CN102302592B

CN102302592B - 胡柚皮黄酮的制备工艺及其用途

Info

Publication number: CN102302592B
Application number: CN201110269192.2A
Authority: CN
Inventors: 熊耀康; 蒋剑平; 张春椿; 徐春根
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2011-09-13
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2031-09-13
Also published as: CN102302592A

Abstract

本发明属于中药活性物质的制备工艺技术领域，特别是涉及一种胡柚皮黄酮的制备工艺及其用途。所述的制备工艺包括如下步骤：(1)前处理：取新鲜成熟果皮切成丝，待用；(2)提取：向胡柚皮丝中加入乙醇溶液，浸泡、加热至沸腾提取提取液；(3)浓缩：提取物浓缩至总黄酮含量达38.33mg/mL以上的浓缩物；(4)分离、纯化；(5)干燥。本发明的有益效果是：本发明胡柚皮黄酮新的制备工艺其工艺稳定、可行，成品的黄酮含量均比原工艺高；提高了原料的利用率、有效成分的提取率；且胡柚皮黄酮可用于治疗高脂血症，降低血脂，治疗心血管疾病，增强心血管功能。

Description

胡柚皮黄酮的制备工艺及其用途

技术领域

本发明属于中药活性物质的制备工艺技术领域，特别是涉及一种胡柚皮黄酮的制备工艺及其用途。

背景技术

常山胡柚(Citrus changshan-huyou Y.B chang)，又名胡柚、金柚，是柚[C.grandis(Linn.)osbeek]与甜橙[C.sinensis(Linn.)osbeek]的杂交品种，以浙江常山为重点产区。其皮秋末冬初采集，分割5～7瓣，悬起晒干或阴干，作为药材。其性温、味辛甘苦、无毒，在《唐本草》、《本草求原》、《列子》、《纲目》等文献中均有记载。其功用主治为：化痰、消食、下气、快膈；治气郁胸闷、脘腹冷痛、食滞、咳喘、疝气。

目前，国内外研究结果表明，胡柚皮中存在种类繁多、含量丰富的黄酮类化合物，其中尤以橙皮苷为最多，其次是柚皮苷。这些黄酮类化合物在工业上都是很好的染料和抗氧化剂。近几十年来，人们发现黄酮类化合物具有多种生理功能和较大的药用价值，如橙皮苷有调节血管渗透性和类似维生素P的作用，这已在许多国家成为法定药物；柚皮苷有抗炎作用。另外，橙皮苷和柚皮苷还有抗病毒、抗变态反应、保护心血管系统、抗癌防癌、利胆及作为一种新型甜味剂等作用，具有很大的开发和利用价值。

现代医学认为造成心脑血管疾病的直接原因是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)，而高血脂和脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化形成的主要原因，最终引发脑出血、血栓和心肌梗塞并导致死亡。高脂血症分为高胆固醇血症、高甘油三酯血症及高胆固醇合并高甘油三酯血症三大类。研究指出心脑血管发病率与血浆胆固醇含量呈线性正相关。根据损伤反应学说，AS的发生和发展与血液中总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)等水平密切相关；低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(very low density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)是主要因素，其浓度与冠心病(coronary heart disease，CHD)发病率呈正相关，而高密度脂蛋白胆固醇(high densitylipoprotein cholesterin，HDL-C)可抑制细胞对LDL-C的摄取，把过多的胆固醇以酯的形式从细胞中转运出来，阻止胆固醇在细胞内的堆积。高脂血症的形成与膳食因素关系密切，可以通过药物或膳食降低血清胆固醇水平，阻止胆固醇在细胞内的堆积，有效的降低CHD的发病率，是预防与治疗心脑血管病的主要途径。高脂饮食能诱导氧化损伤和脂代谢紊乱，氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用。血管壁如有过多氧化剂时，可使LDL氧化，形成氧化LDL，LDL的脂质过氧化物对动脉硬化斑的形成起着重要作用。Vladimirov报道动脉硬化患者血清LPO(氧自由基氧化细胞膜上磷脂形成的脂质过氧化物)含量升高，LPO增多可诱发血管内皮细胞损伤，而内皮细胞损伤在动脉粥样硬化的发病机理中起重要作用。因此，氧化应激与高脂血症及动脉粥样硬化之间关系十分密切。

MDA在组织中的含量间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。超氧化物歧化酶(SOD)广泛地存在于各种生物中，它专一地清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤。SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)与过氧化氢酶(CAT)构成了机体清除活性氧的酶促系统，三者协同作用对减少活性氧的产生、防止脂质过氧化及其中间代谢产物对机体的损害具有十分重要的作用。因此，血液或肝组织中SOD与MDA的水平直接反映了体内的氧化应激水平。

柚皮苷、橙皮苷及多甲基黄酮等柑橘类黄酮化合物能明显降低动物或人体TC、TG、LDL及一些相关酶，如β-羟基-β-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)、胆固醇酰基转移酶(ACAT酶)的活力。然而，关于胡柚皮黄酮(Pure Total Flavonoids Citrus，PTFC)对高脂血症、高脂饮食所致脂质代谢紊乱引起的氧化应激是否具有调节作用，目前尚无文献报导。

发明内容

本发明目的在于提供一种胡柚皮黄酮新的制备工艺；本发明另一目的在于提供胡柚皮黄酮在辅助降血脂功能的保健食品和治疗高脂血症药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：胡柚皮黄酮的制备工艺，其按如下步骤：

(1)前处理：将胡柚分拣、清洗，再将清洗后的胡柚的果皮与果肉分离，取新鲜成熟果皮切成丝，待用；

(2)提取：向胡柚皮丝中加入6～20倍的乙醇溶液，浸泡0.5～4小时，加热至沸腾提取30～180min得提取液，所述的乙醇质量浓度为5～95％；

(3)浓缩：将提取液浓缩处理，回收乙醇至无醇味，提取物浓缩至总黄酮含量达38.33mg/mL以上的浓缩物；

(4)分离、纯化：对步骤(3)得到的浓缩物，调节pH至3.0～5.0，将2BV(BV：柱体积)的浓缩物，以1.5～2.5BV/h上样速度上大孔树脂层析柱内进行吸附，静止吸附0.5～1.5h后，用8～12BV蒸馏水洗脱后，用3～5BV的30％～90％乙醇为洗脱剂，流速为1～3mL/min洗脱黄酮类物质，收集洗脱液；

(5)干燥：将洗脱液减压回收乙醇至无醇味，浓缩液冷冻干燥成干粉，干粉的总黄酮纯度达76％以上。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(2)中，所述的提取的次数为2～4次，每次提取间隔为0.5～0.8h，且在第1次提取时进行0.5～4小时的浸泡处理。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(3)中，所述的提取液浓缩处理为：提取液在温度40～60℃，真空度-0.05～-0.1Mpa条件下真空减压浓缩至总黄酮含量达38.33mg/mL以上的浓缩物。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(3)中，所述的提取液浓缩处理为：先将提取液真空减压浓缩至原体积的40～70％得浓缩液，向浓缩液中加质量浓度为92～98％的乙醇并静置12～24小时初级醇沉，浓缩液与乙醇的体积比为1∶2～5，取初级醇沉的上清液待用；向初级醇沉的沉淀物中加质量浓度为92～98％的乙醇并静置1～3小时次级醇沉；取次级醇沉的上清液与初级醇沉的上清液混合得混合液，将混合液真空减压浓缩至与提取液浓缩后的浓缩液的体积相等，然后将浓缩后的混合液注入大孔树脂层析，洗脱，洗脱液真空减压浓缩至固形物含量达40％以上；所述的真空减压浓缩的条件为：温度50～80℃，真空度-0.05～-0.1Mpa。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(4)中，选用的大孔树脂型号为HPD-100、HPD-300、HPD-750的任意一种。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(4)中，可用聚酰胺树脂或离子交换树脂代替大孔树脂。

上述浓缩后的混合液注入量为大孔树脂的8～12倍，所述的洗脱为先用水冲洗至流出液澄清，再用质量浓度为40～80％的食用乙醇洗脱。

所述的胡柚皮黄酮在具辅助降血脂功能的保健食品和治疗高脂血症的药物中的应用包括能降低血脂，治疗心血管疾病，增强心血管功能。

本发明的有益效果是：本发明胡柚皮黄酮新的制备工艺其工艺稳定、可行，成品的黄酮含量均比原工艺高；提高了原料的利用率、有效成分的提取率；且胡柚皮黄酮可用于治疗高脂血症，降低血脂，治疗心血管疾病，增强心血管功能。

大孔树脂吸附法是目前应用广泛的一种分离、纯化方法。从显微结构上看，大孔吸附树脂含有很多具有微观小球的网状孔穴结构，颗粒的总表面积很大，且包含一定量的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力；另外，这些网状孔穴的孔径有一定的范围，使它们对通过孔径的化合物根据其分子量的不同而具有一定的选择性。基于吸附性和分子筛原理，有机化合物在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的。经大孔树脂吸附技术处理后，可有效地去除提取液中大量的糖类、无机盐、黏液质等杂质成分，有利于增强植物提取物产品的稳定性。大孔树脂吸附技术所需设备简单，生产周期短。利用大孔吸附树脂提取黄酮类化合物的一般方法是将植物提取液通过大孔树脂，有效成分吸附到树脂上，首先用水洗脱除去可溶性糖类、蛋白质、果胶等，再用不同浓度的醇溶液洗脱所吸附的黄酮类物质，洗脱液回收，干燥洗脱液，得到有效成分提取物的半成品。

选用的大孔树脂型号为HPD-100、HPD-300或HPD-750中的任意一种；是从上样液PH值、上样液浓度、洗脱溶剂及洗脱溶剂用量等方面进行了考察，旨在确定胡柚皮有效部位柱层析分离条件，为今后产业化应用和开发胡柚皮黄酮类产品奠定基础。

本文所涉及的试剂之间均为体积份。

附图说明

图1是本发明中正常对照组大鼠肝脏组织HE病理图片；

图2是本发明中模型对照组大鼠肝脏组织HE病理图片；

图3是本发明中低剂量组大鼠肝脏组织HE病理图片；

图4是本发明中中剂量组大鼠肝脏组织HE病理图片；

图5是本发明中高剂量组大鼠肝脏组织HE病理图片；

图6是本发明中阳性对照组大鼠肝脏组织HE病理图片；

图7是不同溶酶浓度对胡柚皮总黄酮提取率的影响(n＝3)；

图8是不同提取时间对胡柚皮总黄酮提取率的影响(n＝3)；

图9是不同固液比对胡柚皮总黄酮提取率的影响(n＝3)；

图10是八种树脂的等温吸附动力学曲线。

具体实施方式

涉及的具体仪器和材料如下：

(一)实验仪器

UV-2550紫外分光光度仪(日本岛津)；

R系列旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；

TC-15恒温电热套(海宁市华星仪器厂)；

W501B型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；

KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；

HN101-2电热恒温鼓风干燥箱(南通沪南科学仪器有限公司)；

电子天平(上海天平仪器厂)；

SHB-3T循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；

ACS-E2电子秤(上海三积分电子有限公司)。

(二)实验材料

胡柚皮(批号：20091010；采自浙江常山)，由浙江中医药大学药学院资源鉴定教研室熊耀康教授鉴定为芸香科柑橘属常山胡柚(Citrus ChangShan-huyou Y. B.Chang)的新鲜成熟果皮；

甲醇(一级色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司出品，批号071030101)；

柚皮苷(中国药品生物制品检定所，批号：UNNO.1230CN.32058)；

乙醇(浙江省建德市莲花化工试剂厂，批号：20090506)。

(三)实验方法

1)胡柚皮总黄酮及柚皮苷含量测定

胡柚皮总黄酮和柚皮苷分析方法，采用紫外/可见分光光度法和高效液相色谱法，分别在波长283nm处测定溶液的吸光度和峰面积，并代入回归方程，计算浓度和含量。

2)胡柚皮总黄酮提取得率计算

胡柚皮总黄酮的提取得率可按以下公式计算：

胡柚皮总黄酮得率(mg/g)＝(C×10×100)/(0.5×W×1000)

式C-根据回归方程计算得到的样品溶液中总黄酮浓度(μg/mL)；10、100-稀释倍数；0.5-取0.5mL待测液；W-原料胡柚皮的质量(g)；1000-单位换算数量级。

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

胡柚皮黄酮的制备工艺，所述的制备工艺包括如下步骤：

(2)提取：精密称取胡柚皮丝500g，向果皮中加入6倍的乙醇溶液，浸泡0.5小时，加热至沸腾，提取2次，每次提取间隔为30min得提取液，所述的乙醇质量浓度为25％；

(3)浓缩：提取液在温度40℃，真空度-0.08Mpa条件下真空减压浓缩，浓缩至原体积的40％的浓缩液，向浓缩液中加质量浓度为92％的乙醇并静置12小时初级醇沉，浓缩液与乙醇的体积比为1∶2，取初级醇沉的上清液待用；向初级醇沉的沉淀物中加质量浓度为92％的乙醇并静置1小时次级醇沉；取次级醇沉的上清液与初级醇沉的上清液混合得混合液，将混合液真空减压浓缩至与提取液浓缩后的浓缩液的体积相等，然后将浓缩后的混合液注入型号为HPD-100大孔树脂层析，洗脱，洗脱液真空减压浓缩至固形物含量达40％；回收乙醇至无醇味，提取物浓缩至总黄酮含量为40mg/mL的浓缩物；

(4)分离、纯化：对步骤(3)得到的浓缩物，调节pH至3.0，将2BV的浓缩物，以1.5BV/h上样速度上型号为HPD-100的大孔树脂层析柱内进行吸附，静止吸附0.5h后，用8BV蒸馏水洗脱后，用3BV的70％乙醇为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱黄酮类物质，收集洗脱液；

浓缩后的混合液注入量为大孔树脂的8倍，所述的洗脱为先用水冲洗至流出液澄清，再用质量浓度为70％的乙醇洗脱。

(5)干燥：将洗脱液在温度50℃，真空度-0.08Mpa的条件下减压回收乙醇至无醇味，浓缩液冷冻干燥成干粉。

上述制备得到的干粉为10.85克，经检测干粉的总黄酮纯度为76％，胡柚皮总黄酮提取得率为2.17％。

实施例2

胡柚皮黄酮的制备工艺，所述的制备工艺包括如下步骤：

(2)提取：精密称取胡柚皮丝500g，向果皮中加入10倍的乙醇溶液，浸泡1.5小时，加热至沸腾，提取3次，每次提取间隔为30min得提取液，所述的乙醇质量浓度为50％；

(3)浓缩：提取液在温度50℃，真空度-0.06Mpa条件下真空减压浓缩，浓缩至原体积的50％得浓缩液，向浓缩液中加质量浓度为94％的食用乙醇并静置16小时初级醇沉，浓缩液与食用乙醇的体积比为1∶3，取初级醇沉的上清液待用；向初级醇沉的沉淀物中加质量浓度为94％的乙醇并静置1.5小时次级醇沉；取次级醇沉的上清液与初级醇沉的上清液混合得混合液，将混合液真空减压浓缩至与提取液浓缩后的浓缩液的体积相等，然后将浓缩后的混合液注入型号为HPD-300的大孔树脂层析，洗脱，洗脱液真空减压浓缩至固形物含量达50％；回收乙醇至无醇味，提取物浓缩至总黄酮含量为50mg/mL的浓缩物；

(4)分离、纯化：对步骤(3)得到的浓缩物，调节pH至3.5，将2BV的浓缩物，以2BV/h上样速度上大孔树脂层析柱内进行吸附，静止吸附0.8h后，用9BV蒸馏水洗脱后，用4BV的70％乙醇为洗脱剂，流速为1.5mL/min洗脱黄酮类物质，收集洗脱液；选用的大孔树脂型号为HPD-300；

浓缩后的混合液注入量为大孔树脂的10倍，所述的洗脱为先用水冲洗至流出液澄清，再用质量浓度为60％的乙醇洗脱。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(4)中，低温连续干燥为在温度为70℃，真空度-0.08Mpa下干燥至水分含量5.5％。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(4)中，喷雾干燥为将浓缩物雾化喷入温度为280℃环境下干燥至水分含量5.5％。

(5)干燥：将洗脱液在温度60℃，真空度-0.07Mpa的条件下减压回收乙醇至无醇味，浓缩液冷冻干燥成干粉。

上述制备得到的干粉为12.85克，经检测干粉的总黄酮纯度为80％，胡柚皮总黄酮提取得率为2.57％。

实施例3

胡柚皮黄酮的制备工艺，所述的制备工艺包括如下步骤：

(1)前处理：将胡柚分拣、清洗，再将清洗后的胡柚的果皮与果肉分离，取新鲜成熟果皮待用；

(2)提取：精密称取胡柚皮丝500g，向果皮中加入16倍的乙醇溶液，浸泡3小时，加热至沸腾，提取3次，每次提取间隔为48min得提取液，所述的乙醇质量浓度为60％；

(3)浓缩：提取液在温度55℃，真空度-0.08Mpa条件下真空减压浓缩，浓缩至原体积的50％得浓缩液，向浓缩液中加质量浓度为96％的乙醇并静置20小时初级醇沉，浓缩液与乙醇的体积比为1∶4，取初级醇沉的上清液待用；向初级醇沉的沉淀物中加质量浓度为96％的乙醇并静置2小时次级醇沉；取次级醇沉的上清液与初级醇沉的上清液混合得混合液，将混合液真空减压浓缩至与提取液浓缩后的浓缩液的体积相等，然后将浓缩后的混合液注入型号为HPD-300大孔树脂层析，洗脱，洗脱液真空减压浓缩至固形物含量达60％；回收乙醇至无醇味，提取物浓缩至总黄酮含量为60mg/mL的浓缩物；

(4)分离、纯化：对步骤(3)得到的浓缩物，调节pH至4，将2BV的浓缩物，以2BV/h上样速度上大孔树脂层析柱内进行吸附，静止吸附1h后，用10BV蒸馏水洗脱后，用4BV的70％乙醇为洗脱剂，流速为2mL/min洗脱黄酮类物质，收集洗脱液；选用的大孔树脂型号为HPD-300；

浓缩后的混合液注入量为大孔树脂的11倍，所述的洗脱为先用水冲洗至流出液澄清，再用质量浓度为70％的乙醇洗脱。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(4)中，低温连续干燥为在温度为80℃，真空度-0.09Mpa下干燥至水分含量5％。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(4)中，喷雾干燥为将浓缩物雾化喷入温度为300℃环境下干燥至水分含量5％。

(5)干燥：将洗脱液在温度70℃，真空度-0.06Mpa的条件下减压回收乙醇至无醇味，浓缩液冷冻干燥成干粉。

上述制备得到的干粉为13.55克，经检测干粉的总黄酮纯度为85％，胡柚皮总黄酮提取得率为2.71％。

实施例4

胡柚皮黄酮的制备工艺，所述的制备工艺包括如下步骤：

(2)提取：精密称取胡柚皮丝500g，向果皮中加入20倍的乙醇溶液，浸泡4小时，加热至沸腾，提取3次，每次提取间隔为60min得提取液，所述的乙醇质量浓度为95％；

(3)浓缩：提取液在温度60℃，真空度-0.1Mpa条件下真空减压浓缩，浓缩至原体积的70％得浓缩液，向浓缩液中加质量浓度为98％的乙醇并静置24小时初级醇沉，浓缩液与食用乙醇的体积比为1∶5，取初级醇沉的上清液待用；向初级醇沉的沉淀物中加质量浓度为98％的乙醇并静置3小时次级醇沉；取次级醇沉的上清液与初级醇沉的上清液混合得混合液，将混合液真空减压浓缩至与提取液浓缩后的浓缩液的体积相等，然后将浓缩后的混合液注入苯乙烯型大孔树脂层析，洗脱，洗脱液真空减压浓缩至固形物含量达70％；回收乙醇至无醇味，提取物浓缩至总黄酮含量为70mg/mL的浓缩物；

(4)分离、纯化：对步骤(3)得到的浓缩物，调节pH至5，将2BV的浓缩物，以2.5BV/h上样速度上大孔树脂层析柱内进行吸附，静止吸附1.5h后，用12BV蒸馏水洗脱后，用5BV的70％乙醇为洗脱剂，流速为3mL/min洗脱黄酮类物质，收集洗脱液；选用的大孔树脂型号为HPD-750；

浓缩后的混合液注入量为苯乙烯型大孔树脂的12倍，所述的洗脱为先用水冲洗至流出液澄清，再用质量浓度为80％的乙醇洗脱。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(4)中，低温连续干燥为在温度为100℃，真空度-0.1Mpa下干燥至水分含量4.5％。

所述的胡柚皮黄酮制备工艺的步骤(4)中，喷雾干燥为将浓缩物雾化喷入温度为350℃环境下干燥至水分含量4.5％。

(5)干燥：将洗脱液在温度60℃，真空度-0.1Mpa的条件下减压回收乙醇至无醇味，浓缩液冷冻干燥成干粉。

上述制备得到的干粉为14.65克，经检测干粉的总黄酮纯度为88％，胡柚皮总黄酮提取得率为2.93％。

以下通过具体实验对本发明的制备方法进行分析说明：

一、胡柚皮黄酮提取工艺研究

由于影响到提取过程的因素主要包括：溶酶浓度、提取时间、固液比及提取次数等因素；以下通过实验，对影响提取的各因素进行单因素考察，以确定正交试验优选的范围。以紫外可见分光光度法测定不同因素单因素试验中胡柚皮提取液的总黄酮含量，并以该含量为指标，考察各因素不同水平对胡柚皮总黄酮提取率的影响。

(一)、实验方法

1、溶酶浓度

精密称取胡柚皮丝100g，分别加10倍量10％、30％、50％、70％、90％乙醇，加热至沸，沸后煎煮提取30min，提取1次，滤取提取液，浓缩至100mL，精密量取0.1mL，置100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供试品溶液(含生药1mg/mL)，紫外分光光度法测定总黄酮的含量，考察溶酶浓度对胡柚皮总黄酮提取率的影响。

2、提取时间

精密称取胡柚皮丝100g，加10倍量70％乙醇，加热至沸，沸后分别煎煮提取15min、30min、45min、60min、90min，滤取提取液，浓缩至100mL，精密量取0.1mL，置100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供试品溶液(含生药1mg/mL)，紫外分光光度法测定总黄酮的含量，考察不同提取时间对胡柚皮总黄酮提取率的影响。

3、固液比

精密称取胡柚皮丝100g，分别加8、10、12、14、16倍量70％乙醇，加热至沸，沸后煎煮提取1.0h，滤取提取液，浓缩至100mL，精密量取0.1mL，置100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供试品溶液(含生药1mg/mL)，紫外分光光度法测定总黄酮的含量，考察不同料液比对胡柚皮总黄酮提取率的影响。

4、提取次数

精密称取胡柚皮丝100g，分别加10倍量70％乙醇，加热至沸，沸后煎煮提取1.0h，提取4次，每次提取液，浓缩至100mL，精密量取0.1mL，置100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供试品溶液(含生药1mg/mL)，紫外分光光度法测定总黄酮的含量，分别测定1、2、3、4次黄酮提取率，考察提取次数对胡柚皮总黄酮提取率的影响。

5、正交试验研究

5.1正交试验设计

根据单因素实验结果，选择对胡柚皮总黄酮提取率具有显著影响的四个因素：提取时间(A)、固液比(B)、溶酶浓度(C)、提取次数(D)作为考察因素，以总黄酮含量与浸膏粉得率为考察指标，采用正交试验综合评分法优化提取工艺，以正交表L₉(3⁴)安排实验，见表1。

表1因素水平表

5.2正交试验

精密称取胡柚皮9份，每份100g，按正交试验安排表进行提取，合并提取液，过滤后浓缩至100mL，取90mL浓缩干燥至浸膏粉，精密称取浸膏粉重量，计算浸膏粉得率。另10mL精密量取0.1mL，置100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得供试品溶液(含生药1mg/mL)，紫外分光光度法测定总黄酮的含量，采用HPLC法测定提取液中柚皮苷的含量。

5.3工艺验证试验

按正交试验优选后的最佳工艺条件进行三次验证性试验，考察工艺的稳定性和可行性。

(二)、实验结果

1、溶酶浓度的确定

不同溶酶浓度的总黄酮提取量如图7所示，可见，起始阶段，随着提取溶酶浓度的增加，总黄酮提取量明显增加，但溶酶浓度达70％以上，当溶酶浓度继续增加，总黄酮的提取量趋于平稳。因此，溶酶浓度为70％时就可以提取出绝大部分胡柚皮总黄酮。

2、提取时间的确定

不同提取时间的总黄酮提取率如图8所示，起始阶段，随着提取时间的延长，总黄酮的提取量明显增加；达到60min后，当提取时间继续增加，总黄酮的提取量增加逐渐趋于平稳。因此，提取时间为60min时就可以提取出绝大部分胡柚皮总黄酮。

3、固液比的确定

从图9中可以看出，液固比对胡柚皮总黄酮得率的影响表现为先增大后趋于平缓并略有下降。在固液比为1∶14条件下，总黄酮提取率达最大值0.95％。固液比增加主要是增加了物料体系与提取剂体系间有效成分的浓度差，有利于物质的溶出。从原料节省方面考虑，固液比确定为1∶14。

4、提取次数的确定

设定提取溶酶为70％乙醇，固液比为1∶10，提取时间为1h，取胡柚皮100g，提取4次，分别测定提取1、2、3、4次总黄酮的提取量分别为6.034mg/g、4.578mg/g、1.125mg/g、0.252mg/g，为了减少后期浓缩的困难以及节省能耗考虑，以提取2次为宜。

5、正交试验结果

5.1正交试验分析

通过单因素实验发现在胡柚皮总黄酮的提取过程中，某些条件如溶酶浓度、提取时间，固液比、提取次数等会影响胡柚皮总黄酮的提取得率。以下通过正交实验设计法，分析各因素的主次顺序以及对实验指标的影响规律。本文通过L₉(3⁴)进行正交实验，全面考察上述四个因素对胡柚皮总黄酮提取得率的影响。实验方案及结果见表2。

表2胡柚皮总黄酮提取工艺正交试验结果

表3方差分析结果(一)

表4方差分析结果(二)

表5方差分析结果(三)

注：F_0.05(2，2)＝19.00，F_0.01(2，2)＝99.00

从表2的正交实验结果直观分析，影响柚皮苷提取得率的四因素的顺序为C＞B＞A＞D；表1-3为柚皮苷提取率的方差分析结果，因素C(溶酶浓度)的影响极显著，而A、B、D影响不显著。

影响胡柚皮总黄酮提取率的四因素的顺序为A＞B＞C＞D；表4为胡柚皮总黄酮提取率的方差分析结果，因素A(提取时间)的影响极显著，而B、C、D的影响不显著。

影响胡柚皮提取工艺浸膏得率的四因素的顺序为D＞A＞C＞B；表5为胡柚皮醇提取浸膏得率的方差分析结果，因素D(提取次数)的影响极显著，而A、B、C的影响不显著。

根据生产实际情况，结合生产成本考虑，确定最佳提取工艺为A₂B₃C₂D₃，即胡柚皮切成胡柚丝，加16倍量70％的乙醇溶液，提取2次，每次提取1.5小时。

因所选组合不在实验设计中，需做验证试验。

5.2工艺验证

表6工艺验证试验结果

按优选工艺A₂B₃C₂D₃平行提取三次，得到胡柚皮粗总黄酮(CTFC)，CTFC中总黄酮的平均含量为14.96％，平均提取率为8.18％，结果见表6。可见优选工艺稳定、可行。

(三)、分析与讨论

胡柚皮总黄酮的提取是分离纯化的基础，其提取率的高低直接影响到产品的成本。黄酮类物质的提取是根据相似相溶原理进行的，提取过程的实质是黄酮类物质从植物内部向溶剂中转移的传质过程：首先溶剂从溶剂主体传递到固体颗粒的表面；其次溶剂扩散并渗入固体内部以及内部的微孔内部；再次黄酮类物质溶解到溶剂中，并通过固体微孔孔道内的溶剂扩散到固体表面；最后黄酮类物质从固体表面传递到溶剂主体中。在这一系列的步骤中，影响黄酮类物质提取的控制因素主要是黄酮类物质在所选用的溶剂中的溶解度大小和其向溶剂扩散的难易程度。通常按极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶的一般规律来选择，溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选用乙醇具有溶解性能好，对植物细胞的穿透能力强的优点，除了蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多数有机化合物都能在乙醇中溶解。另外，乙醇可与水以任何比例混溶，可以根据被提取物质的性质，采取不同浓度的乙醇进行提取。

(四)、小结

以胡柚皮总黄酮得率、浸膏得率、柚皮苷含量为指标，乙醇提取胡柚皮总黄酮的较佳工艺为胡柚皮切成胡柚丝，加16倍量70％的乙醇溶液，提取2次，每次1.5小时。在此工艺条件下，总黄酮的平均含量为14.96％，平均提取率为8.18％。

二、胡柚皮黄酮分离纯化树脂的研究

由于本发明选用的树脂型号可为HPD-100、HPD-300、HPD-750型大孔树脂中的任意一种，也可以用聚酰胺树脂、离子交换树脂替代大孔树脂，且选用不用型号的大孔树脂会有不同的效果。以下通过具体实验对该部分的内容，作进一步说明。

(一)、实验材料

实验所用的大孔树脂见表7

表7实验用大孔树脂

(二)、实验方法

1、上样液制备

称取胡柚皮丝1000g，加16倍量70％的乙醇溶液，提取2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，减压浓缩至380mL(含黄酮38.33mg/mL为宜)，储存备用。

2、静态吸附试验

2.1大孔树脂预处理及含水量测定

选择HPD-100、HPD-300、HPD-750、D101、AB-8、BS-45、ADS-17、DM130型树脂为研究对象。分别用95％乙醇在室温下密封浸泡24h，使其充分溶胀后，继续用95％乙醇冲洗树脂柱，直至流出的乙醇冲洗液与蒸馏水等量混合无浑浊，即以大量的蒸馏水洗至无乙醇味，再用1％盐酸浸泡2～4h，用纯化水洗至pH值呈中性；最后用1.0％氢氧化钠浸泡2～4h，用水洗至pH值呈中性，密封，备用。

沧州宝恩化工有限公司的大孔树脂预处理方法如下：在树脂柱内加入高于树脂层10cm的乙醇浸泡4h，放出浸液，至洗涤液在试管中加水稀释不混浊，再用水洗涤至乙醇含量小于1.0％，即可使用。

称取一定量预处理后，抽干水分的大孔树脂，置于80℃的真空干燥箱中干燥至恒重，根据树脂的湿重质量和干重质量，计算树脂的含水量。

Y(％)＝{1-(M1/M0)}×100％

其中：Y--树脂的含水量(％)；M1干树脂的质量(g)；M0湿树脂的质量(g)。

2.2静态吸附等温线的绘制

精密称取上述8种大孔树脂，每份相当于相应的干树脂5.00g，分装入100mL具塞锥形瓶中，精密加入上柱液30mL，避光密封，每30min振摇1min，持续2h，并与0、2、4、6、8、10h吸取上清液1mL，采用紫外分光光度法测定吸光度A值，计算不同时间各树脂对胡柚皮总黄酮的吸附量，并绘制等温吸附曲线。

2.3静态吸附-解吸试验

分别精密量取上样液30mL(上样总黄酮1149.9mg)，加到预处理好的各型大孔树脂中，静态吸附24h，每隔0.5h振摇1min，上样液滤过，吸取上层液适量，采用紫外分光光度法测定吸光度A值，计算总黄酮的质量浓度和吸附率。滤出的各树脂另置于100mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇100mL，每隔30min振摇1min，8h后滤过，滤液浓缩至干，用甲醇溶解并定容至100mL，精密量取各滤液0.2mL，采用紫外分光光度法测定吸光度A值，计算解吸率，剩余样液减压蒸干，得固体样品，称定质量，计算总黄酮的质量分数。按下式计算静态饱和吸附量、洗脱量、静态解吸率及总黄酮质量分数。

从吸附性能与洗脱率及总黄酮质量分数综合筛选大孔树脂型号。

饱和吸附量＝(上样液中总黄酮的质量浓度-吸附后溶液中的总黄酮质量浓度)×体积/干树脂质量

洗脱量＝洗脱液中总黄酮的质量/干树脂质量

解吸率＝(洗脱液质量浓度×体积)/饱和吸附量×100％

总黄酮质量分数＝洗脱液中总黄酮的质量/洗脱液的浸膏量×100％

(三)、实验结果

1、八种树脂含水量测定结果

所选树脂的含水量测定结果见表8所示。树脂的含水量在运送、储存等过程中会发生较大的变化。因此，有必要在使用前重新测定其含水量，以获得可靠的实验结果。

表8树脂的含水量测定结果

2、大孔树脂静态吸附研究

2.1静态动力学研究

树脂的吸附动力学特性与吸附操作的生产效率密切相关。在吸附时间充分的情况下，有些树脂可能具有相近的饱和吸附量，但是树脂在化学和物理结构上的差异，导致了其吸附动力学过程的差异性。根据静态吸附结果，选择了HPD-100、HPD-300、HPD-750、D101、AB-8、BS-45、ADS-17、DM130八种树脂进行静态吸附动力学实验。图7为八种树脂的静态吸附动力学曲线。

从图10可知，这八种树脂吸附2h多都基本已达到吸附饱和，属于快速平衡型。但只有HPD-100和HPD-300吸附率较高，且吸附平衡后，变化不大，而其他几种类型树脂，相对而言吸附率较低，且吸附曲线不平稳，随着时间的变化吸附率变化比较大。

2.2静态吸附与解吸附结果

树脂单位质量的黄酮吸附量是设备设计的重要参数，直接影响到生产成本。树脂在分离纯化中草药中有效成分的应用是利用了吸附的可逆性(即解吸过程)。生产上要求树脂具有较大的吸附量和较高的解吸率，以保证有效成分最大程度的回收。因此，吸附量和解吸率的测定是树脂试验和选型的重要环节和考察因素。

根据实验方法，分别用8种树脂对胡柚皮黄酮粗提液在30℃下进行静态吸附和解吸实验。结果见表9。

表9、不同型号树脂对胡柚皮总黄酮的静态吸附-解吸能力

对比可见，各种树脂的吸附能力为HPD-100＞HPD-300＞D-101＞BS-45＞ADS-17＞HPD-750＞AB-8＞DM-130。从解吸附角度看，HPD-300的解吸附率达到了87.65％，AB-8的解吸附率也在85％以上。

树脂的极性和空间结构(孔径、孔容、比表面积)是影响树脂吸附性能的重要因素。实验所用的树脂均为聚苯乙烯型，有非极性、弱极性、中极性等类型。

从表9中可以看出，非极性和弱极性的树脂的吸附量较中极性的树脂小。根据匹配原则，极性树脂较易吸附极性物质，非极性树脂较易吸附非极性物质，即有相似相吸的规律。所以可能是由于胡柚皮中黄酮的极性相对较大，有利于中极性的树脂吸附。但有机物是通过树脂的孔径扩散到树脂孔内表面，才能被树脂吸附。因此树脂除了具有适当的功能基外，还需具有合适的孔径大小和比表面积，从而使树脂的吸附具有一定得选择性。其中，孔径的大小直接影响不同大小分子的自由出入，同时，由于大孔树脂的吸附原理主要为物理吸附，所以比表面积的增加，表面张力增大，有利于吸附。树脂的实际应用由树脂的极性、孔径、比表面积、孔容的综合性能决定，所以对其性能的评价要从吸附量、解吸率以及动力学等方面综合考虑。

以上实验结果表明HPD100、HPD300、HPD750三种树脂具有较高的吸附量和较好的解吸率，且同时动力学良好，故可以选择此三种吸附树脂分离纯化胡柚皮总黄酮。

以下通过动物实验对胡柚皮总黄酮的降血脂作用及机理进行说明：

三、药效试验研究

采用高脂血症大鼠模型，评价胡柚皮黄酮(Pure Total Flavonoids Citrus，PTFC)对高血脂大鼠体内降血脂作用，研究PTFC对大鼠脂质代谢的影响；PTFC对机体抗脂质过氧化能力的影响；为PTFC功能食品的进一步研发提供一定的理论基础。

(一)实验材料

1.PTFC

性状：类黄色疏松粉末，以柚皮苷计，总黄酮含量为76.22％；由浙江省中医院制剂中心提供；贮存方法：避光、干燥、常温(25℃以下)保存。配制方法：临用前用生理盐水(NS)溶解至所需浓度。

2.阳性药物

辛伐他汀片；性状：白色或类白色片；含量：10mg/片；批号：090517；生产单位：山东罗欣药业股份有限公司；贮存方法：遮光，密闭，阴凉处(不超过20℃)保存。配制方法：临用前用蒸馏水溶解至所需浓度。

3.实验动物

清洁级雄性SD大鼠，体重为180～200g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司[生产许可证：SCXK(沪)2008-0016]；实验在浙江中医药大学动物实验研究中心屏障动物实验设施进行[SYXK(浙)2008-0115]。

以上实验动物使用3R原则给予人道的关怀。屏障系统实验饲养室，温度：22±1℃，湿度：50-70％，光照：150-200Lx，12小时明暗交替，噪音＜50dB，使用许可证[SYXK(浙)2008-0115]。饮水：自来水过滤灭菌，置于高压灭菌的饮水瓶中自由饮用。饲料：全价营养颗粒饲料。饲养方式：自由饮食，大鼠饲养笼中给予充足的饲料和水，每笼饲养5只大鼠，试验前，每只大鼠称重、标记编号。

4.主要试剂

胆固醇，批号：100901，购于上海伯奥生物科技有限公司；蛋黄粉，批号：20101202，购于浙江长兴艾格生物制品有限公司；三号胆盐，批号：20101102-00，购于杭州微生物试剂有限公司；猪油，批号：20101213，农华牌，购于杭州世纪联华超市。总胆固醇(TC)试剂盒，批号：13041/931002/1，购于上海申能德赛技术诊断有限公司；甘油三脂(TG)试剂盒，批号：57146/975001/2，购于上海申能德赛技术诊断有限公司；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒，批号：14095/64183/1，购于上海申能德赛技术诊断有限公司；低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒，批号：0101026，购于上海复星长征医学科学有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，批号：20101222，由南京建成生物工程研究所生产；丙二醛(MDA)测定试剂盒，批号：20101223，由南京建成生物工程研究所生产；

5.仪器设备

725型-86℃低温冰箱，美国FORMA公司；AG204-电子分析天平，瑞士METTLER公司；HM335E型轮转切片，德国MICROM公司；染色机，德国LEICA公司；AP280组织包埋机，德国MICROM公司；脱水机，德国MICROM公司；AXIOVERT200荧光倒置显微镜，德国ZEISS公司；Allegra X-15R型冷冻离心机，美国贝克曼公司；Milli-Q型超纯水仪，法国Millipore公司；7020型全自动生化分析仪，日本日立。

(二)实验方法

1.动物分组

90只SPF级雄性SD大鼠，在实验环境下大鼠喂饲基础饲料观察7d后，禁食16h，称量体重，取尾血测定血清总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)水平。根据体重和TC水平，将实验动物随机分为6组：对照组、模型组、PTFC(50、100、200mg·kg^-1)组和辛伐他汀(10mg·kg^-1)组，每组15只。

2.造模方法

实验动物分组后，除对照组喂食普通饲料外，其他各组均喂食高脂饲料(由77.5％基础饲料、2％胆固醇、10％蛋黄粉和10％猪油、0.5％胆酸盐配方制备而成)，喂食28d致大鼠脂代谢紊乱模型-高脂血症大鼠。

3.给药方式、时间与剂量

造模同时，50、100、200mg·kg^-1PTFC组分别经口灌胃给予5.0、10.0、20.0mg/mL的PTFC溶液(1.0mL/100g)；10mg·kg^-1辛伐他汀组灌胃给予浓度为1.0mg/mL的辛伐他汀溶液(1.0mL/100g)；对照组和模型组灌胃给予相同容积的生理盐水(1.0mL/100g)，即10mL/kg体重的NS。以上各组给药每日一次，共28次。

4.实验步骤

于造模14d，禁食16h，取尾血，测定血清TC、TG、HDL-C水平，并称量体重。实验于28d结束，禁食16h，称重，3％戊巴比妥麻醉动物，心脏取血，并立即解剖取动物，取肝脏并称重，测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平及其他各项实验指标。并根据测定结果计算血脂综合指数(LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C比值及动脉硬化指数AI)，AI＝(TC-HDL-C)/HDL-C。

肝脏离体肉眼观察后，延其矢状切面切成约5mm厚的组织块，然后置于10％福尔马林溶液中固定24h，流水冲洗2h，常规梯度酒精洗脱，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm厚连续切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，生物显微镜观察摄影。

5.统计学处理

SPSS13.0软件进行数据处理分析，实验数据以

表示，采用One-Way ANOVA统计，用LSD检验分析各组间均数差异的显著性。

(三)实验结果

1、对大鼠血清中甘油三酯(TG)的影响

表10PTFC对高血脂大鼠血清TG的影响(n＝15，

)

注：与正常对照组比较，^△P＜0.05；与模型对照组比较组，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.01。

由表10表明，与正常对照组比，模型对照组大鼠血清中甘油三酯在2周时明显升高(P＜0.05)，4周时恢复至正常组水平；给予50、100、200mg·kg^-1的PTFC后，低、中、高剂量组的大鼠血清中甘油三酯在给药2周和4周均明显降低(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，阳性对照组大鼠血清中甘油三酯在给药2周和4周均明显降低(P＜0.01，P＜0.001)，50mg·kg^-1PTFC的降血清甘油三酯作用优于10mg·kg^-1辛伐他汀。

2、对血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和HDL-C/TC比值的影响

表11PTFC对血清HDL-C和HDL-C/TC比值的影响(n＝15，)

注：与正常对照组比较，^△△P＜0.01；与模型对照组比较组，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表11表明，与正常对照组比，模型对照组大鼠血清中HDL-C在2、4周无明显变化(P＞0.05)，但HDL-C/TC比值明显降低(P＜0.01)；给予50、100、200mg·kg^-1的PTFC后，低、高剂量组的大鼠血清中HDL-C在给药2周时明显降低(P＜0.05)，低、中、高剂量组的大鼠血清中HDL-C在给药4周时明显降低(P＜0.01)，但低、中、高剂量组的大鼠血清HDL-C/TC比值均明显升高(P＜0.01)，阳性对照组大鼠血清中HDL-C/TC比值在给药2、4周时明显升高(P＜0.01)，PTFC的升高HDL-C/TC比值作用与10mg·kg^-1辛伐他汀相当。

3、对血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响

表12PTFC对高脂血症大鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响(n＝15，

)

组别	药物剂量/(mg·kg^-1)	LDL-C/(mmol/L)
			正常组	--	0.183±0.065
模型组	--	0.998±0.425^△△△
			PTFC	50	0.294±0.168^***
	100	0.296±0.074^***
				200	0.341±0.139^***
辛伐他汀	10	0.380±0.150^***

注：与正常对照组比较，^△△△P＜0.001；与模型对照组比较组，^***P＜0.001。

由表12表明，与正常对照组比，模型对照组大鼠血清中LDL-C在4周时明显升高(P＜0.001)；给予50、100、200mg·kg^-1的PTFC后，低、中、高剂量组的大鼠血清中LDL-C在给药4周时明显降低(P＜0.001)，阳性对照组大鼠血清中LDL-C在给药4周时明显降低(P＜0.001)，50、100、200mg·kg^-1PTFC的降低LDL-C作用均优于10mg·kg^-1辛伐他汀。

4、对大鼠血清中血脂综合指数(LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C比值及动脉硬化指数AI的影响

表13PTFC对高脂血症大鼠血脂综合指数和动脉硬化指数的影响(n＝15，

)

注：与正常对照组比较，^△P＜0.05，^△△△P＜0.001；与模型对照组比较组，^*P＜0.05，^***P＜0.001。

由表13表明，与正常对照组比，模型对照组大鼠血清中LDL-C/HDL-C比值和AI指数在4周时明显升高(P＜0.001)，TG/HDL-C比值也显著升高(P＜0.05)；给予50、100、200mg·kg^-1的PTFC后，低、中、高剂量组的大血清中LDL-C/HDL-C比值和AI指数在给药4周时明显降低(P＜0.001)，TG/HDL-C比值也显著降低(P＜0.001)，阳性对照组的大鼠血清中LDL-C/HDL-C比值和AI指数在给药4周时明显降低(P＜0.001)，50、100mg·kg^-1PTFC的降低LDL-C/HDL-C比值、TG/HDL-C比值和AI指数的作用优于10mg·kg^-1辛伐他汀。

5、对高脂血症大鼠肝脏组织病理形态学的影响

肉眼观察正常对照组肝脏颜色鲜红，大小无异常；而模型对照组和药物组大鼠肝脏明显肿大，并呈黄褐色，触之有油腻感，而低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠肝脏肿大程度明显减轻，色泽较红。

各组观察肝脏组织病理形态学发现：

(1)正常对照组大鼠未发现肝细胞脂肪变性及坏死，肝细胞内无脂滴分布，肝窦清晰可见，肝索排列整齐，汇管区无炎细胞浸润，小叶结构完整(见附图1)。

(2)模型对照组大鼠肝脏出现重度肝细胞脂肪变性，肝细胞增大，胞浆内弥散性空泡状脂滴多而大，重者融合为大脂滴，将细胞核挤向一边，形似脂肪细胞，肝窦受压变窄，肝索排列紊乱；同时可见汇管区见少量炎细胞浸润(见附图2)。

(3)低剂量组大鼠个别肝脏出现重度肝细胞脂肪变性，其它大鼠的肝细胞脂肪变性程度为中度；胞浆内中等细小脂滴较多，脂滴泡不大，但仍可见大脂滴，偶见肝细胞中度坏死(见附图3)。

(4)中剂量组大鼠半数左右肝脏出现中度肝细胞脂肪变性，其余大鼠的肝细胞脂肪变性程度为轻度；胞浆内中等细小脂滴较多，脂滴泡不大，但仍可见大脂滴(见附图4)。

(5)高剂量组大鼠半数以上肝脏出现中度肝细胞脂肪变性，其余大鼠的肝细胞脂肪变性程度为轻度；胞浆内中等细小脂滴较多，脂滴泡不大，但仍可见大脂滴(见附图5)。

(6)阳性对照组大鼠个别肝脏出现中度肝细胞脂肪变性，其余大鼠的肝细胞脂肪变性程度为轻度；胞浆内中等细小脂滴较多，脂滴泡不大，但仍可见大脂滴(见附图6)。

6、对高脂血症大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响

表14表明，与正常对照组比，模型对照组大鼠血清中SOD在4周时明显降低(P＜0.001)，而MDA则明显升高(P＜0.001)；给予50、100、200mg·kg^-1的PTFC后，低、中、高剂量组的大鼠血清中SOD在给药4周时均明显升高(P＜0.001，P＜0.05)，而MDA则明显降低(P＜0.001，P＜0.01)。阳性对照组的大鼠在给药4周时血清中SOD明显升高(P＜0.01)，MDA明显降低(P＜0.01)。

表14PTFC对高脂血症大鼠血清SOD和MDA的影响(n＝10，

)

注：与正常对照组比较，^△△△P＜0.01；与模型对照组比较组，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

7、对高脂血症大鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响

表15表明，与正常对照组比，模型对照组大鼠肝脏中MDA在4周时明显升高(P＜0.01)，SOD明显降低(P＜0.01)；给予50、100、200mg·kg-1的PTFC后，低、中、高剂量组的大鼠肝脏中MDA在给药4周时均明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，并呈现一定的剂量-效应关系；而SOD在给药4周时明显升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，阳性对照组的大鼠肝脏MDA在给药4周时明显降低(P＜0.01)，SOD明显升高(P＜0.01)。

表15PTFC对高脂血症大鼠肝组织SOD和MDA的影响(n＝10，

)

注：与正常对照组比较，^△△P＜0.01；与模型对照组比较组，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

(四)、分析与结论

第一，实验中大鼠喂予高脂饲料后，血清总胆固醇水平显著升高，而高血脂大鼠给予50、100、200mg·kg^-1的PTFC后，低、中、高剂量组大鼠血清中总胆固醇均明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，低、中剂量组的大鼠血清中甘油三酯均明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，说明PTFC能有效地降低血清总胆固醇和甘油三酯的水平。

第二，实验中大鼠喂予高脂饲料后，血清HDL-C/TC比值明显降低，LDL-C、LDL-C/HDL-C比值和AI指数在4周时明显升高。而高血脂大鼠给予50、100、200mg·kg-1的PTFC后，低、中、高剂量组的大鼠血清中HDL-C明显降低和HDL-C/TC比值明显升高(P＜0.01)，低、中、高剂量组的大鼠血清中LDL-C明显降低(P＜0.01)，低、中、高剂量组的大鼠血清中LDL-C/HDL-C比值和AI指数明显降低(P＜0.01)；说明PTFC能有效地降低血清TC、TG、LDL-C水平和LDL-C/HDL-C比值及AI指数，因此，能有效地降低血清LDL-C水平和LDL-C/HDL-C比值及AI指数，能降低动脉粥样硬化和冠心病的风险。

第三，PTFC能显著升高高脂血症大鼠血清和肝组织中SOD含量，降低血清和肝组织中MDA含量，具有抑制自由基的脂质过氧化，加强自由基的清除，保护抗氧化酶的活性等作用。

Claims

1.胡柚皮黄酮的制备工艺，其特征是按如下步骤：

（1）前处理：将胡柚分拣、清洗，再将清洗后的胡柚的果皮与果肉分离，取新鲜成熟果皮，切成丝，待用；

（2）提取：向胡柚皮丝中加入体积为6～20倍的乙醇溶液，浸泡0.5～4小时，加热至沸腾提取30～180min得提取液，所述的乙醇质量浓度为5～95%；

（3）浓缩：将提取液浓缩处理，回收乙醇至无醇味，提取物浓缩至总黄酮含量达38.33mg/mL以上的浓缩物；

（4）分离、纯化：对步骤（3）得到的浓缩物，调节pH至3.0～5.0，将2BV的浓缩物，以1.5～2.5BV/h上样速度上大孔树脂层析柱内进行吸附，静止吸附0.5～1.5h后，用8～12BV蒸馏水洗脱后，用3～5BV的30%～90%乙醇为洗脱剂，流速为1～3mL/min洗脱黄酮类物质，收集洗脱液；大孔树脂型号为HPD-100、HPD-300、HPD-750中的任意一种；

（5）干燥：将洗脱液减压回收乙醇至无醇味，浓缩液冷冻干燥成干粉，干粉的总黄酮纯度达76%以上。

2.根据权利要求1所述的胡柚皮黄酮的制备工艺，其特征在于：步骤（2）所述的提取的次数为2～4次，每次提取间隔为0.5～0.8h，且在第1次提取时进行0.5～4小时的浸泡处理。

3.根据权利要求1或2所述的胡柚皮黄酮的制备工艺，其特征在于：步骤（3）所述的提取液浓缩处理为：提取液在温度40～60℃，真空度-0.05～-0.1Mpa条件下真空减压浓缩至总黄酮含量达38.33mg/mL以上的浓缩物。

4.根据权利要求1或2所述的胡柚皮黄酮的制备工艺，其特征在于：步骤（3）所述的提取液浓缩处理为：先将提取液真空减压浓缩至原体积的40～70%得浓缩液，向浓缩液中加质量浓度为92～98%的乙醇并静置12～24小时初级醇沉，浓缩液与乙醇的体积比为1：2～5，取初级醇沉的上清液待用；向初级醇沉的沉淀物中加质量浓度为92～98%的乙醇并静置1～3小时次级醇沉；取次级醇沉的上清液与初级醇沉的上清液混合得混合液，将混合液真空减压浓缩至与提取液浓缩后的浓缩液的体积相等，然后将浓缩后的混合液注入大孔树脂层析，洗脱，洗脱液真空减压浓缩至固形物含量达40%以上。

5.根据权利要求4所述的胡柚皮黄酮的制备工艺，其特征在于：所述的真空减压浓缩的条件为：温度50～80℃，真空度-0.05～-0.1Mpa。

6.根据权利要求4所述的胡柚皮黄酮的制备工艺，其特征在于：浓缩后的混合液注入量为大孔树脂的8～12倍，所述的洗脱为先用水冲洗至流出液澄清，再用质量浓度为40～80%的乙醇洗脱。

7.根据权利要求1所述的胡柚皮黄酮的制备工艺，其特征在于：步骤（4）中选用的大孔树脂由聚酰胺树脂或离子交换树脂替换。