CN107266527A - 羊肚菌、黄精和雪花莲活性多糖蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

羊肚菌、黄精和雪花莲活性多糖蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种活性多糖蛋白的制备方法，其包括如下步骤：(1)将原料进行超微粉碎至300目，然后加入氯化钠溶液进行浸提，过滤离心后，获得沉淀和上清液；(2)向所得上清液加入硫酸铵，使饱和度至40％，静置处理后离心，弃去沉淀；(3)利用超滤膜对步骤(2)所得物进行超滤，浓缩至原体积的20～30％；(4)向步骤(3)所得物加入乙醇，进行沉淀处理后离心，取沉淀；(5)对步骤(4)所得物进行冻干，获得所述活性多糖蛋白；所属原料为羊肚菌、黄精、雪花莲中的至少一种。本发明获得的活性多糖蛋白的纯度高且得率较大；与现有技术相比，本发明所得活性多糖蛋白的抑制氧自由基、清除羟自由基及抑制肿瘤细胞的活性有很大提高。

Description

羊肚菌、黄精和雪花莲活性多糖蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明具体涉及羊肚菌、黄精、雪花莲等真菌与植物活性多糖蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
糖结合蛋白是具有与各种糖专一结合特性的一类结合蛋白。其中大多数有血凝活力，有的还具有促细胞有丝分裂的作用。这些性质与凝集素没有明显的区别，因此有人称这类蛋白质为凝集素，也有人称它为受体(受体可以是蛋白质、糖蛋白、糖脂或其它化合物，所以应该说是多种受体中的一类)。如哺乳动物肝细胞膜上对半乳糖专一的结合蛋白，Ashwell等研究者在同一篇文章中又称它为凝集素和受体，主要根据其性质和功能从不同的角度命名，没有严格区分的标准。
糖结合蛋白存在于所有生物体：病毒、细菌、真菌、高等植物、动物乃至人的许多组织和器官中。其中有许多是各种细胞膜的组成成分，包括质膜、微粒体膜、高尔基复合体膜等。目前还陆续有新的糖结合蛋白被发现。经过数亿年的生物演化，这类蛋白质仍被保留下来，表明它们是生物体内不可缺少的成分，并具有重要的功能。至于它们在机体内的作用直至近几十年才为人们所重视。目前已有许多实验室对它们在生物体内的作用、作用机理正在进行广泛而深人的研究。
细胞与细胞间的粘着如海绵、粘菌的团聚、细菌感染宿主细胞等；机体生长发育和代谢调节控制，如体液中的废物和老化细胞的清除、分子或离子的传递、胚胎发育、粘菌生长的调节等；分子间的识别，如雌蕊受精、精子与卵的结合，共生固氮、防御病原体的侵袭等，都包含有糖结合蛋白的作用。糖结合蛋白主要的一些功能包括胞饮作用、粘着作用、结合蛋白在共生固氮中的作用。
从具有重要药用价值的植物和真菌中开展糖结合蛋白的研究，具有重要意义。主要的研究方向有：从中选取糖结合蛋白多肽未被研究的、有重要药用价值的植物以及多种药食兼用的真菌，集成运用蛋白质化学、肿瘤的细胞生物学、病毒学、分子生物学、生物信息学、蛋白质组学、蛋白质工程和结构生物学相关技术，分离具有自主知识产权的抗重大常见恶性肿瘤(肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等)、抗艾滋病、流感和肝炎等病毒活性的新型糖结合蛋白质和多肽类化合物(特别是凝集素、受体等生物活性大分子)；进行其生物学活性和作用机制研究，揭示糖结合蛋白多肽药物与细胞内相关蛋白质相互作用的规律，发现并确立其作用新靶点；进行功能基因克隆、结构模拟、表达和定点突变研究以及空间结构研究等。
我们已研究报道过属于真菌糖结合蛋白的双孢菇凝集素通过调节细胞周期蛋白介导胰岛β细胞增殖。
不过，如何从一些中药中获得具有重要药用活性的多糖蛋白，目前还未形成统一的认识。
发明内容
针对现有技术的缺点和本领域的需求，本发明的目的之一在于提供一种活性多糖蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将原料进行超微粉碎至300目，然后加入氯化钠溶液进行浸提，过滤离心后，获得沉淀和上清液；
(2)向所得上清液加入硫酸铵，使饱和度至40％，静置处理后离心，弃去沉淀；
(3)利用超滤膜对步骤(2)所得物进行超滤，浓缩至原体积的20～30％；
(4)向步骤(3)所得物加入乙醇，进行沉淀处理后离心，取沉淀；
(5)对步骤(4)所得物进行冻干，获得所述活性多糖蛋白；
所属原料为羊肚菌、黄精、雪花莲中的至少一种。
在本发明中，属于植物糖结合蛋白的黄精凝集素、雪花莲凝集素家族，是从传统中药黄精根茎、雪花莲中分离出的一种甘露糖/唾液酸结合凝集素，具有抗肿瘤作用。
本发明通过前期研究的积累，整合优化了诸如羊肚菌、黄精、雪花莲等真菌和植物的多糖结合蛋白分离流程，形成了简便高效的真菌和植物多糖蛋白分离制备工艺。
作为本发明的优选实施方案，所述原料为羊肚菌和黄精的混合物；优选的，羊肚菌和黄精的重量比为1:1。
作为本发明的优选实施方案，所述原料为羊肚菌、黄精和雪花莲的混合物；优选的，羊肚菌、黄精和雪花莲的重量比为1:1:1。
优选的，步骤(1)中，利用氯化钠溶液进行浸提时，采取两次浸提的方式；第一次浸提时，氯化钠溶液的浓度为0.1～0.5M，加入量为10～20ml/g·原料，浸提时间为4～8小时；第二次浸提时，取第一次浸提后所得物，进行离心，取沉淀，加入浓度为0.1～0.5M的氯化钠溶液，加入量为5～10ml/g·所述沉淀，浸提时间为2～4小时。
优选的，步骤(2)中，静置处理的时间为4～6小时，和/或，步骤(3)中，超滤时，超滤膜的截留分子量为5000～6000道尔顿。
优选的，步骤(4)中，乙醇与步骤(3)所得物的体积比为6:4～9:1；沉淀处理时，时间为4～6小时。
优选的，在整个制备过程中，温度不高于42℃，各步骤中进行离心时于4℃下进行。
本发明的另外一个目的在于提供由上述制备方法制备得到的活性多糖蛋白。
本发明的另外一个目的在于提供含有上述活性多糖蛋白的制剂，所述制剂包括口服制剂或者注射制剂。
本发明的另外一个目的在于提供所述的活性多糖蛋白在抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力中至少一个方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明获得的活性多糖蛋白的纯度高且得率较大；
(2)与现有技术相比，本发明所得活性多糖蛋白的抑制氧自由基、清除羟自由基及抑制肿瘤细胞的活性有很大提高。
附图说明
图1为本发明所得活性多糖蛋白对于HeLa细胞的抑制情况结果图；
图2为利用MTT分析法进行本发明所得活性多糖蛋白对A549细胞的抑制情况的结果图；
图3位利用MTT分析法进行本发明所得活性多糖蛋白对HeLa细胞的抑制情况的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中所述的“质量体积比”值得是g/ml。如“质量体积比15倍”则意为15ml/g。
实施例1
将羊肚菌、黄精、雪花莲干燥材料各取10g混合共30g，用超微粉碎机粉碎至300目，然后加入质量体积比15倍体积的0.1M氯化钠溶液，搅拌均匀，浸提6小时，2层纱布过滤，离心(4℃,5,000g,30min)，获得上清和沉淀。
取上述沉淀，加入质量体积比5倍体积的0.5M氯化钠溶液，搅拌均匀，浸提2小时，2层纱布过滤，离心(4℃,5,000g,30min)，获得上清和沉淀。
将所得全部上清合并，得到提取液。
向提取液中添加硫酸按达40％饱和度，放置5小时，离心(4℃,10,000g,20min)去沉淀；
取上清，采用超滤浓缩脱盐，超滤膜的截留分子量为6000道尔顿；体积浓缩至原来的25％，加入无水乙醇(60％)，沉淀6小时后离心(4℃,5,000g,30min)，获得沉淀；
将所述沉淀冻干，得灰白色粉末，即为活性多糖蛋白，整个提取过程在42℃以下。
实施例2
将羊肚菌、黄精干燥材料各取20g混合共40g，用超微粉碎机粉碎至300目，然后加入质量体积比10倍体积的0.3M氯化钠溶液，搅拌均匀，浸提6小时，2层纱布过滤，离心(4℃,5,000g,30min)，获得上清和沉淀。
取上述沉淀，加入质量体积比8倍体积的0.3M氯化钠溶液，搅拌均匀，浸提4小时，2层纱布过滤，离心(4℃,5,000g,30min)，获得上清和沉淀。
将所得全部上清合并，得到提取液。
向提取液中添加硫酸按达40％饱和度，放置6小时，离心(4℃,10,000g,20min)去沉淀；
取上清，采用超滤浓缩脱盐，超滤膜的截留分子量为5000道尔顿；体积浓缩至原来的20％，加入无水乙醇(85％)，沉淀5小时后离心(4℃,5,000g,30min)，获得沉淀；
将所述沉淀冻干，得灰白色粉末，即为活性多糖蛋白，整个提取过程在42℃以下。
实施例3
将羊肚菌干燥材料取50g，用超微粉碎机粉碎至300目，然后加入质量体积比20倍体积的0.2M氯化钠溶液，搅拌均匀，浸提4小时，3层纱布过滤，离心(4℃,5,000g,30min)，获得上清和沉淀。
取上述沉淀，加入质量体积比10倍体积的0.2M氯化钠溶液，搅拌均匀，浸提3小时，3层纱布过滤，离心(4℃,5,000g,30min)，获得上清和沉淀。
将所得全部上清合并，得到提取液。
向提取液中添加硫酸按达40％饱和度，放置4小时，离心(4℃,10,000g,20min)去沉淀；
取上清，采用超滤浓缩脱盐，超滤膜的截留分子量为5000道尔顿；体积浓缩至原来的30％，加入无水乙醇(90％)，沉淀4小时后离心(4℃,5,000g,30min)，获得沉淀；
将所述沉淀冻干，得灰白色粉末，即为活性多糖蛋白，整个提取过程在42℃以下。
实施例4
将羊肚菌、雪花莲干燥材料各取25g混合共50g，用超微粉碎机粉碎至300目，然后加入质量体积比10倍体积的0.5M氯化钠溶液，搅拌均匀，浸提6小时，2层纱布过滤，离心(4℃,5,000g,30min)，获得上清和沉淀。
取上述沉淀，加入质量体积比5倍体积的0.1M氯化钠溶液，搅拌均匀，浸提4小时，2层纱布过滤，离心(4℃,5,000g,30min)，获得上清和沉淀。
将所得全部上清合并，得到提取液。
向提取液中添加硫酸按达40％饱和度，放置4小时，离心(4℃,10,000g,20min)去沉淀；
取上清，采用超滤浓缩脱盐，超滤膜的截留分子量为5000道尔顿；体积浓缩至原来的20％，加入无水乙醇(75％)，沉淀6小时后离心(4℃,5,000g,30min)，获得沉淀；
将所述沉淀冻干，得灰白色粉末，即为活性多糖蛋白，整个提取过程在42℃以下。
实验例
总抗氧化能力的测定采用磷钼酸铵比色法；还原力的测定采用普鲁士蓝法；清除超氧阴离子自由基能力的测定采用邻苯三酚自氧化法；清除羟基自由基能力的测定采用水杨酸比色法。总抗氧化能力和还原力的测定中，吸光度值越大表明活性越强；对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力的测定中，清除率越大，表明活性越强。清除率按式(1)计算。
R＝(D0－D)/D0×100％。 (1)
式中，R表示清除率；D0表示对照管的吸光度；D表示样品管的吸光度。
所有试验均以VC作阳性对照，根据试验结果计算样品和VC的IC50(总抗氧化能力和还原力为吸光度值为0.5时对应的样品浓度；其他为清除率50％时对应的样品浓度)，并计算样品的VC当量(每克多糖蛋白相当于VC的毫克数，即VC的IC50除以多糖蛋白的IC50)。
表1提取活性多糖蛋白的抗氧化活性
实验例2
活性多糖蛋白抑制肿瘤细胞试验
细胞采用HeLa细胞；培养条件为：在含有10％胎牛血清(FBS)，1％谷氨酰胺(200mmo1/L)，青霉素(100IU/mL)和链霉素(100mg/L)的RPMI 1640培养基中37℃培养，CO2浓度为5％。HeLa细胞在24孔板培养，培养基500μL，培养24h后，加入药物质量为10μg、20μg、40μg、80μg的提取物蒸馏水溶液100μL，继续培养24h，观察。结果见图1。
体外抗肿瘤活性采用MTT法评价
HeLa细胞，人肺癌细胞(A549)培养条件为：在含有10％胎牛血清(FBS)，1％谷氨酰胺(200mmo1/L)，青霉素(100IU/mL)和链霉素(100mg/L)的RPMI 1640培养基中37℃培养，CO2浓度为5％。提取的活性多糖蛋白对HeLa和A549细胞生长的影响效果采用MTT法进行评价。HeLa细胞或A549细胞在96孔板的培养密度为5×104cell/mL。固定时间添加含有培养基的多糖蛋白样品溶液。24h去除培养液。然后采用MTT法测定细胞抑制效果。
根据以下公式计算:
细胞活性(％)＝实验组吸光值/空白组吸光值×100％。
结果如图2和图3所示。

Claims (10)

1.活性多糖蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将原料进行超微粉碎至300目，然后加入氯化钠溶液进行浸提，过滤离心后，获得沉淀和上清液；
(2)向所得上清液加入硫酸铵，使饱和度至40％，静置处理后离心，弃去沉淀；
(3)利用超滤膜对步骤(2)所得物进行超滤，浓缩至原体积的20～30％；
(4)向步骤(3)所得物加入乙醇，进行沉淀处理后离心，取沉淀；
(5)对步骤(4)所得物进行冻干，获得所述活性多糖蛋白；
所属原料为羊肚菌、黄精、雪花莲中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原料为羊肚菌、黄精和雪花莲的混合物；优选的，羊肚菌、黄精和雪花莲的重量比为1:1:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原料为羊肚菌和黄精的混合物；优选的，羊肚菌和黄精的重量比为1:1。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，利用氯化钠溶液进行浸提时，采取两次浸提的方式；第一次浸提时，氯化钠溶液的浓度为0.1～0.5M，加入量为10～20ml/g·原料，浸提时间为4～8小时；第二次浸提时，取第一次浸提后所得物，进行离心，取沉淀，加入浓度为0.1～0.5M的氯化钠溶液，加入量为5～10ml/g·所述沉淀，浸提时间为2～4小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，静置处理的时间为4～6小时，和/或，步骤(3)中，超滤时，超滤膜的截留分子量为5000～6000道尔顿。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，乙醇与步骤(3)所得物的体积比为6:4～9:1；沉淀处理时，时间为4～6小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在整个制备过程中，温度不高于42℃，各步骤中进行离心时于4℃下进行。
8.由权利要求1～7任一项所述制备方法制备得到的活性多糖蛋白。
9.包含权利要求8所述的活性多糖蛋白的制剂，所述制剂包括口服制剂或者注射制剂。
10.权利要求8所述的活性多糖蛋白在抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力中至少一个方面的应用。
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