CN107669557A

CN107669557A - 一种塔纳卡提取方法

Info

Publication number: CN107669557A
Application number: CN201711092900.3A
Authority: CN
Inventors: 张坚强; 周锦珂; 彭颖华; 王丽华; 吴少莉; 陈燕玲; 宁雪萍
Original assignee: Luo Jie Bio Tech Ltd Guangzhou
Current assignee: Luo Jie Bio Tech Ltd Guangzhou
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN107669557B

Abstract

本发明属于植物提取技术领域，尤其涉及一种塔纳卡的提取方法。本发明提供了一种塔纳卡的提取方法，包括：将塔纳卡粉末进行微射流提取，得到提取物。该提取方法提取效率高，对塔纳卡的黄酮类化合物破坏少，该提取方法提取的塔纳卡提取物总黄酮含量高，有助于塔纳卡作用的发挥，相对密度为1.020～1.080时，塔纳卡提取物的总黄酮含量可达到为4～10mg/mL。并且，该提取方法易于操作，适用于产业化推广应用。实验结果证明，该提取方法提取的塔纳卡提取物安全性强，具备显著广谱紫外线吸收效果，可清除多种自由基。

Description

一种塔纳卡提取方法

技术领域

本发明属于植物提取技术领域，尤其涉及一种塔纳卡提取方法。

背景技术

塔纳卡，又名黄香楝(Hesperethusa crenulata)，属芸香科柑果子属，为生长于印度次大陆和东南亚地区的热带植物。在缅甸，人们常将黄香楝树皮磨成粉后与水进行调和涂敷于面部，起防晒、清凉、美容等多种功效。由于黄香楝对皮肤无毒副作用，是天然的化妆品，因而在当地广受欢迎。但将黄香楝树皮直接磨粉使用，有效成分未溶出，实际效果差，并且影响美观、使用范围较窄、等弊端，因而需要提取其有效成分以增强其适用性。

江珊等采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水四种溶剂提取黄香楝树皮，40℃下在超声仪中提取黄香楝树皮30min后抽滤，将滤液进行旋蒸浓缩，再真空干燥得粉末状提取物(黄香楝树皮提取物的多酚含量及抗氧化研究，化学研究与应用，2014年4月第26卷第4期)，但超声提取黄香楝树皮较难实现产业化，纯化过程也过于繁琐。朱俐俐等采用乙醇、二氯甲烷、丙酮和水为溶剂提取黄香楝树皮，加热回流提取2h后处理得到提取物(黄香楝树活性成分的提取及防晒研究，浙江化工2016年第47卷第11期)，提取过程引入了多种有机溶剂，且加热回流法耗能较大，不符合节能环保要求。中国专利201410054494.1公开了一种塔纳卡提取物的制备方法，以水或者乙醇水溶液为提取溶剂，经粉碎、回流提取、浓缩、干燥、再粉碎得到塔纳卡提取物，提取过程繁琐。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种塔纳卡提取物，用于解决现有技术提取塔纳卡提取物过程繁琐、耗能大等的问题。

本发明的具体技术方案如下：

本发明还提供了一种塔纳卡提取物的提取方法，包括：将塔纳卡粉末进行微射流提取，得到提取物。

优选的，所述微射流提取的提取溶剂为水和/或低级醇；

所述提取溶剂与所述塔纳卡粉末的质量比为5～40：1。

优选的，所述微射流提取的冷媒温度为0～30℃；

所述微射流提取的进料速度为5～30L/min。

进一步的，将塔纳卡粉末进行微射流提取之后，得到提取物之前还包括：

将微射流提取得到的提取液进行后处理。

优选的，所述后处理具体为固液分离、除杂、纯化和浓缩。

优选的，所述固液分离具体为采用高速离心进行固液分离；

所述除杂具体为采用微孔滤膜除去杂质；

所述纯化具体为采用超滤膜进行纯化；

所述浓缩具体为减压浓缩至25℃时相对密度为1.020～1.080。

优选的，所述高速离心的离心速度为10000～20000rpm，所述高速离心的离心时间为10～80min；

所述微孔滤膜的孔径为0.1～1μm；

所述超滤膜的孔径为1000～15000Da。

优选的，所述减压浓缩的温度为50～80℃，所述减压浓缩的压力为0.085～0.098Mpa。

优选的，所述微射流提取为采用微射流提取器进行提取；

所述微射流提取器包括：微射流提取单元；

所述微射流提取单元包括：壳体、内齿环和微射流环；

所述壳体为具有中空结构的圆柱体；

所述内齿环和所述微射流环径向贴附于所述壳体的内壁；

所述内齿环无间隙地设置于所述微射流环的工作前端；

所述微射流环将所述壳体隔成微射流提取腔室；

所述微射流环开有微射流孔。

本发明还提供了上述技术方案所述的提取方法获得的塔纳卡提取物。

综上所述，本发明提供了一种塔纳卡提取方法，包括：将塔纳卡粉末进行微射流提取，得到提取物。该提取方法提取效率高，对塔纳卡的黄酮类化合物破坏少，该提取方法提取的塔纳卡提取物总黄酮含量高，有助于塔纳卡作用的发挥，相对密度为1.020～1.080时，塔纳卡提取物的总黄酮含量可达到为4～10mg/mL。并且，该提取方法易于操作，适用于产业化推广应用。实验结果证明，该提取方法提取的塔纳卡提取物安全性强，具备显著广谱紫外线吸收效果，可清除多种自由基。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明中的一种微射流提取器的结构示意图；

图2为本发明中的一种微射流提取单元中的引导环、内齿环、内外齿环和微射流环的局部主视图；

图3为本发明中提供的一种微射流环的示意图；

图4为本发明塔纳卡提取物对紫外照射斑马鱼鱼鳍损伤的影响(0h)；

图5为本发明塔纳卡提取物对紫外照射斑马鱼鱼鳍损伤的影响(24h)；

图6为本发明塔纳卡提取物对紫外照射斑马鱼鱼鳍损伤的影响(48h)；

图7为本发明塔纳卡提取物对紫外照射斑马鱼鱼鳍损伤的影响与时间的关系图；

图示说明，1.驱动单元；2.吊拉环状物；3.电源接口；4.联轴器；5.第二冷媒出口；6.进料口；7.一级微射流提取腔室；8.螺旋推进叶片；9.二级微射流提取腔室；10.第一冷媒出口；11.出料口；12.三级微射流提取腔室；13.转轴；14.清洗排污出口；15.支架；16.引导环；17.第一冷却环；18.壳体；19.第一冷媒进口；20.第二冷媒进口；21.第二冷却环；22.底座；23.减震片；711.内齿环；712.微射流孔；713.微射流环；714.内外齿环。

具体实施方式

本发明提供了一种塔纳卡提取物的提取方法，用于解决现有技术提取塔纳卡提取物过程繁琐、耗能大等的问题。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，微射流提取的提取溶剂为水和/或低级醇；

提取溶剂与塔纳卡的质量比为5～40：1。

本发明中，微射流提取的冷媒温度为0～30℃，微射流提取的冷媒温度更优选为10～20℃，；

微射流提取的进料速度为5～30L/min，微射流提取的进料速度更优选为15～30L/min。

本发明中，低级醇为丙二醇或丁二醇；

丙二醇为质量分数为20-70％的丙二醇；

丙二醇为1，2-丙二醇和/或1，3-丙二醇；

丁二醇为1，2-丁二醇、1，3-丁二醇和/或1，4-丁二醇；

更优选为，丙二醇为1，2-丙二醇，丁二醇是1，3-丁二醇。

本发明中，将塔纳卡粉末进行微射流提取之后，得到提取物之前还包括：

将微射流提取得到的提取液进行后处理。

本发明中，后处理具体为固液分离、除杂、纯化和浓缩。

后处理更具体为依次进行固液分离、除杂、纯化和浓缩。

本发明中，固液分离具体为采用高速离心进行固液分离；

除杂具体为采用微孔滤膜除去杂质；

纯化具体为采用超滤膜进行纯化；

浓缩具体为减压浓缩至25℃时相对密度为1.020～1.080，浓缩具体更优选为减压浓缩至25℃时相对密度为1.040～1.080。

本发明中，高速离心的离心速度为10000～20000rpm，高速离心的离心速度更优选为14000～20000rpm，高速离心的离心速度进一步优选为14000～18000rpm，高速离心的离心时间为10～80min，高速离心的离心时间更优选为20～60min；

微孔滤膜的孔径为0.1～1μm，微孔滤膜的孔径更优选为0.2～0.8μm；

超滤膜的孔径为1000～15000Da，超滤膜的孔径更优选为2000～10000Da。

本发明中，减压浓缩的温度为50～80℃，减压浓缩的压力为0.085～0.098Mpa。

本发明中，将塔纳卡粉末进行微射流提取之前还包括：将干燥塔纳卡树根或树皮依次进出切片和粉碎，得到塔纳卡粉末，塔纳卡粉末的目数为20～100目，塔纳卡粉末的目数更优选为40～80目。

本发明中，微射流提取为采用微射流提取器进行提取。

请参阅图1至图3，图1为本发明中的一种微射流提取器的结构示意图，图2为本发明中的一种微射流提取单元中的引导环、内齿环、内外齿环和微射流环的局部主视图，图3为本发明中提供的一种微射流环的示意图。

本发明中，微射流提取器包括：微射流提取单元；

微射流提取单元包括：壳体18、内齿环711和微射流环713；

壳体18为具有中空结构的圆柱体；

内齿环711和微射流环713径向贴附于壳体18的内壁；

内齿环711无间隙地设置于微射流环713的工作前端；

微射流环713将壳体18隔成微射流提取腔室；

微射流环713开有微射流孔712。

本发明中，微射流提取单元还包括：内外齿环714、引导环16、螺旋推进叶片8、转轴13、密封环和第一冷却环17；

内外齿环714设置于内齿环711内并与内齿环711同轴，内外齿环714固定于微射流环713的工作前端；

引导环16径向贴附于壳体18的内壁并无间隙地位于内齿环711的工作前端；

引导环16的内径由引导环16的第一端到引导环16的第二端逐渐减小；

引导环16的第二端与内齿环711相接；

螺旋推进叶片8和转轴13设置于壳体18内，螺旋推进叶片8固定于转轴13的外壁；

转轴13位于微射流环713的中空部并通过密封环与微射流环713连接；

引导环16设置于螺旋推进叶片8的推进方向端；

第一冷却环17套于壳体18的外壁。

需要说明的是，内齿环711为可拆卸式径向贴附于壳体18的内壁，内外齿环714为可拆卸式固定于微射流环713的工作前端。

引导环16能够将螺旋推送叶片8传递的中药物料进行引流、避免死角；内齿环711、内外齿环714和微射流环713对中药物料也具有引流作用；第一冷却环17设置于壳体18的外壁并包括第一冷媒进口19和第一冷媒出口10，用于控制微射流提取过程中中药物料的温度。

本发明中，微射流提取器还包括：传动单元和驱动单元1；

传动单元包括联轴器4和第二冷却环21；

联轴器4的第一端与转轴13连接。

第二冷却环21套于联轴器4的外壁；

第二冷却环21上设置第二冷媒进口20和第二冷媒出口5，用于引入冷媒给转轴13降温；

驱动单元1的输出轴与联轴器4的第二端连接。

本发明中，微射流孔712的直径为0.1～1.0cm；

微射流孔712的孔壁设有不规则突起；

内齿环711的内齿为不规则齿；

内外齿环714的内齿和外齿为不规则齿。

微射流孔712的0.1～1.0cm直径适合于粉碎成最粗粉及以下粒径的中药材的提取加工，微射流孔712孔壁的不规则突起，对中药物、料有絮流、切割等作用。

微射流提取腔室的数量为两个或两个以上。

本发明中，壳体18具体为抗压金属材料制成的中空筒状容器，壳体18在塔纳卡进行提取后的流通方向端设置有清洗排污出口14。

塔纳卡提取时，在驱动单元1的带动下，通过螺旋推进叶片8，使塔纳卡物料形成了巨大的离心力，塔纳卡物料瞬间通过狭小的微射流孔712，进行了二次加速，形成高频的微射流，塔纳卡物料在纯物理状态下经高速射流撞击、挤压，强烈涡流混合和强力振动扩散的作用，导致塔纳卡物料组织细胞破碎，从而实现低温、快速、全成分提取，保持了塔纳卡的色、香、味，且效率极高。

本发明中，微射流提取腔室的数量为三个，包括一级微射流提取腔室7、二级微射流提取腔室9和三级微射流提取腔室12。

进一步的，还包括：减震片23；

驱动单元1设置于减震片23上，减震片23用于减少驱动单元1的震动和噪音。

本发明中，还包括：支架15和底座22，壳体18通过支架15安装于底座22上，驱动单元1垫有减震片23后设置于底座22上。

本发明中，驱动单元1包括旋转电机，在旋转电机上设置有吊拉环状物2以便于安装，并在旋转电机上设置有电源接口3。

本发明中，壳体18上设置有进料口6和出料口11，用于微射流提取器中塔纳卡物料的进出。

本发明还提供了上述技术方案的提取方法获得的塔纳卡提取物。塔纳卡提取物包含黄酮类化合物；

塔纳卡提取物的总黄酮含量为4～10mg/mL；

塔纳卡提取物的相对密度为1.020～1.080。

本发明中，该提取方法提取效率高，对塔纳卡的黄酮类化合物破坏少，该提取方法提取的塔纳卡提取物总黄酮含量高，有助于塔纳卡作用的发挥。并且，塔纳卡提取物具有明确的有效成分含量，有助于塔纳卡提取物产品的质量控制。

本发明提取方法提取的塔纳卡提取物含有丰富的黄酮类物质，具有广谱紫外线吸收效果。本发明塔纳卡的提取方法工艺简单，可高效率制得有效成分富集的塔纳卡提取物，非常适用于规模化生产。

本发明还提供了上述技术方案所述的提取方法获得的塔纳卡提取物在制备化妆品中的应用。其中，该化妆品具有防晒或晒后修复作用。以质量百分比计，塔纳卡提取物的添加量在化妆品中的含量为1～50％，化妆品的剂型包括霜剂、乳剂、凝胶剂、水剂、面膜等，有助于修复晒后损伤和美白晒黑皮肤化妆品的开发。

本发明提供了一种塔纳卡的提取方法，包括：将塔纳卡粉末进行微射流提取，得到提取物。该提取方法提取效率高，对塔纳卡的黄酮类化合物破坏少，该提取方法提取的塔纳卡提取物总黄酮含量高，有助于塔纳卡作用的发挥，相对密度为1.020～1.080时，塔纳卡提取物的总黄酮含量可达到为4～10mg/mL。并且，该提取方法易于操作，适用于产业化推广应用。实验结果证明，该提取方法提取的塔纳卡提取物安全性强，具备显著广谱紫外线吸收效果，可清除多种自由基。

实施例1

将5kg塔纳卡根打粉，过70目筛网，得平均目数为70目的塔纳卡粉末，向塔纳卡粉末中加入150kg的60％1，3-丁二醇溶液，搅拌均匀，置于微射流提取器中，在冷媒温度20℃、进料速度20L/min条件下进行提取，得到提取液。

将上述提取液泵入高速离心机进行固液分离，离心速度为17000rpm，收集分离液。然后将分离液泵入膜处理系统采用0.5μm微孔滤膜和7000Da超滤膜依次进行除杂、纯化，得到膜分离液。

将上述膜分离液进行真空减压浓缩，真空减压浓缩条件为水浴温度70℃，真空度为0.086Mpa～0.096Mpa，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.045(25℃)，即得塔纳卡提取物。

实施例2

将5kg塔纳卡根打粉，过80目筛网，得平均目数为80目的塔纳卡粉末，向塔纳卡粉末中加入200kg的20％1，3-丁二醇和20％1，2-丙二醇(w/w)混合溶液，搅拌均匀，置于微射流提取器中，在冷媒温度30℃、进料速度5L/min条件下进行提取，得到提取液。

将上述提取液泵入高速离心机进行固液分离，离心速度为18000rpm，收集分离液。然后将离心液泵入膜处理系统采用0.4μm微孔滤膜和8000Da超滤膜依次进行除杂、纯化，得到膜分离液。

将上述膜分离液进行真空减压浓缩，真空减压浓缩条件为水浴温度75℃，真空度为0.086Mpa～0.092Mpa，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.052(25℃)，即得塔纳卡提取物。

实施例3

将5kg塔纳卡根打粉，过40目筛网，得平均目数为40目的塔纳卡粉末，向塔纳卡粉末中加入165kg的30％1，3-丁二醇和40％1，2-丙二醇(w/w)混合溶液，搅拌均匀，置于微射流提取器中，在冷媒温度10℃、进料速度20L/min条件下进行提取，得到提取液。

将上述提取液泵入高速离心机进行固液分离，离心速度为18000rpm，收集分离液。然后将离心液泵入膜处理系统采用0.3μm微孔滤膜和9000Da超滤膜依次进行除杂、纯化，得到膜分离液。

将上述膜分离液进行真空减压浓缩，真空减压浓缩条件为水浴温度75℃，真空度为0.087Mpa～0.093Mpa，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.072(25℃)，即得塔纳卡提取物。

实施例4

将5kg塔纳卡根打粉，过50目筛网，得平均目数为50目的塔纳卡粉末，向塔纳卡粉末中加入25kg的40％1，3-丁二醇和20％1，2-丙二醇(w/w)混合溶液，搅拌均匀，置于微射流提取器中，在冷媒温度0℃、进料速度10L/min条件下进行提取，得到提取液。

将上述提取液泵入高速离心机进行固液分离，离心速度为14000rpm，收集分离液。然后将离心液泵入膜处理系统采用0.2μm微孔滤膜和10000Da超滤膜依次进行除杂、纯化，得到膜分离液。

将上述膜分离液进行真空减压浓缩，真空减压浓缩条件为水浴温度75℃，真空度为0.089Mpa～0.098Mpa，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.068(25℃)，即得塔纳卡提取物。

实施例5

将5kg塔纳卡根打粉，过40目筛网，得平均目数为40目的塔纳卡粉末，向塔纳卡粉末中加入100kg的60％1，2-丙二醇溶液，搅拌均匀，置于微射流提取器中，在冷媒温度15℃、进料速度20L/min条件下进行提取，得到提取液。

将上述提取液泵入高速离心机进行固液分离，离心速度为17000rpm，收集分离液。然后将离心液泵入膜处理系统采用0.4μm微孔滤膜和4000Da超滤膜依次进行除杂、纯化，得到膜分离液。

将上述膜分离液进行真空减压浓缩，真空减压浓缩条件为水浴温度75℃，真空度为0.085Mpa～0.095Mpa，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.079(25℃)，即得塔纳卡提取物。

对比例1

将5kg塔纳卡根打粉，过40目筛网，得平均目数为40目的塔纳卡粉末，向塔纳卡粉末中加入100kg的60％乙醇溶液，搅拌均匀，置于超声提取器中，在温度40℃、频率40KHz条件下提取30min，得到提取液。

将上述提取液泵入离心机进行固液分离，离心速度为4000rpm，收集分离液。然后将离心液进行真空减压浓缩，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.070(25℃)，即得塔纳卡提取物。

对比例2

将5kg塔纳卡根打粉，过40目筛网，得平均目数为40目的塔纳卡粉末；向塔纳卡粉末中加入100kg的纯水，搅拌均匀，置于加热釜中，煎煮提取2h，过滤，得到第一提取液后将药渣再加入相当于原药材重量10倍的纯水，同法煎煮提取1h，得到第二提取液。

将上述两份提取液降温处理，泵入离心机进行固液分离，离心速度为4000rpm，收集分离液。然后将离心液进行真空减压浓缩，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.070(25℃)，即得塔纳卡提取物。

实施例6

总黄酮含量检测

1)对照品溶液的配制

精密称取芦丁对照品5mg，置25mL棕色容量瓶中，用少量甲醇溶液溶解后稀释至刻度，得浓度为0.2mg/mL的芦丁对照溶液。

2)标准曲线的制备

精密量取芦丁对照品溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分别置于25mL容量瓶中，各加水至6.0mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min后加1％氢氧化钠试液10mL，最后加水至刻度，摇匀，放置15min。于510nm处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，对照品浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准方程。

3)样品测定

分别精密量取1.0mL实施例1至5和对比例1至2的塔纳卡提取物(如果试样中的黄酮浓度高则应适当稀释再取1.0mL用于显色测定)，置25mL容量瓶中，按照“标准曲线的制备”项下的方法，自“加水至6.0mL”起，依法测定吸光度值，从标准曲线上读出供试品溶液中总黄酮的浓度(mg/mL)，通过计算公式计算即得样品中总黄酮含量，结果如表1所示。从表1可知，本发明塔纳卡提取物的总黄酮含量相对于对比例1和对比例2高出200％～600％。

计算公式：

X＝C×V2/V1

X为样品中总黄酮含量，单位为mg/mL；

C为从标准曲线上查得供试品溶液中总黄酮的浓度，单位为mg/mL；

V1为样品测定体积，单位为mL；

V2为样品定容体积，单位为mL。

表1不同实施例塔纳卡提取物中总黄酮含量

实施例7

本实施例提供了一种添加塔纳卡提取物的防晒霜，以重量百分比计，原料如表2所示。

表2一种添加塔纳卡提取物的防晒霜配方

上述添加塔纳卡提取物的防晒霜制备方法步骤如下：

1)将B相原料依次加入油相锅，打开加热搅拌直到完全溶解均匀，80～85℃保温；预先将B1相用胶体碾磨机混合至完全均匀；

2)将A相原料依次加入水相锅，开始加热搅拌，溶解完全后加入A1，搅拌均匀，加热到80～85℃保温，直到完全溶解均匀，继续搅拌保温；

3)抽B相到均质乳化锅，搅拌5min，均质条件下，加入B1，继续升温至80℃，继续搅拌20min；

4)抽真空至均质乳化锅内负压状态，均质8min；加入C，均质1min后，开始降温；降温至45℃，加入D相，至少搅拌30min；降温至35℃以下，经初步检验合格后出料。

实施例8

塔纳卡提取物的UVB吸收能力测试实验

将实施例1至5和对比例1至2的塔纳卡提取物的任意一种添加到基础防晒霜基质中，以体外仪器法检测SPF值。观察塔纳卡提取物对防晒产品的影响。

1)测试样品

参照实施例7防晒霜配方制备防晒霜，具体防晒霜配方如表3所示。

表3不同防晒霜配方

2)测试仪器：防晒系数SPF测量系统SPF-290S；

3)测试载体：3M-Transpore透明膜；

4)测试环境：温度：22±2℃；相对湿度(RH)：50±5％。

随机选择不同实施例和对比例所得塔纳卡提取物，以10％浓度添加到防晒霜基质中，得到共5个试样，体外防晒SPF值测试结果如表4所示。对比5个试样与空白防晒霜的体外SPF值，可确定本发明塔纳卡提取物可有效提高防晒霜的SPF值，且当添加浓度为10％时，SPF值的增加值可达9～13。而同样添加条件下，对比例塔纳卡提取物对防晒霜SPF值的提高效果较弱，SPF值的增加值只有2～3。

表4不同防晒霜的体外SPF值结果

产品编号	SPF测试值
		F0	13.4
F1	22.6
		F2	24.6
F3	23.3
		F4	15.6
F5	16.2

实施例9

塔纳卡提取物安全性和防晒效果实验

以斑马鱼为实验模型，以添加了本发明实施例3塔纳卡提取物的水为养殖水，观察对斑马鱼胚胎的影响。并通过与空白组和阳性样品组比较，观察本发明塔纳卡提取物对受紫外线照射后皮肤和细胞的影响。

1)实验仪器与试剂

Z-A-S5斑马鱼养殖单元(上海海圣生物实验设备有限公司)；SZ780连续变倍体式显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)；万分之一电子天平(Sartorius)；6孔细胞培养板(Costar)；培养皿(直径＝95mm)；15mL离心管(HOUDIOR)；烧杯(BOMEX)；移液枪(Sartorius)；ZF-7型紫外灯分析灯(上海骥辉科学分析器有限公司)；奥克立林(adamas-beta)。

2)实验方法

a.配制实验溶液

用养殖水将实施例3塔纳卡提取物配成400mg/L、800mg/mL 2个浓度梯度，各10mL，以养殖水为空白对照(-UV)，养殖水为模型对照(+UV)，奥克立林为阳性对照。

b.实验用鱼及其受精卵的采集

将性成熟斑马鱼(AB系，国家斑马鱼资源中心引入，本实验室扩繁)雌雄分缸，饲养于斑马鱼养殖单元。斑马鱼养殖水(pH 6.7；电导率520μs/cm)，水温保持在(26±2)℃，光照/黑暗周期控制在14h∶10h。暴露实验开始前一天将雌雄以1∶2配对，自然交配产卵。

c.塔纳卡提取物对斑马鱼发育毒性实验

i)每个实验浓度均设3个平行组。于受精卵收集后2～3hpf进行药物暴露实验。选用6孔培养板作为胚胎实验容器，每孔注入相应浓度的实验液5mL，每孔放入受精卵20枚。

ii)受精后2～3hpf进行暴露实验，至暴露0hpf、24hpf、48hpf、72hpf时，倒置显微镜下观察斑马鱼胚胎的发育变化，斑马鱼胚胎发育至48hpf以后基本会出现畸形特征，包括发育停滞、无鱼鳔、心包囊肿、脊柱弯曲、卵黄囊水肿、尾巴和尾鳍自我分解等畸形状况，并统计24hpf、48hpf和72hpf时各实验组斑马鱼胚胎的累计孵化率、畸形率及死亡率。

iii)实验数据处理

暴露结束后，记录斑马鱼胚胎孵化数、畸形数和死亡数，计算斑马鱼胚胎孵化率、畸形率和死亡率。斑马鱼胚胎死亡的判断为肉眼观察早期胚胎不透明，卵凝结；后期幼鱼无心脏跳动，发育停止。

孵化率(％)＝孵化胚胎/胚胎总数×100％

畸形率(％)＝畸形胚胎/存活胚胎总数×100％

死亡率(％)＝死亡胚胎/胚胎总数×100％

实验数据均用平均值±标准差表示。

d.塔纳卡提取物的防晒功效评价实验

i)挑选正常发育72hpf的幼鱼于6孔板中，1条/孔，每孔加入3mL样品溶液，设置3个复孔，再用紫外灯照射，距离为5cm，在2.5h内，每0.5h照射30s，照射完后吸尽样品液，换成养殖水。然后于紫外照射后第1天、2天动态观察斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍的损伤情况。

ii)实验数据处理与评价方法

以正常未照射紫外线的斑马鱼为对照，在体视显微镜观察斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍的损伤程度，腹鳍、尾鳍和背鳍的完整性≥90％为正常，20％～90％为减少，<20％为缺失。

3)实验结果

a.塔纳卡提取物对斑马鱼胚胎发育毒性的影响

实施例3塔纳卡提取物对斑马鱼胚胎死亡率、孵化率和畸形率的影响如表5、表6和表7所示。实施例3塔纳卡提取物对斑马鱼胚胎发育的LD50在48hpf和72hpf时分别为2.37g/L(95％置信区间为1.93，2.92)和1.58g/L(95％置信区间为1.24,1.94g/L)。结果表明本发明塔纳卡提取物在浓度<800mg/L条件下，与空白对照组比较，塔纳卡提取物对斑马鱼胚胎发育无明显影响。

b.塔纳卡提取物对斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍的影响

实施例3塔纳卡提取物对斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍的影响如图4至图7所示，图4为本发明塔纳卡提取物对紫外照射斑马鱼鱼鳍损伤的影响(0h)，图5为本发明塔纳卡提取物对紫外照射斑马鱼鱼鳍损伤的影响(24h)，图6为本发明塔纳卡提取物对紫外照射斑马鱼鱼鳍损伤的影响(48h)，图7为本发明塔纳卡提取物对紫外照射斑马鱼鱼鳍损伤的影响与时间的关系图。实验结果表明实施例3塔纳卡提取物对紫外线辐射照射引起的斑马鱼鱼鳍损伤的防护作用与同等条件下的奥克立林相似。紫外线辐射前，空白对照组(-UV)、模型对照组(+UV)、阳性对照组(奥克利林+UV)和塔纳卡提取物处理组(+UV)的斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍均保持完整、均匀。当紫外线辐射后1天后，空白对照组(-UV)斑马鱼的腹鳍、尾鳍和背鳍保持完整；而模型对照组(+UV)斑马鱼的腹鳍、尾鳍和背鳍均不完整，出现明显损伤；阳性对照组(奥克利林+UV)在400mg/L浓度时，斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍出现明显的损伤，与模型对照组(+UV)相似，而阳性对照组(奥克利林+UV)在800mg/L浓度时，斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍的也出现损伤，但损伤程度比模型对照组(+UV)小；塔纳卡提取物处理组(+UV)在400mg/L浓度时，斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍也出现明显的损伤，与模型对照组(+UV)相似，而塔纳卡提取物处理组(+UV)在800mg/L浓度时，斑马鱼腹鳍、尾鳍和背鳍的也出现损伤，与阳性对照组(奥克利林+UV)在800mg/L浓度时相似，且优于模型对照组(+UV)。

表5塔纳卡提取物对斑马鱼胚胎死亡率(％)的影响

800mg/L

1600mg/L

2400mg/L

3200mg/L

4000mg/L

空白组

48hpf

5.0±0.0

20.0±10.0

65.0±17.3

61.7±23.1

78.3±20.8

6.7±7.6

72hpf

13.3±10.4

61.7±7.6

73.3±10.4

78.3±12.6

86.7±15.3

6.7±7.6

表6塔纳卡提取物对斑马鱼胚胎孵化率(％)的影响

800mg/L

1600mg/L

2400mg/L

3200mg/L

4000mg/L

空白组

48hpf

0.0±0.0

72hpf

66.7±10.4

0.0±0.0

90.0±13.2

表7塔纳卡提取物对斑马鱼胚胎畸形率(％)的影响

800mg/L

1600mg/L

2400mg/L

3200mg/L

4000mg/L

空白组

48hpf

21.7±7.6

95.0±5.0

100.0±0.0

6.7±7.6

72hpf

36.7±16.1

100.0±0.0

28.3±36.2

实施例10

抗氧化测试之一：DPPH自由基清除实验

1)测定原理

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517nm下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而评价试验样品的抗氧化能力。抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。

2)DPPH试剂的配制

精密称取DPPH粉末(分子量约394)0.0600g，置于250mL容量瓶，用适量95％乙醇溶解定容至250mL，得浓度为0.06mmol/L的DPPH试剂。需要说明的是，如测试中样品出现不溶物析出情况，可适当降低乙醇酒精度。

3)供试品的制备

取实施例1至5和对比例1至2所得塔纳卡提取物加95％乙醇溶液定容，配制成0.01g/mL试液。并同样方法配制1mg/mL维生素E对照液。

4)抗氧化能力测定

a.在10ml试管中依次加入4.0ml DPPH溶液和1.0ml 95％乙醇，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以95％乙醇为参比，在517nm处测吸光值，记为A0。

b.在10ml试管中依次加入4.0ml DPPH溶液和1.0ml待测试样溶液，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以95％乙醇为参比，在517nm处测吸光值，记为Ar。

c.在10ml试管中依次加入4.0ml 95％乙醇溶液和1.0ml待测试样溶液，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以95％乙醇为参比，在517nm处测吸光值，记为As。

d.计算公式：样品对DPPH自由基的清除率：

5)测试结果

测试结果如表8中所示，本发明塔纳卡提取物添加量为0.01g/mL时，具有与1mg/mL维生素E相当的抗自由基效果，呈现出较强的抗氧化能力，实际应用时可有效清除对皮肤有负面影响的自由基，减轻紫外线照射引起的皮肤损伤、衰老。而同等测试浓度下，对比例塔纳卡提取物的DPPH自由基清除率仅达到本发明塔纳卡提取物的1/3。

表8DPPH自由基抑制效果

测试品	DPPH自由基清除率
		维生素E(1mg/mL)	96.7％
实施例1塔纳卡提取物(0.01g/mL)	86.3％
		实施例2塔纳卡提取物(0.01g/mL)	87.6％
实施例3塔纳卡提取物(0.01g/mL)	92.7％
		实施例4塔纳卡提取物(0.01g/mL)	90.1％
实施例5塔纳卡提取物(0.01g/mL)	86.8％
		对比例1塔纳卡提取物(0.01g/mL)	32.4％
对比例2塔纳卡提取物(0.01g/mL)	28.5％

抗氧化测试之二：ABTS自由基清除能力测定

1)测定原理

以ABTS(2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)水溶性的自由基引发剂为显色剂，ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·再向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS+·发生反应而使反应体系褪色，6min后在734nm下检测吸光值(A734)的变化。

2)试剂配制

a.PBS溶液(pH＝7.2)：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml，加新沸过的冷水稀释至200mL，摇匀，即得。

b.2.45mM过硫酸钾：称取0.0662g过硫酸钾溶于水并定容至100mL。

c.7mM ABTS+·储备液：称取0.0384g ABTS，用2.45mmol/L过硫酸钾溶解，定容至10mL，溶液呈墨绿色，在室温、避光条件下静置12～16h，该储备液可稳定保存3～4d。。

d.ABTS+·测定液：将ABTS+·储备液以PBS稀释，使其吸光度在734nm波长处达到0.700±0.020。

3)测定方法

a.取4mL的ABTS+·工作液与1mL样品混合10s后25℃避光静置6min，在734nm处测定吸光值。以4mLPBS+1mL样品作为参比，记A样品。

b.取4ml的ABTS+·工作液与1mLPBS混合10s后25℃避光静置6min，在734nm处测定吸光值。以PBS作为参比，记A0。

抑制率(％)＝((A0-A样品))/A0×100％

4)测试结果

测试结果如表9所示，本发明塔纳卡提取物添加量为0.01g/mL时，具有与5mg/mL维生素C相当的体外总抗自由基效果，呈现很强的抗氧化性，实际应用中可有效降低对皮肤有负面影响的自由基活性，减轻晒后的皮肤损伤。而同等测试浓度下，对比例塔纳卡提取物对ABTS+·自由基清除率仅达到本发明塔纳卡提取物的1/3～1/2。

表9 ABTS+体外总抗自由基效果

抗氧化测试之三：酪氨酸酶抑制测试

1)测定原理

酪氨酸酶是黑色素生成过程中的主要限速酶，其活性与黑色素的合成量成正相关。皮肤颜色的深浅主要取决于皮肤黑素细胞的量和合成黑色素的能力。酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶，催化L-酪氨酸羟基化转变成L-多巴，同时氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌再经过一系列反应，最后形成黑色素。酪氨酸酶是一种含铜的金属氧化还原酶，能催化空气中的氧对酪氨酸的氧化反应。催化过程可以通过酪氨酸转换反应过程的颜色变化来监测，在490nm处测定吸光度，根据公式，计算酪氨酸酶抑制率。

2)试剂配制

a.PBS(pH＝6.8)的制备

精密称取6.80g磷酸二氢钾，溶于250mL的纯水，得0.2mlo/L磷酸二氢钾溶液；精密称取0.94g氢氧化钠，溶于118mL的纯水。取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250mL，取0.2mol/L氢氧化钠溶液118mL，用水稀释至1000mL，即得PBS(pH＝6.8)。

b.L-酪氨酸溶液的配制

用PBS配制成1.5mM的L-酪氨酸溶液：用少许0.1M HCl溶解L-酪氨酸，然后再用PBS(pH＝6.8)稀释到pH＝7，即得。

c.酪氨酸酶溶液的配制

用PBS配制成200U/mL的酪氨酸酶溶液：酪氨酸酶用PBS(pH＝6.8)溶解分装于PE管，置于－20℃装箱中保存，用时取出放于4℃冰箱解冻。

d.标准品溶液的配制

精确称取0.1g熊果苷粉末，溶于20mL的纯水中，得到5mg/mL的母液，再对半稀释到2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL。

3)酪氨酸酶活性检测方法

精密量取样品溶液0mL、PBS 2.0mL、酪氨酸酶溶液1.0mL混匀，记为A；精密量取样品溶液0mL、PBS 3.0mL、酪氨酸酶溶液0mL混匀，记为B；精密量取样品溶液1.0mL、PBS1.0mL、酪氨酸酶溶液1.0mL混匀，记为C；精密量取样品溶液1.0mL、PBS 2.0mL、酪氨酸酶溶液0mL混匀，记为D；混匀后在37℃水浴中恒温10min，然后各加入1.0mL的酪氨酸溶液，反应15min后于490nm处测定吸光度。以B作为参比读取A，以D作为参比读取C。

计算公式：

A为未加样品的加酶混合液所测的吸光度；B为未加样品亦未加酶的混合液所测的吸光度；C为加样品和酶的混合液所测的吸光度；D为加样品而未加酶的混合液所测的吸光度。

4)测试结果

测试结果如表10所示，本发明实施例塔纳卡提取物添加量为0.01g/mL时，具有与5mg/mL熊果苷相当的酪氨酸酶抑制效果，呈现出很好的美白功效。实际应用时有助于晒黑皮肤的快速修复。而同等测试浓度下，对比例塔纳卡提取物的酪氨酸酶抑制率仅达到本发明塔纳卡提取物的1/6～1/4。

表10酪氨酸酶体外抑制试验效果

测试品	酪氨酸酶抑制率
		熊果苷(5mg/mL)	89.4％
实施例1塔纳卡提取物(0.01g/mL)	85.2％
		实施例2塔纳卡提取物(0.01g/mL)	86.5％
实施例3塔纳卡提取物(0.01g/mL)	94.5％
		实施例4塔纳卡提取物(0.01g/mL)	91.2％
实施例5塔纳卡提取物(0.01g/mL)	86.1％
		对比例1塔纳卡提取物(0.01g/mL)	21.3％
对比例2塔纳卡提取物(0.01g/mL)	12.6％

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种塔纳卡提取物的提取方法，其特征在于，包括：将塔纳卡粉末进行微射流提取，得到提取物。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述微射流提取的提取溶剂为水和/或低级醇；

所述提取溶剂与所述塔纳卡粉末的质量比为5～40：1。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述微射流提取的冷媒温度为0～30℃；

所述微射流提取的进料速度为5～30L/min。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，将塔纳卡粉末进行微射流提取之后，得到提取物之前还包括：

将微射流提取得到的提取液进行后处理。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述后处理具体为固液分离、除杂、纯化和浓缩。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述固液分离具体为采用高速离心进行固液分离；

所述除杂具体为采用微孔滤膜除去杂质；

所述纯化具体为采用超滤膜进行纯化；

所述浓缩具体为减压浓缩至25℃时相对密度为1.020～1.080。

7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述高速离心的离心速度为10000～20000rpm，所述高速离心的离心时间为10～80min；

所述微孔滤膜的孔径为0.1～1μm；

所述超滤膜的孔径为1000～15000Da。

8.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述减压浓缩的温度为50～80℃，所述减压浓缩的压力为0.085～0.098Mpa。

9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述微射流提取为采用微射流提取器进行提取；

所述微射流提取器包括：微射流提取单元；

所述微射流提取单元包括：壳体、内齿环和微射流环；

所述壳体为具有中空结构的圆柱体；

所述内齿环和所述微射流环径向贴附于所述壳体的内壁；

所述内齿环无间隙地设置于所述微射流环的工作前端；

所述微射流环将所述壳体隔成微射流提取腔室；

所述微射流环开有微射流孔。

10.根据权利要求1至9任意一项所述的提取方法获得的塔纳卡提取物。