CN107312823A - 一种tnfrsf12a基因的实时荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

一种tnfrsf12a基因的实时荧光pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种TNFRSF12A基因的实时荧光PCR检测试剂盒。本发明所述试剂盒中包括TNFRSF12A基因检测引物，所述TNFRSF12A基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。所述试剂盒特异性好；操作简便，提高了检测效率，为肺癌及时检测和早期诊断提供了有力工具。

Description

一种TNFRSF12A基因的实时荧光PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种TNFRSF12A基因的实时荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
TNFRSF12A(又称FN14，TWEAKR，CD266)基因是一个生长因子诱导调节的早期应答基因，该基因编码102个氨基酸，是一种I型跨膜蛋白。人的TNFRSF12A蛋白最近被鉴定为TWEAK(TNF超家族成员)的细胞表面受体。有文章报道TNFRSF12A与TRAF(肿瘤坏死因子受体相关因子)1,2,3以及5结合发挥作用。
发表于《美国病理学杂志》(The American Journal of Pathology)的一项研究表明：TNFRSF12A是在非小细胞肺癌的生长和扩散中起重要作用的基因。
肺癌是全世界癌症患者死亡的首要原因，这些癌症约85％为非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)发生基因突变。当被激活时，该突变基因导致肿瘤的发生发展。利用肿瘤患者切除的肺癌样本研究，研究人员发现许多EGFR突变患者也表现出高于正常水平的成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(TNFRSF12A)。研究人员认为，表皮生长因子受体的激活可以导致TNFRSF12A基因表达和活性的增加。该研究小组还发现，而过度表达的TNFRSF12A能增强肺肿瘤的形成和转移，抑制TNFRSF12A减少非小细胞肺癌的转移。
研究数据表明，TNFRSF12A可以促进非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭。因此，TNFRSF12A可能被证明是非小细胞肺癌和其他类型肿瘤的治疗靶标。TNFRSF12A基因已被发现在其他类型肿瘤中升高，包括胶质母细胞瘤和某些类型的乳腺癌，表明TNFRSF12A可能是癌症的治疗靶点。
免疫组化是检测组织样本中TNFRSF12A蛋白表达常用的方法，但大多数肿瘤患者是晚期，失去了手术机会，大块肿瘤组织难以获得。而实时荧光定量PCR技术以其特异性强，所需组织少(活检组织，脱落细胞等)，定量，敏感，方便等优点已得到全世界的公认，广泛用于肿瘤相关基因，病原体等诸多临床检测。用定量PCR法检测肿瘤相关基因，就能在基因水平上对肿瘤做更精确的早期诊断。
发明内容
针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种TNFRSF12A基因的实时荧光PCR检测试剂盒及其制备和应用。
为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种TNFRSF12A基因的实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括TNFRSF12A基因检测引物，所述TNFRSF12A基因检测引物包括核苷酸序列如SEQID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
优选地，所示试剂盒还包括GAPDH基因检测引物，所述GAPDH基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。
本发明的试剂盒采用实时荧光PCR检测技术进行TNFRSF12A基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断肺癌等肿瘤感染情况。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。
基于本发明所述试剂盒是采用实时荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：SYBR premix ex Taq、无菌水(ddH2O)、样品基因组DNA提取试剂、dNTPs、RT buffer、RNasin、M-MLV-RTase等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的各组引物对，也可以是含有配置好的含有各组引物对的PCR检测混合液。
所述PCR检测混合液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测混合液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有SYBR premix ex Taq、无菌水(ddH2O)。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者cDNA即可获得PCR反应体系。
优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有TNFRSF12A基因表达的cDNA样本。
优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无TNFRSF12A基因表达的cDNA样本。
本发明的第二方面，提供了前述TNFRSF12A基因的实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述TNFRSF12A基因检测引物、GAPDH基因检测引物；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。
步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。
优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)95℃15S；(b)95℃5S；(c)60℃30S；步骤(b)-(c)循环40次。
本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备TNFRSF12A基因检测产品中的用途。
优选地，所述检测产品用于检测肿瘤，所述肿瘤包括但不限于肺癌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用实时荧光PCR技术，设计了TNFRSF12A基因检测引物、GAPDH基因检测引物，可以在单个PCR反应管中同时检测2个基因，能够准确地检测TNFRSF12A基因的存在，缩短了实验周期，提高了检测效率，为及时检测并诊断肺癌在内的肿瘤感染情况提供了有力工具。本发明所用引物均基于GenBank公共数据库中序列设计，特异性好；操作简便，无需对PCR产物进行额外处理。PCR扩增和荧光检测在同一反应管中进行，全程处于封闭状态，大大降低了样本间交叉污染和环境污染的风险。可直接对各种样本进行检测，无需富集培养。
附图说明
图1：待测样品扩增曲线。
图2：TNFRSF12A基因溶解曲线。
图3：内参基因GAPDH溶解曲线。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1试剂盒的制备
引物设计与合成：分别以TNFRSF12A基因和GAPDH全长cDNA序列(GeneBank登录号分别为NM_016639和NM_002046)为模板，设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合，检测用引物有两对：TNFRSF12A基因检测引物；内参基因检测引物(GAPDH，管家基因)，其核苷酸序列如下表1所示：
表1
上述各组引物对可单独包装，也可以组合配成PCR检测混合液。所述PCR检测混合液中，上述各引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各组引物对，也可以是含有配置好的含有各组引物对的PCR检测混合液。
进一步地，所述试剂盒还可以含有SYBR premix ex Taq、无菌水(ddH2O)、样品基因组DNA提取试剂、dNTPs、RT buffer、RNasin、M-MLV-RTase等等。
实施例2试剂盒的使用及评价
1、样品准备：
1)待测样本：肺癌细胞。
2)微量样品即可，可以是新鲜的肺癌组织或液氮保存的肺癌组织，每次均设阴性对照组和阳性对照组。对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无TNFRSF12A基因表达的cDNA样本，阳性对照为有TNFRSF12A基因表达的cDNA样本。
2、总RNA抽提(根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行)
1)去细胞上清，每孔加入1ml于Trizol吹打，室温静止5min，然后转移至心的1.5mleppendorf管中；
2)每管加入200μl氯仿，用力震荡15s，室温静置15min；
3)4℃，12000rpm，离心15min；
4)从每管中吸取上清至另一新的1.5ml eppendorf管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀10min；
5)4℃，12000rpm离心10min后，去上清；
6)加入至少1ml 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。
7)4℃，10000rpm离心5min，弃上清。
8)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥(不需完全干燥)；
9)加入20μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
3、cDNA获得(逆转录反应)
M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司。Oligo dT购自上海生工。RNase-free的物品都购自Axygen。
说明：根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行,均为RNase－free操作。
1)将1μl Oligo dT(0.5μg/μl)和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H2O至9μl。混匀后离心，70℃温浴10min。之后立即插入到0℃冰水浴中，使Oligo dT和模板退火；
2)按下表2的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀，得到RT反应液；
表2
3)在每个反应管中加入11μl的RT反应液，混匀后离心；
4)RT反应在42℃进行1hour后完成，之后用70℃处理10min使RT酶失活；
5)得到的RT反应产物-cDNA可立即用于PCR，也可保存在-80℃以后使用。
4、SYBR Green Real-time PCR
Real-time PCR在TAKARA的TP800上完成。SYBR GreenⅠ来自TAKARA。
1)按下表3配置PCR反应体系：
表3
2)设定程序为两步法Real-Time定量：预变性95℃，15S，之后每一步变性95℃，5S,退火延伸60℃，30S,共进行40个循环；每次在延伸阶段读取吸光值。
表4
3)制作熔解曲线：PCR结束后，在95℃变性1min；然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合；从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30S,同时读取吸光值：
表5
。
5、TNFRSF12A基因表达的相对定量分析
待测样品扩增曲线如图1所示，TNFRSF12A基因溶解曲线如图2所示，内参基因GAPDH溶解曲线如图3所示，溶解曲线表明TNFRSF12A基因和内参基因均无非特异性扩增。根据目的基因和内参基因的ΔCt来判断目的基因的相对表达量。阳性对照样本，PSMC2基因和内参基因均得到扩增；阴性对照样本，无PSMC2基因的扩增曲线，只有内参基因的扩增曲线。
具体结果如下：
表6
。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种TNFRSF12A基因的实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括TNFRSF12A基因检测引物，所述TNFRSF12A基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所示试剂盒还包括GAPDH基因检测引物，所述GAPDH基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有SYBR premix exTaq、无菌水、样品基因组DNA提取试剂、dNTPs、RT buffer、RNasin、M-MLV-RTase中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有TNFRSF12A基因表达的cDNA样本。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照可为无TNFRSF12A基因表达的cDNA样本。
7.如权利要求1～6任一权利要求所述的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有如权利要求1～2任一权利要求中的PCR检测引物；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断目的的方法。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)95℃15S；(b)95℃5S；(c)60℃30S；步骤(b)-(c)循环40次。
10.如权利要求1～6任一权利要求所述的检测试剂盒在制备TNFRSF12A基因检测产品中的用途。
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