CN107349279B - 一种旱柳柳花总黄酮的提取方法及抗氧化应用 - Google Patents

Abstract

采用微波辅助乙醇提取旱柳柳花总黄酮，并对其抗氧化活性进行研究。在单因素探究实验的基础上，通过正交实验对单因素实验选取的水平进行工艺优化得到旱柳柳花总黄酮对羟自由基、DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除作用。

Description

一种旱柳柳花总黄酮的提取方法及抗氧化应用

背景技术

旱柳(Salix matsudana Koidz)柳花为杨柳科(Salicaceae)柳属落叶乔木旱柳的花。柳花又名“杨花”、“柳椹”、“柳蕊”。柳花可以药食两用，作枕芯有安神催眠之功效。若将柳花研碎，可用于制药。《药性论》上记载：将柳花捣碎，可用于止血、贴疮、治疗牙痛等。黄酮是柳花中一类主要的有效成分，种类多样，包括木犀草素、槲皮素、二氢山奈酚、儿茶素、异鼠李素等。现代药理学表明柳花黄酮具有抗炎、抗癌、抗氧化等作用。文献表明黄花柳花总黄酮对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

越来越多的研究表明肿瘤、癌症、帕金森、糖尿病等疾病均与人体内过量的自由基相关，抗氧化剂对于许多自由基引起的衰老及老化相关疾病都能够起到预防作用。

但是，目前未见有关旱柳柳花黄酮的研究报道，申请人采用微波法对旱柳柳花黄酮的提取工艺，提高了提取效率，得到了清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基的有效成分。

发明内容

为了获得有效成分，申请人通过大量的试验，得到黄酮提取物的制备方法，制备方法如下：

1)将收集好的柳花在室温条件下放入烘箱中烘干至其恒重，用粉碎机粉碎过筛，备用。

2)准确称取处理好的柳花粉末，加入有机溶液，微波提取，提取次数为1～2，抽滤，用相应的提取有机溶液洗涤，即得黄酮提取物。

优选有机溶剂为甲醇、乙醇，料液比为1:20-25(g/mL)。更优选料液比为1:25(g/mL)。

优选乙醇或者甲醇浓度在10％～60％的水溶液。更优选乙醇浓度为60％。

优选微波功率为65～325W。更优选功率为325W。

优选微波提取2～10min。更优选提取时间为10min。

优选提取次数为1～2。更优选提取次数为2次。

优选，用粉碎机粉碎并过60-100目筛。更优选过60目筛。

附图说明

图1芦丁标准曲线

图2乙醇浓度对总黄酮提取的影响

图3微波功率对总黄酮提取的影响

图4微波时间对总黄酮提取的影响

图5料液比对总黄酮提取的影响

图6提取次数对总黄酮提取的影响

图7总黄酮对DPPH自由基的清除率

图8总黄酮对羟自由基的清除率

图9总黄酮对ABTS自由基的清除率

具体实施方式

实施例1标准曲线的绘制

1材料与方法

实验仪器

V-1100D型可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；AL204电子天平(梅特勒－托利多仪器公司)；LWMC-201微电脑微波化学反应器(南京陵江科技开发有限责任公司)。

实验材料

芸香叶苷(芦丁)、过二硫酸钾、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、95％乙醇、无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸、双氧水30％均购自国药集团化学试剂有限公司；2，2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购自sigma公司；旱柳柳花(采摘自校内中马路旁)；实验用水均为超纯水。

1.3实验方法

1.3.1样品预处理

将收集好的柳花在适温条件下放入烘箱中烘干至其恒重，用粉碎机粉碎并过60目筛，备用。

1.3.2绘制芸香叶苷(芦丁)标准曲线

用电子天平称取芸香叶苷(芦丁)20.00mg并用无水乙醇溶解，定容到100mL的容量瓶中，制得芦丁标准液。用移液管准确吸取芦丁标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于10mL比色管中，加入0.5mL 5％NaNO2溶液，混合均匀后静置5min；加入0.5mL 10％Al(NO3)3溶液，5min后加入2.0mL 4％NaOH溶液，静置15min；最后用无水乙醇定容。平行3次。在波长510nm处，测吸光度，绘制标准曲线。

1.3.3黄酮含量的测定

取1mL的柳花提取液于10mL比色管中，加入5％NaNO2溶液0.5mL，摇匀，反应5min。再加入10％的Al(NO3)3溶液0.5mL，摇匀，反应5min。再加入2.0mL 4％的NaOH溶液，混匀。15min后用无水乙醇定容。平行3次。在波长510nm处测吸光度。由芦丁标准曲线计算出柳花中黄酮的质量，进而求出黄酮的含量。

实验结果得出线性方程为y＝11.723x-0.0055，R2＝0.9992，结果见图1。该回归方程表明，芦丁在0.01～0.06mg/mL范围内线性关系良好，可以用于黄酮浓度的计算。(y代表吸光度；x代表芦丁标准溶液浓度，mg/mL)。总黄酮含量计算公式为：

黄酮含量(mg/g)＝(黄酮浓度×稀释倍数×提取液体积)/样品质量

实施例2乙醇浓度的选择

准确称取处理好的柳花粉末0.5g，以料液比为1:20(g/mL)分别加入10、30、50、60、70、90％乙醇溶液。在微波功率为325W的条件下提取10min。抽滤，洗涤，定容于50mL容量瓶中。相同条件下平行3次，按照实施例1中1.3.3项下的方法测定吸光度，并计算黄酮含量。

乙醇浓度选择的结果见图2，由图2可知：乙醇浓度在10％～60％时，黄酮含量随浓度的增大而增大；大于60％，黄酮含量反而随着浓度的增加而降低，因此优选乙醇浓度为60％。

实施例3微波功率的选择

准确称取处理好的柳花粉末0.5g，以料液比1:20(g/mL)加入60％的乙醇溶液。在65、195、325、455、585W的微波功率下提取10min。抽滤，洗涤，定容于50mL的容量瓶。平行3次，按照实施例1中1.3.3项下的方法测定吸光度，并计算黄酮含量。

微波功率的大小代表了微波辐射强度的大小。微波辐射强度越大，越容易分解细胞壁纤维，有助于提取物的溶出，增大提取效果；但是微波功率过大又容易产生局部过热，提取物变性，从而降低了提取效果。

由图3可知，在65～325W范围内，功率增大促进了柳花黄酮的提取；功率再增大，黄酮含量降低。故优选325W为较佳的提取功率。

实施例4微波时间的选择

称取处理好的柳花粉末0.5g，以料液比1:20(g/mL)加入60％的乙醇溶液。在微波功率325W的条件下分别提取2、6、10、14、16min。抽滤，洗涤，定容于50mL的容量瓶。平行3次，按照实施例1中1.3.3项下的方法测定吸光度，并计算黄酮含量。

由图4可知：当微波时间在2～10min时，黄酮含量随微波时间的增加不断增大；提取时间过长，提取物易发生结构变化，因而10～16min黄酮含量逐渐下降，所以优选10min为较佳的提取时间。

实施例5料液比的选择

称取处理好的柳花粉末0.5g，按照1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35(g/mL)的液料比加入适量60％乙醇溶液。在微波功率为325W的条件下提取10min。抽滤，洗涤，定容于50mL的容量瓶。平行3次，按照实施例1中1.3.3项下的方法测定吸光度，并计算黄酮含量。

由图5知，随着溶剂量增加，黄酮的溶解量增大，使得黄酮含量增大。当料液比达到1:25(g/mL)后黄酮含量有所下降。溶剂量过大可能会溶出更多杂质，且造成资源浪费，所以选择料液比为优选1:25(g/mL)。

实施例6提取次数的选择

称取处理好的柳花粉末0.5g，以料液比1:25(g/mL)加入60％乙醇溶液。在微波功率为325W的条件下提取10min。抽滤，洗涤，定容于50mL的容量瓶。按照相同的方法分别提取1、2、3、4次。平行3次，按照实施例1中1.3.3项下的方法测定吸光度。

由图6可知：在提取次数为1～2时，黄酮含量明显增大；超过2次后，黄酮含量基本不变。因此从提取成本及提取效率看，选择两次为较佳的提取次数。

实施例8抗氧化实验

清除DPPH自由基

用无水乙醇配制0.1mmol/L DPPH自由基溶液。在10mL比色管中分别移入不同体积的黄酮溶液和Vc溶液，再加入3.0mL DPPH溶液，定容。黄酮溶液和Vc溶液浓度均为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55mg/mL。避光反应30min后在517nm处测定吸光度。按照式(1)计算清除率：

清除率(％)＝[A₀-(A₁-A₂)]/A₀×100％ (1)

式中：A₀为未加黄酮溶液测定的吸光度；A₁为待测液的吸光度；A₂为不加DPPH溶液测定的吸光度。

清除羟自由基

在10mL比色管中加入依次加入2.0mmol/L硫酸亚铁溶液2.0mL，1.0mmol/L H₂O₂溶液2.0mL，摇匀；再加入不同量的黄酮溶液和Vc溶液，混匀。最后加入6.0mmol/L水杨酸溶液2.0mL，定容。黄酮和Vc溶液浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL。37℃条件下水浴15min后在510nm处测吸光度。按照式(2)计算清除率：

清除率(％)＝[A₀-(A₁-A₂)]/A₀×100％ (2)

式中：A₀为未加黄酮溶液测定的吸光度；A₁为待测液的吸光度；A₂为不加H₂O₂溶液所测定的吸光度。

清除ABTS自由基

将ABTS用超纯水配制成2.0mmol/L溶液，取50mL上述溶液与200mL 70.0mmol/LK₂S₂O₈水溶液混合均匀，室温避光放置16h，得到ABTS自由基溶液。将ABTS自由基溶液稀释至吸光度为0.70±0.02。配制黄酮和Vc溶液，使浓度均为0.01、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80mg/mL。

取0.2mL黄酮提取液，加入3.8mL ABTS自由基溶液混匀，10min后测定其吸光度。按照式(3)计算清除率：

清除率(％)＝[A₀-(A₁-A₂)]/A₀×100％ (3)

式中：A₀为未加黄酮溶液测定的吸光度；A₁为待测液的吸光度；A₂为不加ABTS自由基溶液所测定的吸光度。

正交实验

根据单因素实验结果，以料液比(A)、乙醇浓度(B)、微波时间(C)、微波功率(D)为考察因素进行正交实验。

表1实验因素及水平

正交设计及结果

通过对单因素结果的分析，确定正交实验因素水平。采用四因素三水平实验设计，考察料液比(A)、乙醇浓度(B)、微波时间(C)、微波功率(D)对柳花总黄酮的影响，进一步确定最佳的提取工艺条件。正交结果见表2，方差分析见表3。

表2正交实验结果

表3方差分析

注：F_0.05(2,2)＝19.00。

实验结果分析表明，提取柳花中总黄酮的最佳工艺为A₂B₂C₂D₂，即微波功率325W，微波时间10min，乙醇浓度60％，料液比1：25(g/mL)。各因素对黄酮含量影响的顺序为B>A>C>D。方差分析结果显示因素A、B具有显著的影响，即料液比、乙醇浓度对黄酮的提取影响较大。

验证实验

分别称取0.5g柳花粉末3份，在最佳工艺条件下提取黄酮，测吸光度，并计算柳花总黄酮的含量。3次实验总黄酮含量分别为41.41mg/g、41.33mg/g、41.67mg/g，平均含量为41.47mg/g，RSD为0.42％。结果精密度良好，表明该工艺稳定，可以用于柳花中黄酮的提取。

抗氧化实验结果

DPPH自由基

实验结果见图7，可知黄酮清除DPPH自由基的能力与提取液浓度呈正比，最大可达89.30％。相同浓度的溶液，Vc对DPPH自由基的清除率高于柳花提取液。虽然柳花黄酮对DPPH自由基清除能力没有Vc高，但是柳花黄酮对DPPH自由基还是有较强的清除效果。

羟自由基

由图8可知，在0.01～0.30mg/mL浓度范围内，清除率随着黄酮提取液浓度的增加而增大。当提取液浓度为0.30mg/mL时，清除率最大，可达88.70％，清除效果较好。

ABTS自由基

分析图9可知，清除ABTS自由基的能力随着黄酮提取液浓度的增加呈上升趋势。当提取液浓度大于0.4mg/mL时，清除率基本达到稳定，最高可达92.12％。柳花黄酮对ABTS自由基也有较强的清除效果。

Claims (2)

1.一种旱柳柳花总黄酮的提取方法，其特征在于：制备方法如下：

1)将收集好的柳花在室温条件下放入烘箱中烘干至其恒重，用粉碎机粉碎过60目筛，备用。

2)准确称取处理好的柳花粉末，加入有机溶剂，微波提取，提取次数为1～2，抽滤，洗涤即得黄酮提取物；所述有机溶剂为浓度60％的乙醇水溶液，料液比为1: 25g/mL；微波功率为325W；微波提取为10min；提取次数为2次。

2.如权利要求1所述的提取方法制备得到的旱柳柳花总黄酮在制备抗氧化药物组合物中的用途。

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