacgtcaccc ccgacgcctg gcccacctgg 120

cccgtcaagc tcggttggct caccccccgc ggtggtgagc tcatcgccta cctcggtcac 180

taccagcgcc agcgcctcgt cgccgacggt ctcctcgcca agaagggttg cccccagtcc 240

ggtcaggtcg ccatcatcgc cgacgtcgac gagcgcaccc gcaagaccgg tgaggccttc 300

gccgccggtc tcgcccccga ctgcgccatc accgtccaca cccaggccga cacctcctcc 360

cccgaccccc tcttcaaccc cctcaagacc ggtgtctgcc agctcgacaa ctccaacgtc 420

accgacgcca tcctctcccg cgccggtggt tccatcgccg acttcaccgg tcaccgccag 480

accgccttcc gcgagctcga gcgcgtcctc aacttccccc agtccaacct ctgcctcaag 540

cgcgagaagc aggacgagtc ctgctccctc acccaggccc tcccctccga gctcaaggtc 600

tccgccgaca acgtctccct caccggtgcc gtctccctcg cctccatgct caccgagatc 660

ttcctcctcc agcaggccca gggtatgccc gagcccggtt ggggtcgcat caccgactcc 720

caccagtgga acaccctcct ctccctccac aacgcccagt tctacctcct ccagcgcacc 780

cccgaggtcg cccgctcccg cgccaccccc ctcctcgacc tcatcaagac cgccctcacc 840

ccccaccccc cccagaagca ggcctacggt gtcaccctcc ccacctccgt cctcttcatc 900

gccggtcacg acaccaacct cgccaacctc ggtggtgccc tcgagctcaa ctggaccctc 960

cccggtcagc ccgacaacac cccccccggt ggtgagctcg tcttcgagcg ctggcgccgc 1020

ctctccgaca actcccagtg gatccaggtc tccctcgtct tccagaccct ccagcagatg 1080

cgcgacaaga cccccctctc cctcaacacc ccccccggtg aggtcaagct caccctcgcc 1140

ggttgcgagg agcgcaacgc ccagggtatg tgctccctcg ccggtttcac ccagatcgtc 1200

aacgaggccc gcatccccgc ctgctccctc taa 1233

<210> 9

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtccgaca tgaagtccgg taacatctcc atgaaggcca tcctgatccc cttcctgtcc 60

ctgctgatcc ccctgacccc ccagtccgcc ttcgcc 96

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 10

atgtcgttcc gatctctact cgccctgagc ggcctcgtct gcacagggtt ggcaaatgtg 60

atttccaagc gcgcg 75

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 11

Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly

1 5 10 15

Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala

20 25

<210> 12

<211> 84

<212> DNA

<213> 米曲霉(Asp.oryzae)

<400> 12

atggtcgcct ggtggtccct cttcctctac ggtctccagg tcgccgcccc cgccctcgcc 60

gccacccccg ccgactggcg ctcc 84

<210> 13

<211> 28

<212> PRT

<213> 米曲霉(Asp.oryzae)

<400> 13

Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala Ala

1 5 10 15

Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser

20 25

<210> 14

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagtccgagc ccgagctcaa gctcgagtcc gtcgtcatcg tctcccgcca cggtgtccgc 60

gcccccacca aggccaccca gctcatgcag gacgtcaccc ccgacgcctg gcccacctgg 120

cccgtcaagc tcggtgagct caccccccgc ggtggtgagc tcatcgccta cctcggtcac 180

tactggcgcc agcgcctcgt cgccgacggt ctcctcccca agtgcggttg cccccagtcc 240

ggtcaggtcg ccatcatcgc cgacgtcgac gagcgcaccc gcaagaccgg tgaggccttc 300

gccgccggtc tcgcccccga ctgcgccatc accgtccaca cccaggccga cacctcctcc 360

cccgaccccc tcttcaaccc cctcaagacc ggtgtctgcc agctcgacaa cgccaacgtc 420

accgacgcca tcctcgagcg cgccggtggt tccatcgccg acttcaccgg tcactaccag 480

accgccttcc gcgagctcga gcgcgtcctc aacttccccc agtccaacct ctgcctcaag 540

cgcgagaagc aggacgagtc ctgctccctc acccaggccc tcccctccga gctcaaggtc 600

tccgccgact gcgtctccct caccggtgcc gtctccctcg cctccatgct caccgagatc 660

ttcctcctcc agcaggccca gggtatgccc gagcccggtt ggggtcgcat caccgactcc 720

caccagtgga acaccctcct ctccctccac aacgcccagt tcgacctcct ccagcgcacc 780

cccgaggtcg cccgctcccg cgccaccccc ctcctcgacc tcatcaagac cgccctcacc 840

ccccaccccc cccagaagca ggcctacggt gtcaccctcc ccacctccgt cctcttcatc 900

gccggtcacg acaccaacct cgccaacctc ggtggtgccc tcgagctcaa ctggaccctc 960

cccggtcagc ccgacaacac cccccccggt ggtgagctcg tcttcgagcg ctggcgccgc 1020

ctctccgaca actcccagtg gatccaggtc tccctcgtct tccagaccct ccagcagatg 1080

cgcgacaaga cccccctctc cctcaacacc ccccccggtg aggtcaagct caccctcgcc 1140

ggttgcgagg agcgcaacgc ccagggtatg tgctccctcg ccggtttcac ccagatcgtc 1200

aacgaggccc gcatccccgc ctgctccctc taa 1233

<210> 15

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile

130 135 140

Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn

165 170 175

Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Cys Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln

210 215 220

Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala

275 280 285

Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 16

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagtccgagc ccgagctcaa gctccagtcc gtcgtcatcg tctcccgcca cggtgtccgc 60

gcccccaccc gcgccaccca gctcatgcag aacgtcaccc ccgacgcctg gcccacctgg 120

aaccagaccc tcggtgagct caccccccgc ggtggtgagc tcatcgccta cctcggtcac 180

tactggcgcc agcgcctcgt cgccgacggt ctcctcccca accagacctg cccccagtcc 240

ggtcaggtcg ccatcatcgc cgacaccgac gagcgcaccc gcaagaccgg tgaggccttc 300

gccgccggtc tcgcccccga ctgcgccatc accgtccaca cccaggccga cacctcctcc 360

cccgaccccc tcttcaaccc cctccgcacc ggtgtctgcc agctcgacaa cgccaacgtc 420

accgacgcca tcctcgagcg cgccggtggt tccatcgccg acttcaccgg tcactaccag 480

accgccttcc gcgagctcga gcgcgtcctc aacttctccc agtccaacct ctgcctcaag 540

cgcgagaagg aggacgagtc ctgctccctc acccaggccc tcccctccga gctcaaggtc 600

tccgccgact gcgtctccct caccggtgcc gtctccctcg cctccatgct caccgagatc 660

ttcctcctcc agcaggccca gggtatgccc gagcccggtt ggggtcgcat caccgactcc 720

caccagtgga acaccctcct ctccctccac aacgcccagt tcgacctcct caaccgcacc 780

cccgaggtcg cccgctcccg cgccaccccc ctcctcgacc tcatcaagac cgccctcacc 840

cccaacggta cccagaagca ggccaagggt gtcaccctcc ccacctccgt cctcttcatc 900

gccggtcacg acaccaacct cgccaacctc ggtggtgccc tcgagctcaa ctggaccctc 960

cccggtcagc ccgacaacac cccccccggt ggtgagctcg tcttcgagcg ctggcgccgc 1020

ctctccgaca actcccagtg gatcaacgtc tccctcgtct tccagaccct ccagcagatg 1080

cgcgacaaga cccccctctc cctcaacacc ccccccggtg aggtcaagct caccctcgcc 1140

ggttgcgagg agcgcaacgc ccagggtatg tgctccctcg ccggtttcac ccagatcgtc 1200

aacgaggccc gcctccccgc ctgctccctc taa 1233

<210> 17

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Gln Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Arg Ala Thr Gln Leu Met Gln Asn Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Asn Gln Thr Leu Gly Glu Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Asn Gln Thr Cys Pro Gln Ser

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Thr Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Arg Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile

130 135 140

Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Asn

165 170 175

Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Glu Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Cys Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln

210 215 220

Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu

245 250 255

Leu Asn Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro Asn Gly Thr Gln Lys Gln Ala

275 280 285

Lys Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Asn Val Ser Leu

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Leu Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 18

<211> 2515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtacagtgac cggtgactct ttctggcatg cggagagacg gacggacgca gagagaaggg 60

ctgagtaata agccactggc cagacagctc tggcggctct gaggtgcagt ggatgattat 120

taatccggga ccggccgccc ctccgccccg aagtggaaag gctggtgtgc ccctcgttga 180

ccaagaatct attgcatcat cggagaatat ggagcttcat cgaatcaccg gcagtaagcg 240

aaggagaatg tgaagccagg ggtgtatagc cgtcggcgaa atagcatgcc attaacctag 300

gtacagaagt ccaattgctt ccgatctggt aaaagattca cgagatagta ccttctccga 360

agtaggtaga gcgagtaccc ggcgcgtaag ctccctaatt ggcccatccg gcatctgtag 420

ggcgtccaaa tatcgtgcct ctcctgcttt gcccggtgta tgaaaccgga aaggccgctc 480

aggagctggc cagcggcgca gaccgggaac acaagctggc agtcgaccca tccggtgctc 540

tgcactcgac ctgctgaggt ccctcagtcc ctggtaggca gctttgcccc gtctgtccgc 600

ccggtgtgtc ggcggggttg acaaggtcgt tgcgtcagtc caacatttgt tgccatattt 660

tcctgctctc cccaccagct gctcttttct tttctctttc ttttcccatc ttcagtatat 720

tcatcttccc atccaagaac ctttatttcc cctaagtaag tactttgcta catccatact 780

ccatccttcc catcccttat tcctttgaac ctttcagttc gagctttccc acttcatcgc 840

agcttgacta acagctaccc cgcttgagca gacatcacca tgaaaaagcc tgaactcacc 900

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ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta tcggcacttt 1080

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acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc tgaaaccgaa 1200

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agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata cactacatgg 1320

cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc actggcaaac tgtgatggac 1380

gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tgatgctttg ggccgaggac 1440

tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt cctgacggac 1500

aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga ttcccaatac 1560

gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt gtatggagca gcagacgcgc 1620

tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc ggctccgggc gtatatgctc 1680

cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gcaatttcga tgatgcagct 1740

tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag ccgggactgt cgggcgtaca 1800

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agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg aatagtgatt taatagctcc 1920

atgtcaacaa gaataaaacg cgttttcggg tttacctctt ccagatacag ctcatctgca 1980

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agcttagcag agctattttc attttcggga gacgagatca agcagatcaa cggtcgtcaa 2100

gagacctacg agactgagga atccgctctt ggctccacgc gactatatat ttgtctctaa 2160

ttgtactttg acatgctcct cttctttact ctgatagctt gactatgaaa attccgtcac 2220

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cacacattca tcgtaggtat aaacctcgaa atcattccta ctaagatggt atacaatagt 2340

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aactctccta tgagtcgttt acccagaatg cacaggtaca cttgtttaga ggtaatcctt 2460

ctttctagaa gtcctcgtgt actgtgtaag cgcccactcc acatctccac tcgag 2515

<210> 19

<211> 1979

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatcccggg tctacgccag gaccgagcaa gcccagatga gaaccgacgc agatttcctt 60

ggcacctgtt gcttcagctg aatcctggca atacgagata cctgctttga atattttgaa 120

tagctcgccc gctggagagc atcctgaatg caagtaacaa ccgtagaggc tgacacggca 180

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tatcagcaat acacgtaatt taaactcgtt agcatggggc tgatagctta attaccgttt 420

accagtgccg cggttctgca gctttccttg gcccgtaaaa ttcggcgaag ccagccaatc 480

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caactcccag tttacactcg tcgagccaac atcctgacta taagctaaca cagaatggct 660

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agcgcccaga taacaatggg catgccttat gccgtgaccg acgccgttct ggctcctcat 1080

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cgccatccca tcgccgccct cctgtgctac ccggccgcgc gataccttat gggcagcatg 1200

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atcgtgttgg gggcccttcc ggaggacaga cacatcgacc gcctggccaa acgccagcgc 1320

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catgctacga aagagcagaa aaaaacctgc cgtagaaccg aagagatatg acacgcttcc 1920

atctctcaaa ggaagaatcc cttcagggtt gcgtttccag gcggccgcaa attacatgt 1979

<210> 20

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctaccaatgc tctcgaggat tgcctgaaca ttgacattcg gcgtccggcc gggaccaccg 60

cggactcgaa gctgcctgtg ctggtctgga tctttggcgg aggctttgaa cttggttcaa 120

aggcgatgta tgatggtaca acgatggtat catcgtcgat agacaagaac atgcctatcg 180

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tcatgatagt actagccata ttaatgaagg gcatatacca cgcgttggac ctgcgttata 1500

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gggacggcga atccccggga attgaaagaa attgcatccc aggccagtga ggccagcgat 1620

tggccacctc tccaaggcac agggccattc tgcagcgctg gtggattcat cgcaatttcc 1680

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gtgaggggct gaagtgcttc ctccctttta gacgcaactg agagcctgag cttcatcccc 1980

agcatcatta cacctcagca 2000

<210> 21

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acaatcaatc catttcgcta tagttaaagg atggggatga gggcaattgg ttatatgatc 60

atgtatgtag tgggtgtgca taatagtagt gaaatggaag ccaagtcatg tgattgtaat 120

cgaccgacgg aattgaggat atccggaaat acagacaccg tgaaagccat ggtctttcct 180

tcgtgtagaa gaccagacag acagtccctg atttaccctt gcacaaagca ctagaaaatt 240

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ttccccatca ttgctttccc caggggcctc ccaacgacta aatcaagagt atatctctac 420

cgtccaatag atcgtcttcg cttcaaaatc tttgacaatt ccaagagggt ccccatccat 480

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accttgaact cactcttgtt ttaatagtga tcttggtgac ggagtgtcgg tgagtgacaa 840

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gatgaggagc catcggtctc tgcacgcaaa cccaacttcc tcttcattct cacggatgat 1020

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cgctacctat aacgcgccct ttgtgaacgg tttcaatggc tccgacttcc tcctcgaccc 1440

ccacacatat tcctactgga atgcgacata ccagcgaaac catgagcctc cgcggagtta 1500

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gagacatgcg catttgtttg ctgatgcaaa ggtgccgcgg acgcctaatt tcaatccgga 1740

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acggctacca cattggccat 2000

<210> 22

<211> 2480

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 22

tgccattggc ggaggggtcc ggacggtcag gaacttagcc ttatgagatg aatgatggac 60

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atgaaaagcg gaaacatatc gatgaaagcg atcttaatcc catttttatc tcttctgatt 720

ccgttaaccc cgcaatctgc attcgctcag agtgagccgg agctgaagct ggaaagtgtg 780

gtgattgtca gtcgtcatgg tgtgcgtgct ccaaccaagg ccacgcaact gatgcaggat 840

gtcaccccag acgcatggcc aacctggccg gtaaaactgg gttggctgac accgcgcggt 900

ggtgagctaa tcgcctatct cggacattac caacgccagc gtctggtagc cgacggattg 960

ctggcgaaaa agggctgccc gcagtctggt caggtcgcga ttattgctga tgtcgacgag 1020

cgtacccgta aaacaggcga agccttcgcc gccgggctgg cacctgactg tgcaataacc 1080

gtacataccc aggcagatac gtccagtccc gatccgttat ttaatcctct aaaaactggc 1140

gtttgccaac tggataactc gaacgtgact gacgcgatcc tcagcagggc aggagggtca 1200

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caggcattac catcggaact caaggtgagc gccgacaatg tctcattaac cggtgcggta 1380

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ccggggtggg gaaggatcac cgattcacac cagtggaaca ccttgctaag tttgcataac 1500

gcgcaatttt atttgctaca acgcacgcca gaggttgccc gcagccgcgc caccccgtta 1560

ttagatttga tcaagacagc gttgacgccc catccaccgc aaaaacaggc gtatggtgtg 1620

acattaccca cttcagtgct gtttatcgcc ggacacgata ctaatctggc aaatctcggc 1680

ggcgcactgg agctcaactg gacgcttccc ggtcagccgg ataacacgcc gccaggtggt 1740

gaactggtgt ttgaacgctg gcgtcggcta agcgataaca gccagtggat tcaggtttcg 1800

ctggtcttcc agactttaca gcagatgcgt gataaaacgc cgctgtcatt aaatacgccg 1860

cccggagagg tgaaactgac cctggcagga tgtgaagagc gaaatgcgca gggcatgtgt 1920

tcgttggcag gttttacgca aatcgtgaat gaagcacgca taccggcgtg cagtttgtaa 1980

tgccattggc ggaggggtcc ggacggtcag gaacttagcc ttatgagatg aatgatggac 2040

gtgtctggcc tcggaaaagg atatatgggg atcatgatag tactagccat attaatgaag 2100

ggcatatacc acgcgttgga cctgcgttat agcttcccgt tagttatagt accatcgtta 2160

taccagccaa tcaagtcacc acgcacgacc ggggacggcg aatccccggg aattgaaaga 2220

aattgcatcc caggccagtg aggccagcga ttggccacct ctccaaggca cagggccatt 2280

ctgcagcgct ggtggattca tcgcaatttc ccccggcccg gcccgacacc gctataggct 2340

ggttctccca caccatcgga gattcgtcgc ctaatgtctc gtccgttcac aagctgaaga 2400

gcttgaagtg gcgagatgtc tctgcaggaa ttcaagctag atgctaagcg atattgcatg 2460

gcaatatgtg ttgatgcatg 2480

<210> 23

<211> 2459

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 23

tgccattggc ggaggggtcc ggacggtcag gaacttagcc ttatgagatg aatgatggac 60

gtgtctggcc tcggaaaagg atatatgggg atcatgatag tactagccat attaatgaag 120

ggcatatacc acgcgttgga cctgcgttat agcttcccgt tagttatagt accatcgtta 180

taccagccaa tcaagtcacc acgcacgacc ggggacggcg aatccccggg aattgaaaga 240

aattgcatcc caggccagtg aggccagcga ttggccacct ctccaaggca cagggccatt 300

ctgcagcgct ggtggattca tcgcaatttc ccccggcccg gcccgacacc gctataggct 360

ggttctccca caccatcgga gattcgtcgc ctaatgtctc gtccgttcac aagctgaaga 420

gcttgaagtg gcgagatgtc tctgcaggaa ttcaagctag atgctaagcg atattgcatg 480

gcaatatgtg ttgatgcatg tgcttcttcc ttcagcttcc cctcgtgcag atgaggtttg 540

gctataaatt gaagtggttg gtcggggttc cgtgaggggc tgaagtgctt cctccctttt 600

agacgcaact gagagcctga gcttcatccc cagcatcatt acacctcagc aatgtcgttc 660

cgatctctac tcgccctgag cggcctcgtc tgcacagggt tggcaaatgt gatttccaag 720

cgcgcgcaga gtgagccgga gctgaagctg gaaagtgtgg tgattgtcag tcgtcatggt 780

gtgcgtgctc caaccaaggc cacgcaactg atgcaggatg tcaccccaga cgcatggcca 840

acctggccgg taaaactggg ttggctgaca ccgcgcggtg gtgagctaat cgcctatctc 900

ggacattacc aacgccagcg tctggtagcc gacggattgc tggcgaaaaa gggctgcccg 960

cagtctggtc aggtcgcgat tattgctgat gtcgacgagc gtacccgtaa aacaggcgaa 1020

gccttcgccg ccgggctggc acctgactgt gcaataaccg tacataccca ggcagatacg 1080

tccagtcccg atccgttatt taatcctcta aaaactggcg tttgccaact ggataactcg 1140

aacgtgactg acgcgatcct cagcagggca ggagggtcaa ttgctgactt taccgggcat 1200

cggcaaacgg cgtttcgcga actggaacgg gtgcttaatt ttccgcaatc aaacttgtgc 1260

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gatgcatg 2468

<210> 29

<211> 2468

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 29

tgccattggc ggaggggtcc ggacggtcag gaacttagcc ttatgagatg aatgatggac 60

gtgtctggcc tcggaaaagg atatatgggg atcatgatag tactagccat attaatgaag 120

ggcatatacc acgcgttgga cctgcgttat agcttcccgt tagttatagt accatcgtta 180

taccagccaa tcaagtcacc acgcacgacc ggggacggcg aatccccggg aattgaaaga 240

aattgcatcc caggccagtg aggccagcga ttggccacct ctccaaggca cagggccatt 300

ctgcagcgct ggtggattca tcgcaatttc ccccggcccg gcccgacacc gctataggct 360

ggttctccca caccatcgga gattcgtcgc ctaatgtctc gtccgttcac aagctgaaga 420

gcttgaagtg gcgagatgtc tctgcaggaa ttcaagctag atgctaagcg atattgcatg 480

gcaatatgtg ttgatgcatg tgcttcttcc ttcagcttcc cctcgtgcag atgaggtttg 540

gctataaatt gaagtggttg gtcggggttc cgtgaggggc tgaagtgctt cctccctttt 600

agacgcaact gagagcctga gcttcatccc cagcatcatt acacctcagc aatggtcgcc 660

tggtggtccc tcttcctcta cggtctccag gtcgccgccc ccgccctcgc cgccaccccc 720

gccgactggc gctcccagtc cgagcccgag ctcaagctcg agtccgtcgt catcgtctcc 780

cgccacggtg tccgcgcccc caccaaggcc acccagctca tgcaggacgt cacccccgac 840

gcctggccca cctggcccgt caagctcggt gagctcaccc cccgcggtgg tgagctcatc 900

gcctacctcg gtcactactg gcgccagcgc ctcgtcgccg acggtctcct ccccaagtgc 960

ggttgccccc agtccggtca ggtcgccatc atcgccgacg tcgacgagcg cacccgcaag 1020

accggtgagg ccttcgccgc cggtctcgcc cccgactgcg ccatcaccgt ccacacccag 1080

gccgacacct cctcccccga ccccctcttc aaccccctca agaccggtgt ctgccagctc 1140

gacaacgcca acgtcaccga cgccatcctc gagcgcgccg gtggttccat cgccgacttc 1200

accggtcact accagaccgc cttccgcgag ctcgagcgcg tcctcaactt cccccagtcc 1260

aacctctgcc tcaagcgcga gaagcaggac gagtcctgct ccctcaccca ggccctcccc 1320

tccgagctca aggtctccgc cgactgcgtc tccctcaccg gtgccgtctc cctcgcctcc 1380

atgctcaccg agatcttcct cctccagcag gcccagggta tgcccgagcc cggttggggt 1440

cgcatcaccg actcccacca gtggaacacc ctcctctccc tccacaacgc ccagttcgac 1500

ctcctccagc gcacccccga ggtcgcccgc tcccgcgcca cccccctcct cgacctcatc 1560

aagaccgccc tcacccccca ccccccccag aagcaggcct acggtgtcac cctccccacc 1620

tccgtcctct tcatcgccgg tcacgacacc aacctcgcca acctcggtgg tgccctcgag 1680

ctcaactgga ccctccccgg tcagcccgac aacacccccc ccggtggtga gctcgtcttc 1740

gagcgctggc gccgcctctc cgacaactcc cagtggatcc aggtctccct cgtcttccag 1800

accctccagc agatgcgcga caagaccccc ctctccctca acaccccccc cggtgaggtc 1860

aagctcaccc tcgccggttg cgaggagcgc aacgcccagg gtatgtgctc cctcgccggt 1920

ttcacccaga tcgtcaacga ggcccgcatc cccgcctgct ccctctaatg ccattggcgg 1980

aggggtccgg acggtcagga acttagcctt atgagatgaa tgatggacgt gtctggcctc 2040

ggaaaaggat atatggggat catgatagta ctagccatat taatgaaggg catataccac 2100

gcgttggacc tgcgttatag cttcccgtta gttatagtac catcgttata ccagccaatc 2160

aagtcaccac gcacgaccgg ggacggcgaa tccccgggaa ttgaaagaaa ttgcatccca 2220

ggccagtgag gccagcgatt ggccacctct ccaaggcaca gggccattct gcagcgctgg 2280

tggattcatc gcaatttccc ccggcccggc ccgacaccgc tataggctgg ttctcccaca 2340

ccatcggaga ttcgtcgcct aatgtctcgt ccgttcacaa gctgaagagc ttgaagtggc 2400

gagatgtctc tgcaggaatt caagctagat gctaagcgat attgcatggc aatatgtgtt 2460

gatgcatg 2468

Claims

1.一种在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的信号肽，其特征在于，所述信号肽选自米曲霉TAKA淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

2.权利要求1所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.权利要求1或2所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的信号肽，其中所述丝状真菌选自黑曲霉。

4.权利要求3所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的信号肽，其中所述大肠杆菌植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求3所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的信号肽，其中所述大肠杆菌植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.17所示。

6.一种经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体的基因，其具有如SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列；或具有与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。

7.一种经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列，其具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；或具有与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。

8.一种在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其特征在于，将米曲霉TAKA淀粉酶与编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列连接，然后将含有所述序列的表达盒导入到丝状真菌中进行表达，其中所述米曲霉TAKA淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

9.权利要求8所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其中所述米曲霉TAKA淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

10.权利要求8所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其中所述丝状真菌选自黑曲霉。

11.权利要求8所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其中大肠杆菌植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，大肠杆菌植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.17所示。

12.权利要求8所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其中编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列未经密码子优化。

13.权利要求8所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其中编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列经密码子优化，其具有如SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列；或具有与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。

14.权利要求13所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其中经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列如SEQ IDNO.14所示。

15.权利要求13所述的在丝状真菌中提高大肠杆菌植酸酶或其突变体分泌表达的方法，其中经密码子优化的编码大肠杆菌植酸酶或其突变体成熟肽的DNA序列如SEQ IDNO.16所示。