CN107582606A - 豆芋花乙醇提取物的制备方法及其抗氧化用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种豆芋花乙醇提取物的制备方法，包括以下步骤：1)、将豆芋花和含0.1mol/L盐酸的乙醇混合后打浆、超声浸提，提取液离心，得上清液；2)、将上清液旋转蒸发浓缩直至为原体积的10～20％；3)、所得的浓缩液采用大孔树脂进行分离纯化，以体积浓度1％甲酸水溶液作为淋洗剂，以含有0.1％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂，收集洗脱液；4)、将洗脱液旋转蒸发浓缩成至为原体积的10～20％，得浆状浓缩液；5)、将浆状浓缩液先预冻，然后用真空冷冻干燥机将其干燥成粉末状，得到豆芋花乙醇提取物。本发明还同时提供了上述豆芋花乙醇提取物在制备肝细胞氧化损伤抑制剂中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种豆芋花乙醇提取物的制备方法及其抗氧化应用。
背景技术
豆芋(Apios americana Medikus)原产于北美洲东部的加拿大至美国佛罗里达州的南部地区，属多年生豆科植物(蝶形花科亚科)。其可食用部分为地下块茎，且其蛋白质含量高于其他植物块茎，是一种既营养又有经济价值的作物，因而常被印第安人作为主食。豆芋自2009年国内引种成功，并被逐渐在富阳、金华、龙游、温州等地推广种植。研究表明豆芋不同部位(花、藤、叶、块茎)均含有丰富的游离氨基酸、可溶性蛋白、多糖、皂苷、黄酮、异黄酮、维生素C、维生素E和矿物质等成分。其中，豆芋花的维生素C含量最高，同时还含有较高含量的维生素E、总皂苷和异黄酮，具有极大的开发潜力。
美国豆芋对高血压、糖尿病和高血脂症等现代生活习惯病具有明显的改善效果。
自由基是由物质在受到外界条件刺激后所产生的原子或基团，并带有非常活跃的未成对电子，容易和其他原子或基团结合，形成稳定的结构。人体在新陈代谢的过程中可以产生自由基，主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧自由基、过氧化氮和一氧化氮等，造成一系列的生物反应。当人体处于正常的生理条件下，体内的自由基清除体系(也称抗氧化体系)能够清除过多的自由基，使细胞和组织免受自由基的伤害性攻击；但在病理条件下，人体内源性自由基的产生系统和清除系统失去平衡，致使自由基过剩。过剩的自由基会诱导氧化应激现象，氧化应激能引起生物大分子(如脂类、蛋白质和DNA)的氧化损伤，引起一系列的生物学反应，导致炎症、癌症、心血管病、老年痴呆症(Alzheimer)和衰老等慢性退行性疾病的发生。
抗氧化剂具有清除活性氧和氧自由基的能力，是一类能够阻止或延缓自动氧化的物质，在维持机体的正常生命活动方面起着非常重要的作用。抗氧化剂能够清除体内过剩的自由基，使体内自由基的产生系统和清除系统保持动态平衡。流行病学表明，抗氧化剂在预防慢性疾病方面发挥着至关重要的作用。自由基能够诱导氧化应激反应，补充足够的抗氧化剂能有效阻止或延缓这一反应，可有效地保护人体细胞免受氧化应激所引起的损伤，从而降低糖尿病、心血管疾病和癌症等慢性疾病的患病率。越来越多的研究表明，谷物、水果和蔬菜中的抗氧化剂能够预防或减少这种潜在的氧化损伤。摄食谷物、水果和蔬菜与降低患癌症等疾病的风险具有高度的相关性。因此，目前很多营养与保健食品的研究人员都非常关注有关抗氧化和慢性疾病发生及预防的研究与话题，但对于豆芋花提取物的抗氧化活性报道较少。
《美国豆芋不同部位生化特征成分分析》一文告知了：
测量游离氨基酸、可溶性蛋白和总糖时：粉碎后过0.42mm筛，采用3:500(m/v)加入100℃的蒸馏水，于100℃进行恒温水浴提取。
测量总皂苷、总黄酮和异黄酮含量时：采用1:100(m/v)加入无水乙醇，于60℃恒温水浴3h。
测量VC时：取样品1g，用40ml 0.01mol/L的HCL浸泡于60℃超声40min。
测量VE时，取样品3g，用加入20ml无水乙醇，50℃恒温震荡50min。
CN201210574017.9的发明《大越豆芋花总皂苷、多糖同时制备的方法及其用途》告知了以下内容：制备方法按以下步骤：1)采摘大越豆芋花，清洗，干燥，粉碎，过40目筛，得到大越豆芋花粉末；2)大越豆芋花粉末，按照料液比1:10～1:20，加入浓度为70％～90％乙醇，在50～80℃回流提取1～3次，每次时间1～3小时，过滤，得上清液和滤渣；3)上清液，挥干后用水溶解，石油醚脱脂，正丁醇萃取，取正丁醇部分经大孔吸附树脂吸附洗脱后，浓缩，干燥得到豆芋花皂苷粉；4)滤渣，挥干溶媒，用其重量10～20倍的蒸馏水，于70～90℃回流提取1～3次，每次时间2～3小时，过滤，收集合并滤过液；5)滤过液脱色、脱蛋白，浓缩，加入乙醇，静置过夜进行醇沉，收集沉淀，透析后，用DEAE～纤维素柱层析，分别用蒸馏水、0.1M，0.3M，0.5M～NaCl溶液洗脱液，收集0.3M～0.5M～NaCl洗脱液，透析，浓缩，干燥，得豆芋花多糖。本发明从大越豆芋花中同时制备得到的总皂苷和多糖，纯度高，活性强，可以在制备具有抗氧化、血糖调节作用的药物或功能食品中得到广泛应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种豆芋花乙醇提取物的制备方法及其抗氧化用途，为医学、食品科学等领域开发天然抗氧化剂提供新资源。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种豆芋花乙醇提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)、按照1g:8～12ml(较佳为1g:10ml)的料液比将豆芋花和含0.1mol/L盐酸的乙醇混合后打浆，所得浆液于45±5℃超声浸提90±10min后，提取液离心(3000g离心30min)，得上清液；
2)、将上清液在旋转蒸发仪进行旋转蒸发浓缩直至为原体积的10～20％；
3)、将步骤2)所得的浓缩液采用大孔树脂进行分离纯化；以体积浓度1％甲酸水溶液作为淋洗剂，以含有0.1％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂，收集洗脱液；
所述含有0.1％甲酸的甲醇水溶液的制备方法为：在100ml体积浓度80％甲醇水溶液中加入0.1ml的甲酸；
4)、将步骤3)所得的洗脱液旋转蒸发浓缩成至为原体积的10～20％，得浆状浓缩液；
5)、将步骤4)所得的浆状浓缩液先于-70～-90℃预冻5～7h，然后用真空冷冻干燥机将其干燥成粉末状，得到豆芋花乙醇提取物。
作为本发明的豆芋花乙醇提取物的制备方法的改进：
所述步骤3)为：
首先用两倍柱体积的甲醇活化大孔树脂，三倍柱体积的双蒸水进行平衡；然后以0.4～0.6mL/min(较佳为0.5mL/min)的流速上样(上样量为100～200ml，即约为柱体积的10～20％)，待提取液被充分吸附后，用体积浓度1％甲酸水溶液作为淋洗剂进行淋洗(淋洗的目的是为了除去蛋白质、糖、酸等物质)，所述淋洗剂的用量为两倍柱体积，流速为0.4～0.6mL/min(较佳为0.5mL/min)；最后用含有0.1％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂进行充分洗脱，所述洗脱剂的用量三倍柱体积，流速为0.4～0.6mL/min(较佳为0.5mL/min)；收集洗脱液。
作为本发明的豆芋花乙醇提取物的制备方法的进一步改进：
所述步骤3)中的大孔树脂为大孔树脂X-5(天津兴南允能高分子技术有限公司)。
作为本发明的豆芋花乙醇提取物的制备方法的进一步改进：
将步骤1)离心所得的滤渣替代步骤1)中的豆芋花重复进行步骤1)的打浆、超声浸提和离心；重复次数为2～3；
将所有离心所得的上清液合并后进行步骤2)。
在本发明中：
步骤2)和步骤4)的旋转蒸发均在38±2℃，-0.09MPa的真空度下进行。
步骤5)的真空冷冻干燥为在-40±2℃，1.2Pa的真空度下进行，直至所得的豆芋花乙醇提取物含水率≤0.1％。
本发明还同时提供了利用上述任一方法制备所得的豆芋花乙醇提取物在制备肝细胞氧化损伤抑制剂中的应用。
本发明采用HepG2细胞(人肝细胞)进行实验，通过噻唑蓝(MTT)法测定豆芋花乙醇提取物处理对HepG2细胞增殖活性的影响，并采用豆芋花乙醇提取物提前保护24h后，加入过氧化氢(H2O2)诱导4h构建细胞氧化应激模型，探讨豆芋花乙醇提取物对细胞氧化损伤的保护作用。即，本发明提供了豆芋花乙醇提取物在制备由过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞氧化损伤抑制剂中的应用。
本发明的豆芋花乙醇提取物，可开发为天然的抗氧化药品和食品，代替人工合成的抗氧化剂治疗因人体内自由基过多而产生的疾病。
采用本发明方法制备而得的豆芋花乙醇提取物能够有效保护由过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞氧化损伤，减少活性氧的产生，具有良好的开发前景。.本发明为豆芋花乙醇提取物提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领域。
本发明的豆芋花乙醇提取物的用法为口服，用量以片剂为例，每次约150～250mg，每日三次。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为不同浓度豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞增殖活力的影响对比图；
图2为不同浓度豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞形态的影响对比图(200μm)；
A.对照组；B.H2O2模型组；C.H2O2+低浓度豆芋花乙醇提取物组(L)；D.H2O2+中浓度豆芋花乙醇提取物组(M)；E.H2O2+高浓度豆芋花乙醇提取物组(H)；
图3为不同浓度豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞细胞核损伤的影响对比图(100μm)；
A.对照组；B.H2O2模型组；C.H2O2+低浓度豆芋花乙醇提取物组(L)；D.H2O2+中浓度豆芋花乙醇提取物组(M)；E.H2O2+高浓度豆芋花乙醇提取物组(H)；F.对A、B、C、D、E分别进行定量后的结果；
图4为不同浓度豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞活性氧自由基(DHE荧光)的影响对比图(100μm)；
A.对照组；B.H2O2模型组；C.H2O2+低浓度豆芋花乙醇提取物组(L)；D.H2O2+中浓度豆芋花乙醇提取物组(M)；E.H2O2+高浓度豆芋花乙醇提取物组(H)；F.对A、B、C、D、E分别进行定量后的结果；
图5为不同浓度豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞活性氧自由基(DCF荧光)的影响对比图(100μm)；
A.对照组；B.H2O2模型组；C.H2O2+低浓度豆芋花乙醇提取物组(L)；D.H2O2+中浓度豆芋花乙醇提取物组(M)；E.H2O2+高浓度豆芋花乙醇提取物组(H)；F.对A、B、C、D、E分别进行定量后的结果；
图6为不同浓度豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞线粒体膜电位的影响对比图(100μm)；
A.对照组；B.H2O2模型组；C.H2O2+低浓度豆芋花乙醇提取物组(L)；D.H2O2+中浓度豆芋花乙醇提取物组(M)；E.H2O2+高浓度豆芋花乙醇提取物组(H)；F.对A、B、C、D、E分别进行定量后的结果；
图7为不同浓度豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞线粒体膜脂质过氧化的影响对比图(100μm)；
A.对照组；B.H2O2模型组；C.H2O2+低浓度豆芋花乙醇提取物组(L)；D.H2O2+中浓度豆芋花乙醇提取物组(M)；E.H2O2+高浓度豆芋花乙醇提取物组(H)；F.对A、B、C、D、E分别进行定量后的结果；
图8为不同浓度豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞谷胱甘肽消耗的影响对比图(100μm)；
A.对照组；B.H2O2模型组；C.H2O2+低浓度豆芋花乙醇提取物组(L)；D.H2O2+中浓度豆芋花乙醇提取物组(M)；E.H2O2+高浓度豆芋花乙醇提取物组(H)；F.对A、B、C、D、E分别进行定量后的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、一种豆芋花乙醇提取物的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、以1g:10ml的比例将豆芋花和含0.1mol/L盐酸的乙醇混合，利用榨汁机进行打浆；所得浆液在45℃条件下，超声(40,000Hz的超声波频率)浸提90min后，提取液3000g离心30min，
离心所得的滤渣替代上述步骤中的豆芋花重复进行上述步骤的打浆、超声浸提和离心；重复次数为2次；
将上述3次离心所得的上清液合并后进行下述步骤2)。
2)、将所得的上清液在旋转蒸发仪(旋转蒸发设定的工艺参数为温度38℃，真空度-0.09MPa)进行旋转蒸发浓缩直至为原体积的15％；
3)、将旋蒸所得浓缩液采用大孔树脂进行分离纯化，所采用的大孔树脂为大孔树脂X-5(天津兴南允能高分子技术有限公司)，依次进行以下步骤：
首先用两倍柱体积的甲醇活化大孔树脂，三倍柱体积双蒸水进行平衡；
然后以0.5mL/min的流速上样，上样量为200ml(为柱体积的10％)；提取液充分吸附后，1％甲酸(即，体积浓度1％甲酸水溶液)淋洗除去蛋白质、糖、酸等物质，该淋洗剂的用量为两倍柱体积，流速为0.5mL/min；最后用含有0.1％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂充分洗脱，该洗脱剂的用量三倍柱体积，流速为0.5mL/min；收集洗脱液。
所述含有0.1％甲酸的甲醇水溶液的制备方法为：在100ml体积浓度80％甲醇水溶液中加入0.1ml的甲酸；
4)、将大孔树脂分离纯化所得洗脱液旋转蒸发(旋转蒸发设定的工艺参数为温度38℃，真空度-0.09MPa)进行旋转蒸发浓缩直至为原体积的15％，得浆状浓缩液；
5)、将浓缩液在-80℃预冻6h，然后用真空冷冻干燥机48h(真空冷冻干燥机设定的工艺参数为-40℃，1.2Pa)将其干燥成粉末状(含水率≤0.1％)，得到豆芋花乙醇提取物。
实验一、豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞增殖活力的影响
将培养的HepG2细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h后分组，即空白对照组、H2O2组、10、20、40、80、160、320、640、1280ug/mL豆芋花乙醇提取物组，每组重复8孔，置于37℃、5％CO2培养箱中共同孵育24h后，吸出孔中残余液体，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液漂洗两次后空白对照组加入正常培养液，H2O2组、10、20、40、80、160、320、640、1280ug/mL加入H2O2终浓度为150uM的培养液继续培养2h。然后吸出各孔中残余液体，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液漂洗两次后加入100ul的MTT(0.5mg/mL溶于不含血清培养基)，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养4小时。随后，去除每孔液体，每孔加入150ul二甲基亚砜(DMSO)，在水平摇床上震荡10分钟，酶标仪于570nm处测定其吸光值。
细胞增殖活性(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值*100％。
根据图1所示，MTT实验结果显示，在H2O2诱导损伤的基础上添加不同浓度的豆芋花乙醇提取物进行预培养，发现细胞存活率都优于氧化损伤模型，其中20、40、80、160ug/mL四个浓度下细胞存活率显著优于损伤模型且同未受损伤的对照组细胞存活率无显著性差异，证明豆芋花乙醇提取物在0-320ug/mL浓度范围内对HepG2细胞均无毒性，且有利于细胞损伤修复。
实验二、豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞形态的影响
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别用浓度为50、100、200ug/mL(分别对应低浓度、中浓度、高浓度)的豆芋花乙醇提取物处理24h，再用H2O2(过氧化氢终浓度150μM)处理细胞2h诱导氧化应激细胞模型，随后用显微镜观察细胞形态并拍照。
根据图2可知，同对照组相比，模型组在视野范围内的细胞数量有所减少，细胞质脱水浓缩，细胞核体积增大，细胞体积减小，表现出细胞凋亡的特征，表明H2O2模型的成功构建诱导细胞发生氧化损伤，进而引起细胞凋亡。加入不同浓度的豆芋花乙醇提取物质进行预培养的细胞在氧化应激条件下则表现出较为正常的细胞形态，且随着浓度的不断提升，高浓度培养组的细胞形态同对照组基本相似，证明豆芋花乙醇提取物对细胞氧化损伤具有修复和保护作用。
实验三、豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞细胞核损伤的影响
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别用浓度为50、100、200ug/mL的豆芋花乙醇提取物处理24h，再用H2O2(过氧化氢终浓度150μM)处理细胞2h诱导氧化应激细胞模型，分别加入终浓度为10μM的Hoechst 33258染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，并计算平均光密度值。
根据图3可知，同对照组相比，模型组的细胞核亮度显著增加，形成致密明亮的蓝色荧光，蓝色团块碎裂，染色质皱缩发生高亮。在图3B中表现的尤为明显，表明细胞凋亡的发生。而经过豆芋花提取物预处理的组，细胞核荧光强度相较于模型组均出现了不同程度地减少，细胞核形状规则，核膜完整，蓝色荧光均匀弥散，皱缩减缓的趋势同图2的细胞形态一致，表明豆芋花乙醇提取物对H2O2诱导的细胞核氧化损伤具有保护作用。每个处理组定量结果见图3中的F。
实验四、豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞活性氧自由基(DHE荧光)的影响
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别用浓度为50、100、200ug/mL的豆芋花乙醇提取物处理24h，再用H2O2(过氧化氢终浓度150μM)处理细胞2h诱导氧化应激细胞模型，分别加入10μM的DHE染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，并计算平均光密度值。
根据图4可知，同对照组相比，模型组的荧光强度显著增强，半定量数值为五组中的最高值。而经过豆芋花提取物预培养的组，荧光强度显著减小，且随着提取物浓度增加，H2O2诱导产生的ROS含量减少，充分证明了豆芋花乙醇提取物能有效清除活性氧自由基(ROS)。每个处理组定量结果见图4中的F。
实验五、豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞活性氧自由基(DCF荧光)的影响
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别用浓度为50、100、200ug/mL的豆芋花乙醇提取物处理24h，再用H2O2(过氧化氢终浓度150μM)处理细胞2h诱导氧化应激细胞模型，分别加入10μM的DCF染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，并计算平均光密度值。
根据图5可知，同对照组相比，模型组的荧光强度显著增强，半定量数值为五组中的最高值。而经过豆芋花提取物预培养的组，荧光强度显著减小，且随着提取物浓度增加，H2O2诱导产生的ROS含量减少，趋势同图4中DHE荧光一致，充分证明了豆芋花乙醇提取物能有效清除活性氧自由基(ROS)。每个处理组定量结果见图5中的F。
实验六、豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞线粒体膜电位的影响
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别用浓度为50、100、200ug/mL的豆芋花乙醇提取物处理24h，再用H2O2(过氧化氢终浓度150μM)处理细胞2h诱导氧化应激细胞模型，然后采用5μg/mL线粒体膜电位探针罗丹明123(RH123)荧光探针进行染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，并计算平均光密度值。
根据图6可知，同对照组相比，模型组的荧光强度显著低于对照组，视野中可见的细胞数量也显著减少，表明氧化应激导致细胞线粒体膜电位下降，线粒体基质体积变化，ATP减少，最终线粒体功能无法维持而导致细胞死亡。加入豆芋花乙醇提取物进行预培养的细胞在氧化应激条件下依然保持着优于模型组的线粒体膜电位水平和数量，表明豆芋花乙醇提取物可以有效抑制活性氧导致的线粒体损伤，且在安全浓度范围内，抑制效果同作用浓度正相关。每个处理组定量结果见图6中的F。
实验七、豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞线粒体膜脂质过氧化的影响
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别用浓度为50、100、200ug/mL的豆芋花乙醇提取物处理24h，再用H2O2(过氧化氢终浓度150μM)处理细胞2h诱导氧化应激细胞模型，分别加入10μM的NAO染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，并计算平均光密度值。
根据图7可知，同对照组相比，视野中模型组和豆芋花乙醇提取物培养组的线粒体数量有所减少，但平均荧光强度随着提取物浓度的升高不断提升，同模型组相比有着显著性的增强，趋势同Rh123探针的染色结果一致，证明豆芋花乙醇提取物可以有效缓解线粒体膜的脂质过氧化情况。每个处理组定量结果见图7中的F。
实验八、豆芋花乙醇提取物对过氧化氢(H2O2)诱导的肝细胞谷胱甘肽消耗的影响
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别用浓度为50、100、200ug/mL的豆芋花乙醇提取物处理24h，再用H2O2(过氧化氢终浓度150μM)处理细胞2h诱导氧化应激细胞模型，分别加入10μM的NDA染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，并计算平均光密度值。
根据图8可知，经豆芋花乙醇提取物预处理的细胞在H2O2大量出现的情况下，荧光强度显著高于未经处理的模型组，表明该物质一方面有效减少了自由基的产生使得谷胱甘肽的消耗减少，荧光强度增加；另一方面，使得谷胱甘肽分子在氧化应激条件下依然保持着较高的活性和被还原能力，能够持续性地发挥自由基清除功效。同时，GSH含量同脂质过氧化程度有关，其含量的下降会引起脂质过氧化的发生，故图8的荧光强度趋势也证实了GSH含量的不断提升，再次印证了豆芋花乙醇提取物的抗氧化功效和抑制谷胱甘肽消耗的正向作用。每个处理组定量结果见图8中的F。
对比例1-1、将实施例1步骤1)中的“0.1mol/L盐酸的乙醇”改成“乙醇”，其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1步骤1)中的“0.1mol/L盐酸的乙醇”改成“0.2mol/L盐酸的乙醇”，其余等同于实施例1。
对比例2-1、将实施例1步骤3)中的洗脱剂由“含有0.1％甲酸的甲醇水溶液”改成“甲醇水溶液(体积浓度80％甲醇水溶液)”；其余等同于实施例1。
对比例2-2、将实施例1步骤3)中的洗脱剂由“含有0.1％甲酸的甲醇水溶液”改成“含有0.2％甲酸的甲醇水溶液(体积浓度80％甲醇水溶液)”；其余等同于实施例1。
对比例3-1、实施例1步骤3)中的作为洗脱剂的“含有0.1％甲酸的甲醇水溶液”，将甲醇水溶液的体积浓度由80％改成60％；其余等同于实施例1。
对比例3-2、实施例1步骤3)中的作为洗脱剂的“含有0.1％甲酸的甲醇水溶液”，将甲醇水溶液的体积浓度由80％改成100％(即，纯甲醇)；其余等同于实施例1。
对比例4、将大孔树脂由大孔树脂X-5改成大孔吸附树脂D-101，其余等同于实施例1。
将上述所有对比例所得的豆芋花乙醇提取物按照上述实验一、实验五所述方法进行检查，所得结果如下表1所示。
表1
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.豆芋花乙醇提取物的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)、按照1g:8～12ml的料液比将豆芋花和含0.1mol/L盐酸的乙醇混合后打浆，所得浆液于45±5℃超声浸提90±10min后，提取液离心，得上清液；
2)、将上清液在旋转蒸发仪进行旋转蒸发浓缩直至为原体积的10～20％；
3)、将步骤2)所得的浓缩液采用大孔树脂进行分离纯化，以体积浓度1％甲酸水溶液作为淋洗剂，以含有0.1％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂，收集洗脱液；
所述含有0.1％甲酸的甲醇水溶液的制备方法为：在100ml体积浓度80％甲醇水溶液中加入0.1ml的甲酸；
4)、将步骤3)所得的洗脱液旋转蒸发浓缩成至为原体积的10～20％，得浆状浓缩液；
5)、将步骤4)所得的浆状浓缩液先于-70～-90℃预冻5～7h，然后用真空冷冻干燥机将其干燥成粉末状，得到豆芋花乙醇提取物。
2.根据权利要求1所述的豆芋花乙醇提取物的制备方法，其特征是：
所述步骤3)为：
首先用两倍柱体积的甲醇活化大孔树脂，三倍柱体积的双蒸水进行平衡；然后以0.4～0.6mL/min的流速上样，待提取液被充分吸附后，用体积浓度1％甲酸水溶液作为淋洗剂进行淋洗，所述淋洗剂的用量为两倍柱体积，流速为0.4～0.6mL/min；最后用含有0.1％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂的用量三倍柱体积，流速为0.4～0.6mL/min；收集洗脱液。
3.根据权利要求2所述的豆芋花乙醇提取物的制备方法，其特征是：
所述步骤3)中的大孔树脂为大孔树脂X-5。
4.根据权利要求1～3任一所述的豆芋花乙醇提取物的制备方法，其特征是：
将步骤1)离心所得的滤渣替代步骤1)中的豆芋花重复进行步骤1)的打浆、超声浸提和离心；重复次数为2～3；
将所有离心所得的上清液合并后进行步骤2)。
5.如权利要求1～4任一方法制备所得的豆芋花乙醇提取物在制备肝细胞氧化损伤抑制剂中的应用。
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